CN1232530C - 小麦乙烯受体蛋白及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的乙烯受体蛋白-小麦乙烯受体蛋白，编码小麦乙烯受体蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种小麦乙烯受体蛋白的方法。本发明还公开了编码这种小麦乙烯受体蛋白的多核苷酸的用途，尤其是用于改变植物的成熟性。

Description

小麦乙烯受体蛋白及其编码序列

技术领域

本发明属于生物学领域，具体地说，本发明涉及新的小麦(Triticumaestivum)乙烯受体蛋白及其多核苷酸编码序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种与植物的熟性有关的、具有乙烯结合能力的乙烯受体蛋白。

背景技术

控制农作物熟性的因素十分复杂，有关控制作物热性的基因及其产物的研究历来是植物生长发育研究领域的热点课题。乙烯作为控制作物生长发育的五大植物激素之一，是作物成熟和衰老过程中最主要的调节因子，乙烯信号启动了作物体内一系列与控制熟性有关的基因表达和酶系反应。

乙烯受体蛋白是乙烯生物合成和乙烯信号传递途径中的一个关键的信号传递因子，广泛存在于各类农作物、瓜果蔬菜及花卉中，决定乙烯的生物合成以及植物对乙烯的敏感能力，并控制植物成熟和衰老的进程。

首例乙烯受体蛋白编码基因基因etr1于1993年从模式植物拟南芥中克隆到，其后采用etr1基因片段作为探针，在不足6年的时间内从马铃薯、苹果、香蕉和番茄等近30种作物的cDNA库中，成功地克隆了与拟南芥乙烯受体蛋白编码基因在功能和结构上同源的熟性相关基因。国外已从数十种作物、蔬菜、水果和花卉中克隆到与熟性相关的乙烯受体蛋白编码基因，但目前尚无小麦乙烯受体基因克隆的相关研究报道。

植物乙烯感应机制及其相关基因在结构和功能上高度保守性，这种保守性使乙烯受体蛋白在调节各类植物乙烯生物合成和乙烯信号传导中具有广泛的生物学功能，该蛋白结构上的变异、甚至是某个氨基酸残基的点突变，均会导致转基因植株在叶片脱离、花期延迟或果实成熟等性状的变化，这在拟南芥、烟草、石竹等植物的转基因植株构建上均有成功的例子。

与熟性相关的乙烯受体蛋白编码基因在植物叶片脱落和果实成熟中起着重要的作用，其突变导致属主植物熟性改变。拟南芥乙烯受体蛋白的显性突变等位基因etr1-1在转基因的香石竹中异源表达，使异源属主获得乙烯不敏感特性，从而导致熟性的变异。大约一半的转基因植株与对照比较花的衰败平均至少延迟了6天，延迟期最长达16天。转基因花不表现花瓣内卷曲的典型的乙烯依赖性衰败现象，转基因植株的花瓣始终保持坚挺，直至逐步褪色和腐烂。

为了有效地、针对性地改变植物品种的成熟性(如花期延长或果实成熟延缓)，本领域迫切需要开发与成熟性有关的蛋白及其编码基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的乙烯受体蛋白(即小麦乙烯受体蛋白)及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在改变植物成熟性(如花期延长或果实成熟延缓)方面的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的小麦乙烯受体蛋白多肽，该多肽源自小麦，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯结合功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述小麦乙烯受体蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-2223位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-2226位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有小麦乙烯受体蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达小麦乙烯受体蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有小麦乙烯受体蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的小麦乙烯受体蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2226个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗小麦乙烯受体蛋白多肽活性的化合物，以及抑制小麦乙烯受体蛋白多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在小麦乙烯受体蛋白的方法，它包括：将样品与小麦乙烯受体蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在小麦乙烯受体蛋白。

在本发明的第八方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进小麦乙烯受体蛋白多肽活性的激动剂，或者筛选抑制小麦乙烯受体蛋白多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的小麦乙烯受体蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第九方面，提供了一种改变植物成熟性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列，所述的小麦乙烯受体蛋白多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯结合功能的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从小麦中分离获得了新的乙烯受体蛋白，发现其与其他物种中分离的乙烯受体蛋白有一定同源性，并且通过实验证实了小麦乙烯受体蛋白具有乙烯结合能力，并且转入植物后，可导致植物熟性的变化。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“小麦乙烯受体蛋白”、“小麦乙烯受体蛋白多肽”或可互换使用，都指具有小麦乙烯受体蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的小麦乙烯受体蛋白或多肽”是指小麦乙烯受体蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化小麦乙烯受体蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括小麦乙烯受体蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然小麦乙烯受体蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“小麦乙烯受体蛋白多肽”指具有小麦乙烯受体蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与小麦乙烯受体蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括小麦乙烯受体蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与小麦乙烯受体蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗小麦乙烯受体蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含小麦乙烯受体蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了小麦乙烯受体蛋白多肽的可溶性片段。通常，该片段具有小麦乙烯受体蛋白多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供小麦乙烯受体蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然小麦乙烯受体蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“小麦乙烯受体蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列：成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码小麦乙烯受体蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的小麦乙烯受体蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或小麦乙烯受体蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的小麦乙烯受体蛋白多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码小麦乙烯受体蛋白多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，小麦乙烯受体蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含小麦乙烯受体蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得成熟性改变(如花期延长或果实成熟延缓)的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的小麦乙烯受体蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗小麦乙烯受体蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组小麦乙烯受体蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激小麦乙烯受体蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对小麦乙烯受体蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与小麦乙烯受体蛋白基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制小麦乙烯受体蛋白的分子，也包括那些并不影响小麦乙烯受体蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的小麦乙烯受体蛋白基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的小麦乙烯受体蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达小麦乙烯受体蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用小麦乙烯受体蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与小麦乙烯受体蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗小麦乙烯受体蛋白的抗体可用于检测样品中的小麦乙烯受体蛋白。

多克隆抗体的生产可用小麦乙烯受体蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测小麦乙烯受体蛋白水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的小麦乙烯受体蛋白水平，可用于解释小麦乙烯受体蛋白在成熟性方面重要性。

一种检测检测样品中是否存在小麦乙烯受体蛋白的方法是利用小麦乙烯受体蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与小麦乙烯受体蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在小麦乙烯受体蛋白。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用小麦乙烯受体蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测小麦乙烯受体蛋白的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从小麦cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2226个碱基，其开放读框位于1-2223位，编码全长为741个氨基酸的小麦乙烯受体蛋白(SEQ IDNO：2)。小麦乙烯受体蛋白具有明确的结合乙烯的功能，但结合能力比见报道的拟南芥野生型ETR1低10倍，显示其较强的延迟花期或果实成熟能力。此外，小麦乙烯受体蛋白在核酸水平上与已见报道的乙烯受体基因的最高同源性为64.2％，最低为43.3％，在氨基酸水平上的同源性最高为56.4％，最低为39.8％，是一个能用于构建延迟花期或果实成熟的转基因花卉、果蔬等转基因植物的新基因。

小麦乙烯受体蛋白为改变植物的成熟性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过与熟性相关的基因如乙烯受体蛋白编码基因的导入，改变现有优良农作物品种的熟性，获得转基因早熟小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。

转乙烯受体蛋白编码基因植株通过改变或打乱宿主植物的乙烯信号传递的遗传控制机理，使转基因植株获得乙烯敏感或不敏感特性，在熟性上表现出早熟或晚熟等变异。这一技术路线完全不仅在研究思路和构建途径上有创新性，而且还具有更强的可操作性和更高的成功率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

小麦乙烯受体蛋白基因的克隆

使用Qiagen公司的mRNA Isolation Kit按公司提供的试剂盒操作说明书分离纯化小麦的mRNA。使用Promega公司的Universal Riblone cDNASynthesis System，以上述分离的mRNA为模板，逆转录合成cDNA。选用λgt11噬菌体载体(Promega)，与加EcoRI接头的cDNA连接成重组体，然后包装铺板。噬菌斑密度大约为15000pfu/Φ150mm平板，噬菌体DNA转移至尼龙膜。采用随机引物法标记拟南芥、水稻和烟草乙烯受体基因DNA为探针，65℃杂交20-24小时。根据杂交结果挑取阳性噬菌斑，共获得10个阻性噬菌斑。

经酶切和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整小麦的乙烯受体蛋白ETR1基因。经全核苷酸序列分析结果表明：小麦乙烯受体蛋白编码基因全长为2226bp(SEQ ID NO：1)，其ORF位于1-2223位，编码全长为741个氨基酸的小麦乙烯受体蛋白，其序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2

RT-PCR法获得小麦乙烯受体蛋白的编码序列

为了验证序列的正确性，根据SEQ ID NO：1的序列，设计和合成了如下引物：

正向引物5’-3’27    ATGGGACCCGGATCAGTTG(SEQ ID NO：3)

反向引物5’-3’2190  TTGATTCCAGCTTTGCAAGG(SEQ ID NO：4)

以用常规方法抽提的小麦Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，回收，连接到T-Easy载体上采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果结果验证了小麦乙烯受体蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO：1)的正确性。

实施例3

小麦乙烯受体蛋白的结构分析

将小麦乙烯受体蛋白全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL +DDBJ +PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations +PDB +SwissProt +Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现小麦乙烯受体蛋白及其编码基因与已报道的下列物种的乙烯受体蛋白有一定同源性：在核苷酸水平上，与拟南芥、水稻和烟草的乙烯受体蛋白基因的同源性分别为43.3％，46.6％、64.2％；在氨基酸水平上，与拟南芥、水稻和烟草的乙烯受体蛋白的同源性分别为48.2％、39.8％、56.4％。

此外，小麦乙烯受体蛋白基因在SEQ ID NO：1的187-210位处含保守的乙烯结合位点的典型结构：tttatagttctttgtggagcaaca(SEQ ID NO：5)，相应的氨基酸残基为SEQ ID NO：2中的63-70位FIVLCGAT(SEQ ID NO：6)。这暗示本发明蛋白具有乙烯受体蛋白的相应功能。

实施例4

小麦乙烯受体蛋白的点突变

据报道，拟南芥乙烯受体蛋白的显性突变等位基因etr1-1当氨基酸序列中65位半胱氨酸残基(Cys⁶⁵)点突变为酪氨酸(Tyr)或丝氨酸残基(Ser)后突变蛋白不能结合乙烯，在转基因的香石竹中异源表达，使异源属主获得乙烯不敏感特性，从而导致熟性的变异。大约一半的转基因植株与对照比较花的衰败平均至少延迟了6天，延迟期最长达16天。

在本实施例中，在分析小麦乙烯受体蛋白序列的基础上，在需要突变的部位设计引物ttttatcgttctttatggagcaa(SEQ ID NO：7)，使用TaKaRa MutanBEST Kit，以实施例2中获得的PCR产物为模板，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2中第67位半胱氨酸残基(tgt)Cys⁶⁷点突变为酪氨酸Tyr⁶⁷(tat)的突变等位基因etrw02(即SEQ ID NO：1中第200位g→a)。

采用BioDev PCR产物快速纯化回收试剂盒并应用Promega pGEM-T EasyVector Systems对PCR产物进行克隆，连接产物通过转化进入到E.coli DH5α中，然后在含Ap(50μg/ml)/IPTG/X-gal的LB平板上选择白斑。经核苷酸序列分析证明67位半胱氨酸残基(tgt)确实已点突变为酪氨酸(tat)。将该点突变的基因定名为小麦乙烯受体基因突变体etrw02。

实施例5

小麦乙烯受体蛋白及其突变体etrw02在酵母菌中表达及其乙烯结合能力

本实施例中，使用中间过渡载体—转运载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)。pPIC9质粒由两区段组成，一区段来源于常用的大肠杆菌克隆载体pBR322，包括复制起始区(ori)和氨苄青霉素抗性基因片断；另一区段来源于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)染色体上的酒精氧化酶基因片段的表达盒，主要结构如下：酒精氧化酶基因的5’旁侧序列—酒精氧化酶基因启动子—酒精氧化酶基因终止区-3’旁侧序列。外源植酸酶基因插入到酒精氧化酶基因启动子之后。

将实施例2获得的小麦乙烯受体基因，实施例4获得的突变体ETRW02基因和拟南芥野生型etr1基因插入到转运载体pPIC9的多克隆位点上(EcoRI酶切位点)，与a-因子信号肽编码序列正确融合，受可诱导的酵母酒精氧化酶AOX1启动子控制，得到重组转运载体pPETRW01(小麦野生型)、pPETRW02(小麦突变体)和pPETRA01(拟南芥野生型)。

以pPETRW02为例，在重组毕赤酵母的构建过程中，首先要将重组转运载体pPETRW02中的来源大肠杆菌的DNA部分用限制性内切酶BglII切去，用剩下的DNA部分电击转化毕赤酵母，通过其上的酒精氧化酶基因的3’旁侧序列和5’旁侧序列与酵母染色体上的同源序列进行同源重组，将位于酒精氧化酶基因的3’旁侧序列和5’旁侧序列之间的植酸酶基因双交换整合到酵母染色体上，并替换下染色体上的酒精氧化酶基因，使酵母由能利用甲醇为碳源生长变为不能利用甲醇生长，利用此标记初步筛选到重组酵母(mut^-)，进一步通过受体酵母为His缺陷型而重组后将变为非缺陷型这一标记，最终筛选到重组酵母P.pastorispPETRW02。

按相同方法，获得重组酵母pPETRW01和pPETRA01(对应于小麦乙烯受体蛋白和拟南芥的etr1)。

采用¹⁴C标记乙烯利(购自Sigma公司)，研究小麦乙烯受体基因及其突变体ETRW02在酵母菌中的乙烯结合功能。

结果表明，含拟南芥野生型ETR1的酵母菌的乙烯结合能力为5700±210 ¹⁴C₂H₄dpm/mg，含小麦的ETR1的酵母菌的乙烯结合能力为1456±133 ¹⁴C₂H₄ dpm/mg，而65位半胱氨酸被取代的突变体ETRW02的乙烯结合能力为580±105¹⁴C₂H₄ dpm/mg。小麦的ETR1的乙烯结合能力比拟南芥野生型ETR1低约4倍，而小麦ETR1突变体乙烯结合能力比拟南芥野生型ETR1低10倍。

实施例6

小麦乙烯受体蛋白基因突变体etrw02的植物表达载体

在本实施例中，将etrw02中BamH1/EcoR1片段克隆到pUC衍生质粒pAB80(p35s-gusA-Tnos)(购自Stratagene公司)上，替代gusA基因，使etrw02基因被控制在CaMV 35s启动子(全植株表达)之下。具体步骤如下：

1.用PCR引物AB33和AB34扩增得到etrw02 5’端3.1kb片段。扩增产物用BamH1/EcoR1酶切，将酶切片段连接到用同样双酶切的pAB80质粒上，得质粒pBWE-2。

AB33上游引物(-440 to-417)5’端含有BamH1酶切位点：

5’-CCCGGATCCTCTTCTCCGATCAATTCTTCCC-3’(SEQ ID NO：8)

AB34下游引物(+2657 to +2638)，5’端含有EcoR1酶切位点：

5’-CCGGAATTCGCCTTTACATGCCCTCG-3’(SEQ ID NO：9)

2.用PCR引物AB35和AB36扩增得到etrw02 3’端3.9kb。扩增产物经EcoR1酶切后连接到同样用EcoR1酶切的pBWE-2质粒上。这样克隆有正确表达方向的质粒称谓pBWE22。

AB35上游引物(+2638 to +2657)，3’端含有EcoR1酶切位点：

5’-CGAGGGCATGTAAAGGCGAATTCCGG-3’(SEQ ID NO：10)

AB36下游引物(+5659 to +2640)，5’端含有EcoR1酶切位点：

5’-CCGGAATTGGTCTAAACAACGCCAAG-3’(SEQ ID NO：11)

3.pBWE22上的SalI/ClaI片段(含完整的突变体基因etrw02，其表达由CaMV 35s启动子控制)插入到二元载体pAB2(Stratagene公司)中，得到质粒pBWE220。

按相同方法，获得含完整的野生型基因etrw01，其表达由CaMV 35s启动子控制的质粒pBWE110。

实施例7

花期延长的转基因香石竹的构建

将二元载体pBWE220分别利用三亲结合方法从E.coli中转到Agrobacteriumtumefaciens AGLO(购自Stratagene公司)，助质粒为pRK2013(购自Stratagene公司)。而后用Agrobacterium tumefaciens转染香石竹叶片。在、待分化培养基上长出分化芽后，转入生根培养基诱导生根。一周后于温室培养共得到12株经Southern和Northern杂交证明确实含有小麦etrw02(67位半胱氨酸被酪氨酸取代的突变体)基因片段的转基因植株。

转基因植株的花期与非转基因植株比较，大约一半的转基因植株与对照比较花的衰败平均至少延迟了8天，延迟期最长达20天。转基因花不表现花瓣内卷曲的典型的乙烯依赖性衰败现象，转基因植株的花瓣始终保持坚挺，直至逐步褪色和腐烂。

按相同方法，使用质粒pBWE110将野生型的小麦乙烯受体蛋白基因转入香石竹，获得转基因的植株，结果大约三分之一的转基因植株与对照比较花的衰败平均至少延迟了4天，延迟期最长达10天。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                序列表

<110>中国农业科学院原子能利用研究所

<120>小麦乙烯受体蛋白及其编码序列

<130>025278

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2226

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2223)

<223>

<400>1

atg gat tgt aaa ggc ttt gtt ccc caa tgg gac ccg gat cag ttg tta    48

Met Asp Cys Lys Gly Phe Val Pro Gln Trp Asp Pro Asp Gln Leu Leu

1               5                   10                  15

atc aaa tta acg tat acc tcc ata ttc ttt att gca tgg gcc ata cct    96

Ile Lys Leu Thr Tyr Thr Ser Ile Phe Phe Ile Ala Trp Ala Ile Pro

            20                  25                  30

ccc arc cat att agg ggt gaa ttc ttc gtt act aag gtc gct ttt aaa    144

Pro Ile His Ile Arg Gly Glu Phe Phe Val Thr Lys Val Ala Phe Lys

        35                  40                  45

ttt cca tat aaa agc tgg gta ctc gtc gtg cag ttt ggt gct ttt ata    192

Phe Pro Tyr Lys Ser Trp Val Leu Val Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile

    50                  55                  60

gtt ctt tgt gga gca aca cat ctt atc aac ttg tgg act ctc acc ccc    240

Val Leu Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Leu Thr Pro

65                  70                  75                  80

cat aca agg act gtg gcg ata gtg aaa cca aac gca tta gtc ttg act    288

His Thr Arg Thr Val Ala Ile Val Lys Pro Ash Ala Leu Val Leu Thr

                85                  90                  95

gct gta gtg tcc tgt gca acg gct aaa ata ctc ttt cac atc atc cca    336

Ala Val Val Ser Cys Ala Thr Ala Lys Ile Leu Phe His Ile Ile Pro

            100                 105                 110

gac cta agt gta gtc ccc acc agg aga tca ttt gtg caa aaa caa gcg    384

Asp Leu Ser Val Val Pro Thr Arg Arg Ser Phe Val Gln Lys Gln Ala

        115                 120                 125

gca aga tcc agt gct gaa atg ttt tct aaa gcg caa caa gaa aag tac    432

Ala Arg Ser Ser Ala Glu Met Phe Ser Lys Ala Gln Gln Glu Lys Tyr

    130                 135                 140

aca ata ggg ttt cga ccg cta acc cag acc aaa atc aat act tcc aaa    480

Thr Ile Gly Phe Arg Pro Leu Thr Gln Thr Lys Ile Asn Thr Ser Lys

145                 150                 155                 160

cga atc caa atg ttg ccc act ggg ttt tgg aag cta ggg aga cac ggt    528

Arg Ile Gln Met Leu Pro Thr Gly Phe Trp Lys Leu Gly Arg His Gly

                165                 170                 175

gca cta caa gaa tgc gcc tta tgg ata aaa act aac ccc ggg ccc agt    576

Ala Leu Gln Glu Cys Ala Leu Trp Ile Lys Thr Asn Pro Gly Pro Ser

            180                 185                 190

ctc ccc att tct cac aaa ata tgt caa cat aag ccc caa aag ttt act    624

Leu Pro Ile Ser His Lys Ile Cys Gln His Lys Pro Gln Lys Phe Thr

        195                 200                 205

ata ccc ccc cat ttt cct agt caa aat aca gtc ttg gtt acg ttt cgt    672

Ile Pro Pro His Phe Pro Ser Gln Asn Thr Val Leu Val Thr Phe Arg

    210                 215                 220

gtc tgg aaa gtg tct aac aaa ctc ccg gtg aac gaa ctc cgg aaa gct    720

Val Trp Lys Val Ser Asn Lys Leu Pro Val Asn Glu Leu Arg Lys Ala

225                 230                 235                 240

ggg aag tac atg cca ggt gag gtg gtt gct gtc agg gtc ccc ctt ctg    768

Gly Lys Tyr Met Pro Gly Glu Val Val Ala Val Arg Val Pro Leu Leu

                245                 250                 255

cat ctc tca aac ttc cac ata aat gat tgg cct gaa ctc tcg aca aag    816

His Leu Ser Asn Phe His Ile Asn Asp Trp Pro Glu Leu Ser Thr Lys

        260                 265                 270

cgt tat gcc tta ata gtt atg gtg ctc act tct ggc gta gca aga caa    864

Arg Tyr Ala Leu Ile Val Met Val Leu Thr Ser Gly Val Ala Arg Gln

    275                 280                 285

gtt cac gtc cat gaa ttg atg ctc gtt acc gta gtg tgc cga tca gtg    912

Val His Val His Glu Leu Met Leu Val Thr Val Val Cys Arg Ser Val

    290                 295                 300

agc tct tgg aat ctc aca atc tgc cgt ctg gag gaa tca atg agg gct    960

Ser Ser Trp Asn Leu Thr Ile Cys Arg Leu Glu Glu Ser Met Arg Ala

305                 310                 315                 320

aga gac ccc att cta gaa cag cga gta gcc ctt gat aaa gcg agg ccc    1008

Arg Asp Pro Ile Leu Glu Gln Arg Val Ala Leu Asp Lys Ala Arg Pro

                325                 330                 335

gag gcg gtt gaa ctg tgg aaa gcg cgc aat gac cct ctg ttt gcc aaa    1056

Glu Ala Val Glu Leu Trp Lys Ala Arg Asn Asp Pro Leu Phe Ala Lys

            340                 345                 350

cat cat agg ttt agg act ttc cgt ccc cat tat atc agc acc tcg ctc    1104

His His Arg Phe Arg Thr Phe Arg Pro His Tyr Ile Ser Thr Ser Leu

        355                 360                 365

ggt aac acc ttt acc gaa ctg cac tta agg caa acc ctg atg gtg gaa    1152

Gly Asn Thr Phe Thr Glu Leu His Leu Arg Gln Thr Leu Met Val Glu

    370                 375                 380

aca atc ctt aaa ttt agt aac ctt tta gca cac tct atc tta gat gtc    1200

Thr Ile Leu Lys Phe Ser Asn Leu Leu Ala His Ser Ile Leu Asp Val

385                 390                 395                 400

gtt gac cct tca gaa tcc gaa gat gga agc ctc ctt ctt aaa cgt tgg    1248

Val Asp Pro Ser Glu Ser Glu Asp Gly Ser Leu Leu Leu Lys Arg Trp

                405                 410                 415

gac ttt caa tct cac gtt ctc ttc agg gaa gtc ctc aac tta ttc ttt    1296

Asp Phe Gln Ser His Val Leu Phe Arg Glu Val Leu Asn Leu Phe Phe

            420                 425                 430

cct att gcg tct gtg tta aac tgt atg tct cgc ctg act tgt ctt acc    1344

Pro Ile Ala Ser Val Leu Asn Cys Met Ser Arg Leu Thr Cys Leu Thr

        435                 440                 445

atc aac ccg gaa ttt gct atc gga gat agg ccc ttt cta atg caa att    1392

Ile Asn Pro Glu Phe Ala Ile Gly Asp Arg Pro Phe Leu Met Gln Ile

    450                 455                 460

ctt tta aat gtt gtt ggc aat gct gta aaa ttt tca aaa gaa ggc agt    1440

Leu Leu Asn Val Val Gly Asn Ala Val Lys Phe Ser Lys Glu Gly Ser

465                 470                 475                 480

gta tcg aaa tct ctg gtt gct acc ccc tcg acc tcc ttg agc gat cct    1488

Val Ser Lys Ser Leu Val Ala Thr Pro Ser Thr Ser Leu Ser Asp Pro

                485                 490                 495

aga gct acc aag ttc tcc ccc gta caa agt gaa aac cat ttt ata aat    1536

Arg Ala Thr Lys Phe Ser Pro Val Gln Ser Glu Asn His Phe Ile Asn

            500                 505                 510

cgc gtg cag gtg aag gac cac att tcg ggt atc aat cca caa gac att    1584

Arg Val Gln Val Lys Asp His Ile Ser Gly Ile Asn Pro Gln Asp Ile

        515                 520                 525

aaa aaa ctg ttt gtg aag aaa gca cac ccc cag aca cta gcg acc aaa    1632

Lys Lys Leu Phe Val Lys Lys Ala His Pro Gln Thr Leu Ala Thr Lys

    530                 535                 540

tta tcg ggt ggc acc gga ctc ggc cta gca att tcc aaa agg ttt gtt    1680

Leu Ser Gly Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Ser Lys Arg Phe Val

545                 550                 555                 560

aat ctt atg gaa ggt cat att tgg atc gaa agt gaa gga ctt ggc aag    1728

Asn Leu Met Glu Gly His Ile Trp Ile Glu Ser Glu Gly Leu Gly Lys

                565                 570                 575

ggg tct act gct att tta atc gtt ccc ctt ggc aaa ccc gga cgt tcg    1776

Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ile Val Pro Leu Gly Lys Pro Gly Arg Ser

            580                 585                 590

cct gag ttc gga ctt aaa ttc atg aaa cga atg cct agc tta cat ata    1824

Pro Glu Phe Gly Leu Lys Phe Met Lys Arg Met Pro Ser Leu His Ile

        595                 600                 605

ggc ttt act aaa ctt tca aaa ttg gtt aac caa tcc ata ccc cca ggg    1872

Gly Phe Thr Lys Leu Ser Lys Leu Val Asn Gln Ser Ile Pro Pro Gly

    610                 615                 620

aat ctg agc ata gtg act aaa ggc cta ctg gta cat cta aaa tgt gac    1920

Asn Leu Ser Ile Val Thr Lys Gly Leu Leu Val His Leu Lys Cys Asp

625                 630                 635                 640

gtg acg acc gtc agt tcc ggc gac gaa tgt aag aaa gtt ctt acc caa    1968

Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Asp Glu Cys Lys Lys Val Leu Thr Gln

                645                 650                 655

gag cat ccc gtg acc cct tac aga cgt aag cat acc gga tac agg ctg    2016

Glu His Pro Val Thr Pro Tyr Arg Arg Lys His Thr Gly Tyr Arg Leu

            660                 665                 670

aat aga ccc acg tgc gcg aat aca cga aaa gtt tgg gaa aca tca caa    2064

Asn Arg Pro Thr Cys Ala Asn Thr Arg Lys Val Trp Glu Thr Ser Gln

        675                 680                 685

cag gcc act tat tgt ggc act aac agg aaa cac aaa acg gtc caa aag    2112

Gln Ala Thr Tyr Cys Gly Thr Asn Arg Lys His Lys Thr Val Gln Lys

    690                 695                 700

ccc cat tgg tta ccg tac ggc ata gac gac att cac caa ccc aaa gcc    2160

Pro His Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Asp Asp Ile His Gln Pro Lys Ala

705                 710                 715                 720

caa att acc acc ttg caa agc tgg aat caa gaa ctc ttg gaa act caa    2208

Gln Ile Thr Thr Leu Gln Ser Trp Asn Gln Glu Leu Leu Glu Thr Gln

                725                 730                 735

gtt tcc aaa acc acc tag                                            2226

Val Ser Lys Thr Thr

            740

<210>2

<211>741

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum)

<400>2

Met Asp Cys Lys Gly Phe Val Pro Gln Trp Asp Pro Asp Gln Leu Leu

1               5                   10                  15

Ile Lys Leu Thr Tyr Thr Ser Ile Phe Phe Ile Ala Trp Ala Ile Pro

            20                  25                  30

Pro Ile His Ile Arg Gly Glu Phe Phe Val Thr Lys Val Ala Phe Lys

        35                  40                  45

Phe Pro Tyr Lys Ser Trp Val Leu Val Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile

    50                  55                  60

Val Leu Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Leu Thr Pro

65                  70                  75                  80

His Thr Arg Thr Val Ala Ile Val Lys Pro Asn Ala Leu Val Leu Thr

                85                  90                  95

Ala Val Val Ser Cys Ala Thr Ala Lys Ile Leu Phe His Ile Ile Pro

            100                 105                 110

Asp Leu Ser Val Val Pro Thr Arg Arg Ser Phe Val Gln Lys Gln Ala

        115                 120                 125

Ala Arg Ser Ser Ala Glu Met Phe Ser Lys Ala Gln Gln Glu Lys Tyr

    130                 135                 140

Thr Ile Gly Phe Arg Pro Leu Thr Gln Thr Lys Ile Asn Thr Ser Lys

145                 150                 155                 160

Arg Ile Gln Met Leu Pro Thr Gly Phe Trp Lys Leu Gly Arg His Gly

                165                 170                 175

Ala Leu Gln Glu Cys Ala Leu Trp Ile Lys Thr Asn Pro Gly Pro Ser

            180                 185                 190

Leu Pro Ile Ser His Lys Ile Cys Gln His Lys Pro Gln Lys Phe Thr

        195                 200                 205

Ile Pro Pro His Phe Pro Ser Gln Asn Thr Val Leu Val Thr Phe Arg

    210                 215                 220

Val Trp Lys Val Ser Asn Lys Leu Pro Val Asn Glu Leu Arg Lys Ala

225                 230                 235                 240

Gly Lys Tyr Met Pro Gly Glu Val Val Ala Val Arg Val Pro Leu Leu

                245                 250                 255

His Leu Ser Asn Phe His Ile Asn Asp Trp Pro Glu Leu Ser Thr Lys

            260                 265                 270

Arg Tyr Ala Leu Ile Val Met Val Leu Thr Ser Gly Val Ala Arg Gln

        275                 280                 285

Val His Val His Glu Leu Met Leu Val Thr Val Val Cys Arg Ser Val

    290                 295                 300

Ser Ser Trp Asn Leu Thr Ile Cys Arg Leu Glu Glu Ser Met Arg Ala

305                 310                 315                 320

Arg Asp Pro Ile Leu Glu Gln Arg Val Ala Leu Asp Lys Ala Arg Pro

                325                 330                 335

Glu Ala Val Glu Leu Trp Lys Ala Arg Asn Asp Pro Leu Phe Ala Lys

            340                 345                 350

His His Arg Phe Arg Thr Phe Arg Pro His Tyr Ile Ser Thr Ser Leu

        355                 360                 365

Gly Asn Thr Phe Thr Glu Leu His Leu Arg Gln Thr Leu Met Val Glu

    370                 375                 380

Thr Ile Leu Lys Phe Ser Asn Leu Leu Ala His Ser Ile Leu Asp Val

385                 390                 395                 400

Val Asp Pro Ser Glu Ser Glu Asp Gly Ser Leu Leu Leu Lys Arg Trp

                405                 410                 415

Asp Phe Gln Ser His Val Leu Phe Arg Glu Val Leu Asn Leu Phe Phe

            420                 425                 430

Pro Ile Ala Ser Val Leu Asn Cys Met Ser Arg Leu Thr Cys Leu Thr

        435                 440                 445

Ile Asn Pro Glu Phe Ala Ile Gly Asp Arg Pro Phe Leu Met Gln Ile

    450                 455                 460

Leu Leu Asn Val Val Gly Asn Ala Val Lys Phe Ser Lys Glu Gly Ser

465                 470                 475                 480

Val Ser Lys Ser Leu Val Ala Thr Pro Ser Thr Ser Leu Ser Asp Pro

                485                 490                 495

Arg Ala Thr Lys Phe Ser Pro Val Gln Ser Glu Asn His Phe Ile Asn

            500                 505                 510

Arg Val Gln Val Lys Asp His Ile Ser Gly Ile Asn Pro Gln Asp Ile

        515                 520                 525

Lys Lys Leu Phe Val Lys Lys Ala His Pro Gln Thr Leu Ala Thr Lys

    530                 535                 540

Leu Ser Gly Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Ser Lys Arg Phe Val

545                 550                 555                 560

Asn Leu Met Glu Gly His Ile Trp Ile Glu Ser Glu Gly Leu Gly Lys

                565                 570                 575

Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ile Val Pro Leu Gly Lys Pro Gly Arg Ser

            580                 585                 590

Pro Glu Phe Gly Leu Lys Phe Met Lys Arg Met Pro Ser Leu His Ile

        595                 600                 605

Gly Phe Thr Lys Leu Ser Lys Leu Val Asn Gln Ser Ile Pro Pro Gly

    610                 615                 620

Asn Leu Ser Ile Val Thr Lys Gly Leu Leu Val His Leu Lys Cys Asp

625                 630                 635                 640

Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Asp Glu Cys Lys Lys Val Leu Thr Gln

                645                 650                 655

Glu His Pro Val Thr Pro Tyr Arg Arg Lys His Thr Gly Tyr Arg Leu

            660                 665                 670

Asn Arg Pro Thr Cys Ala Asn Thr Arg Lys Val Trp Glu Thr Ser Gln

        675                 680                 685

Gln Ala Thr Tyr Cys Gly Thr Asn Arg Lys His Lys Thr Val Gln Lys

    690                 695                 700

Pro His Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Asp Asp Ile His Gln Pro Lys Ala

705                 710                 715                 720

Gln Ile Thr Thr Leu Gln Ser Trp Asn Gln Glu Leu Leu Glu Thr Gln

                 725                 730                 735

Val Ser Lys Thr Thr

            740

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

atgggacccg gatcagttg                                                 19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ttgattccag ctttgcaagg                                               20

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum)

<400>5

tttatagttc tttgtggagc aaca                                          24

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum)

<400>6

Phe Ile Val Leu Cys Gly Ala Thr

1               5

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ttttatcgtt ctttatggag caa                                            23

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cccggatcct cttctccgat caattcttcc c                                    31

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

ccggaattcg cctttacatg ccctcg                                          26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

cgagggcatg taaaggcgaa ttccgg                                          26

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

ccggaattgg tctaaacaac gccaag                                         26

Claims (10)

1.一种分离的小麦乙烯受体蛋白多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯结合功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽(b)是将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有乙烯结合功能的由(a)衍生的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-2223位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-2226位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种具有小麦乙烯受体蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达小麦乙烯受体蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有小麦乙烯受体蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的小麦乙烯受体蛋白特异性结合的抗体。

10.一种改变植物成熟性的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列，所述的小麦乙烯受体蛋白多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或

添加而形成的，且具有乙烯结合功能的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入小麦乙烯受体蛋白多肽DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。