CN1219060C - 甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列 - Google Patents

Abstract

一种甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括：编码具有甘蓝型油菜BnBDC1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗旱耐盐方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱半干旱、盐碱半盐碱条件下生物产量的损失。

Description

甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种甘蓝型甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列，属于基因工程领域。

背景技术

近代地球气候环境的变化和人类的活动引起的地表沙漠和半沙漠化，以及大面积干旱半干旱地区和盐碱滩涂地的存在，要求有适宜于这些地区种植的农作物品种能够不断地得到推广。当前一个重要的育种手段是将表现出耐盐抗旱的基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗盐耐旱的农作物新品种。相关的耐盐抗旱基因及其蛋白的研究越来越多。包含BURP区域的蛋白是植物中发现的一个蛋白质家族。它是根据甘蓝型油菜BnBNM2、蚕豆VfUSP、拟南芥AtRD22和番茄LsPG1β四个蛋白名的第一个字母来命名的。该基因在N-端有一个特异的重复结构，C-端有一个信号肽，在植物的生长、发育和抗逆反应中发挥重要作用。其中，AtRD22类基因在植物不同的逆境环境下均有明显的增强表达，是植物ABA信号传导研究中一个重要的参照基因。

在对现有技术文献的分析中，虽然杂志《Molecular And General Genetics综合分子遗传学》在1993，238(1-2)：17-25发表了文章“The plant hormoneabscisic acid mediates the drought-induced expression but not theseed-specific expression of rd22，a gene responsive to dehydration stressin Arabidopsis thaliana(植物激素脱落酸介导的干旱诱导表达但不是种子特异表达的拟南芥基因rd22是脱水胁迫应答基因)”，对基因RD22在脱水和盐胁迫处理下的表达已经做了充分肯定，是脱落酸ABA诱导表达的正相关的基因，但尚不清楚该基因的耐盐、抗旱和抗虫方面的效果，并且该基因在冷胁迫下不发挥作用，此外至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列。本发明公开了与甘蓝型油菜BnBDC1密切相关的蛋白基因和甘蓝型油菜BnBDC1蛋白序列及其核酸序列，及其在利用转基因技术改良植物抗旱耐盐中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnBDC1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。更佳地，所述的编码序列具有SEQID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的包含BURP区域的甘蓝型油菜RD22类相关蛋白质多肽BnBDC1，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、活性氧以及水杨酸处理下均能发挥作用，而水杨酸是植物抗病虫的信号分子。

在本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

在本发明还提供了一种用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗旱耐盐蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有甘蓝型油菜BnBDC1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第42-1205位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第42-1205位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第42-1205位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第55-645位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜BnBDC1相同功能的蛋白的SEQID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗旱耐盐蛋白或多肽”指具有甘蓝型油菜BnBDC1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜BnBDC1相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜BnBDC1蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的甘蓝型油菜BnBDC1多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜BnBDC1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜BnBDC1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“甘蓝型油菜BnBDC1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

               表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys

Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
			Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

                            表2

84％identity in 1208nt overlap

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Query：706  t-ctcggtgaaacctggctcgggagaagcagagatgatgaagaaaacgattgaggagtgt 764

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Query：825  gacttcagcgtttctaaacttggcaaagatcacgttcgtgctgtctccactgaggtggct 884

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Query：885  gagaagaatgcaccgatgcaaaagtacagaatcgcggcggctggggtaaagaagttgtca 944

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Query：945  gacgacaagtcggtggtgtgtcacaaacagaagtacccattcgctgtgttctactgccac 1004

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Sbjct：956  gacgataaatctgtggtgtgtcacaaacagaagtacccattcgcggtgttctactgccac 1015

Query：1005 aaggcgatgatgacgagcgtttacgcggttcccctcgaaggagagaacgggttgcgtgct 1064

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Sbjct：1016 aaggcgatgatgacgaccgtctacgcggttccgctcgagggagagaacgggatgcgagct 1075

Query：1065 aaagcggttgcggtatgtcacaagaacacctcggcgtggaacccaaaccacttggccttt 1124

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Sbjct：1076 aaagcagttgcggtatgccacaagaacacctcagcttggaacccaaaccacttggccttc 1135

Query：1125 aaagtccttaaggtgaagcctgggagtgttccggtctgccatttcctccctgaaacccat 1184

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Sbjct：1136 aaagtcttaaaggtgaagccagggaccgttccggtctgccacttcctcccggagactcat 1195

Query：1185 gttgtttggttcagctactagata 1208

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Sbjct：1196 gttgtgtggttcagctactagata 1219

Query：甘蓝型油菜BnBDC1的核酸序列

Sbjct：拟南芥AtRD22的核酸序列(AY090244)

表2为本发明的甘蓝型油菜BnBDC1蛋白与拟南芥AtRD22蛋白(FLC)的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

                                    表3

85％identity in 387aa overlap，90％similarity in 387aa overlap

Query：1 MAIRLSLICLLVS--VTAIAADLTPERYWNSALPNTPIPNSLRHLFTSDFSDEESTNVQV 58

           MAIRL LICLL S  V AIAADLTPERYW++ALPNTPIPNSL +L T DF+DE+STNVQV

Sbjct：1   MAIRLPLICLLGSFMVVAIAADLTPERYWSTALPNTPIPNSLHNLLTFDFTDEKSTNVQV 60

Query：59  GKGGVNVYTGKGKPGGGTAVNVGKGGVHVN---TGKGKGTHVSVSGGKGHGGGVGVHTGK 115

           GKGGVNV T KGK G GTAVNVGKGGV V+      G GTHVSV  GKGHGGGV VHTGK

Sbjct：61  GKGGVNVNTHKGKTGSGTAVNVGKGGVRVDTGKGKPGGGTHVSVGSGKGHGGGVAVHTGK 120

Query：116 PGKRTDVGVGKGGVIVHTRHKGKPVYVGVKPGHNPFAYNYAASETQLHDDPKAALFFLEK 175

           PGKRTDVGVGKGGV VHTRHKG+P+YVGVKPG NPF YNYAA ETQLHDDP AALFFLEK

Sbjct：121 PGKRTDVGVGKGGVTVHTRHKGRPIYVGVKPGANPFVYNYAAKETQLHDDPNAALFFLEK 180

Query：176 DMVPGKAMNLRFNAEDGYNGKTAFLPRGEAETVPFGSEKSSEILNTFSVKPGSGEAEMMK 235

           D+V GK MN+RFNAEDGY GKTAFLPRGEAETVPFGSEK SE L  FSV+ GS EAEMMK

Sbjct：181 DLVRGKEMNVRFNAEDGYGGKTAFLPRGEAETVPFGSEKFSETLKRFSVEAGSEEAEMMK 240

Query：236 KTIEECEAKRVGGEEKYCATSLESMVDFSVSKLGKDHVRAVSTEVAEKNAPMQKYRIAAA 295

           KTIEECEA++V GEEKYCATSLESMVDFSVSKLGK HVRAVSTEVA+KNAPMQKY+IAAA

Sbjct：241 KTIEECEARKVSGEEKYCATSLESMVDFSVSKLGKYHVRAVSTEVAKKNAPMQKYKIAAA 300

Query：296 GVKKLSDDKSVVCHKQKYPFAVFYCHKAMMTSVYAVPLEGENGLRAKAVAVCHKNTSAWN 355

           GVKKLSDDKSVVCHKQKYPFAVFYCHKAMMT+VYAVPLEGENG+RAKAVAVCHKNTSAWN

Sbjct：301 GVKKLSDDKSVVCHKQKYPFAVFYCHKAMMTTVYAVPLEGENGMRAKAVAVCHKNTSAWN 360

Query：356 PNHLAFKVLKVKPGSVPVCHFLPETHVVWFSY 387

           PNHLAFKVLKVKPG+VPVCHFLPETHVVWFSY

Sbjct：361 PNHLAFKVLKVKPGTVPVCHFLPETHVVWFSY 392

Query：甘蓝型油菜BnBDC1的氨基酸序列

Sbjct：拟南芥AtRD22的氨基酸序列(S34823)

表3为本发明的甘蓝型油菜BnBDC1蛋白与拟南芥AtRD22的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括甘蓝型油菜BnBDC1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜BnBDC1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。

诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜BnBDC1多肽时，可以将甘蓝型油菜BnBDC1编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜BnBDC1蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析甘蓝型油菜BnBDC1基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜BnBDC1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜BnBDC1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜BnBDC1相关的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在甘蓝型油菜BnBDC1相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜BnBDC1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的甘蓝型油菜BnBDC1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜BnBDC1相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与甘蓝型油菜BnBDC1相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对甘蓝型油菜BnBDC1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜BnBDC1相关相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的甘蓝型油菜BnBDC1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的甘蓝型油菜BnBDC1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜BnBDC1相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明具有实质性特点和显著进步，本发明在抗旱耐盐具有明显的作用，能够明显降低在干旱和盐碱半盐碱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱和高盐能够造成大部分农作物如水稻、棉花、甘蓝型油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，因此，本发明具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明：

说明：

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

甘蓝型油菜BnBDC1基因的克隆

1.组织分离(isolation)

甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)从市场上购得，将甘蓝型油菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据拟南芥AtRD22基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR

PCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(612bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtRD22基因的同源性很高，故初步认为它是一个抗旱耐盐基因。

(2)3’-RACE

PCR[AP+RD301(5’-TGCCACAAGGCGATGATGAC-3’)]得到RD3’(328bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtRD22基因的同源性很高，故初步认为它是一个与RD22相关基因。

(3).5’-RACE

第一轮PCR  [AAP+RD501(5’-CCNTCGAGNGGAACCGCGTA-3’)]

第二轮PCR[(AUAP+RD502(5’-CGGAGAAGCTGTAGAGCTT-3’))得到RD5’(约883bp)(过程同(1))

将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。

BLAST的结果证明从甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥AtRD22相关的基因。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜BnBDC1蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2

甘蓝型油菜BnBDC1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的甘蓝型油菜BnBDC1全长cDNA的长度为1326bp，详细序列见SEQ IDNO.3，其中开放读框位于42-1205位核苷酸(1164个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜BnBDC1的氨基酸序列，共387个氨基酸残基，分子量为41411.51道尔顿，等电点(pI)为9.30。详细序列见SEQ ID NO.3。

将甘蓝型油菜BnBDC1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因AtRD22在核苷酸水平上具有84％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因AtRD22(S34823)也有85％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因BnBDC1与拟南芥基因AtRD22无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因AtRD22(S34823)已经被证明在干旱条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因BnBDC1在抗旱耐盐方面也具有相似的作用。

实施例3

甘蓝型油菜基因BnBDC1蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的抗旱耐盐性鉴定

含目的基因(甘蓝型油菜基因BnBDC1基因)的表达载体的构建

根据甘蓝型油菜基因BnBDC1的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因BnBDC1基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物拟南芥。

1.发苗：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。

2.剪苗：剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。

预培养基：MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)

3.转化共培养：将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。

4.筛选培养：共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。

筛选培养基：MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)

生根培养基：MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)

5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

含甘蓝型油菜基因BnBDC1的转基因拟南芥植株的抗旱耐盐性鉴定

鉴于编码BnBDC1，如拟南芥的AtRD22基因已被证明在抗旱耐盐条件下发挥作用，而甘蓝型油菜基因BnBDC1转录水平与拟南芥的AtRD22具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因BnBDC1的转基因拟南芥植株进行抗旱耐盐鉴定。用300Mm氯化钠和300mM甘露醇处理处理转基因植株和转基因植株的种子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BnBDC1基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株BnBDC1转录水平在盐和甘露醇处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在盐和甘露醇处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是生长没有未经处理的植株快。在抗氧化、耐冷和抗病虫试验中，转基因植株也明显表现出比对照未转基因植株生长正常。这证明甘蓝型油菜基因BnBDC1基因比拟南芥基因RD22具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐盐的研究和产业化生产中。

实施例4

甘蓝型油菜基因BnBDC1在甘蓝型油菜中的拷贝数分析

采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII Xba I BamH和EcoRI酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene Images^TMContents CDP-Star^TM labelling module(PRN3540)，我们将BnBDC1基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现多条杂交条带，说明甘蓝型油菜基因BnBDC1在甘蓝型油菜中拷贝数不低于2。

实施例5

甘蓝型油菜基因BnBDC1在甘蓝型油菜中的表达谱分析

1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗先后经200mM甘露醇0.5小时、100mMNaCl3小时、4℃48小时、1500μJ/m²紫外线照射0.5小时，200uM H₂O₂3小时，100μM脱落酸4小时和500uM水杨酸12小时处理，然后用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。

5.膜上杂交信号的检出：1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene Images^TM Contents CDP-Star^TMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；不同的化学物质和激素处理，都不同程度的提高了甘蓝型油菜BnBDC1转录水平，尤其是甘露醇(相当于干旱处理)下，表达明显比其它处理增强。说明甘蓝型油菜BnBDC1转录水平在干旱、盐、冷和活性氧胁迫下，均能发挥作用。水杨酸处理也明显提高该基因的表达水平，说明该基因在病虫害胁迫下也会发挥作用。

甘蓝型油菜BnBDC1基因在甘露醇的不同时间处理的表达谱分析

1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经200mM甘露醇处理1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时和24小时，然后按照上面提到的方法抽提RNA，并进行定量。

2.采用一步反应法定量进行表达分析，利用One Step RNA PCR Kit(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd)，具体操作按照试剂盒说明书进行。每个反应包括2.5μl10×One Step RNA PCR buffer，5μl 25mM MgCl₂，5μldNTP混合液，20U RNase抑制剂，0.5U AMV Rtase XL，0.5U AMV-Optimized Taq，特异引物1(5’-ATGGCGATTCGTCTTTCGT-3’)和特异引物2 RD502各10μMol，各种时间处理的RNA 2μl，然后补充无.RNase水到25μl。PCR反应条件如下：50℃15分钟，94℃2分钟，然后进行94℃30秒，58℃30秒和72℃1.5分钟共30循环，最后72℃延伸5分钟。

3.反应结束后，取10μlPCR反应液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，5V/cm电压电泳1小时左右，在凝胶成像系统上观察DNA量。

定量RT-PCR结果显示，甘蓝型油菜BnBDC1在甘露醇处理5分钟后开始启动表达，在6小时后达到最高峰，并保持不变，说明甘蓝型油菜BnBDC1在干旱处理下，随其表达量与时间呈正相关。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：20bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.1

GGAGAGGA(A/G)AA(A/G)TATTGTGC

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：20bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.2

TGTGGCA(A/T/C/G)AC(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)ACTGCT

(2)SEQ ID NO.3的信息

<110>上海交通大学

<120>甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列

<140>031415431

<141>2003-07-10

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1326

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400>1

aaattcatca aaactacatt tctattctaa ctcccacaga aatggcgatt cgtctttcgt    60

tgatatgcct tcttgtttca gtcacggcca ttgcggctga tttaacgccg gagcgttatt   120

ggaactctgc cttaccaaac actcccatac caaactctct tcgccatctt tttacgtcag   180

attttagcga cgaggaaagc accaacgtcc aagtagggaa aggaggcgtg aacgtttaca   240

ccggaaaagg taagcctggc ggaggaaccg ccgtgaacgt tggaaaggga ggtgtacatg   300

tgaacaccgg caagggtaag ggaacacacg tgagcgttag cggtggaaaa ggccacggag   360

gaggcgtcgg cgtccacacc gggaagccag gaaagagaac cgacgtagga gttggcaaag   420

gtggcgttat agtgcacacg cgccacaagg gaaagccggt ctacgtcggg gtgaaaccag   480

gacataaccc ttttgcgtat aactatgcag cgagcgagac tcagctccac gacgatccca   540

aagctgctct cttcttcttg gagaaagaca tggttcccgg aaaagctatg aacctcaggt   600

ttaatgcgga ggacggctac aacggcaaaa ccgcgttctt gccacgtgga gaggcggaaa   660

cggtgccgtt cgggtctgag aagtcctcgg agatcttgaa cacgttctcg gtgaaacctg   720

gctcgggaga agcagagatg atgaagaaaa cgattgagga gtgtgaagcg aaaagagtcg   780

gtggcgaaga gaagtattgt gctacgtctt tggagtcgat ggtggacttc agcgtttcta   840

aacttggcaa agatcacgtt cgtgctgtct ccactgaggt ggctgagaag aatgcaccga   900

tgcaaaagta cagaatcgcg gcggctgggg taaagaagtt gtcagacgac aagtcggtgg   960

tgtgtcacaa acagaagtac ccattcgctg tgttctactg ccacaaggcg atgatgacga  1020

gcgtttacgc ggttcccctc gaaggagaga acgggttgcg tgctaaagcg gttgcggtat  1080

gtcacaagaa cacctcggcg tggaacccaa accacttggc ctttaaagtc cttaaggtga  1140

agcctgggag tgttccggtc tgccatttcc tccctgaaac ccatgttgtt tggttcagct  1200

actagatatg cttttctata ttttgtaata atatataaga agatctatat tctgggatgt  1260

tttgtatgta tacatatata tagtaatgtg tgggtttcat ataatcaaaa aaaaaaaaaa  1320

aaaaaa                                                             1326

<210>2

<211>387

<212>PRT

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400>2

MAIRLSLICL LVSVTAIAAD LTPERYWNSA LPNTPIPNSL RHLFTSDFSD EESTNVQVGK  60

GGVNVYTGKG KPGGGTAVNV GKGGVHVNTG KGKGTHVSVS GGKGHGGGVG VHTGKPGKRT 120

DVGVGKGGVI VHTRHKGKPV YVGVKPGHNP FAYNYAASET QLHDDPKAAL FFLEKDMVPG 180

KAMNLRFNAE DGYNGKTAFL PRGEAETVPF GSEKSSEILN TFSVKPGSGE AEMMKKTIEE 240

CEAKRVGGEE KYCATSLESM VDFSVSKLGK DHVRAVSTEV AEKNAPMQKY RIAAAGVKKL 300

SDDKSVVCHK QKYPFAVFYC HKAMMTSVYA VPLEGENGLR AKAVAVCHKN TSAWNPNHLA 360

FKVLKVKPGS VPVCHFLPET HVVWFSY                                     387

Claims (2)

1、一种甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列，其特征在于，包括：编码具有甘蓝性油菜BnBDC1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列具有SEQID NO.3中从核苷酸第42-1205位的核苷酸序列或其简并性序列。

2、根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnBDC1蛋白编码序列，其特征是，所述编码序列具有SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列，或将SEQ ID NO.3序列缺失、插入和/或取代、在5`或3`端添加一个或数个核苷酸获得的序列。