CN1594570A - 甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列 - Google Patents

Abstract

一种用于基因工程技术领域甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列。所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnMKK1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39－1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39－1007位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗旱病虫害等不良环境胁迫具有明显的作用，能够明显减少农作物在干旱、病虫害等不良环境条件下生物产量的损失。

Description

甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列

技术领域

本发明涉及的是一种用于基因工程技术领域的蛋白编码序列，特别是一种甘蓝型甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1(BnMKK1)蛋白编码序列。

背景技术

农作物在生长过程中会遇到各种各样的自然灾害而造成减产，如干旱、滞涝和病虫害等。当前一个重要的育种手段是将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。植物为抵抗不良的外界环境的胁迫，在长期的自然进化中发展起复杂的信号传递系统帮助自己度过当前的困境，其中MAP激酶(Mitogen-actived protein kinase)信号传递系统在抗逆过程中扮演了极其重要的作用。MAPKs是由MAP激酶(MAPK)与MAP激酶的激酶(mitogen-activatedprotein kinase kinase，MAPKK)和MAP激酶的激酶的激酶(mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase，MAPKKK)3种类型组成。植物细胞感受环境胁迫(如损伤、干旱、低温等)和生长发育信号(生长素、乙烯、脱落酸等)后，可以通过受体蛋白激酶等上游激活子顺次激活MAPKKK、MAPKK、MAPK。其中，MAPKK是该传递链中中间的一个激酶，直接作用于MAPK调控下游的基因表达，使植物表现出各种抗逆性能，是植物信号传递过程中重要的一环。

在对现有技术文献的分析中，虽然杂志《the Plant Journal植物杂志》在2002，29：637-647发表了文“Activation of AtMEK1，an Arabidopsis mitogen-activatedprotein kinase kinase，in vitro and in vivo：analysis of active mutantsexpressed in E.coli and generation of the active form in stress responsein seedlings(体内和体外的拟南芥细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶AtMEK1的激活：大肠杆菌活性的突变表达分析和幼苗压力反应中的活性形式)”，对基因MKK1在不同的非生物胁迫处理下的表达已经做了充分描述，但尚不清楚该基因的耐盐、抗旱和抗虫等其它环境因素的效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列。本发明公开了与甘蓝型油菜BnMKK1密切相关的蛋白基因和甘蓝型油菜BnMKK1蛋白序列及其核酸序列，应用转基因技术改良植物抗生物和非生物胁迫的能力，使其在抗各种环境胁迫中具有明显的作用，即能够明显降低在干旱、水淹和病虫害土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnMKK1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列杂交。该编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。该编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列。

所述的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白质活性的多肽，是本发明分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶甘蓝型油菜MAPK类相关蛋白质多肽BnMKK1，它包括：具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、活性氧以及水杨酸处理下均能发挥作用，提供植物的抵抗各种不良环境的能力。

所述的DNA分子，它包含在本发明所提供的一种载体，该载体是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递激酶的激酶”指编码具有甘蓝型油菜BnMKK1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第39-1007位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第39-1007位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第39-1007位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(70-85％一致性)下，更佳的在高度严紧条件(85％以上一致性)下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜BnMKK1相同功能的蛋白的SEQID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递的蛋白激酶的激酶编码序列”指具有甘蓝型油菜BnMKK1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜BnMKK1相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜BnMKK1蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的甘蓝型油菜BnMKK1多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜BnMKK1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜BnMKK1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“甘蓝型油菜BnMKK1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                               表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

                     表2

86％ identity in 1091nt overlap

Query：39   atgaagaagggtggattcagcaataatctcaagttctcaatccctcctgctggcgagcaa 98

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Query：939  cctgagttatcttcattcatctccacttgtttgca-aaggacccaaacagtcgaagctct  997

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Sbjct：925  cctgagttatcctcattcatctccacatgtttgcagaaggagcccaacagtcgaagctct  984

Query：998  gctagggaactaatggaacatcctttcgtgaagaaatacgacaacaactcggagatcaac 1057

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Sbjct：985  gcaaaggaactgatggaacatcctttcttgaacaaatacg---actactcggggatcaat 1041

Query：1058 ctcgcgtcacactttacaaatgcagggtctccgcttgcaacgcttaagaatctgtctggt 1117

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Sbjct：1042 ctcgcgtcctacttcacagatgcaggatcgccacttgcaacacttgggaacctgtctggt 1101

Query：1118 acattctccgt 1128

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Sbjct：1102 acgttctccgt 1112

Query：甘蓝型油菜BnMKK1的核酸序列

Sbjct：拟南芥AtMKK1的核酸序列(AF067792)

表2为本发明的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白与拟南芥AtMKK1蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

                             表3

90％ identity in 313aa overlap

Query：1   MKKGGFSNNLKFSIPPAGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRIVSQSEPEALSPIKP 60

           MKKGGFSNNLK +IP AGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRI+SQ EPE LSPIKP

Sbjct：1   MKKGGFSNNLKLAIPVAGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRIISQLEPEVLSPIKP 60

Query：61  ADDKLGLSDLDMVKFVGKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLNVDEAIRKSIAQELKIN 120

           ADD+L LSDLDMVK +GKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLN+DEAIRK+IAQELKIN

Sbjct：61  ADDQLSLSDLDMVKVIGKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLNIDEAIRKAIAQELKIN 120

Query：121 QSSQCPYLVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSLEDFLKSVKTIPESYLSTIFKQVLQGLI 180

           QSSQCP LVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSL DFLKSVK IP+SYLS IF+QVLQGLI

Sbjct：121 QSSQCPNLVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSLADFLKSVKAIPDSYLSAIFRQVLQGLI 180

Query：181 YLHHDKHIIHRDLKPSNLLVNHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIV 240

           YLHHD+HIIHRDLKPSNLL+NHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIV

Sbjct：181 YLHHDRHIIHRDLKPSNLLINHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIV 240

Query：241 GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPYLPPDEEETWSSAFELMEAIVDQPPPTLPSESFS 300

           GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPY PP++EETW+S FELMEAIVDQPPP LPS +FS

Sbjct：241 GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPYAPPNQEETWTSVFELMEAIVDQPPPALPSGNFS 300

Query：301 PELSSFISTCLQR 313

           PELSSFISTCLQ+

Sbjct：301 PELSSFISTCLQK 313

Query：甘蓝型油菜BnMKK1的氨基酸序列

Sbjct：拟南芥AtMKK1的氨基酸序列(ACC72754)

表3为本发明的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白与拟南芥AtMKK1的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括甘蓝型油菜BnMKK1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜BnMKK1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜BnMKK1多肽时，可以将甘蓝型油菜BnMKK1编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜BnMKK1蛋白表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法和一步法RT-PCR法技术分析甘蓝型油菜BnMKK1基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜BnMKK1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜BnMKK1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜BnMKK1相关的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在甘蓝型油菜BnMKK1相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜BnMKK1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的甘蓝型油菜BnMKK1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜BnMKK1相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与甘蓝型油菜BnMKK1相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对甘蓝型油菜BnMKK1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜BnMKK1相关相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的甘蓝型油菜BnMKK1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜BnMKK1相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明具有在抗各种环境胁迫具有明显的作用，能够明显降低在干旱、水淹和病虫害土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱、水淹和病虫害能够造成大部分农作物如水稻、棉花、甘蓝型油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，此外大面积的应用各种农药也严重污染环境，因此，本发明具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明：

说明：

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

甘蓝型油菜BnMKK1基因的克隆

1.组织分离(isolation)

甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)从市场上购得，将甘蓝型油菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离(RNA isolation)

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据拟南芥AtMKK1基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR

PCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到PCR产物(405bp)进行回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMKK1基因的同源性很高，故初步认为它是一个细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。

(2)3’-RACE

PCR[AP+M301(5’-TCTCCAGAGAG(G/A)ATCGTTGG-3’)]得到M3’(694bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMKK1基因的同源性很高，故初步认为它是一个与MAPK相关基因。

(3).5’-RACE

第一轮PCR[AAP+M501(5’-ATT(C/G)GATGGTTTCAAGTCAC-3’)]

第二轮PCR[(AUAP+M502(5’-TCAGGGATGG(T/C)TTT(G/A)ACTGA-3’)]得到M5’(约741bp)(过程同(1))

将测序结果的重叠区拼接，发现得到的片段既是该基因的完整编码区。

BLAST的结果证明从甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥AtMKK1相关的基因。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2

甘蓝型油菜BnMKK1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的甘蓝型油菜BnMKK11全长cDNA的长度为1464bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放读框位于39-1007位核苷酸(1114个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜BnMKK1的氨基酸序列，共370个氨基酸残基，分子量为35708.39道尔顿，等电点(pI)为5.59。详细序列见SEQ ID NO.3。

将甘蓝型油菜BnMKK1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因AtMKK1在核苷酸水平上具有90％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因AtMKK1(CAB75493)也有94％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因BnMKK1与拟南芥基因AtMKK1无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因AtMKK1(ACC72754)已经被证明在多个非生物胁迫条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因BnMKK1在抗逆方面也具有相似的作用。

实施例3

甘蓝型油菜基因BnMKK1蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的抗逆性鉴定

含目的基因(甘蓝型油菜基因BnMKK1)的表达载体的构建

根据甘蓝型油菜基因BnMKK1的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因BnMKK1基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物拟南芥。

1.发苗：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。

2.剪苗：剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。

预培养基：MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)

3.转化共培养：将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。

4.筛选培养：共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。

筛选培养基：MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)

生根培养基：MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)

5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

含甘蓝型油菜基因BnMKK1的转基因拟南芥植株的抗逆性鉴定

鉴于编码BnMKK1，如拟南芥的AtMKK1基因已被证明在抗逆条件下发挥作用，而甘蓝型油菜基因BnMKK1转录水平与拟南芥的AtMKK1具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因BnMKK1的转基因拟南芥植株进行抗逆性鉴定。用300mM氯化钠和300mM甘露醇处理处理转基因植株和转基因植株的种子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BnMKK1基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株BnMKK1转录水平在盐和甘露醇处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量提高，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在盐和甘露醇处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是比未经处理的植株生长稍慢。在抗厌氧、抗氧化和抗病试验中，转基因植株也明显表现出比对照(未转基因植株)生长正常。这证明甘蓝型油菜基因BnMKK1基因比拟南芥基因AtMKK1具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐盐的研究和产业化生产中。

部分已检测出是阳性的转基因植株，在生长后期，产生了类似于植株受细菌、真菌、病毒和类病毒等病原物侵染后所形成的病斑，即所谓的植物过敏性死亡。从这一现象来看，可以推测MKK基因在植物体中的表达引起了MAPK级联中的一些下游蛋白激酶或者转录子等的激活，启动了植物过敏性反应，类似的结果也在烟草NtMEK2的超表达研究中出现。初步推测MKK基因在MAPK级联中可能参与了病原信号的传递，但还需进一步的研究结果进行证实。

实施例4

甘蓝型油菜基因BnMKK1在甘蓝型油菜中的拷贝数分析

采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII Xba I BamH和EcoR I酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司GeneImages^TM Contents CDP-Star^TM labelling module(PRN3540)，我们将BnMKK1基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现少量的杂交条带，说明甘蓝型油菜基因BnMKK1在甘蓝型油菜中是低拷贝。

实施例5

甘蓝型油菜BnMKK1基因在NaCl、甘露醇、H₂O₂的不同时间处理的表达谱分析

1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经200mM甘露醇、200mM NaCl和200μM H₂O₂处理0分钟、2分钟、5分钟、20分钟、1小时、2小时、6小时、12小时和24小时，然后按照华舜公司提供的RNA抽提试剂盒抽提RNA，并进行定量。

2.采用一步反应法定量进行表达分析，利用One Step RNA PCR Kit(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd)，具体操作按照试剂盒说明书进行。每个反应包括2.5μl10×One Step RNA PCR buffer，5μl 25mM MgCl₂，5μl dNTP混合液，20U RNase抑制剂，0.5U AMV Rtase XL，0.5U AMV-Optimized Taq，特异引物1(5’-ATGAACAACGCCGGCGGCCA-3’)和特异引物2(5 ’-CTAAGCATATGTTGGATTGAGTGC-3’)各10μMol，各种时间处理的RNA 2μl，然后补充无RNase水到25μl。PCR反应条件如下：50℃ 30分钟，94℃ 2分钟，然后进行94℃ 30秒，60℃ 30秒和72℃ 1分钟共30循环，最后72℃延伸5分钟。

3.反应结束后，取15μl PCR反应液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，5V/cm电压电泳1小时左右，在凝胶成像系统上观察DNA量。

定量RT-PCR结果显示，甘蓝型油菜BnMKK1在4℃、甘露醇和脱落酸ABA处理1小时后达到最高峰，随后表达降低；但H₂O₂处理中2小时后就达到最高峰随后降低。这些表达特点说明甘蓝型油菜BnMKK1是典型的信号传递蛋白，属于各种逆境处理早期表达基因，并启动各种与抗逆有关的基因的表达，提高植株的抗逆能力。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

      (A)长度：23bp

      (B)类型：核苷酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.1

GG(A/T/C/G)A(A/G)(A/T/C/G)GGA(A/G)(A/T/C/G)(C/T)GG(A/C/T)GG(A/G/T)(A/G)(C/T)(A/T/C/G)GT

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

      (A)长度：20bp

      (B)类型：核苷酸

      (C)链性：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.2

CTC(A/T/C/G)GG(A/T/C/G)S(A/C/T)CAT(A/G)TA(A/T/C/G)(G/T)(C/T)(A/G)(A/C/T)A(A/T/C/G)GT(A/T/C/G)CC

(2)SEQ ID NO.3的信息

<110>上海交通大学

<120>甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1435

<212>DNA

<213>Brassica napus

<220>

<221>CDS

<222>(39)..(1007)

<400>1

gggaaagcga cgagaagaag aaggaagaag aagacgaa atg aag aag ggt gga ttc     56

                                         Met Lys Lys Gly Gly Phe

                                         1               5

agc aat aat ctc aag ttc tca atc cct cct gct ggc gag caa tcc atc      104

Ser Asn Asn Leu Lys Phe Ser Ile Pro Pro Ala Gly Glu Gln Ser Ile

            10                  15                 20

acc aaa ttc ttg acg cag agc ggt acg ttc aag gat gga gat ctg cga      152

Thr Lys Phe Leu Thr Gln Ser Gly Thr Phe Lys Asp Gly Asp Leu Arg

        25                  30                 35

gta aac aag gat gga gtt cgc atc gtc tct caa tct gag cct gaa gct      200

Val Asn Lys Asp Gly Val Arg Ile Val Ser Gln Ser Glu Pro Glu Ala

    40                  45                 50

cta tct ccg att aag cca gcg gat gat aag ttg ggc tta tcc gat tta      248

Leu Ser Pro Ile Lys Pro Ala Asp Asp Lys Leu Gly Leu Ser Asp Leu

55                  60                 65                  70

gac atg gtt aaa ttc gtt ggt aaa gga agc agt ggt gtt gtg cag ctt      296

Asp Met Val Lys Phe Val Gly Lys Gly Ser Ser Gly Val Val Gln Leu

                75                 80                  85

gtt caa cac aaa tgg act ggt caa ttc ttc gcc tta aag gtc att caa      344

Val Gln His Lys Trp Thr Gly Gln Phe Phe Ala Leu Lys Val Ile Gln

            90                 95                  100

cta aac gtc gat gaa gct att cgc aag tca att gca caa gag ctt aaa      392

Leu Asn Val Asp Glu Ala Ile Arg Lys Ser Ile Ala Gln Glu Leu Lys

        105                 110                115

ata aac cag tcc tca caa tgt ccg tac ctt gtt acc tcc tac caa tcg      440

Ile Asn Gln Ser Ser Gln Cys Pro Tyr Leu Val Thr Ser Tyr Gln Ser

    120                 125                130

ttt tac gat aac ggc gca atc tcg ctg ata ttg gag tac atg gac ggt      488

Phe Tyr Asp Asn Gly Ala Ile Ser Leu Ile Leu Glu Tyr Met Asp Gly

135                 140                145                 150

gga tct cta gaa gac ttt ctc aaa tca gtc aaa acc atc cct gag tcc      536

Gly Ser Leu Glu Asp Phe Leu Lys Ser Val Lys Thr Ile Pro Glu Ser

                155                160                 165

tat ctt tct acc atc ttt aag caa gtg ctt cag gga ctg atc tat ctt      584

Tyr Leu Ser Thr Ile Phe Lys Gln Val Leu Gln Gly Leu Ile Tyr Leu

            170                175                 180

cat cat gac aag cac atc atc cac cgt gac ttg aaa cca tcg aat ctg      632

His His Asp Lys His Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu

        185                 190                195

ttg gtc aac cac aga gga gag gtc aag atc act gac ttc ggt gtg agt      680

Leu Val Asn His Arg Gly Glu Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Val Ser

    200                 205                210

acc gtt atg act aac acc gcg ggt tta gca aac acc ttt gtc ggg act      728

Thr Val Met Thr Asn Thr Ala Gly Leu Ala Asn Thr Phe Val Gly Thr

215                 220                225                 230

tac aac tat atg tct cca gag agg atc gtt ggg aac aag tac ggt aac      776

Tyr Asn Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Val Gly Asn Lys Tyr Gly Asn

                235                240                 245

aaa agc gat ata tgg agc ttg gga tta gta gtg ctt gaa tgt gca aca      824

Lys Ser Asp Ile Trp Ser Leu Gly Leu Val Val Leu Glu Cys Ala Thr

            250                255                 260

ggg aag ttc cca tat ttg cca cca gat gaa gag gaa aca tgg agc agt      872

Gly Lys Phe Pro Tyr Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Thr Trp Ser Ser

        265                270                 275

gct ttc gag ttg atg gaa gca atc gtg gac caa cca cca cca act ctt      920

Ala Phe Glu Leu Met Glu Ala Ile Val Asp Gln Pro Pro Pro Thr Leu

    280                 285                290

cct tca gaa agc ttc tcc cct gag tta tct tca ttc atc tcc act tgt      968

Pro Ser Glu Ser Phe Ser Pro Glu Leu Ser Ser Phe Ile Ser Thr Cys

295                 300                305                 310

ttg caa agg acc caa aca gtc gaa gct ctg cta ggg aac taatggaaca      1017

Leu Gln Arg Thr Gln Thr Val Glu Ala Leu Leu Gly Asn

                315                320

tcctttcgtg aagaaatacg acaacaactc ggagatcaac ctcgcgtcac actttacaaa   1077

tgcagggtct ccgcttgcaa cgcttaagaa tctgtctggt acattctccg tttaagctct   1137

ccagggagac aaatagtatc ttcatcatct ggtggttact gttatcttct gaggtttctt   1197

tgtctttaac ttccagttaa ataaatgatc ttaatcatct actatatata tatatatata   1257

tatttgtatt gttgctgtat tttgataata tgagctacat gagagtcctt attcagtttt   1317

atttttttat tttccactcg gagctctcat aagtgagata ctttggattg gaatgttatg   1377

ttgaaaaaga agattcatta ttttattagt gtttttttct tcaaaaaaaa aaaaaaaa     1435

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>2

Met Lys Lys Gly Gly Phe Ser Asn Asn Leu Lys Phe Ser Ile Pro Pro

1               5                   10                  15

Ala Gly Glu Gln Ser Ile Thr Lys Phe Leu Thr Gln Ser Gly Thr Phe

            20                  25                  30

Lys Asp Gly Asp Leu Arg Val Asn Lys Asp Gly Val Arg Ile Val Ser

        35                  40                  45

Gln Ser Glu Pro Glu Ala Leu Ser Pro Ile Lys Pro Ala Asp Asp Lys

    50                  55                  60

Leu Gly Leu Ser Asp Leu Asp Met Val Lys Phe Val Gly Lys Gly Ser

65                  70                  75                  80

Ser Gly Val Val Gln Leu Val Gln His Lys Trp Thr Gly Gln Phe Phe

                85                  90                  95

Ala Leu Lys Val Ile Gln Leu Asn Val Asp Glu Ala Ile Arg Lys Ser

            100                 105                110

Ile Ala Gln Glu Leu Lys Ile Asn Gln Ser Ser Gln Cys Pro Tyr Leu

        115                 120                 125

Val Thr Ser Tyr Gln Ser Phe Tyr Asp Asn Gly Ala Ile Ser Leu Ile

    130                 135                 140

Leu Glu Tyr Met Asp Gly Gly Ser Leu Glu Asp Phe Leu Lys Ser Val

145                 150                 155                 160

Lys Thr Ile Pro Glu Ser Tyr Leu Ser Thr Ile Phe Lys Gln Val Leu

                165                 170                 175

Gln Gly Leu Ile Tyr Leu His His Asp Lys His Ile Ile His Arg Asp

            180                 185                 190

Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val Asn His Arg Gly Glu Val Lys Ile

        195                 200                 205

Thr Asp Phe Gly Val Ser Thr Val Met Thr Asn Thr Ala Gly Leu Ala

    210                 215                 220

Asn Thr Phe Val Gly Thr Tyr Asn Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Val

225                 230                 235                 240

Gly Asn Lys Tyr Gly Asn Lys Ser Asp Ile Trp Ser Leu Gly Leu Val

                245                 250                 255

Val Leu Glu Cys Ala Thr Gly Lys Phe Pro Tyr Leu Pro Pro Asp Glu

            260                 265                 270

Glu Glu Thr Trp Ser Ser Ala Phe Glu Leu Met Glu Ala Ile Val Asp

        275                 280                 285

Gln Pro Pro Pro Thr Leu Pro Ser Glu Ser Phe Ser Pro Glu Leu Ser

    290                 295                 300

Ser Phe Ile Ser Thr Cys Leu Gln Arg Thr Gln Thr Val Glu Ala Leu

305               310             315               320

Leu Gly Asn

Claims (6)

1、一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnMKK1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列杂交。

2、根据权利要求1所述的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

3、根据权利要求1或2所述的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第39-1007位的核苷酸序列。

4、根据权利要求1所述的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征是，所述的甘蓝型油菜BnMKK1蛋白质活性的多肽，是分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶甘蓝型油菜MAPK类相关蛋白质多肽BnMKK1，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

5、根据权利要求1所述的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征是，所述的DNA分子，它包含在所提供的一种载体，该载体是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

6、根据权利要求1或5所述的甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白编码序列，其特征是，用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。