CN1190492C - 棉花Na+/H+反向转运蛋白基因及其克隆方法和应用 - Google Patents

棉花Na+/H+反向转运蛋白基因及其克隆方法和应用 Download PDF

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CN1190492C CNB021515301A CN02151530A CN1190492C CN 1190492 C CN1190492 C CN 1190492C CN B021515301 A CNB021515301 A CN B021515301A CN 02151530 A CN02151530 A CN 02151530A CN 1190492 C CN1190492 C CN 1190492C
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Abstract

本发明涉及棉花中Na+/H+反向转运蛋白GhNHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。从0.4mol·L-1NaCl处理的棉花叶片中提取总RNA，反转录成cDNA。利用兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，得到中间片段，然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长cDNA。将该基因转入盐敏感酵母突变体，能在一定程度上恢复其抗盐能力。进一步利用该基因转化烟草，获得的转基因植株能在200mmol·L-1的盐浓度下正常生长。因此，该基因是一个重要的抗盐基因，可以用于转化盐敏感植物来提高其耐盐能力，对于盐敏感植物在盐碱地上的推广种植，具有非常重要的经济效益和社会效益。

Description

棉花Na+/H+反向转运蛋白基因及其克隆方法和应用
(一)技术领域
本发明涉及棉花中Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1的克隆、重组及耐盐性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
(二)背景技术
高浓度的盐引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢特别是降低农作物产量。严重的盐胁迫或渗透胁迫会引起植物体内的第二胁迫——氧化胁迫的发生，甚至导致植物死亡。因此，盐胁迫受到人们的广泛关注，提高作物的耐盐性亦愈来愈受到人们的重视。在高盐下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐胁迫造成的毒害。早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在质膜和液泡膜上的Na+/H+反向转运蛋白基因从许多植物中分离出来。研究结果表明质膜上的Na+/H+反向转运蛋白负责Na+的外排，从而保持植物细胞内低Na+水平。而液泡膜上的Na+/H+反向转运蛋白则负责Na+的液泡区域化，维持细胞内的离子均衡。这大大促进了耐盐基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。Blumwald等利用基因工程手段在番茄和油菜中过量表达Na+反向转运蛋白基因，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐植株，参见于张虹霞等人于2001年《自然生物技术》中的转基因抗盐番茄植株叶中积累盐而果实中不积累盐，19：765-768(Hong-Xia Zhang，Eduardo Blumwald，2001，Nature biotechnology，19：765-768)。
由于Na+/H+反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本发明人从棉花中分离编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na+/H+反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因。进一步构建正义表达载体，转化烟草，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
(三)发明内容
本发明首次从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的全长cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。
从棉花叶片中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+/H+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物：
正向引物：5′-CC(GATC)CC(GATC)AT(TAC)AT(TAC)TT(TC)AA(TC)GC-3′
反向引物：5′-GT(GATC)AC(GATC)TT(AG)TGCCA(GATC)GT(AG)TA-3′
进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，转化DH5α感受态细胞，涂平板，筛选阳性克隆，挑白斑摇菌，提取质粒，并进行酶切鉴定，之后进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长cDNA。具体的PCR试剂与条件为：
10×反应缓冲液                        5μl
25mM MgCl2                            4μl
10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)            1μl
正向引物(10μM)                       2μl
反向引物(10μM)                       2μl
模板cDNA                              1μl
Taq DNA聚合酶                         0.5μl
总体积                                50μl
PCR反应条件为：94℃5分钟，然后进入下列循环：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。
结果扩增到一个614bp的DNA片段。取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取白色菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。
经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为2485bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1629bp，由此推得具543个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的野滨藜、水稻和拟南芥的Na+/H+反向转运蛋白的氨基酸同源性分别为77.30％、72.74％和76.61％，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na+/H+反向转运蛋白的基因。该基因序列如下：
序列表
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度：2485碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：棉花
(f)序列描述：SEQ ID NO.1
ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT   60
TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT   120
CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT   180
CAAGCTCTCTCTTCGAATTTACTCGTCTCTTTGAAACTGTCCGTTTTTTTTTGGTTCAAT   240
AAAATCGCAAATTATTTGCTAATTTAGAGAAGAAAATTGAACGGAGCTGAAACAAGGATG   300
ATTTGTTGCTGCATGATGTTGATTCTCCAAAACGATTCGAGTGCTTAAGGATTTTAAGAT   360
TAGAAAGTTCTTGAAATGGACAGTTCAGAGGCATAAAAATTTTCGAAGATTTACATTGTT   420
GAAGGAGAGCTTAAATCTGAAGCCTTGGACTACAACTGTTTCAGTTAGAAGGAATTGGTG   480
TTTAATAAAATTTGATTTAAAAAGAGGTCAATATGGTGGCTCCGCAGTTAGCTGCTGTCT   540
TTACTAAGTTGCAGACACTATCTACTTCAGACCATGCGTCTGTGGTCTCCATGAACATAT   600
TTGTAGCGCTTCTTTGTGCTTGCATTGTGATTGGTCATCTTTTGGAGGAGAATAGATGGA   660
TGAACGAATCAATTACTGCCCTTATCATTGGTGTTTTTACTGGGGTCATTATTTTGTTGA   720
CAAGTGGGGGTAAAAGCTCTCATCTTTTAGTCTTCAGTGAAGATCTGTTCTTTATCTATC   780
TTCTGCCCCCTATTATATTCAATGCTGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCAATTTTTCCGTA   840
ACTTTATCACCATCATGCTGTTTGGGGCTGTTGGTACACTAATATCTTGTACAATTATCT   900
CTTTAGGTGTAATTAACTTCTTCAAGGAAATGGACATTGGCTCCTTAGACATTGGAGATT   960
TTCTAGCAATTGGTGCAATATTTGCTGCGACAGATTCTGTTTGCACACTGCAGGTGCTTA   1020
ATCAGGATGAGACTCCATTACTCTACAGTTTGGTTTTCGGAGAGGGTGTTGTAAATGATG   1080
CAACATCTGTGGTGCTTTTCAATGCAATCCAGAGTTTTGACCTCGTTAATACCAGTCCTA   1140
GAATTCTTCTGGAGTTTATTGGCAGCTTTTTGTATTTATTTTTAGCAAGCACTATGCTGG   1200
GAGTGATTGTTGGGTTGGTTAGTGCTTACATCATCAAAAAGTTGTACTTTGGAAGGCACT   1260
CAACAGATCGTGAATTTGCTCTTATGATGCTTATGGCATACCTTTCGTATATCATGGCTG   1320
AACTGTTCTATTTGAGTGGCATTCTTACAGTATTCTTTTGTGGGATTGTGATGTCACATT   1380
ATACCTGGCACAATGTAACTGAGAGTTCAAGAGTAACTACAAAGCATGCCTTTGCTACCT   1440
TGTCATTTGTTGCTGAGACTTTTCTCTTTCTTTATGTCGGGATGGATGCTTTGGACATGG   1500
AGAAGTGGAGATTTGTCAGTGATAGCCCTGGAACGTCAGTTGCTGTTAGTGCTGTGCTGA   1560
TGGGTCTTGTTATGGTTGGAAGAGCGGCTTTTGTGTTTCCCCTGTCATTTTTATCCAACT   1620
TGGCAAAGAAATCAACTAGTGAGAAAATCAGCTTCAGGGAACAAATTATAATATGGTGGG   1680
CTGGGCTCATGAGAGGCGCTGTATCTATGG CACTTGCATATAATCAGTTTACAAGGGGGG   1740
GCCATACTCAGTTGCGAGGAAATGCAATTATGATTACAAGCACCATAACCATTGTTCTAT   1800
TCAGCACTGTGGTTTTTGGTTTAATGACTAAACCTCTAATAAGGTTCTTGCTGCCTCATC   1860
CCAAACCAACAGCCAGCATGCTCTCAGACCAATCCACTCCAAAATCAATGGAGGCACCAT   1920
TTCTCGGAAGCGGCCAGGACTCTTTTGATGATAGTTTAATTGGAGTTCATCGACCAAACA   1880
GCATTCGTGCACTTCTTACAACTCCAGCACACACTGTTCATTACTATTGGCGAAAGTTTG   2040
ATAATGCCTTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGCCGGGGTTTTGTGCCCTTCGTTCCTGGCT   2100
CCCCAACAGAAAGGAGTGAACCTAATCTGCCTCAATGGCAATGAGGTGGTTGAACAAGAT   2160
CTCTACAAAAATGTACATGTAATATAACAATGCAGTCGGTTGCAAAAAACATGCTTCTGG   2220
CGAGAAGCCAGTGCGGTATGCTTTGTATGTTTCATGTATAGGCTATATTTTGTTGGTTTT   2280
CAAGTTTCCTCAAGAGGTTCTTGTTTATTCTCCCCGAAACTACCTTCGCACCTGATGCTA   2340
TCTTTCCATTTGACATTTACGAATATTTATGATCTGGGTGAAGCTTAGGGGTAGGTGTGC   2400
CATTCTATTTTGTACGTATACGAGTATTTATTTTGTGTTTATATCAGTGTGTTTAGTTTT   2460
TATTTTTATTAAAAAAAAAAAAAAA   2485
(2)SEQ ID NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：543氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIGVFTGVIILLTSGGKSSHLLV   81
FSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAVGTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAAT   161
DSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAY    241
IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHAFATLSFVAETFLFL   321
YVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMA   401
LAYNQFTRGGHTQLRGNAIMITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKFTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD   461
SLIGVHRPNSIRALLTTPAHYVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLPQWQ   543
根据上述序列，设计构建表达载体的引物：
正向引物：5′-ATGGTGGCTCCGCAGTTAGCT-3′
反向引物：5′-ACCTCATTGCCATTGAGGCAG-3′
以叶的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连接到pMD18-T载体上，进行测序鉴定。然后用XbaI和SalI切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105.
转化烟草，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在100mM、200mM和30mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能正常生长，具较高的耐盐能力。
转化酵母盐敏感突变株，在选择培养基上筛选转化子，将筛选出的阳性转化子在喊含1600mM氯化钠的选择培养基上培养。结果表明GhNHX1对酵母盐敏感突变株有补偿作用，转GhNHX1的酵母盐敏感突变株的耐盐能力大大增强。
根据上述技术，从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因GhNHX1，该基因过量表达能导致转基因烟草具较高的耐盐性。让该基因在棉花中表达，将会提高棉花的耐盐性；如果与特异启动子连接，对其表达进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益.
(四)附图说明
图1是野生型和转GhNHX1基因植株的光合速率的测定结果柱状图
横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示光合速率值；W代表野生型，T代表转基因植株。
图2是野生型和转基因植株的叶绿素含量的测定结果柱状图
横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示叶绿素含量；W代表野生型，T代表转基因植株。
图3是GhNHX1基因对酵母盐敏感突变体的补偿作用图
横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示600nm处的光吸收值；control代表野生型酵母菌株K601，R100/pYES2代表转pYES2(空载体)的酵母菌株，R100/pYES2 GhNHX1代表转GhNHX1基因的酵母菌株。
(五)具体发明实施方式
实施例1：棉花Na+/H+反向转运蛋白基因的克隆方法
1.总RNA的提取：采用RNAeasy mini kit(promoga公司产品)提取总RNA。
2.cDNA第一条链的合成：取2微克总RNA，加入5×反应缓冲液  4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物T26(10pmol/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃反应60分钟，85℃10分钟终止反应。
3.PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：
首先将下列试剂混在一起：
10×反应缓冲液                      5μl
10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)          1μl
正向引物(10μM)                     2μl
反向引物(10(M)                      2μl
模板cDNA                         1μl
Taq DNA聚合酶                    0.5μl
总体积                           50μl
PCR反应条件为：94℃5分钟，然后进入下列循环：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。
4.基因克隆：取2μlPCR与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5.质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。
6.序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
7.3′和5′序列的分离：按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行
8.同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。
实施例2：棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1，如下序列：
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度：2485碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：棉花
(f)序列描述：SEQ ID NO.1
ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT   60
TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT   120
CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT   180
CAAGCTCTCTCTTCGAATTTACTCGTCTCTTTGAAACTGTCCGTTTTTTTTTGGTTCAAT   240
AAAATCGCAAATTATTTGCTAATTTAGAGAAGAAAATTGAACGGAGCTGAAACAAGGATG   300
ATTTGTTGCTGCATGATGTTGATTCTCCAAAACGATTCGAGTGCTTAAGGATTTTAAGAT   360
TAGAAAGTTCTTGAAATGGACAGTTCAGAGGCATAAAAATTTTCGAAGATTTACATTGTT   420
GAAGGAGAGCTTAAATCTGAAGCCTTGGACTACAACTGTTTCAGTTAGAAGGAATTGGTG   480
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CAAGTTTCCTCAAGAGGTTCTTGTTTATTCTCCCCGAAACTACCTTCGCACCTGATGCTA   2340
TCTTTCCATTTGACATTTACGAATATTTATGATCTGGGTGAAGCTTAGGGGTAGGTGTGC   2400
CATTCTATTTTGTACGTATACGAGTATTTATTTTGTGTTTATATCAGTGTGTTTAGTTTT   2460
TATTTTTATTAAAAAAAAAAAAAAA  2485
(3)SEQ ID NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：543氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIGVFTGVIILLTSGGKSSHLLV   81
FSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAVGTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAAT   161
DSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAY    241
IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHAFATLSFVAETFLFL   321
YVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMA   401
LAYNQFTRGGHTQLRGNAIMITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKFTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD   461
SLIGVHRPNSIRALLTTPAHTVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLPQWQ   543
实施例3：表达载体的构建
1.根据分离出的棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1的核苷酸序列，设计引物：
正向引物：5′-ATGGTGGCTCCGCAGTTAGCT-3′
反向引物：5′-ACCTCATTGCCATTGAGGCAG-3’
以叶的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
2.取2μl PCR与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pMD18-TVector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3.用XabI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
4.将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。
实施例4：基因耐盐性分析
1.种植烟草。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10X MS培养基悬浮。
4.将烟草叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。
5.侵染后的叶片切块置于分化培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，)上共培养2天，然后转入选择培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，卡那霉素100毫克/升，头孢青霉素250毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将抗性植株移入花盆，每两天浇含10mmolL-1，10mmolL-1，200mmolL-1和300mmolL-1氯化钠的1/2Hoagland营养液，20天后测定野生型和转基因植株的光合速率和叶绿素含量。
实施例5：棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1对酵母盐敏感突变株的补偿作用
1.将克隆到的全长cDNA亚克隆到pMD18-T载体中，构建成pMD18-T-GhNHX1。
2.将pMD18-T-GhNHX1和酵母表达载体pYES2经BamHI和HindIII酶切，回收目的条带，在连接酶作用下，构建成pYES2-GhNHX1表达载体。
3.挑取YPD平板上的酵母菌株K601(野生型)和R100(盐敏感突变株)单菌落与5mlYPD培养液中，30℃振荡培养过夜，再稀释10倍，振荡培养6小时，3000rpm离心5分钟收集菌体，用1.5mlTE重悬菌体。
4.分别取0.1ml上述菌液、3μg pYES2-GhNHX1质粒和0.6mlTE-liOAC-PEG溶液于一1.5ml离心管中，30℃振荡培养30分钟，42℃热击15分钟，3000rpm离心20秒收集菌体，重悬于0.5ml重蒸水中，取200μl涂布于选择培养基上，30℃培养2-4天。
5.转化子接种到选择培养液中，30℃振荡培养48小时，测定600nm处的光吸收。
          钠离子反向运转蛋白基因序列表-word
                SEQUENCE LISTING
<110>山东农业大学
<120>棉花Na+/H+反向转运蛋白基因的克隆和应用
<130>1
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2485
<212>DNA
<213>Gossypium hirsutum
<220>1
<221>CDS
<222>(513)..(2141)
<223>
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(512)
<223>
<220>
<221>3’UTR<222>  (2142)..(2485)<223>
<400>1
acgcggggca acacagtctt gattttgatc gtttttcgct cccatcgaaa gcgaagattt    60
taagctgaaa aaagaagaga ggaaaattgt ggcaatttgt tggtgagaaa gtcgaagatt    120
cacgtgggta agctccataa acagtgaaac attggatttt cttttttgtt tttgttttct    180
caagctctct cttcgaattt actcgtctct ttgaaactgt ccgttttttt ttggttcaat    240
aaaatcgcaa attatttgct aatttagaga agaaaattga acggagctga aacaaggatg    300
atttgttgct gcatgatgtt gattctccaa aacgattcga gtgcttaagg attttaagat    360
tagaaagttc ttgaaatgga cagttcagag gcataaaaat tttcgaagat ttacattgtt    420
gaaggagagc ttaaatctga agccttggac tacaactgtt tcagttagaa ggaattggtg    480
tttaataaaa tttgatttaa aaagaggtca at atg gtg gct ccg cag tta gct      533
                                    Met Val Ala Pro Gln Leu Ala
                                    1                5
gct gtc ttt act aag ttg cag aca cta tct act tca gac cat gcg tct      581
Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser
        10                  15                  20
gtg gtc tcc atg aac ata ttt gta gcg ctt ctt tgt gct tgc att gtg      629
Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val
    25                  30                  35
att ggt cat ctt ttg gag gag aat aga tgg atg aac gaa tca att act      677
Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr
40                  45                  50                  55
gcc ctt atc att ggt gtt ttt act ggg gtc att att ttg ttg aca agt      725
Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser
                60                  65                  70
ggg ggt aaa agc tct cat ctt tta gtc ttc agt gaa gat ctg ttc ttt      773
Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe
            75                  80                  85
atc tat ctt ctg ccc cct att ata ttc aat gct ggg ttt cag gtg aaa      821
Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys
        90                  95                  100
aag aag caa ttt ttc cgt aac ttt atc acc atc atg ctg ttt ggg gct      869
Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala
    105                 110                 115
gtt ggt aca cta ata tct tgt aca att atc tct tta ggt gta att aac      917
Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn
120                 125                 130                 135
ttc ttc aag gaa atg gac att ggc tcc tta gac att gga gat ttt cta      965
Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser Leu Asp Ile Gly Asp Phe Leu
                140                 145                 150
gca att ggt gca ata ttt gct gcg aca gat tct gtt tgc aca ctg cag      1013
Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln
            155                 160                 165
gtg ctt aat cag gat gag act cca tta ctc tac agt ttg gtt ttc gga      1061
Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly
        170                 175                 180
gag ggt gtt gta aat gat gca aca tct gtg gtg ctt ttc aat gca atc      1109
Glu Gly Val Val Ash Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe Asn Ala Ile
    185                 190                 195
cag agt ttt gac ctc gtt aat acc agt cct aga att ctt ctg gag ttt      1157
Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe
200                 205                 210                 215
att ggc agc ttt ttg tat tta ttt tta gca agc act atg ctg gga gtg      1205
Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Thr Met Leu Gly Val
                220                 225                 230
att gtt ggg ttg gtt agt gct tac atc atc aaa aag ttg tac ttt gga      1253
                            钠离子反向运转蛋白基因序列表-word
Ile Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly
       235                  240                 245
agg cac tca aca gat cgt gaa ttt gct ctt atg atg ctt atg gca tac      1301
Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr
        250                 255                 260
ctt tcg tat atc atg gct gaa ctg ttc tat ttg agt ggc att ctt aca      1349
Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr
    265                 270                 275
gta ttc ttt tgt ggg att gtg atg tca cat tat acc tgg cac aat gta      1397
Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val
280                 285                 290                 295
act gag agt tca aga gta act aca aag cat gcc ttt gct acc ttg tca      1445
Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Set
                300                 305                 310
ttt gtt gct gag act ttt ctc ttt ctt tat gtc ggg atg gat gct ttg      1493
Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu
            315                 320                 325
gac atg gag aag tgg aga ttt gtc agt gat agc cct gga acg tca gtt      1541
Asp Met Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val
        330                 335                 340
gct gtt agt gct gtg ctg atg ggt ctt gtt atg gtt gga aga gcg gct      1589
Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu Val Met Val Gly Arg Ala Ala
    345                 350                 355
ttt gtg ttt ccc ctg tca ttt tta tcc aac ttg gca aag aaa tca act      1637
Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr
360                 365                 370                 375
agt gag aaa atc agc ttc agg gaa caa att ata ata tgg tgg gct ggg      1685
Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly
                380                 385                 390
ctc atg aga ggc gct gta tct atg gca ctt gca tat aat cag ttt aca      1733
Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr
            395                 400                 405
agg ggg ggc cat act cag ttg cga gga aat gca att atg att aca agc      1781
Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser
        410                 415                 420
acc ata acc att gtt cta ttc agc act gtg gtt ttt ggt tta atg act      1829
Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly Leu Met Thr
    425                 430                 435
aaa cct cta ata agg ttc ttg ctg cct cat ccc aaa cca aca gcc agc      1877
Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro His Pro Lys Pro Thr Ala Ser
440                 445                 450                 455
atg ctc tca gac caa tcc act cca aaa tca atg gag gca cca ttt ctc      1925
Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu
                460                 465                 470
gga agc ggc cag gac tct ttt gat gat agt tta att gga gtt cat cga      1973
Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp Ser Leu Ile Gly Val His Arg
            475                 480                 485
cca aac agc att cgt gca ctt ctt aca act cca gca cac act gtt cat      2021
Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr Thr Pro Ala His Thr Val His
        490                 495                 500
tac tat tgg cga aag ttt gat aat gcc ttc atg cgc cct atg ttt ggt      2069
Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala Phe Met Arg Pro Met Phe Gly
    505                 510                 515
ggc cgg ggt ttt gtg ccc ttc gtt cct ggc tcc cca aca gaa agg agt      2117
Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser
520                 525                 530                 535
gaa cct aat ctg cct caa tgg caa tgaggtggtt gaacaagatc tctacaaaaa     2171
Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln
                540
tgtacatgta atataacaat gcagtcggtt gcaaaaaaca tgcttctggc gagaagccag    2231
tgcggtatgc tttgtatgtt tcatgtatag gctatatttt gttggttttc aagtttcctc    2291
aagaggttct tgtttattct ccccgaaact accttcgcac ctgatgctat ctttccattt    2351
gacatttacg aatatttatg atctgggtga agcttagggg taggtgtgcc attctatttt    2411
gtacgtatac gagtatttat tttgtgttta tatcagtgtg tttagttttt atttttatta    2471
aaaaaaaaaa aaaa                                                      2485
<210>2
<211>543
<212>PRT
<213>Gossypium hirsutum
<400>2
Met Val Ala Pro Gln Leu Ala Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala
            20                  25                  30
                                  钠离子反向运转蛋白基因序列表-word
Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg
        35                  40                  45
Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val
65                  70                  75                  80
Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe
                85                  90                  95
Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile
            100                 105                 110
Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser
    130                 135                 140
Leu Asp Ile Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr
145                 150                 155                 160
Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu
                165                170                  175
Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser
            180                 185                 190
Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser
        195                 200                 205
Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu
    210                 215                 220
Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Ile Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile
225                 230                 235                 240
Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala
                245                 250                 255
Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe
            260                 265                 270
Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser
        275                 280                 285
His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys
    290                 295                 300
His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu
305                 310                 315                 320
Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Met Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser
                325                 330                 335
Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu
            340                 345                 350
Val Met Val Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser
        355                 360                 365
Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln
    370                 375                 380
Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala
385                 390                 395                 400
Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly
                405                 410                 415
Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr
            420                 425                 430
Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro
        435                 440                 445
His Pro Lys Pro Thr Ala Ser Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys
    450                 455                 460
Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp
465                 470                 475                 480
Ser Leu Ile Gly Val His Arg Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr
                485                 490                 495
Thr Pro Ala His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala
            500                 505                 510
Phe Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro
        515                 520                 525
Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln
    530                 535                 540

Claims (3)

1.一个棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1，其特征在于具有SEQ ID NO 1所示的核甘酸序列：
ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT  60
TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT  120
CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT  180
CAAGCTCTCTCTTCGAATTTACTCGTCTCTTTGAAACTGTCCGTTTTTTTTTGGTTCAAT  240
AAAATCGCAAATTATTTGCTAATTTAGAGAAGAAAATTGAACGGAGCTGAAACAAGGATG  300
ATTTGTTGCTGCATGATGTTGATTCTCCAAAACGATTCGAGTGCTTAAGGATTTTAAGAT  360
TAGAAAGTTCTTGAAATGGACAGTTCAGAGGCATAAAAATTTTCGAAGATTTACATTGTT  420
GAAGGAGAGCTTAAATCTGAAGCCTTGGACTACAACTGTTTCAGTTAGAAGGAATTGGTG  480
TTTAATAAAATTTGATTTAAAAAGAGGTCAATATGGTGGCTCCGCAGTTAGCTGCTGTCT  540
TTACTAAGTTGCAGACACTATCTACTTCAGACCATGCGTCTGTGGTCTCCATGAACATAT  600
TTGTAGCGCTTCTTTGTGCTTGCATTGTGATTGGTCATCTTTTGGAGGAGAATAGATGGA  660
TGAACGAATCAATTACTGCCCTTATCATTGGTGTTTTTACTGGGGTCATTATTTTGTTGA  720
CAAGTGGGGGTAAAAGCTCTCATCTTTTAGTCTTCAGTGAAGATCTGTTCTTTATCTATC  780
TTCTGCCCCCTATTATATTCAATGCTGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCAATTTTTCCGTA  840
ACTTTATCACCATCATGCTGTTTGGGGCTGTTGGTACACTAATATCTTGTACAATTATCT  900
CTTTAGGTGTAATTAACTTCTTCAAGGAAATGGACATTGGCTCCTTAGACATTGGAGATT  960
TTCTAGCAATTGGTGCAATATTTGCTGCGACAGATTCTGTTTGCACACTGCAGGTGCTTA  1020
ATCAGGATGAGACTCCATTACTCTACAGTTTGGTTTTCGGAGAGGGTGTTGTAAATGATG  1080
CAACATCTGTGGTGCTTTTCAATGCAATCCAGAGTTTTGACCTCGTTAATACCAGTCCTA  1140
GAATTCTTCTGGAGTTTATTGGCAGCTTTTTGTATTTATTTTTAGCAAGCACTATGCTGG  1200
GAGTGATTGTTGGGTTGGTTAGTGCTTACATCATCAAAAAGTTGTACTTTGGAAGGCACT  2260
CAACAGATCGTGAATTTGCTCTTATGATGCTTATGGCATACCTTTCGTATATCATGGCTG  1320
AACTGTTCTATTTGAGTGGCATTCTTACAGTATTCTTTTGTGGGATTGTGATGTCACATT  1380
ATACCTGGCACAATGTAACTGAGAGTTCAAGAGTAACTACAAAGCATGCCTTTGCTACCT  1440
TGTCATTTGTTGCTGAGACTTTTCTCTTTCTTTATGTCGGGATGGATGCTTTGGACATGG  1500
AGAAGTGGAGATTTGTCAGTGATAGCCCTGGAACGTCAGTTGCTGTTAGTGCTGTGCTGA  1560
TGGGTCTTGTTATGGTTGGAAGAGCGGCTTTTGTGTTTCCCCTGTCATTTTTATCCAACT  1620
TGGCAAAGAAATCAACTAGTGAGAAAATCAGCTTCAGGGAACAAATTATAATATGGTGGG  1680
CTGGGCTCATGAGAGGCGCTGTATCTATGGCACTTGCATATAATCAGTTTACAAGGGGGG  1740
GCCATACTCAGTTGCGAGGAAATGCAATTATGATTACAAGCACCATAACCATTGTTCTAT  1800
TCAGCACTGTGGTTTTTGGTTTAATGACTAAACCTCTAATAAGGTTCTTGCTGCCTCATC  1860
CCAAACCAACAGCCAGCATGCTCTCAGACCAATCCACTCCAAAATCAATGGAGGCACCAT  1920
TTCTCGGAAGCGGCCAGGACTCTTTTGATGATAGTTTAATTGGAGTTCATCGACCAAACA  1880
GCATTCGTGCACTTCTTACAACTCCAGCACACACTGTTCATTACTATTGGCGAAAGTTTG  2040
ATAATGCCTTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGCCGGGGTTTTGTGCCCTTCGTTCCTGGCT  2100
CCCCAACAGAAAGGAGTGAACCTAATCTGCCTCAATGGCAATGAGGTGGTTGAACAAGAT  2160
CTCTACAAAAATGTACATGTAATATAACAATGCAGTCGGTTGCAAAAAACATGCTTCTGG  2220
CGAGAAGCCAGTGCGGTATGCTTTGTATGTTTCATGTATAGGCTATATTTTGTTGGTTTT  2280
CAAGTTTCCTCAAGAGGTTCTTGTTTATTCTCCCCGAAACTACCTTCGCACCTGATGCTA  2340
TCTTTCCATTTGACATTTACGAATATTTATGATCTGGGTGAAGCTTAGGGGTAGGTGTGC  2400
CATTCTATTTTGTACGTATACGAGTATTTATTTTGTGTTTATATCAGTGTGTTTAGTTTT  2460
TATTTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAA  2485。
2.根据权利要求1所述的一个棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1，其特征在于该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIG  60
VFTGVIILLTSGGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAV  120
GTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSL  180
VFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAYI  240
IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSR  300
VTTKHAFATLSFVAETFLFLYVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAF  360
VFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMALAYNQFTRGGHTQLRGNAIM  420
ITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKpTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD  480
SLIGVHRPNSIRALLTTPAHTVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLP  540
QWQ  543。
3.根据权利要求1所述的一个棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1的应用，其特征在于该基因在烟草中过量表达，能提高转基因烟草植株的耐盐性。
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