CN1183255C - 适合生产蛋白质的表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适合在丝状真菌内生产蛋白质的表达系统，包括a)一由栓菌或多孔菌属中选出的宿主生物；b)一含有选择标志基因的DNA载体，该基因编码一蛋白质，该蛋白质，于宿主生物转化后，允许选择阳性转化株，该基因选自下述一组：抗生素抗性的基因，其编码破坏抗生素的生长抑制作用的蛋白质，宿主生物无抗生素抗性；编码具有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内(营养缺陷型)基因缺陷的基因；而选择标志基因的表达受至少一种在宿主生物中活化的基因调节元件控制；及c)一含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，而此基因的表达及，如适当，以此方式所生产的蛋白质的分泌，系受一在宿主生物中活化的基因调节元件控制。其中含有选择标志基因的DNA载体，及含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，亦可以一个DNA载体形式存在。

Description

适合生产蛋白质的表达系统
技术领域
本发明涉及适合在栓菌或多孔菌属真菌内生产蛋白质的表达系统、其制备及用途。
背景技术
对于蛋白质生产各种不同的原核及真核的表达系统是已知的。原核的表达系统的实例为大肠杆菌及枯草杆菌。这些生物的基因操作法的地位已很稳固。这些表达系统特有的缺点是经常令人失望的低产率(尤其是真核蛋白质的产率)，所产蛋白质的折叠常使其不呈活化型，而且，特别是，缺乏对表达的蛋白质的转译后修饰。缺乏转译后修饰的实例，为待表达的蛋白质缺乏辅基的掺入或缺乏糖基化作用。
这些原核的表达系统的缺点可用真核系统避免之。
普遍的真核表达系统广泛应用在哺乳动物细胞与昆虫细胞培养系统，及真核微生物，如酵母或丝状真菌。用这些表达系统表达的蛋白质，通常产出时为活化型，在若干实例，产率太低，特别是异源蛋白质的表达。在酿酒酵母中或子囊菌纲的丝状真菌中表达可做为该表达的实例。
据说在丝状真菌(如曲霉)中产率高，尤其在同源蛋白质或子囊菌纲丝状真菌的蛋白。异源蛋白质的表达通常仅在低产率或中产率时进行。例如WO96/00290即说明源于Polyporus pinsitus、担子菌纲丝状真菌的漆酶LCC1的异源表达。至于在曲霉、担子菌纲丝状真菌中表达，发酵的产率高达0.35克/升，与类似的野生型菌株发酵的产率为0.1-0.2克/升相比，此尚属较小增产。
大家对在工业上应用酶(特别是担子菌纲的酶)，兴趣日益增高，其中又以白色腐败真菌最为特殊。实例为水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶或脂肪酶，或氧化还原酶，如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维二糖-醌氧化还原酶或纤维二糖氧化酶。这些酶的潜在用途为木材或纤维素加工。
担子菌纲中出现一类酶，漆酶(对-羟基酚氧化酶，EC1.10.3.2)，大家对其工业上应用最感兴趣。漆酶属于称为“蓝铜蛋白”的蛋白质家族，通常含有四个铜离子排列成三个铜中心，称为型1至型3。漆酶其他特征为系分泌蛋白质而且可能尚有糖基化作用含量，占分子量的10至45％。除对大分子化合物(如木质素)具有解聚(作用)之外，漆酶尚能催化聚合作用，特别是芳香化合物。其实例为在植物中木质素生物合成，其中与植物中的漆酶直接有关。工业界似可用漆酶于制纸时纸浆的去木质化作用，并用于各种聚合反应，如废水处理。有机化学合成用漆酶，乃既有技术，例如芳香族化合物之偶联反应或侧链氧化。然而在工业上应用这些方法的先决条件为漆酶的生产成本比较低及需用量相当大。
对于担子菌纲各种不同的丝状真菌，据说DNA载体适合转化作用与转化株的选择。同种转化担子菌纲Phanerochaete chrysosporium的方法已见于刊物(M.Alic et al.(1991)Curr.Genet.19，491-494)。转化担子菌纲Pleurotusostreatus的DNA-结构已见于刊物(K.Yanai et al.(1996)Biosci.Biotech.Biochem.60，472-475)。美国第5,362,640号专利说明转化担子菌纲Coriolus hirsutus的DNA载体。同样，一转化担子菌纲Coriolus hirsutus的DNA-载体已见于刊物(Y.Iimura et al.(1992)5th International Conference on Biotechnology in the Pulpand Paper Industry，427-431)。迄今尚未公开者，为转化担子菌纲如下表达系统中的任何一种系统，这些系统大幅提高同源或异源蛋白质的表达率。
习知表达载体含有控制在子囊菌纲丝状真菌中表达的基因调节元件，无法在担子菌纲丝状真菌内有效表达。因此，在转化担子菌纲丝状真菌时，无法基于后天获得的抗生素抗性或生色指示蛋白质，或基于营养缺陷型基因缺陷的互补作用选择阳性转化株。
发明内容
本发明涉及在丝状真菌中适合生产蛋白质的表达系统，该表达系统含有：
a)一由栓菌或多孔菌属中选出的宿主生物；
b)一含有选择标志基因(标记基因，marker gene)的DNA载体，该基因编码一蛋白质，该蛋白质，于宿主生物转化后，允许选择阳性转化株，该基因选自下述一组：抗生素抗性的基因，其编码破坏抗生素的生长抑制作用的蛋白质，宿主生物无抗生素抗性；编码具有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的基因；而选择标志基因的表达受至少一种在宿主生物中活化的基因调节元件控制；及
c)一含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，而此基因的表达及以此方式所生产的蛋白质的分泌，系受一在宿主生物中活化的基因调节元件控制，
其中含有选择标志基因的DNA载体，及含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，亦可以一个DNA载体形式存在。
本发明尚涉及一种含有至少一种选择标志基因的DNA载体，该选择标志基因编码一蛋白质，该蛋白质于转化选自栓菌及多孔菌属的宿主生物后，允许选择阳性转化株，其中该选择标志基因由下述一组中选出：抗生素抗性的基因，其编码破坏抗生素的生长抑制作用的蛋白质，宿主生物无抗生素抗性；编码具有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的基因；而选择标志基因的表达受至少一种在宿主生物中活化的基因调节元件控制。
本发明还涉及一种在栓菌及多孔菌中活化的调节元件，包括SEQ ID NO：1内碱基1-1192的序列，或SEQ ID NO：2内碱基1-547的序列，或SEQ IDNO：3内碱基1365-1542的序列。
本发明还涉及一种适合生产能有效表达与分泌蛋白质的真菌菌株的方法，包括用一由栓菌及多孔菌属中选出的真菌作为宿主菌株，该宿主菌具有尿嘧啶核苷营养缺陷型基因缺陷，并用一种DNA载体转化，该DNA载体具有一基因，其能互补宿主菌株中的营养缺陷型基因缺陷；以及从转化混合物选择用DNA载体转化的克隆，所述选择通过选择对营养缺陷型基因缺陷的互补而进行，其中用于互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达由一在宿主菌株内活化的基因调节元件控制。
本发明还涉及一种生产蛋白质的方法，包括用如上所述的表达系统生产蛋白质，或包括培养用如上所述的方法制备的真菌菌株。
附图说明
图1所示为实施例3A中所述的质粒pSCpyrG构建图。
图2所示为实施例6B中所述的质粒pLac3gap构建图。
图3所示为实施例6C中所述的质粒pL3GpyrG构建图。
具体实施方式
本发明涉及在丝状真菌中适合生产蛋白质的表达系统，该表达系统含有：
a)由栓菌与多孔菌属选出的宿主生物及
b)含有编码蛋白质的选择标志基因的DNA载体，其于宿主生物转化后，则准许选择阳性转化株，该基因由下述一组基因中选出：编码破坏抗生素的抑制生长作用(宿主生物无抗生素抗性)的蛋白质的抗生素抗性基因、编码有生色反应能力的蛋白质的基因，及互补宿主生物(营养缺陷型)基因缺陷的基因，其中选择标志基因的表达至少由一在宿主生物中活化的基因调节元件控制，及
c)含有编码将要生产的蛋白质的基因的DNA载体，而此基因的表达，如适合，及所生产的蛋白质的分泌，由在宿主生物中活化的基因调节元件控制。含有选择标志基因的DNA载体，及含有编码将要生产的蛋白质的基因的DNA载体也可以一个DNA载体存在。
适合的具有抗生素抗性的基因，最好为源于潮霉素，bialaphos，卡那霉素，遗传霉素，博来霉素，寡霉素，G418，zeocin，benomyl及腐草霉素群的基因。
还可并优选使用编码有生色反应能力的蛋白质的选择标志基因，例如葡糖醛酸糖苷酶基因或绿色荧光蛋白质(GFP)的基因。
互补宿主生物营养缺陷型基因缺陷的选择标志基因特别适合。
最合适本发明表达系统的宿主生物为源于栓菌与多孔菌属的单核细胞菌株。
变色栓菌(Trametes versicolor)的宿主生物尤其适合。
依照本发明的表达系统中的宿主生物最好尚具有下述特征：具有代谢基因缺陷(营养缺陷)，由此生长必须的一种或多种代谢产物无法再合成，及不增加此或此等代谢产物，宿主生物无法再在最低营养要求培养基上生长。
因此，本发明还涉及这样的表达系统，由栓菌及多孔菌属选出的宿主生物具有代谢基因缺陷(营养缺陷)，由此生长必须的一种或多种代谢产物无法再合成，不增加此或此等代谢产物，宿主生物无法再在最低营养要求培养基上生长，及在互补宿主生物营养缺陷型基因缺陷的原则下选取选择标志基因。
能互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的选择标志基因的实例是OCT-基因(为鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因编码，US5,362,640)，pyr G基因(编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的基因，Goosen et al.，Curr.Genet/(1987)11，499-503)，trpC基因(为一基因，其三功能基因产物具有适合磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶、谷氨酰胺酰胺转移酶及吲哚-甘油磷酸合酶的酶活性，Yelton et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，1470-1474)，或nia D基因(编码硝酸还原酶的基因)。
特别适合的选择标志基因是pyr G基因，其为乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(尿嘧啶核苷代谢的酶)编码，其能互补宿主菌株pyr G-基因缺陷中的尿嘧啶核苷营养缺陷。特别适合的宿主生物是pyr G-基因内有尿嘧啶核苷缺陷的营养缺陷的源于栓菌或多孔菌属的菌株。
pyr G-基因最好源于担子菌纲的真菌，例如蘑菇，革盖菌，多孔菌，灰侧耳菌，Phanerochaete，裂褶菌或栓菌属。
最适合pyr G-基因表达者为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH基因)的启动子及终止子元件，源于，例如，担子菌纲的群交裂褶菌、双色蘑菇(GAPDH Ag2基因)，Phanerochaete chrysosporium、变色栓菌的丝状真菌，或漆酶基因的启动子及终止子元件，最好是源于变色栓菌的漆酶I或漆酶III基因。
特别适合本发明表达系统的选择标志基因为编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的基因(pyr G-基因)，最好源于担子菌纲群交裂褶菌或担子菌纲变色栓菌。
源于担子菌纲群交裂褶菌的pyr G-基因的表达最好由群交裂褶菌的pyr G-基因的启动子及，如适合，终止子调节。
源于担子菌纲变色栓菌的pyr G-基因的表达最好由适合变色栓菌的pyr G-基因的启动子调节。
本发明的表达系统特别适合水解酶的基因的表达，该水解酶，例如，为纤维素酶、半纤维素酶及脂酶，或为氧化还原酶，例如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维二糖醌氧化还原酶或纤维二糖氧化酶。
特别适合漆酶的基因表达。
本发明尚涉及一DNA载体，该DNA载体含有至少一个选择标志基因，其编码一蛋白质，在转化栓菌及多孔菌属的真菌后，可以使得选择阳性转化株，其特征为所选出的选择标志基因选自具有抗生素抗性的基因，该基因编码能消除抗生素的抑制生长作用的蛋白质，宿主生物不具有该抗生素抗性；编码有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内(营养缺陷)基因缺陷的基因，该选择标志基因至少由一于宿主生物中活化的基因调节元件控制。
本发明的DNA载体，基于互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的原因，准许于转化选自栓菌及多孔菌属的真菌时选择阳性转化株。
尤其，选择变色栓菌丝状真菌的转化株，在一最佳具体实施例，缺乏变色栓菌营养缺陷型菌株的pyr G-基因的转化株，特别适于互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷。
本发明的DNA载体亦适合下述基因的表达：该基因为栓菌及多孔菌属的宿主生物内的蛋白质基因编码。为了本发明的宗旨，为蛋白质编码的基因也指蛋白质结构基因衍生的cDNA基因。该基因可能与宿主生物异源亦可能与宿主生物同源。
依据本发明，该DNA载体最好尚含有至少一个为待表达的蛋白质基因编码的基因。
依据本发明，该DNA载体最好含有至少一个为水解酶编码的基因，该水解酶，例如源于纤维素酶、半纤维素酶及脂酶或源于氧化还原酶，例如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维二糖醌氧化还原酶或纤维二糖氧化酶。
依据本发明，该DNA载体最好含有一漆酶的基因。
编码蛋白的基因的表达必须的启动子可源自待表达的基因，或者也可使用与待表达基因的编码区功能性相连的外源基因的启动子。
因此，本发明的DNA启动子还包括用于表达编码蛋白质的基因的启动子。本发明的DNA载体特别优选包括能保证获得高水平表达的启动子作为编码蛋白质的基因的表达的启动子。
用于本目的的启动子，例如为蛋白质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子，例如源于变色栓菌。
依照本发明，最好亦含有一个适合编码蛋白质基因的转录终止子。
也可用待表达的编码蛋白质基因的终止子或外来基因的终止子作为转录终止子。最好该转录终止子源于漆酶的基因。
蛋白质的表达可在细胞内进行，亦可在能对分泌起作用的信号序列存在的情况下，在细胞外进行。
如果想从细胞分泌已表达的蛋白质，依据本发明，该DNA载体最好含有一个能在编码蛋白质基因上游5’起作用的信号序列。此外，所谓的分泌载体亦可功能性连结到编码蛋白质基因5’端，存在于本发明的DNA载体内。
该分泌载体可为分泌蛋白质的基因，亦可为分泌蛋白质的基因片段。该分泌载体可功能性连结至待分泌的蛋白质，从而产生一个源于分泌载体及待分泌的蛋白质的融合蛋白质。在另一具体实施例中，分泌载体与待分泌的蛋白质的连结，要使该分泌载体与待分泌蛋白质能分离。例如，在分泌载体与待分泌蛋白质间连接部位插入一适合裂解蛋白质的酶的识别序列。一个例子的赖氨酸精氨酸识别序列，适合所谓KEX2蛋白酶，分泌载体的一个实例是源于黑曲霉的葡糖淀粉酶(Contreras et al.，Bio/Technology(1991)9，378-381，Brockhuijsen et al.，J.ofBiotechnology(1993)31，135-145)。
依据本发明，在表达的蛋白质的表达和分泌中涉及的除在编码蛋白质基因3’端处转录终止子以外的DNA序列，同样可呈现在DNA载体内。一个实例是由Neurospora crassa的漆酶的基因所提供，其3’端包括13个氨基酸，该氨基酸在蛋白质分泌期间删除，所以成熟蛋白质已不复存在(Germann ct al.，J.Biol.Chem.(1988)263，885-896)。
依据本发明，系由习知的方法制备DNA载体，实例中已说明各种可能性。所说明的方法可由熟悉本项技术者适用于其他载体、抗性基因、调节元件及结构基因。
依照本发明，该DNA载体适合生产能有效表达及分泌蛋白质的真菌菌株。
所以，本发明亦与生产能有效表达及分泌蛋白质的真菌菌株的方法有关。
本方法包括使用选自栓菌及多孔菌属的真菌做为宿主生物，该真菌具有营养缺陷型基因缺陷并依习知的方法，用一种DNA载体转化，该DNA载体具有一基因，其能互补宿主菌株中的营养缺陷型基因缺陷；以及从转化混合物选择用DNA载体转化的克隆，所述选择通过选择对营养缺陷型基因缺陷的互补而进行，其中用于互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达由一在宿主菌株内活化的基因调节元件控制。
可以用做基因表达宿主之丝状真菌属于栓菌或多孔菌属。
优选的用于基因表达的宿主是单核担子菌纲，来自栓菌和多孔菌属。
该源于担子菌纲的宿主菌株的其他优点，为具有一营养缺陷型基因缺陷可以用做识别阳性转化株的选择标志。例如亦可用，源于担子菌纲的宿主菌株，该担子菌纲在OCT基因、pyr G-基因、trpC基因或niaD基因内具有基因缺陷。
基因表达最佳宿主为选自栓菌及多孔菌属在pyr G-基因内具有缺陷的真菌。
特别适合基因表达者为变色栓菌(在pyr G-基因内具有缺陷及具有尿嘧啶核苷营养缺陷)宿主。
宿主菌株之转化系由既有技术中之对应方法为之。这些方法包括藉CaCl2/PEG法转化原生质体，藉电穿孔转化或biolitic转化(用含有DNA的微射弹轰击)转化。这些方法标准教科书中均有说明。
例如依据本发明待转化的基因以习知的方法克隆进DNA载体，并用上述方法输入选自栓菌及多孔菌属的丝状真菌。
但是，待转化的基因也可以克隆在无选择标志基因的表达载体内，并与一互补产生转化株的宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的载体一起应用(共转化)。
转化用的最佳菌株为选自栓菌及多孔菌属的丝状真菌。源于担子菌纲的有关菌株而且可以是单核细胞或双核细胞菌株。于最佳具体实施例中为尿嘧啶核苷营养缺陷型菌株。该菌株具有pyr G-基因缺陷。
特别适合转化者为单核细胞、尿嘧啶核苷—营养缺陷、缺乏pyr G—的菌株(源于变色栓菌)。
例如，将原生质体，于载体DNA转化后，放在一培养基上，为了原生质体的渗透稳定，加入山梨糖醇、甘露(糖)醇或蔗糖，以选择具有互补pyr G-基因转化株来进行阳性转化株的选择。
于本发明的一个最佳具体实施例中，该丝状真菌(变色栓菌)在同源系统以漆酶(源自变色栓菌)的基因转化。如此，该漆酶的表达率提高，依既有技术标准，漆酶的生产率亦大幅改善(发酵培养基中0.1克漆酶/升)。
为此最好使用漆酶基因固有的启动子，或源于变色栓菌强表达的基因的启动子。最好使用漆酶基因I及III的启动子，其分离详述于第四实施例中。最好使用漆酶I基因，在SEQ ID NO：1碱基1-11 92的序列段。使用漆酶III基因，在SEQ ID NO：2碱基1-547的序列段。另一强表达的基因的启动子由GAPDH启动子代表(源于变色栓菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。GAPDH启动子的分离详于第五实施例。GAPDH启动子序列相应于SEQ ID NO：3的序列段，碱基1-1542。尤其，SEQ ID NO：3的序列段，碱基1365-碱基对1542，与此同源并具有＞73％同源性之序列适合表达。最好依照本发明至少有一个下述的序列段同样存在于调节元件中：
SEQ ID NO：3：碱基1005-碱基对1123，与此序列段同源并具有＞52％的同源性的序列；或
SEQ ID NO：3：碱基815-碱基对947，与此序列段同源并具有＞44％的同源性的序列；或
SEQ ID NO：3：碱基640-碱基对728，与此序列段同源并具有＞50％的同源性的序列。
本发明中所说明的同源性程度，用电脑程序(Wisconsin PackageVersion 9.1，Genetics Computer Group(GGG)，Madison，Wisconsin)即可获得有关的结果。用次程序(fasta)及预定值(字尺寸6)查询资料库测定同源性。最近似的序列用次程序(gap)检查同源性。用预设参数“gap creation penalty 50及gap extension penalty 3”。此外，用次程序(gap)及上述预设参数检查同源性GAPDH基因(源自Coriolushirsutus)启动子之序列(公开于日本专利09047289)，资料库内尚无此项资料。
因此，本发明亦与在栓菌或多孔菌中活化的调节元件有关，其特征为，该调节元件包括SEQ ID NO：1的碱基的1-1192的序列段或SEQ ID NO：2碱基1-547的序列段或SEQ ID NO：3的碱基1365-1542序列段，与此序列段同源及同源性＞73％的序列。
最好使用选择培养基，在此选择培养基上仅适合pyr G-基因功能性表达的选择标志基因转化的变色栓菌转化株生长。在无尿嘧啶核苷存在的情况下优先使用在第二实施例中说明的最低营养要求培养基，在该培养基上变色栓菌的pyr G营养缺陷型菌株不再能生长，或者仅于加添尿嘧啶核苷酸始能继续生长。
依据本发明，使用含pyr G-基因做为选择系统的DNA载体之成败端视栓菌转化株内选择标志基因之表达成效而定。有效表达的要件为适当的表达信号。
担子菌纲的表达信号带来变色栓菌的功能性表达，令人惊异地比子囊菌纲的表达信号有效得多，因此，依照本发明DNA载体内的pyr G-选择标志基因最好在担子菌纲的基因调节元件控制下，最好使用自栓菌及多孔菌属选出者。
最好pyr G-基因由其上游的5’启动子区及其下游的3’终止子区控制。其中群交裂褶菌的pyr G-基因由群交裂褶菌的pyr G-基因的表达信号控制的DNA片段参阅Froeliger et al.，Gene(1989)83，387-393。pyr G-基因也可以由担子菌纲的表达信号控制(与pyr G-a基因者不同)。具有此功能的表达信号包括担子菌纲的丝状真菌，例如Coriolus hirsutus，Phanerochaete chrysosporium，双色蘑菇或变色栓菌的GAPDH启动子，源于Coriolus hirsutus的OCT启动子，源于变色栓菌的漆酶I或漆酶III的启动子，双色蘑菇的GAPDH基因的终止子，或变色栓菌漆酶I或漆酶III的终止子。
第三实施例中的载体应特别优选，其中群交裂褶菌的pyr G-基因由群交裂褶菌的pyr G-基因的表达信号控制。
pyr G-基因可系编码具有乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶酶活性的蛋白质的任何基因。该pyr G-基因最好源于担子菌纲的丝状真菌，例如，双色蘑菇，Phanerochaete chrysosporium，Coriolus hirsutus，Polyporus pinsitus，群交裂褶菌或变色栓菌。
群交裂褶菌与变色栓菌pyr G-基因特别适合。
本发明尚与选自栓菌及多孔菌属的包括本发明的DNA载体的真菌菌株有关。
这些菌株能有效表达及分泌蛋白质。
因此，本发明亦特别与含有本发明的DNA载体的栓菌或多孔菌属的丝状真菌有关。
已表达及已分泌的蛋白质可能系异源蛋白质，亦可能是同源蛋白质。
一种漆酶应优选。此种漆酶例如已知源于变色栓菌的菌株(漆酶基因的实例是漆酶I的基因：SEQ ID NO：1，碱基1193-3312，或漆酶III的基因：SEQ ID NO：2，碱基548-2542)。
因此，本发明亦与生产蛋白质的方法有关，包括使用依照本发明的表达系统，以生产蛋白质习知的方式，或以培养真菌菌株习知的方式培养真菌菌株，该真菌菌株系依照本发明的生产方法生产者。
例如此等生产方法已见于刊物(CA：AN 96-203142，Eggert et al.，Appl.Environ.Microbiol(1996)62，1151-1158，Martinez et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1994)41，500-504，或WO93/08272)。
以下的实施例系用于进一步说明本发明的内容。实施例中处理DNA或RNA的标准方法，例如用限制核酸内切酶、DNA聚合酶、逆转录酶等处理，标准方法例如细菌的转化、Southern及Northern分析、DNA序列、放射标志、筛检及PCR技术，除另有指明外，依制造商的建议，如无制造商的说明书，则依照标准教科书的既有技术。
实施例1：
生产栓菌原生质体与真菌菌落的再生
用变色栓菌TV-1的双核细胞菌株(保藏于德意志微生物保藏中心，D-38124 Braunschweig，保藏号11523)，变色栓菌38070(得自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD20852 USA)，单核细胞菌株变色栓菌F2 100(保藏于德意志微生物保藏中心，D-38124Braunschweig，保藏号11972)制得原生质体。变色栓菌菌丝体开始时可由在麦芽琼脂培养皿上(3％麦芽提取液，0.3％黄豆粗磨粉的胨，1.5％琼脂-琼脂，pH5.0)在28℃温度下培养7天而获得。从麦芽琼脂培养皿取三块，用以接种在500ml Erlenmeyer烧瓶内的100ml无菌1.5％麦芽提取液培养基(3％麦芽提取液，0.3％黄豆粗磨粉的胨，pH5.0)，或在162cm2细胞培养管内的125ml无菌培养基。该培养基在不震荡情况下，于28℃温度下培育7天直到菌丝体在培养液内形成致密垫。将培养液倾析掉并加入新鲜培养基(100ml培养物的菌丝体加30ml)。菌丝体用Ultra Turrax均化(9500rpm，4分钟)，在震荡情况下(100rpm)，28℃下再培育18小时。
用这种方法生产的菌丝体悬浮液用1500rpm(2000×g)离心5分钟收集。如此获得的菌丝体再通过悬浮在0.1M MgSO4，0.6M蔗糖，0.1M磷酸，pH5.8(OMT培养基)中随后离心清洗三次。称量分离的菌丝体并在4℃温度下储存，再用分解酶处理。
原生质体系用下述方法生产：一烧瓶菌丝体悬浮在15ml在无菌烧瓶内的OMT培养基内的刚制备并经无菌过滤的分解酶混合物(Novozym 234(3mg/ml，Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)溶液中。悬浮在酶溶液内的菌丝体在震荡的培育器(Infors)内低速(80rpm)在30℃温度下培育1至3小时。在培育期间，用显微镜观察原生质体的生成。自由游动的原生质体在正常情况下1小时后即可看到。原生质体形成的端点用显微镜目视测定，以在玻璃滤器中的玻璃棉过滤的方法将原生体移离其他菌丝体。玻璃棉用冰冷的OMT培养基谨慎清洗。原生质体用在无菌样品管(2000rpm；2500×g，4℃，10分钟)离心悬浮液的方法予以分离。细胞进一步的加工要在4℃温度下进行。用悬浮在OMT培养基内清洗原生质体沉淀，离心再分离。如果需要，应重复清洗。原生质体的浓度用显微镜下的计数室内测定。原生质体悬浮液调整到1×108个原生质体/ml浓度用于原生质体再生或转化实验。
再生实验中，制备原生质体悬浮液的连续稀释液并在琼脂培养皿(含1.5％麦芽提取液、0.1％胰蛋白酶解酪蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％琼脂和用于渗透稳定的0.4M甘露(糖)醇)上铺板。这样，确定活细胞的比例，并测定获得的原生质体可否再生菌丝体类似的成长。这样，渗透稳定的细胞(例如菌丝体片段)的比例即在无渗透稳定作用的培养皿(无甘露(糖)醇)情况下测定。在28℃温度下培育7天后获得的菌落予以计数。一系列原生质体制备物中存活细胞的比例约0.5％。这些结果显示可产生存活的及可再生的原生质体从事变色栓菌转化实验。
实施例2
分离变色栓菌的pyr G缺陷突变体
变色栓菌营养缺陷型突变体在吡啶代谢中具有一基因缺陷(pyr-突变体)，用下述方法分离之(参阅Boeke et al.，Method Enzymol(1987)154，164-175)。所用的选择剂是具有基因毒性的物质5-氟乳清酸(FOA)。变色栓菌原生质体用紫外线处理诱变。
A：紫外线诱变
用实施例1中的单核细胞菌株变色栓菌F2 100进行诱变。本菌株的原生质体依照实施例1中的说明制备。
用BioRad紫外线交联仪(5.8W/cm2)，距离紫外线源16cm)诱变。用作诱变的原生质体量为8×109。将变色栓菌的原生质体纳入平皿并用紫外线照射不同长短的时间。此显示在上述条件下照射60秒为嗣后选择营养缺陷型突变体是最佳时段。
B：选择尿嘧啶核苷营养缺陷的突变体
用下述最低营养要求培养基(MM)选择尿嘧啶核苷营养缺陷的突变体：
葡萄糖           20g/l
琼脂             15g/l
磷酸二氢钾       1g/l
硫酸镁           0.5g/l
磷酸氢二钠       0.1g/l
腺嘌呤           27.5mg/l
DL-苯丙氨酸      0.15g/l
L-天冬酰胺       2.5g/l
硫胺素           0.48mg/l
氯化钙           10mg/l
硫酸铁          10mg/l
硫酸铜          2mg/l
硫酸锌          1mg/l
硫酸锰          1mg/l
pH5.0，用硫酸调整。
为了原生质体的渗透稳定，该最低营养要求培养基互补0.6M蔗糖(MMS-培养基)。为了液态培养，制备最低营养要求培养基时不用琼脂。
开始时该MMS培养基补充以不同浓度的FOA及10mM尿嘧啶核苷以显示各种不同栓菌菌株在选择培养基上的生长特质。显示具有1.5mg/mlFOA及10mM尿嘧啶核苷的MMS(选择性MMS)完全抑制了栓菌菌株的生长。
在含有选择性MMS的平板上接种紫外线诱变的原生质体(见A段)。在温度28℃下培育21天。与未诱变的原生质体比，生长出来35个菌落。将这些潜在具有pyr缺陷的突变体放在MM平板，具有10mM尿嘧啶核苷的MM平板及选择性MM平板上，与F2 100起始菌株生长相比较，旨在详细说明尿嘧啶核苷营养缺陷表型。此显示，取出的35个栓菌突变体菌落中有三个具有pyr缺陷表型，详见表1。
表1：变色栓菌突变体最低营养要求培养基上生长的情形
菌株 MM MM+10mM尿嘧啶核苷 MM+10mM尿嘧啶核苷+1.5mg/ml FOA
F2 100 + + -
F2 100B11 - + +
F2 100B14 - + +
F2 100B16 - + +
C：pyr G突变体的鉴别
用FOA致突变可获得pyr F基因之突变体(乳清酸磷酸核糖基转移酶)或所需要的pyr G基因突变体(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)。通过源于群交裂褶菌的pyr G基因转化区分pyr G突变体及pyr F突变体(质粒pSCpyrG参阅实施例3)。
用质粒pSCpyr G转化后，自表1所示的三个具有pyr缺陷的突变体可看到MM培养基上的菌落。此显示全部三个突变体在pyr G基因内有缺陷。具有pyr G缺陷的变色栓菌菌株F2 100B11可以约10倍以上的频率转化，因此于后的研究则使用本菌株。
菌株变色栓菌F2 100B11，F2 100B14及F2 100B16是目前为止首次描述的变色栓菌pyr G缺陷菌株。这些具有pyr G缺陷的菌株在先前未公开的变色栓菌的转化过程中用作为宿主生物，因此这是担子菌纲丝状真菌中适合蛋白质表达及蛋白质分泌的新的有价值的宿主生物。以下的实施例描述菌株F2 100B11的此项用途。
实施例3
用源于群交裂褶菌的pyr G基因转化pyr G营养缺陷的变色栓菌菌株
A：分离源于群交裂褶菌的pyr G基因
源于群交裂褶菌的pyr G基因的分离与DNA序列(在刊物中称为URA1基因)参阅Froeliger et al.，Gene(1989)83，387-393。群交裂褶菌的菌丝体(菌株ATCC44201，可向ATCC American Type CultureCollection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852-1776，USA购买)系在麦芽提取液培养基中产生，参阅变色栓菌的实施例1，分离染色体DNA，同样依变色栓菌方法(参阅实施例4)。pyr G基因用群交裂褶菌的染色体DNA聚合酶链反应(PCR)扩增。此系利用引物A及B(源于Froeliger et al.，Gene(1989)83，387-393刊载的序列)，由此则可不仅扩增编码区而且亦可扩增启动子及终止子序列。
引物A：5’-TCCAGCTCGACCTTGCGCCGC-3’SEQ ID NO：4
引物B：5’-GGATCCGACGTGGAGGAGCCG-3’SEQ ID NO：5
PCR扩增依照既有技术及制造商的说明书(Strategene售卖的PCR试剂盒)：在100μl PCR反应中，采用200ng染色体群交裂褶菌DNA反应体系含有制造商提供的缓冲液，此外，1.25 U Pfu聚合酶，四种dNTPs(dATP、dCTP、cGTP及dTTP)各0.2mM及引物A及引物B各100pmol。特定扩增所要的PCR产物的其他条件：在温度94℃下5分钟，再25个循环的在94℃温度下1分钟，在50℃温度下1.5分钟，在72℃温度下2.5分钟。最后，在72℃温度下5分钟。所要的PCR产物，其大小约1.6kb，用琼脂糖凝胶电泳纯化并克隆在PCR-ScriptSK(+)载体(Strategene)中，再转化大肠杆菌。该质粒从转化的大肠杆菌培养物中分离。阳性克隆插入片段的DNA序列分析证实已扩增群交裂褶菌pyr G基因。具有群交裂褶菌pyr G基因的质粒称为pSCpyrG(图1)。
B：变色栓菌pyr G缺陷菌株的转化
变色栓菌F2 100B11的原生质体(参阅实施例2)系依照实施例1所公开的方法制备者。培养营养缺陷的菌株的培养基已补充10mM尿嘧啶核苷。用载体pSCpyrG(见A段)转化。
如实施例1所说明者，所制备的变色栓菌F2 100B11的原生质体，悬浮至最终浓度108/ml。0.1ml原生质体的部分在容积12ml的培育管内与10μg质粒DNA混合，置于冰上30分钟。随后缓慢并重复混合，1.25ml的PEG4000溶液加入转化混合物内。在室温下再培育20分钟，反应管内充满OMT培养基(参阅实施例1)混合并在2000×g于温度4℃下离心分离10分钟。沉淀再悬浮并在无尿嘧啶核苷的渗透稳定MMS平板上铺板(参阅实施例2)。该平板在28℃温度下培育14天，检查菌落生长的状态。在不同的实验中得到的转化率为0.1-3个转化株/μg质粒的DNA。
C：转化株的纯化
挑取得到的转化株的菌丝体，以在新鲜制备的MM-培养基平板上铺板的方式予以纯化。于本例，接种物系放在板中央的一点上。在温度28℃下培育7至14天后，观察到径向菌丝生长。重复纯化过程，自第一次纯化平板边缘取出适合接种的菌丝体。MM平板再重新接种，使用第二次纯化平板的接种物，在28℃温度下继续培育直到生长的菌丝体覆盖整个板面。
D：转化株的分析
变色栓菌的转化株用Southern印迹分析研究质粒pSCpyrG的整合。此可以通过产生各种转化株的菌丝体而进行，对照为在液态培养物中的pyr G缺陷菌株F2 100B11(参阅实施例1，麦芽提取液培养基，加添10mM尿嘧啶核苷)。根据以下实施例4的说明从分离的菌丝体中分离染色体DNA。
所研究的每一种的1μg染色体DNA及100ng质粒pSCpyrG用Not I及Eco RI双消化法切割，用琼脂糖凝胶电泳法分离，印迹到尼龙滤膜(Qiagen)上并与特异于群交裂褶菌的pyr G基因的放射标记DNA探针杂交。
用Not I及Eco RI双消化法切开质粒pSCpyrG，用制备凝胶电泳分离1.4kb长的pyr G基因的DNA片段而制备DNA探针。用α-[32P]-dATP放射标记(“Random Priming”Kit Boehringer Mannheim)1.6kb长pyr G特异性DNA片段。游离的放射性用色谱法在SephadexG25(Pharmacia)上移除，放射标记DNA探针的比活性为1×107cpm/μg。放射标记DNA探针与印迹在尼龙滤膜上的DNA的杂交温度为60℃。或者，依照Southern印迹专业文献说明的条件。Southern印迹用放射自显影技术分析，由此可仅在转化株而不在尿嘧啶核苷营养缺陷型菌株F2 100B11内检测到1.6kb长pyr G特异DNA片段。此结果证实尿嘧啶核苷营养缺陷型变色栓菌菌株F2 100B11转化时质粒pSCpyrG已经整合到基因组并导致选择标志基因pyr G的表达，这样本菌株的尿嘧啶核苷营养缺陷即获得互补。令人惊奇地为首次发现担子菌纲群交裂褶菌的pyr G基因的表达信号也能在变色栓菌中发生作用。
实施例4
变色栓菌漆酶基因的克隆
A：自变色栓菌产生染色体基因库
变色栓菌的基因组DNA自震荡烧瓶培养物的菌丝体中分离。用研钵将1克变色栓菌的菌丝体在有液态氮存在的情况下研磨成细粉末。将该粉末放在无菌样品管内并立刻与5ml提取溶液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.1M EDTA，0.25M NaCl，0.6mg/ml蛋白酶K)及0.5ml月桂酰肌氨酸钠溶液混合。在50℃保温至少2小时后，混合物与0.85ml 5MNaCl和0.7ml在0.7M NaCl中的10％(w/v)CTAB溶液混合，并在65℃温度下培育30分钟。添加7ml氯仿/异戊醇(24∶1)混合后，震荡该混合物并藉离心作用将两相分离。水相移出，添加0.6体积份异丙醇，染色体DNA则沉淀。沉淀的DNA再在柱(Qiagen Genomic Tip)上纯化，如此则可从16g菌丝体分离出来0.5mg染色体DNA。
为建立染色体基因库，用Sau 3A部分消化从变色栓菌TV-1得到的90μg染色体DNA，再用琼脂糖凝胶电泳法分离。分离的染色体DNA片段，其大小范围分别为5-20kb与大于20kb，各克隆在用Bam HI(Stratagene coloning system)预先切割的λ噬菌体。4×104噬菌体/μg载体DNA中存在5-20kb DNA部分，5×104噬菌体/μg载体DNA中存在大于20kb的DNA部分。用感染大肠杆菌菌株XL-1Blue MRF′而扩增噬菌体。
B：分离漆酶特异DNA探针
分离漆酶基因的DNA探针系用简并引物藉变色栓菌基因DNAPCR扩增制成。该简并引物基于习知漆酶基因序列对比而构建。漆酶基因的氨基酸序列在EMBL基因资料库内存有，将源于Neurosporacrassa，Coriolus hirsutus，Phlebia radiata，双色蘑菇，及源于担子菌亚纲未详细鉴定的一种丝状真菌的漆酶基因的氨基酸序列进行对比。亦可通过序列对比鉴别具有5-7个氨基酸长度的4种肽，其在所有的漆酶中完全保守。这些肽转译回DNA，考虑用简并密码子产生简并引物。引物的序列如下：
引物C：5’-TGGCAYGGNTTYTYCA-3’SEQ ID NO：6
引物D：5’-TCDATRTGRCARTG-3’  SEQ ID NO：7
引物E：5’-ATTCAG GGATCCTGGTAYCAYWSNCAY-3’SEQ ID NO：8
引物F：5’-ATACGA GGATCCRTGNCCRTGNARRTG-3’SEQ ID NO：9
引物E及F在5’区内含有一Bam HI裂解位点(下面划线)，与其连接有适当的简并漆酶序列。PCR扩增依照既有技术及制造商的说明书(Perkin Elmer的PCR试剂盒)进行：在第一次PCR中，100μl PCR反应使用200μg变色栓菌染色体DNA，反应含有制造商提供的缓冲液，此外，1.25U Taq聚合酶、1.25mM MgCl2、各0.2mM 4种dNTPs(dATP、dCTP、cGTP及dTTP)，各100pmol引物C及D。所需的PCR产物特定扩增的其他条件：在94℃温度下5分钟，接着7个循环的在94℃温度下0.5分钟，在40℃温度下1分钟，在60℃温度下2.5分钟，以及30个循环的在94℃温度下0.5分钟，在50℃温度下1分钟，在72℃温度下2.5分钟。在第二个PCR反应中使用1μl第一个PCR反应，该第二个PCR反应尚含有1.25U Taq聚合酶、1.25mM MgCl2、各0.2mM 4种dNTP，各100pmol引物E及F。所需的PCR产物特定扩增的其他条件：在94℃温度下5分钟，接着7个循环的在94℃温度下0.5分钟，在40℃温度下1分钟，在60℃温度下2.5分钟，以及30个循环的在94℃温度下0.5分钟，在50℃温度下1分钟，在72℃温度下2.5分钟。获得的PCR产物约1.1kb。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，用限制酶Bam HI切割，克隆在BamHI切割的pUC18载体并转化大肠杆菌。该质粒于转化的大肠杆菌中分离。在5’-及3’-端的DNA序列分析确认该克隆的DNA片段为漆酶基因片段。
为制备适合筛检漆酶基因的DNA探针，用Bam HI切开漆酶特异PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，并用α-[32P]-dATP放射标记之(“Random Priming”Kit，Boehringer Mannheim)。用色谱法在SephadexG25(Pharmacia)上除去游离放射性。放射标记探针的比活性为1×10-7cpm/μgDNA。
C：分离染色体的漆酶基因
用A段中所述的变色栓菌TV-1染色体基因库。依照既有技术的方法筛检基因组漆酶基因。在第一次筛检，将大肠杆菌XL-1 BlueMRF’首先培养在10个平皿上，然后用染色体基因库的50000个噬菌体感染每个平皿(参阅实施例4的5-20kb部分)。在37℃温度下培育过夜后，将新成的噬菌体转移到尼龙滤膜(Stratagene)。该滤膜再依照制造商的建议用放射标记的漆酶特异探针予以杂交(参阅B段)。在杂交缓冲液(含50％甲酰胺)内，杂交温度为45℃。取出阳性克隆用重复筛检法纯化之。在筛检过程中三次分离后20个强烈杂交噬菌体克隆被分离并再克隆在pBK CMV载体(Strategene)，使用制造商(Stratagene)建议的方法，经体内切除割而再克隆。用限制性核酸内切酶藉消化分析克隆及DNA序列分析发现，20个克隆中，有15个漆酶克隆。获得2种不同的漆酶克隆，这2种不同的漆酶基因称为漆酶I和漆酶III，具有该二种漆酶基因的质粒分别为pLac100(SEQ ID NO：1)及pLac300(SEQ ID NO：2)。该二种漆酶基因不仅包含结构基因(编码区)的序列信息，而且尚包括在ATG起始密码子之前的5’区(启动子区)的信息及终止密码子后面3’区(终止子区)的信息，这些是变色栓菌的新的基因调节元件，可用于产生适合在担子菌纲的丝状真菌内基因表达的DNA载体。表2摘要说明在SEQ ID NO：1(漆酶I基因)及SEQ ID NO：2(漆酶III基因)中相应的序列区。
表2：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2内的遗传元件
SEQ ID NO：1漆酶I基因 SEQ ID NO：2漆酶III基因
起动子 碱基对1-1192 碱基对1-547
结构基因(具有内含子) 碱基对1193-3312 碱基对548-2542
终止子 碱基对3313-7986 碱基对2542-5762
实施例5
克隆变色栓菌GAPDH基因
A：从变色栓菌分离GAPDH DNA探针
使用菌株变色栓菌TV-1(参阅实施例1)。分别依照实施例1及实施例4的说明培养TV-1及分离染色体DNA。
基于源于Phanerochaete chrysosporium的GADPH基因的公布的DNA序列(M，C.Harmsen et al.(1992)，Curr.Genet.22，447-454)及源于Coriolus hirsutus的GAPDH基因(JP 9-47289)的DNA序列构建用于GAPDH特异基因片段PCR扩增的引物。这些引物具有以下的DNA序列。
引物G：5’-CGTATCGGCCGTATCGTCCTCCG-3’SEQ ID NO：10
引物H：5’-CGCCCTTCAAGTGGGCAGAGGCC-3’SEQ IDNO：11
依照既有的技术，进行PCR扩增：在PCR反应中将200ng染色体变色栓菌DNA投入100μl PCR反应，反应中包括有厂商提供的缓冲液及1.25U Taq聚合酶、1.25mM MgCl2、4种dNTP(dATP、dCTP、cGTP及dTTP)各0.2mM、各100pmol引物G及H。所要的PCR产物特定扩增的其他条件：在94℃温度下5分钟，接着7个循环的在94℃温度下0.5分钟，在47℃温度下1分钟，在72℃温度下1分钟，及30个循环的在94℃温度下0.5分钟，在50℃温度下1分钟，在72℃温度下1分钟。获得的PCR产物约0.43kb。
该PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，克隆在载体PCR-ScriptSK(+)(Stratagene)并转化大肠杆菌。从转化的大肠杆菌培养物分离该质粒。在5’-及3’-端的DNA序列分析确认该克隆的DNA片段是P.chrysosporium GAPDH基因片段。
为制备适合筛检漆酶基因的DNA探针，藉Not I及Eco RI切开漆酶特异PCR片段，在琼脂糖凝胶电泳上分离，并用α[32P]-dATP放射标记之(“Random Primng”Kit，Boehringer Mannheim)。用色谱法在Sephadex G25(Pharmacia)上除去游离放射性。放射标记DNA探针的比活性为1×107cpm/μg DNA。
B：自变色栓菌分离染色体GAPDH基因
用实施例4的A段中所述的变色栓菌TV-1染色体基因库。依照既有技术的方法筛检染色体GAPDH基因。在第一次筛检，将大肠杆菌XL-1 Blue MRF’首先培养在10个平皿上，然后用染色体基因库的50000个噬菌体感染每个平皿(参阅实施例4的5-20kb部分)。在37℃温度下培育过夜后，将新成的噬菌体转移到尼龙滤膜(Stratagene)。该滤膜再依照制造商的建议用放射标记的GAPDH特异探针予以杂交(参阅A段)。杂交温度为58℃，洗涤温度为58℃。挑出28个阳性克隆，其中10个阳性克隆用重复筛检法纯化。在筛检过程中三次分离后9个强烈杂交噬菌体克隆被分离并再克隆在pBKCMV载体(Strategene)，使用制造商(Stratagene)建议的方法，经体内切除割而再克隆。用限制性核酸内切酶藉消化分析克隆及DNA序列分析发现，所有9个克隆均是GAPDH克隆。依据限制分析的基础，可将9个克隆分成6类。现成的编码区(SEQ ID NO：3，碱基对1543-2387)及在ATG起始密码子前面5′约1.5碱基对的启动子区(SEQ ID NO：3，碱基对1-1542)的DNA序列从具有最大GAPDH基因片段的克隆确定，这一克隆称为pGAPTV(SEQ ID NO：3)。
实施例6
GAPDH启动子与漆酶III基因的功能连接
A：将漆酶III基因克隆在pBluescript载体中
为了进一步加工，将源于pLac300的漆酶III基因再克隆在pBlucscript载体中。这是通过将漆酶III基因作为3.5kb Spe I-Sma I片段自pBK CMV载体分离出来并亚克隆在pBluescript载体中的方式完成，pBK CMV载体系于实施例4中获得者，pBluescript载体先前用SpeI与Sma I切割。产生的6.5kb质粒称为pLac301。为了连接到GAPDH启动子，pLac301含有一源于pBluescript的Not I裂解部位，藉此始可能功能连接到GAPDH启动子的3’端(参阅本实施例B段)。
B：将漆酶III基因的ATG转译起始密码子功能连接到GAPDH启动子
在实施例4中分离的GAPDH基因的1.5kb长启动子区，作为NotI-BspLU11 I片段自pGAPTV(SEQ ID NO：3，参阅实施例5)分离出来，其中Not I裂解位点源于pBK CMV载体部分，BspLU11 I裂解位点源于GAPDH基因的ATG起始密码子。
载体pLac301用Not I酶切并用BspLU11 I部分酶切，分离漆酶III基因的0.55kb启动子部分被缩短的6kb载体片段。
该1.5kb长的Not I-BspLU11 I GAPDH启动子片段，连接到源于pLac301的6kbNot I-BspLU11 I载体片段并转化大肠杆菌。该质粒从转化的大肠杆菌培养物分离出来。用限制分析与DNA序列分析检查阳性克隆。该7.5kb长的载体，其中漆酶III结构基因已功能连接到GAPDH基因的启动子，称为pLac3gap(参阅图2)。于pLac3gap中，GAPDH启动子区通过一BspL11 I裂解位点功能连接到漆酶III基因的ATG转译起始密码子。
C：将选择标志基因pyr G并入载体pLac3gap
为了制备，将一附加的Not I裂解位点并入Eco RI裂解位点，该Eco RI位点源于在载体pSCpyrG内的pCR Script SK(+)载体的多接头，此系用具有下述序列的接头A进行：
5’-AATTCGCGGCCGC-3’SEQ ID NO：12
3’-GCGCCGGCGTTAA-5’SEQ ID NO：13
用Eco RI线性化载体pSCpyrG并以碱性磷酸酶去磷酸化。然后将线性的pSCpyrG载体与各种不同浓度的接头A连接并转化进大肠杆菌。以用Not I消化分离的质粒DNA认出阳性克隆，其中由于第二个Not I裂解位点的导入，释出群交裂褶菌基因片段的1.6kb片段。此载体称为pSCpyrG-Not。
用Not I处理载体pSCpyrG-Not，用琼脂糖凝胶电泳分离这样释出的1.6kb pyr G片段。
用Not I线性化载体pLac3gap，用碱性磷酸酶处理该7.5kb片段以消除5’-磷酸基团。
将1.6kb pyr G片段克隆在已用Not I线性化及去磷酸化的pLac3gap，并转化大肠杆菌，该质粒DNA自阳性大肠杆菌转化株分离出来。阳性转化株含有该1.6kb pyr G基因片段。pyr G选择标志基因之方向与漆酶III基因的方向相同的克隆经限制分析鉴别。长度为9.1kb的载体不仅包含漆酶III基因而且尚包含pyr G选择标志基因，称为pL3GpyrG(图3)。
实施例7
变色栓菌中漆酶III的过量产生
A：变色栓菌的转化
用实施例1中所说明的方法产生变色栓菌原生质体，及用实施例6中所说明的载体pL3GpyrG转化之。
依实施例2中所说明者产生pyr G缺陷菌株变色栓菌F2 100B11的原生质体，并悬浮至最终浓度108/ml。0.1ml原生质体的部分在容积12ml的培育管内与10μg质粒DNA一起在冰上培育30分钟。然后，慢慢地并重复混合，将1.25ml的PEG4000溶液加入转化混合物内。在室温下再培育20分钟，反应管内充满OMT培养基(参阅实施例2)混合并在2000×g于温度4℃下离心分离10分钟。沉淀再悬浮并在渗透稳定的无尿嘧啶核苷的MM平板上铺板(参阅实施例2)。该板在28℃温度下培育14天，检查菌落生长的状态。在不同的实验中得到的转化率为0.5-3个转化株/μg质粒DNA。
B：转化株的纯化
挑取得到的转化株的菌丝体，以在新鲜制备的无尿嘧啶核苷的MM培养基平板上铺板的方式予以纯化。于本例，接种物系放在板中央的一点上。在温度28℃下培育7至14天后，观察到径向菌丝生长。重复纯化过程，自第一次纯化平板边缘取出适合接种的菌丝体。选择性平板再重新接种，使用第二次纯化平板的接种物，在生长的菌丝体覆盖整个板面后，在摇瓶中检查漆酶的产生。
C：在摇瓶内培养
为了在摇瓶内培养，将2cm2菌丝体自显示菌丝体充分生长的平板上取下来，在无菌条件下压碎，并用其接种50ml麦芽提取液培养基(参阅实施例1)的预培养物(在250ml Erlenmeyer烧瓶内)。在28℃温度下培育该预培养物，以120rpm震荡6天。在第6天，以9500rpm，用Ultra Turrax均化预培养物30秒，并用其接种1升Erlenmeycr烧瓶内的250ml的主培养基(其组成，参阅实施例1的MM)。再在28℃温度下，培育主培养物(以120rpm震荡)。培养开始的第二天以后，每天测量漆酶的产量。用底物ABTS(2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)于420nm用光度计测定漆酶活性。ABTS于420nm的消光系数ε420：3.6×104[1×Mol-1×cm-1]。在此，1U漆酶活性相应于转换1μmol ABTS/分(在37℃温度下，pH4.5)。摇瓶培养物中最高酶产量在起始主培养后8-10天到达。表3示出各种转化株与未转化的起始菌株变色栓菌F2 100的比较。未转化的菌株F2100，在用诱导物2，5-二甲代苯胺诱导后再测漆酶产量(参阅Yaveret al.，Applied and Environmental Microbiology(1996)62，834-841)。表3显示与未转化的起始菌株比较，菌株F2 100最好的转化株摇瓶内酶产量增高因子12倍(无诱导)及5倍(有诱导)。
表3：
 变色栓菌菌株  最高酶产量
 F2 100  3.8
 F2 100/二甲代苯胺*  9.6
 TV Lac3gap-2  31.2
 TV Lac3gap-3  36.7
 TV Lac3gap-6  45.8
 TV Lac3gap-8  22.3
 TV Lac3gap-11  46.1
 TV Lac3gap-15  15.1
 TV Lac3gap-17  42.9
 TV Lac3gap-21  30.6
 TV Lac3gap-25  18.3
*在起始主培养物后3天于添加2，5-二甲代苯胺(最终浓度1.5mM)时诱导。
            国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                              国际表格
电化学工业有限公司(国际)                                         存活证明
德国慕尼黑                                                       根据细则10.2由下列国际保藏机构签发
I.保藏人 II.微生物鉴定
名称：电化学工业有限公司(国际)地址：德国慕尼黑 国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11523保藏日或转存日11997-04-25
III.存活声明
上述II栏中的微生物的存活性于1997年4月25日2测试，在该日所述微生物：[x]3存活[]4不存活
IV.进行存活性测试的条件
V.国际保藏机构
名称：德意志微生物保藏中心地址：德国不伦瑞克 授权官员日期：1997年4月29日
1指出原始保藏日，或当进行新保藏或转存时，指出最近的相关日期(新保藏日或转存日)
2在细则10.2(a)(ii)和(iii)所指情形下，指最近的存活性测试
3用义号表示
4如果需要该信息或如果测试结果是负结果时填写
表DSM-BP/9(单页)0196
             国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                                 国际表格
                            原始保藏物受理通知书
                                根据细则7.1签发
电化学工业有限公司(国际)
德国慕尼黑
I.微生物的鉴定特征
由保藏人提供的名称：TV-1 国际保藏机构给出的保藏号：DSM 11523
II.科学描述和/或建议的分类命名
上述微生物附有：[x]科学描述[]建议的分类命名(当适用时以X标记)
III.受理及接受
上述微生物已于1997年4月25日(原始保藏日)1由本国际保藏机构收到。
IV.请求转存的受理
上述微生物于_年_月_日由本国际保藏机构受理，并且将原始保藏物转存为根据布达佩斯条约的保藏的请求于_年_月_日受理。
V.国际保藏机构
名称：德意志微生物保藏中心                授权官员地址：德国不伦瑞克日期：1997年4月29日
1如果细则6.4.d)适用，这一日期应是国际保藏机构收到的日期
表DSM-BP/4(单页)0196
                        序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>适合生产蛋白质的表达系统
<130>Co9618/P
<140>
<141>
<160>13
<170>PatentIn Vers.2.0
<210>1
<211>7986
<212>DNA
<213>Trametes versicolor
<400>1
agcttgcgcg tccgcatcgc ctctaccatg ggaaagaggc aataacgcgg cccccgccgg 60
gaatagcgct atgtggcccc gtccccggag ctctcaaagc ctgggatctc gtctcttcat 120
cattccaagc ggtcgacgct catgtcggac aacgagcccg actcttggct agcctggaaa 180
ggcccgtgtt cggagacaag acctaccccc ggcataggga gcgggacaga tgtgccggag 240
gatgagaacc cgctgggtaa ggagggccag atacatgtgg gcggcgacgc cacggggaca 300
tgggcgtttc cgcttaaccc ctcttctttc ctttcttggc ggaggatcct gcctcagaat 360
catcatgctc gcccggccga aagctctggc ctcccgtcct tcccactcta aacgtacgtg 420
accatcggga tgatcagtct ggccatggat gcgtcaaacc gaccttgcag tgctcaaaca 480
tgtaactgac gcggctcttg cagggcgata ctctccgctc tcgttggctg cgtcgactac 540
cttgtacacc caagatagcg cgtttcctgc ccaaatagcg gtcgaaatgc ccccgcgatc 600
ctctcccgag tactagcatc ccaaccgatc cgacccgctc gaacagctca tgaattaccg 660
aatccatgga cccgcccatc ggcgtagtca gttacgatca agcagacctg aagggtcttc 720
cagtgcactg ggctaccagc gccatccggc gctgcatcta cgcgccttcc cggcgcatta 780
tagacgcatg tggccaccac aggcctgctg gctctcttcc gccaccagcg cggcgcacaa 840
accgtgggac ccagcacact cccgcccact ctcacactgg ccagattcgc gcgaccgccg 900
cctttcaggc ccaaacagat ctggcaggtt tcgatggcgc acgccgtcgt gcctgccgga 960
ttcaattgtg cgccagtcag gcatccggat gcctctacca gcgcggttga ctggaagaga 1020
acaccgaggt catgcattct ggccaagtgc ggccagagga ccgcccgctg gtgcgggtac 1080
ttaaagggcg gcgcggggag gcctgtcgac caagctcaag ctcgccttgg gttcccagtc 1140
tccgccatcc tcctcctccc ccacacactc gctccatatc acgctcggcg ccatgggtct 1200
gcagcggttc agcttcttcg tcaccctcgc gctcgtcgct cgctctcttg cagccatcgg 1260
gccggtggcg agcctcgtcg tcgcgaacgc ccccgtctcg cccgacggct tccttcggga 1320
tgccatcgtg gtcaacggcg tggtcccttc cccgctcatc actgggaaga aggtcggcgt 1380
gttcgttgtc gtcctactcc tttactgaca gcgatctaca gggagaccgc ttccagctca 1440
acgtcgtcga caccttaacc aaccactcca tgctcaagtc cactagtatc gtaagtgtga 1500
cgatccgaat gtgacatcat ccggggctaa ttaaccgcgc acagcactgg cacggcttct 1560
tccaggcagg caccaactgg gcagacggac ccgcgttcgt caaccagtgc cctattgctt 1620
ccgggcattc attcctgtac gacttccatg tgcccgacca ggcaggtaag cagtctttgt 1680
tgtgatcctc gtgtgatgca atgttctcat gctccgacgt gatcgacagg gacgttctgg 1740
taccacagtc atctgtctac gcaatactgt gacgggctgc gaggaccgtt cgtcgtgtac 1800
gaccccaagg atccgcacgc cagccgctac gatgttgaca acggtacgtg cgccacggag 1860
tatatcacac agcatgcgtt gacgtcgggc caacagagag cacggtcatc acgttgaccg 1920
actggtacca caccgctgcc cggctcggtc ccaggttccc gtaagctcgc aatggattag 1980
tttttacgga ttatttgctt atgttgcgtc gatagactcg gcgcggacgc cacgctcatc 2040
aatggtcttg ggcggtcggc ctccactccc accgccgcgc ttgctgtgat caacgtccag 2100
cacggaaagc ggtgagcatt ctcttgcatg ccatttcaat gctctaaatt gacctatcgg 2160
caccacgcag ctaccgcttc cgtctcgttt cgatctcgtg cgacccgaac tacacgttca 2220
gcatcgacgg gcacaatctg accgtcatcg aggtcgacgg tatcaacagc cagcctctcc 2280
ttgtcgactc tatccagatc ttcgccgcgc agcgctactc ctttgtggta tgtcctgccc 2340
tcttggtgct tccaaagtgg cctcgctcac ccattctttt agttgaatgc gaaccaaacg 2400
gtcggcaact actgggtccg tgcgaacccg aacttcggaa cggttgggtt cgccgggggg 2460
atcaactccg ccatcctgcg ctaccaaggc gcaccggtcg ccgagcctac tacgacccag 2520
acgccgtcgg tgatcccgct cattgagacg aacttgcacc ccctcgctcg catgcctgtg 2580
gtacgtttct ttcattcata taatgaccgc gtcgccgagc tcaccgcgcg ctcctatcca 2640
gcctggcagc ccgacgcccg gaggtgtcga caaggcactg aacctggcct tcaacttcgt 2700
gagtgtctat accgcccaat ttggggtcct cgtactgatc atgcggcgca atagaacggc 2760
accaacttct ttatcaacaa cgcgtctttc acaccaccga cagtccccgt gctcctccag 2820
atcctgagcg gtgcgcagac cgcacaggaa ctcctccctg caggctccgt ctacccgctc 2880
ccggcccact ccaccatcga gatcacgctg cccgcgaccg cactagcccc aggcgcgccg 2940
caccccttcc acctgcacgg tgtacgtccc cctccttctc tccctcctcg cacaagtgct 3000
cacgtccagc ccctctagca cgcgttcgcg gtcgtccgca gcgcaggcag cactacgtat 3060
aactacaacg acccgatctt ccgcgacgtc gtgagcaccg gcacgcccgc cgcgggcgac 3120
aacgtcacga tccgcttcca gacggacaac cccgggccgt ggttcctcca ctgccacatc 3180
gacttccacc tcgaggcggg cttcgcgatc gtgttcgcgg aggacgttgc ggatgtgaag 3240
gcggcgaacc cggtcccaaa ggcgtggtcg gacctgtgcc cgatctacga cgggctgagc 3300
gaggccgacc agtgagcgga ggtggtgttg agcgtgaagc tcgagcgtcg accttggggg 3360
atttggcaag gtgttctcat tgaactagtc tttgggttta ttcgttgtta ttctaactcg 3420
cttctctacg gaatgactga gagttgtata ggatgaagta actttcttaa tatatgatat 3480
cacttgacag aggcatggtg tgcaaactgt gtgcattgtg gtagtggttt aggcctttca 3540
aacaggctgt cagttttatc gggggagatg aaagggggca ttgggagggc tgaaaagcat 3600
gctatgtctg gtaacatggt tatagtaaac gtgcattaca ttgaccaaga acgacaagaa 3660
ctaccagggt tgttacatca gtagcattaa gaacaagatg tgcattatgt cgaacacagc 3720
gacgtgatac tatgttcctt agcgattcga ccaaggtcta cggtcaggtg aggtcgatgg 3780
catcctcttc atcgtacgcc aacttcctgc gcttgctctg tgcgtgtgcc gaatcgtcta 3840
tgggcgccgg cttcgagccg gacccgctcg cgcgactcgc ttcaggattt atgcgcggat 3900
agcaatcgca gacaggtgca gatggggagg taggctgagt ctaaggctga acgacgtttt 3960
agacgcgtca acttgacgtc cgcgtcaaac cacaaaacgc gtatgtacag ccgattcccg 4020
ccgcgcgctt gagaagttga gctcccgaaa acgccggaca acgctcaaat gtacggttcc 4080
tgcgctgcac cattcgtacc aggatcgtac gggagctaat atgcgggcgt gtaaaaattt 4140
tagatagaaa aatacataca agttgctgga cgacgaggat atgaaagcgt taagttcgaa 4200
gcatgccggg ctagattgga tcccgggtta tcgaagtatg gtcgcggcgc ggaagcgcca 4260
cccgcgaggc gcactggaag cacctgcata acgcctttgg gcaaatcgtg tgtttgctcg 4320
acgccgacag cggggaggaa cggcggtcct ccatggacta gagggcctcc ttcgcttgca 4380
ttagccacat ggcaggatga agagagaagg aatagacgcc taaccgcgcg accaacgcgc 4440
ctaaggcgcg cgcccttccg cgcactctcc ttccgcaacc gccaattgcc tacgcctcag 4500
ctacacaatc tgccccttgg tcgtgctgcc gcgttcatct tgctcgcttt gctaataaga 4560
acttgaacgt aacattcgca cttgggcccc gctgcaccca tgacgaaaag acccagcgcc 4620
tgggacgtta gcttcccaga tgaagccgcc gcaggtacat ccgcggcact cgcgccatcg 4680
caggctccgg acggcgtacc gcataatcct cccaggagaa gcgcgacatc cagaagtgaa 4740
tcccggaggg actctgaacc agtaagctgg tgtactttac ttatctgagt cgtaaactta 4800
ccccatacag gcggccaagc gtccgagagt cctgcagcct gaggatcgtc gcaagactct 4860
gccaggaccg agtaagcacg tttccttatg aaagaagcca gtcttatcat gtcgcctcca 4920
tacagagcgt gcgtacgtgc ccacgcccga agatatcaag gaggacgtca acacggtcgt 4980
cttcggcgaa gacgcggttg agcagtcggg cgcaagcgta gagaaaccca tccgcgcgct 5040
ttccgatttt gtagtgtttg acccgacgcg gggtttcgag cacatcatgc tcgacgtttt 5100
ggacaatgca acgcctggac gccatttcga ggccgccggc caagtaaggc ctatattctt 5160
gaatgaggaa gatgagggcc aggaagatgg cctggatgac ggagacggcg gcgaacaggc 5220
tcgtcaagta cagcgtataa gaacgagtgc gatattccgg tggtctctcg actatacgaa 5280
ggtcgacgag taagtggtcc tgggaaggtc ttcttccatc gtggcttacc ctttcttgac 5340
cagcccactc tatattgaaa cccaatatag ctggtttgag ttgcgcgcgc cggcccactc 5400
ctaccagcgc attcatcagc gtttctaccg tcctaaccgc atcgcgcaaa tcctcgtctc 5460
gacagcaatc aaatcaccag cgatgcccct cgacgagttt gcagaggcga actacgggga 5520
atgggacgct atgctcggcg aatatatttt cccagaagac atacaagaag ccgtatgtct 5580
gccctctggt caacgtattc tcgctcttat cttgtccaga tgcccttcgt tcggaccgtc 5640
attgacggat gtgaaccaga cgtgaggcgg cgggttctcg atgctcagtt tatcgccgac 5700
cttctgcgtc gtcaatccac cccgcacgtc cagacctccg ttccacggcc acgtgtaccg 5760
cccccgcaat acgtcaacct gacgagtctc acggggaatc tagatctcct cgtactgcaa 5820
ccggagaagc agaaccctac gcatgtttct gccttgatag acgtcctcgc tttgggactt 5880
tttcacgagc acctgaaggt ggtcggcccg ccgccaaagc acccgagcaa gcacaccctc 5940
aagctccagc aggccaagat gcgattggcc ttgacggagc tcgctaatcg ctgcatcgat 6000
gacaacacca cgatcagctt tccacacaat cgacgactgc gcgagaagta ttggagcgct 6060
gtcatagtgg acggcgtcac ttacgaggtg gcgttgtttg caggcttgta ttgctggccc 6120
acggccgctg atatacctct gtgatttaga taggcgactg cgttgttgtg caagcaaaca 6180
catatcggaa acgaccacct cgcaatctcc ccgacgacct gaccgaactt ccggcgaccg 6240
caatcgtcgc cgattacttc tggtacgttg taattttcgc ttgttactat cgcactcaac 6300
gctcttcgcc caggtttgcg aaggtcatat acatcgacca acacaagaag acgctccatg 6360
tccagtggta tgaacattcg tcgaaaacgt acttggatga gatctcggat ccgcacgagg 6420
tcttcttgtg gccaacgtgc gatgatattg acgccaggat cgttgtgggc aaggctacga 6480
ttcatcgcgc tcctccgact gataaggact ttggagctct ggaatacttc tgccggtgag 6540
ttgttctcct atttgcctcg tgctgactaa catttgctgc atgctcgata gctttgccta 6600
ccatgaggaa gatggttcgt tccaggacat cgacgacagg acgatttcac tgctgcagac 6660
tgtccacccc ccggaaaatt gtgctacatg tcatttccaa gagcaacaga ccgaggagtc 6720
gacttgcgtc gtggagggcg gcgccctgca ttatggtggg cacacatatc atgtggacga 6780
ctatgctctc tacgctgcct caggcggtgg accagcgtgt gtcggtagga tcacggagat 6840
ccattcgcct cggcccgctc gagcttcgac ttcccccaag gtccgtgtcg ctcgactagg 6900
ccggaggtcg gatgtcggct atttccccaa caagatggtc cacgaggtgt gcatcagtta 6960
tgctctgcat aaagtgtttg gtttgattga tattcatgca gcgggagctc ttcctgactg 7020
ggccaacaga gacagtagaa ctggatgcca aggcccttct gaagccatgt gtggtggtac 7080
acaagtccga tgtgcttgac ctggaggcct ggtttgacat ctcgcctttc aacttctacg 7140
cccggtatcg gctccctacc ttgaacagcc cttgggcaca gaagaaaata ctgcacagaa 7200
cagatgttct ggcttgtgat atctgtatag aacaacataa cgaacggttt cagcttctgt 7260
cagacctgag ctcaggtggt caggtttgtc tgcgcacttt cgaccctttc ggaggagtgg 7320
gggcctttgg actcgccatg gaagaactcg gctgcatgaa acttacacat gctgtggaga 7380
tcactcccag tgccgccttg acactaaggt atgtgttttt gtggagataa atctatggct 7440
aactctattg taggaaaaac tcaccagaga cagtggtatt caaccaatgt tccaacctgg 7500
tattccagta tgctgtcaag taccatgccg gaaacctcag cagcaatgat atggtgaagg 7560
atctttatga caacactcca attggcaagc ctccctgccc tggggatatt gactgcatag 7620
tagcaggttt cccttggtga gcccaaactc cttgatattt cttcattact gactatcact 7680
catagtcagc cccattccca gctcaacatg ttcaagaaag ccaacgatcg gaagacaaac 7740
ttgatactca accttctgtc ctgggtggac ttcttgcggc cgaagtattg tttcttcgag 7800
aacgtgcgcg gcttcttgag ctccactctc catgcaagac aagcgagcaa ataccgggtc 7860
gagggcggca tcaagatggg cggcttgaag ttccttaccc gttcactatt ggctatgggg 7920
tgagtgtctc acgcgcttat catacaggaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg 7980
atcccc                                                            7986
<210>2
<211>5762
<212>DNA
<213>Trametes versicolor
<400>
tggagctcgc gcgcctgcag gtcgacacta gtggatctac ctcccgtgag aggaacgacg 60
gcgtcgggcc tttctcacgc gcagcgccga cttcgcgcga cagccgctgg tcagggcagc 120
acagacatct cccatcaccc agcttatacg ctcagttccg gcaccgagtc tgacgaatgc 180
ggcccgcctg caatcccgac actgctcggg gcgcgcgatc agactttccg tgaggacgta 240
aggtgctgtc ggccacctct cgacgctctc acgcataccg cagaattcgc gcgacgaccg 300
cgttccaggg cccttgacag atgctgacac cggtgcaatc ttgacactgt accaaccggg 360
taagtctcgt ccttggttct cggggactgg cgccggtcgc taccccttgg tcattcactc 420
taccagagcg ctggcttcgc cgaggtataa aggatgttgc gcgaaaccct caacacccca 480
actcaagccc cacttgagct tttgcgagat cctccacata ccactcacta ctttcaagtt 540
cttcaacatg tcgaggtttc actctcttct cgctttcgtc gttgcttccc ttgcggctgt 600
ggcccacgct ggtatcggtc ctgtcgccga cctcaccatc accaacgcag cggtcagccc 660
cgacgggttt tctcgccagg ccgtcgtcgt gaacggcggc acccctggcc ctctcatcac 720
cggtaacatg gttcgtctcg gcgcgcacta gcggattgta tcgttcctga cacactgttg 780
cagggggatc gcttccagct caatgtcatc gacaacctca cgaaccacac gatgctgaag 840
agcaccagta ttgtgagcta gtattcctcc tggaggaggc ttcattgtgc taataatcgt 900
cgtgtccagc actggcacgg tttcttccag aagggcacca actgggccga cggtcccgcc 960
ttcatcaacc agtgcccgat ctcatctggc cactcgttcc tgtatgactt ccaggttcct 1020
gaccaggctg gtaagtacgg tcgttatgga gtgtactgcg cattgctaaa tcgcatggtg 1080
aacaggcacc ttctggtacc acagtcactt gtccacgcag tactgtgatg gtctgagggg 1140
tccattcgtt gtttacgacc cgaatgaccc ggccgccgac ctgtacgacg tcgacaacgg 1200
taaggacgaa ttcgaaccgt aaatacccgc ttactgataa ctttccgacg aattagacga 1260
cacggtcatt acccttgcgg attggtacca cgtcgccgcg aagctgggcc ccgcattccc 1320
gtaagtccat gggcattgtg ctattgaatc tctcttaact gtgcatatca gtctcggcgc 1380
cgacgccact ctcatcaacg gtaagggacg ctcccccagc acgaccaccg cggacctcac 1440
tgttatcagc gtcactccgg gtaaacggta tgctatatct tatcttatct gatggtactt 1500
tactgagaca tgctctagtt accgtttccg cctggtgtcc ctgtcgtgcg accccaacca 1560
caccttcagc atcgatggcc acaacatgac gatcatcgag accgactcga tcaacacggc 1620
gcccctcgtg gtcgactcca ttcagatctt cgccgcccag cgttactcct tcgtggtaag 1680
tttgattcct ttcatgaggt tggtcgcaat tagtgattgt atggtcatgt agctcgaggc 1740
caaccaggcc gtcgacaact actggattcg cgccaacccg agcttcggta acgtcgggtt 1800
caccggcggc atcaactcgg ctatccttcg ctatgatggc gccgctgcca tcgagcccac 1860
caccacgcag accacttcga ccgagccgct caacgaggtc aacctgcacc cgctggttgc 1920
caccgctgtc gtatgtaata tcttccgtga ttgagcgcat cgttgctgac ttcgaccccc 1980
acagcctggc tctcccgttg cgggtggtgt tgacctggcc atcaatatgg cgttcaactt 2040
caatggcacc aacttcttca tcaacggcgc gtctttcacg cccccgaccg tgcctgtcct 2100
cctccagatc atcagcggcg cgcagaacgc gcaggacctc ctgccctccg gcagcgtata 2160
ctcgctcccc tcgaacgccg acatcgagat ctccttcccc gccaccgccg ctgcccccgg 2220
tgcgccccac cccttccact tgcatgggca cgcgttcgcg gtcgtccgca gcgccggcag 2280
cacggtctac aactacgaca accccatctt ccgcgacgtc gtcagcacgg ggacgcctgc 2340
ggccggtgac aacgtcacca tccgcttccg caccgacaac cccggcccgt ggttcctcca 2400
ctgccacatc gacttccacc tcgaggccgg cttcgccgtc gtgttcgcgg aggacatccc 2460
cgacgtcgcg tcggcgaacc ccgtccccca ggcgtggtcc gacctctgcc cgacctacga 2520
cgcgctcgac cccagcgacc agtaaatggc ttgcgccggt cgatgatagg atatggacgg 2580
tgacttcgca cttgcaatac ggactctcgc ctcattatgg ttacacactc gctctggatc 2640
tctcgtctgt cgtcggaaca aatttgtata attcgcttaa tggttgaaac aaatggaata 2700
ttgggttatt atgcacgcat ttccctgttt gagcgatgga atgatccacg gttaaaaatg 2760
cgttagcgta acttcaagtc gaccatgctt agctgtagtg cacttgcggt acgaggtgtt 2820
acgctttttg cacgactcct tactactcaa ctatactcaa cgctatagct ctaggttgca 2880
ggcagttggc gttcaatatg atggaactaa tagctccata cattctggtt ggttgtacac 2940
tgcgtgttta ctaatcgcta caagatacat ccacttcacg aactgctatc tttgggccac 3000
gtcgcgatct tcaccgcgct ccccgtgagc gtgaacgtgt gcgtcagctt cgcgtccgtg 3060
tcgagcgcga gcgtgtacgt cccagggtgc acccacttct ccccatcctc atccgcgcgc 3120
gcgatcgcgc ccagcgtcac cggcagctgc gcgaccgtgc tcccccgcgg cgcgagccca 3180
tggatgcgcg tgtacgcgac gagcgtcttc ttcgggtgcg gcgcgggccc aaaggagcca 3240
ctcacgaaca gcagcgcgac gtagtcggac gcgaccttcc ccgtgttcgt cacgcgcacc 3300
gcgaacgtgt cgaggggcgc caggtccagg aacgccacgc tctcctggcc gtgcgtcacc 3360
agctgcgaga tggagtacga tttcgcgggg ccgccgaacg acgcggtgga gtcggcgcca 3420
ggggcggccc aggcgaacgc gaaggttgtg tagtgcagcc cgaagccgaa ctcgaagact 3480
ggggtgccgg agtaccactt gtacgtgcgc ccggggttcg tcgcgctcgg gcgcagagtc 3540
atatccgtca tcgggacctg ttcggcgtac gcggcagggt actgcgtgat gggtaggcgt 3600
cccgcggggg ccgccttgcc cgtgaggatg tcgaagagcg cggtgccgcc gctctggccg 3660
gggtagccgc cccagatgat tgcgtttacc tggtggagta gatgtgcacc cgcgtgatta 3720
gctcctgtcg cgggcgtagt tacaagcaaa agggaatgga atggtacgca ctgctttact 3780
gtgcttgagg gcggtgtcgt cgagctggcc gccaccaaac tgcgcgacga tcagcggctt 3840
gcctacgcgc tctagttccg cgacgaggtc gagttggttt cctggccagg ttacgttgag 3900
gcggtctatc tcctcgcgct cgaccgtttc gtcgagccct cccgcgaaga ccaccgcgtc 3960
cgcgcgcttc gcggcagcga cggcggctgc aaagccgctc gtgtcgttgc gggtagtcac 4020
gttggtgccg aatacatact ccacctcaaa tcctgcttgc tgggcacctt gtactgggct 4080
cacgaggtaa ggggcgatac cgaagtagtt gccctgcatg agccgcgtgg cgttcgccca 4140
ggggccgatg agcgcaagct tgcggacgcg tttcgacagc gggaggagcc cgtcgttctt 4200
cagcaggacc atgccctcga cggcagcggt atgtgcgagc tgctgagctt gcggagtgtt 4260
cacgtcaggc catcctagct gacggtaagg ttgtgccgct ggatcgtcga agtagccgag 4320
gctgcagagt tcgtttagaa tagatttcgg gcataacaga aggtcactta ccggacgagc 4380
gatgcgtatt ggcggatagc tgctctacgg aggtccgtcg agttgaccaa accccgttgc 4440
agcgcctcgg gaagataggt ggacgagaat gtcccacagt cgatgtcagt tcctgcgagc 4500
agcgcgtccg ccgccgcttg cgccgggtcg gtggtatagt tgtgcggcgt gaaaatgttt 4560
tgcacagcgt cgcagtcgct cgtaacccac cgatcgtccg taaagcccca gtggtcgcgg 4620
agcacgtcct gcagcaggaa gctgttcgca cacgacggga tgccgttcac ggcgttgtac 4680
gagcacatca cgctcgcgac cttcgcgtcg cgcacgcacg tctggaacgg cgggaggtag 4740
aactcggaca ggtcctgctg cgagacgacc gcgttgaacc cgtagcgcac gacgccctcc 4800
cagttgtcca tgtcgtacgc ggcgaagtgc ttgcagtcgg cgacgacctt gaagtacggc 4860
ttcgggtcga gcccgccttg caggcccagg atgaggttgt agacatattg ggaaaggtgg 4920
aacggatcct ctcccggggt ctcctggccg cggccccatc ggggatcctt gaacgctatt 4980
agacgctgtt tggtgagcgg tcccacaacg gagagtagaa gagaagactc acggttgata 5040
ttgggcgtcc aataatcgag accagcgcgg ccgacgttgt tgaaggcacg ccattctgtg 5100
ctcacgatgg tcgcgatcgc ttgaatgagt gggtcatcga acgcggcacc catcagaatg 5160
gtttggggga aggaggtcgc ataactgaaa ttgccggatg gtgcaaaggt cacacccggg 5220
ctctgggcta caccgtgcta aacataaaaa tgagtatatt gcgacataga taggccgaga 5280
tacgtaccaa accttctgac caccagttgt aggcgggaag acctagacgg ggtacacccg 5340
gagaggcgtt gactgtgttg ttagtgagct cctcgtcagt ccagatgcta atgagcgccg 5400
tagttcgagt gatagggtcc ttggtgacat cacagacggc gttgttcttc agcgggccgt 5460
tgacacaatc cgggaagcca tacgcccgaa cggtcgcagc gccgacggag aacgcggtga 5520
gaaacgcgtg gagacgacgc agaccgttcg ctatctagac aggcaggaac gtgaggagac 5580
agtccaccac gaaccgttcc attttgccct ctcttttaac ggggaactgg gcgttacgtg 5640
ccagggagaa cgtcggagct gggggcgaag agcatgatcc aaagaattca aaaagcttct 5700
cgagagtact tctagagcgg ccgcgggccc atcgattttc cacccggtgg gtaccagtaa 5760
tt                                                                5762
<210>3
<211>2387
<212>DNA
<2 13>Trametes vetsicolor
<400>3
cagtatgtga agcctctggg gattcctgta gaatcatatg tgaggaaccg acgagcttcc 60
catgcttcca ccgcatatcg tgtagtctcc taccaagcag taaccctaac ggctctttcg 120
gtacaccgta cggagtgcga cggaaaggtc gcggacgtag tgagagaaac gatatgttca 180
caagacctat atcatgagaa caggaacgct agagtcgtcg gccgaaaaca agtcgggtat 240
ccgtgaggca gatatcacgt tgaccaggtt tgcgttggtg gcggatgttg cgacggtttg 300
tacgtaccgt acatggcgta caagacgcgg gagtgagccg tgcaaaatgg gacgaatagg 360
aaccccgtag ccgatatgga ccgcaccgga gggattgttg cccatacata agccatatgt 420
tctcgccgtg ccgcgccgag agctggtgtg cgcactagtg ggtgctatta gaagccgagc 480
gaggtaccgt ccctcaggcc aattggggaa taggacggag gcattcgagt aaaatacaca 540
tgggcatgcc tggatggagg catgcacatg cgcaggaggt tagtgcagcg cggccaatag 600
gagggcagga cggagtgaga tcaggagcga gtctggacgg gccgaagagt gagcgagagc 660
agaggcgcgg tgtggccgca cctgatgtta gagcaaagct tatttctgaa ctcgcggctc 720
gtggaggcca gacaggagta cgagcataga caggcgagag cggccggcga ggcgtcgagg 780
tcgggcggag atcacgtcca tccgtccatt ctgtctgcag cctgtgctta caggcaccgg 840
gacagaggcg tacgatgacg tcgtatcgga cggaggagcg cacgaaacgg agcgcggatc 900
ttgatgtttg cgttagagag cagcgggatg agcgaggacg agcgttgaca aacgtctgac 960
tgagcagggc aagcaagagc tccgtgctgc gcggcggtgg gagggaagag ccgagggcgt 1020
gattggacga gggaaggagt catccagacc gcgtcttcgg cgaactgggc gaagaaggct 1080
ggaagagcga cgaggctcgc cggcgcgcgc gcacgctggg ctgctatcga ttgatggtcg 1140
ctcgagcagc gacgttggcc gaggcactgt cctcgaaaga ctcaaatcgt acggtgggcc 1200
ggacatggcc taccggcgac caatccgcga tgggcaaatg tcggtctcgt tatccacgca 1260
cgttctatct cgcccgttgg cacgcccaag gacgactgcg ctgcgactgg gcagtcgtcg 1320
tgggggaaaa cactgcgagg tgcgcggaag ggtgtcgaag gccaaggacg agcggagaac 1380
gggcggcggc gcgggccagc gagcgcccaa agcggaagga cagcacaggc gctgggcggg 1440
tagcgtccga tccatctcag ataagaatcg cccctgcggt atataacgca gaccttgcgc 1500
cccgactgaa ccccatcctc tcatcccatc caccacatcc acatgtcggt cagtacccgg 1560
ctcacccttg cagtccctgc atgcgctgac ctctccctgc agcaacaagt caacgtcgga 1620
atcaacgggt aagatcgctc gcggacttga attcaccgca tacatcctaa tctcgcccaa 1680
tccgcgtcct tttccagttt cggtgagcct gctccctccc tcgcttttaa tcgcgcgcat 1740
atactcaccc attcgcaggt cgtatcggcc gtatcgtcct ccgtaatgcc ctccagcacg 1800
gcaagatcaa tgtcgtcgct gtgaacgagt aagcgcgccc aatctgcatc gcgtaaatca 1860
gacgcgctct aactccctgc gcgcagccct ttcatcgacc ttgagtacat ggtctacatg 1920
ttcaagtacg actccgtcca cggccgcttc aagggccacg tcgaggtcaa ggacggcaag 1980
ctctgggtcg agggcaagcc catcaccgtc ttccaggaga aggacgccgc caacattccc 2040
tggggctccg ccggcgccga ctacatcgtc gagtccaccg gtgtcttcac caccaccgaa 2100
aagtgcgcat acactcaccc aaacatggca ttttgtgact gacgcggttc ccgatcgata 2160
gggcctctgc ccacttgaag ggcggtgcca agaaggtcat catctccgcc ccctccgccg 2220
acgcgcccat gttcgtctgc ggtgttaacc tggactcgta cgaccccaag tacactgtcg 2280
tgcgtgcatt ttcccatcgc gtcgcgcgag aaccccgatt tacctccgcc cgcgtgtaga 2340
tccactagtg tcgacctgca ggcgcgcgag ctccagcttt tgttccc               2387
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
<220>
<221>引物结合
<222>互补((1)..(21))
<400>4
tccagctcga ccttgcgccg c
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(17)
<400>5
ggatccgacg tggaggagcc g
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
简并
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(17)
<400>6
tggcayggnt tyttyca                                                     17
<210>7
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
简并
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(14)
<400>7
tcdatrtgrc artg                                                        14
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物结合
<22 2>(1)..(27)
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
简并
<400>8
attcagggat cctggtayca ywsncay                                          27
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(27)
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
简并
<400>9
atacgaggat ccrtgnccrt gnarrtg                                          27
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(23)
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
<400>10
cgtatcggcc gtatcgtcct ccg                                              23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物结合
<222>(1)..(23)
<220>
<223>人工序列描述：cDNA
<400>11
cgcccttcaa gtgggcagag gcc                                              23
<210>12
                                                                       10
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-特征
<222>()..)
<220>
<223>人工序列描述：接头cDNA.正链
<400>12
aattcgcggc cgc                                                         13
<210>13
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-特征
<222>(1)..(13)
<220>
<223>人工序列描述：接头cDNA，负链
<400>13
aattgcggcc gcg                                                         13

Claims (10)

1、一种适合在丝状真菌内生产蛋白质的表达系统，包括
a)一由栓菌或多孔菌属中选出的宿主生物；
b)一含有选择标记基因的DNA载体，该基因编码一蛋白质，该蛋白质，于宿主生物转化后，允许选择阳性转化株，该基因选自下述一组：抗生素抗性的基因，其编码破坏抗生素的生长抑制作用的蛋白质，宿主生物无抗生素抗性；编码具有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的基因；而选择标记基因的表达受至少一种在宿主生物中活化的基因调节元件控制；及
c)一含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，而此基因的表达及以此方式所生产的蛋白质的分泌，系受一在宿主生物中活化的基因调节元件控制，
其中含有选择标记基因的DNA载体，及含有编码待生产的蛋白质的基因的DNA载体，亦可以一个DNA载体形式存在。
2、根据权利要求1所述的表达系统，其中宿主生物为栓菌或多孔菌属的单核细胞菌株。
3、根据权利要求1或2所述的表达系统，其中宿主生物为变色栓菌。
4、根据权利要求1或2所述的表达系统，其中宿主生物具有乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因缺陷且是尿嘧啶核苷营养缺陷型，且选择标记基因为乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因。
5、根据权利要求1或2所述的表达系统，其中在宿主生物中活化的基因调节元件，系选自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子元件及终止子元件，以及漆酶基因的启动子及终止子元件。
6、根据权利要求1或2所述的表达系统，其中待表达的蛋白质为漆酶。
7、一种含有至少一种选择标记基因的DNA载体，该选择标记基因编码一蛋白质，该蛋白质于转化选自栓菌及多孔菌属的宿主生物后，允许选择阳性转化株，其中该选择标记基因由下述一组中选出：抗生素抗性的基因，其编码破坏抗生素的生长抑制作用的蛋白质，宿主生物无抗生素抗性；编码具有生色反应能力的蛋白质的基因；及互补宿主生物内营养缺陷型基因缺陷的基因；而选择标记基因的表达受至少一种在宿主生物中活化的基因调节元件控制。
8、一种在栓菌及多孔菌中活化的调节元件，包括SEQ ID NO：1内碱基1-1192的序列，或SEQ ID NO：2内碱基1-547的序列，或SEQ ID NO：3内碱基1365-1542的序列。
9、一种适合生产能有效表达与分泌蛋白质的真菌菌株的方法，包括用一由栓菌及多孔菌属中选出的真菌作为宿主菌株，该宿主菌具有尿嘧啶核苷营养缺陷型基因缺陷，并用一种DNA载体转化，该DNA载体具有一基因，其能互补宿主菌株中的营养缺陷型基因缺陷；以及从转化混合物选择用DNA载体转化的克隆，所述选择通过选择对营养缺陷型基因缺陷的互补而进行，其中用于互补宿主菌株内营养缺陷型基因缺陷的基因的表达由一在宿主菌株内活化的基因调节元件控制。
10、一种生产蛋白质的方法，包括用如权利要求1至6中任一项所述的表达系统生产蛋白质，或包括培养用如权利要求9所述的方法制备的真菌菌株。
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