CN1160459C

CN1160459C - 乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因

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Publication number: CN1160459C
Application number: CNB991084500A
Authority: CN
Inventors: ʷ; 曾根旉史
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: AU749069B2; PE20000759A1; SK77199A3; MY114645A; EP0967282A2; KR20000006104A; EP0967282A3; KR100629091B1; PL195017B1; BR9902248A; EP0967282B1; SK284945B6; AU3392699A; CN1239142A; ID22875A; PL333692A1; US6156886A; DE69926691T2; JPH11346776A; DE69926691D1

Abstract

根据黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位IN末端和亚单位IIN末端的氨基酸序列合成寡核苷酸，用此寡核苷酸作引物，黄色短杆菌染色体DNA作模板进行PCR，以上述得到的扩增片段为探针，从乳发酵短杆菌染色体文库中获得编码黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。

Description

乳发酵短杆菌细胞色素BD型醌醇氧化酶基因

技术领域

本发明涉及乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的细胞色素bd型醌醇氧化酶及编码该氧化酶的DNA。

背景技术

大多数生物通过呼吸作用获得生命活动必需的能量。在高等生物中，糖类，蛋白质和脂肪酸被细胞浆中的糖酵解途径和β-氧化降解成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，乙酰-CoA被线粒体中的柠檬酸循环降解。产生的能量以NADH和FADH₂中还原力的形式储存。最后，NADH被位于线粒体内膜上的电子传递体系彻底氧化成水，形成与氧化作用偶联的质子浓度梯度，作为ATP合成的推动力。

依据种类和生长环境不同，细菌的呼吸链通常包括不同的功能酶复合物，能量守恒效率也可能有很大差异。例如，大肠杆菌(EscherichiaColi)含至少两种醌醇氧化酶，bo型和bd型，它们用作呼吸链的末端氧化酶。当在好气培养时，比较具有两种类型酶的野生型菌，只具有bo型的突变株和只具有bd型的突变株的生长产率时，发现只具有bd型酶的突变株的生长产率最低，并且依赖于末端氧化酶的种类和其能量守恒效率(生物科学和生物工程学会会议报告摘要，日本，1995，主题号357)。

棒状菌(Coryneform bacterium)如乳发酵短杆菌和黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)为格兰氏阳性和需氧细菌，是工业上用于生产氨基酸的细菌。尽管对于这些原核细菌(proteobacteria)的呼吸链末端氧化酶已做了广泛研究，它在系统发生学上与棒状菌相差很远，对于与棒状菌同样是格兰氏阳性菌而与它们在系统发生学上有些不同的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和嗜热芽孢杆菌(thermophilicBacillus)的呼吸链末部分的氧化酶也做了广泛研究，但是还未对棒状菌呼吸链中的电子传递体系做细致的研究。就收集对于提高有用物质的产率的基本数据而言，详细阐明棒状菌中能量代谢的关键组分即呼吸链中的电子传递体系有重要意义。进一步，如果能够确定棒状菌呼吸链中电子传递体系的酶及其基因，它们则可用于，如，产生具有更高能效的菌株。

目前，据报道乳发酵短杆菌的呼吸与质子传递相偶联，并涉及了细胞色素a，b和c(Kawahara，Y.，等(1988) 农业生物化学， 52(8)，1979-1983)。已纯化和鉴定了黄色短杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶(Kusumoto，Sone和Sakamoto“氨基酸发酵细菌，黄色短杆菌的呼吸链及其细胞色素bd型甲醌醇氧化酶的特征”第23届生物能量研究组学术会议摘要，1997)。但是，没有有关编码棒状菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因的报道。

发明内容

本发明是从前述观点进行的，其目的是得到棒状菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶的基因并阐明其结构。

本发明人根据黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的亚单位I的N末端和亚单位II的N末端氨基酸序列合成寡核苷酸，用此寡核苷酸作为引物，黄色短杆菌的染色体DNA做模板进行PCR以获得扩增片段。进一步，他们用扩增片段作为探针筛选了野生型乳发酵短杆菌的染色体DNA文库，成功地得到了编码乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。这样就完成了本发明。

也就是说，本发明提供：

(1)一个编码下述(A)或(B)定义的多肽的DNA片段；

(A)具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，

(B)具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，它可包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的替代，删除，插入，添加或倒位，组成能够与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白，

(2)一个编码下述(C)或(D)定义的多肽的DNA片段；

(C)具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，

(D)具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，它可包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代，删除，插入，添加或倒位，组成能够与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚基I联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

(3)一个编码下述(A)或(B)定义的多肽和下述(C)或(D)定义的多肽的DNA片段；

(A)具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，

(B)具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，它可包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代，删除，插入，添加或倒位，组成能够与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

(C)具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，

(D)具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，它可包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代，删除，插入，添加或倒位，组成能够与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

(4)上述(1)中的DNA，为下述(a)或(b)定义的DNA；

(a)具有与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA；或

(b)在严谨条件下可与上述(a)的核苷酸序列杂交的DNA序列，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

(5)上述(2)的DNA，为下述(c)或(d)定义的DNA：

(c)具有与序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA；或

(d)在严谨条件下可与上述(c)的核苷酸序列杂交的DNA序列，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

(6)上述(3)的DNA，为包含下述(a)或(b)定义的DNA和下述(c)或(d)定义的DNA：

(b)在严谨条件下可与上述(a)的核苷酸序列杂交的DNA序列，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白；并且

(7)上述(1)中定义的DNA片段，具有包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸的核苷酸序列，

(8)上述(2)中定义的DNA片段具有包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列，并且

(9)上述(3)中定义的DNA片段，它具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第933至3498位核苷酸的核苷酸序列。

在本说明书中，术语细胞色素bd型醌醇氧化酶活性指表现细胞色素b和细胞色素d的氧化还原差别吸收光谱的活性，它是通过消耗氧气来氧化还原型苯醌复合物。根据具体情况，编码细胞色素bd型醌醇氧化酶或其亚基的DNA片段将被称为“本发明的DNA”。

附图说明

图1代表了乳发酵短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusStearothermophilus)和大肠杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I的亲水性分析结果。符号“☆”代表了三种氧化酶共有的氨基酸残基。

图2代表了乳发酵短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I的氨基酸序列对比。

图3代表了乳发酵短杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II的氨基酸序列对比。

具体实施方式

将在下文中给予本发明更为详细的解释。

根据黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列，可从乳发酵短杆菌的染色体DNA中获得本发明的DNA。具体地，用根据氨基酸序列合成的寡核苷酸作为引物，黄色短杆菌的染色体DNA作为模板获得黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因的部分序列。然后，用得到的部分序列作为探针筛选乳发酵短杆菌的染色体DNA文库，可得到编码乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。

可用如，Saito和Miura( 生物化学和生物物理年报， 72 619(1963)的方法和K.S.Kirby( 生物化学杂志， 64，405，(1956))的方法制备黄色短杆菌和乳发酵短杆菌的染色体DNA。获得染色体DNA文库的步骤包括，用合适的限制性酶部分消化染色体DNA，将得到的每一个DNA片段连接到可在大肠杆菌细胞中自主复制的DNA载体中以制备重组DNA，然后将此DNA导入大肠杆菌。载体不受特别地限制，只要是能够用于基因克隆就可以，质粒载体如pUC19，pUC18，pUC118和pUC119噬菌体载体如λ噬菌体DNA等都适用。

用于PCR的引物可以是，如，具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的寡核苷酸。为了证实得到的PCR产物具有希望的序列，可通过核苷酸测序证实它含有与引物一致的序列，或证实由核苷酸序列推断的氨基酸序列包含黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列。

如果用质粒载体制备文库则通过菌落杂交的方法，若用噬菌体载体制备文库则通过噬斑杂交的方法，利用PCR中得到的DNA片段作为探针筛选乳发酵短杆菌的染色体文库。通过对从克隆中制备的DNA进行核苷酸测序，可证实杂交阳性克隆包含目的细胞色素bd型醌醇氧化酶基因。也可用此探针对杂交阳性克隆初步进行Southern分析。

以上述方式在实施例中得到的乳发酵短杆菌ATCC 13869株的细胞色素bd型醌醇氧化酶基因的核苷酸序列列于SEQ ID NO：1。预测的编码区和由其编码的蛋白的氨基酸序列列于SEQ ID NOS 1-4。用GENETYX-Homology Version 2.2.2(软件发展有限公司)，估计了嗜热脂肪，芽孢杆菌K1041和大肠杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶的编码区和操纵子结构，并分析了其同源性。

细胞色素bd型醌醇氧化酶基因包含两个开放阅读框架(从5′末端阅读的 cyd A和 cydB)，它们分别编码细胞色素bd型醌醇氧化酶的亚单位I(在下文也只称其为“亚单位I”)和其亚单位II(在下文也只称其为“亚单位II”)。据估计 cydA和 cydB分别包括1551bp和1023bp，亚单位I由517个氨基酸残基组成。亚单位II由341个氨基酸残基组成。一个启动子样序列位于 cydA的上游，一个SD样序列分别位于cydA和 cydB的上游，一个终止子样序列位于 cydB的下游。因此， cydA和 cydB被认为形成一个cyd操纵子。

尽管亚单位I的N末端氨基酸残基的密码子为GTG，其在序列表中相应的氨基酸是Val，它实际上是Met。这是由于GTG被看作是起始蛋氨酸的缘故。这样的情况在其它地方也有报道。

图1和图2代表了比较本发明的细胞色素bd型醌醇氧化酶与嗜热脂肪性芽孢杆菌及大肠杆菌亚单位I结构得到的亲水性分析结果以及氨基酸序列对比的结果。I-VII代表跨膜螺旋区，并且已证明至少有7个跨膜螺旋。从图中的模式可以理解它们彼此相似。进一步，含有一个醌醇结合位点，被称为Q环的区域位于大肠杆菌亚单位I的V和VI之间，而乳发酵短杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的cydA Q环的后半部分缺乏同源性，因此Q环被剪短了。考虑到这一点，乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶结构与嗜热脂肪芽孢杆菌而不是大肠杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶的结构相似。亚单位I的氨基酸序列比较表明乳发酵短杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌有约24.7％的同源性，与大肠杆菌有约38.6％的同源性，据认为，就亚单位I整体而言，乳发酵短杆菌的结构与大肠杆菌而不是嗜热脂肪芽孢杆菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶的结构更相似。

据报道，大肠杆菌 cydA的H19，H186和M 393以及嗜热脂肪芽孢杆菌cydA的H21，H184和M 329就作为hem b558的配体而言，是功能上重要的残基。这些氨基酸残基在乳发酵短杆菌cydA中也是保守的，它们是H18，H185和M350。

图3代表了这三种细菌的亚单位II的氨基酸序列对比。对于亚单位II，乳发酵短杆菌与嗜热脂肪芽孢杆菌有约25.9％同源性，与大肠杆菌有约34.8％同源性。

本发明的DNA是编码亚单位I的DNA，它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码，本发明的DNA是编码亚单位II的DNA，它由SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列编码，或者本发明的DNA是编码含有亚单位I和亚单位II的细胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白的DNA。亚单位I，亚单位II或细胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白的制备方法包括，将这样的DNA导入合适的宿主细胞，培养得到的转化子以使DNA表达。具有包含SEQID NO：1所示的核苷酸序列第933至2483位核苷酸的核苷酸酸序列的DNA可作为编码亚单位I的DNA，具有包含第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列的DNA可作为编码亚单位II的DNA，具有包含第933至3498位核苷酸的核苷酸苷序列的DNA可作为编码两个亚基的DNA。用通常的纯化蛋白的方法如，盐析，溶剂沉淀，凝胶过滤层析和离子交换层析，从培养物中收集和纯化产生的细胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白或其亚基。

本发明的编码亚单位I的DNA或者是编码具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列多肽的DNA，包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的替代，删除，插入，添加或倒位，或者是编码的多肽能够组成与亚单位II一起表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白的DNA。

本发明的编码亚单位II的DNA或者是编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列多肽的DNA，包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的替代，删除，插入，添加或倒位，或者是编码的多肽能够组成与亚单位I一起表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白的DNA。

进一步，编码亚单位I，亚单位II或亚单位I和亚单位II都有突变的细胞色素bd型醌醇氧化酶的DNA也包含于本发明DNA中。

术语“多个氨基酸残基”优选地指1-40个，更优选地1-10个氨基酸残基。

编码与上述的亚单位I和/或亚单位II基本相同的蛋白DNA可通过如修饰核苷酸序列得到，如用定点突变方法以使在特定位点上的一个或多个氨基酸残基被替代，删除，插入，添加或倒位。通过常规的为人熟知的突变处理，可获得上述经修饰的DNA。突变处理包括例如，用羟胺体外处理编码亚单位I和/或亚单位II DNA的方法，也包括处理微生物的方法，例如，用紫外线照射或常用于突变处理的突变剂如，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和硝酸处理含有编码亚单位I和/或亚单位II的DNA的，属于埃希氏菌属的细菌。

上述核苷酸的替代，删除，插入，添加或倒位也包括天然存在的突变(突变体或变异体)，例如，以含有细胞色素bd型醌醇氧化酶的个体差异或棒状菌种间或属间差异为基础的突变。

编码与亚单位I和/或亚单位II基本相同蛋白的DNA可通过在合适的细胞中表达具有上述突变DNA并研究表达产物的活性获得。编码与亚单位I和/或亚单位II基本相同蛋白的DNA可通过从编码具有突变的亚单位I和/或亚单位II的DNA或从具有此DNA的细胞中分离在严谨条件下与DNA杂交的DNA来实现，例如，用于分离DNA的DNA具有与SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列和/或具有与SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列，并且分离到的DNA编码的蛋白具有亚单位I和/或亚单位II的活性。

“严谨条件”在此指这样的条件下，形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交。难以用数值表达这种条件。然而，例如严谨条件包括一种条件，在这种条件下，例如，具有不少于50％同源性的DNA可以彼此杂交，而同源性低于50％的DNA彼此不能杂交。换种说法，严谨条件指在这个条件下，在与Southern杂交洗涤中普通条件一致的盐浓度下DNA可以彼此杂交，即，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选地，0.1×SSC，0.1％SDS。

在上述条件下可以杂交的基因包括那些在基因的编码区内具有终止密码子的基因和那些由于活性中心突变失去活性的基因。然而，这种不利的避免可通过将此基因与一个商业化的活性表达载体相连并研究细胞色素bd型醌醇氧化酶活性来实现。

表达本发明DNA的宿主包括，如，各种细菌，如大肠杆菌，棒状菌如，乳发酵短杆菌和黄色短杆菌，真核细胞如啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等。为了将本发明的DNA导入如上述宿主中，可通过将本发明DNA插入载体并将此重组载体转入宿主细胞实现，载体的选择依赖于进行表达的宿主类型。可通过本领域技术人员熟知的基因重组方法进行操作。

本发明的DNA和/或由其细胞色素bd型醌醇氧化酶或其亚基可用于阐明棒状菌的电子传递体系。本发明的DNA也期望用于培育生产具有高效能的有用物质的棒状菌。

用下述实施例为参考，本发明将被特别说明。

<1> 黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的纯化

将培养至稳定期末的黄色短杆菌ATCC 14067株细菌细胞(约120g湿重)悬于200ml缓冲液中(0.5％NaCl，10mM磷酸钠，pH 7.4)，立即在0.5mM玻璃颗粒存在情况下，在bead beater(Biospec)中高速搅拌以破碎细菌细胞。将破碎的细胞悬液于5,000rpm离心10分钟以去除未破碎细菌细胞，将上清于15,000rpm离心10分钟，进一步将得到的上清于15,000rpm离心30分钟。合并两次离心的沉淀物并将其悬浮于上述缓冲液中以得到膜制备物。

用Teflon匀浆器将上述膜制备物(5mg/ml，0.5％NaCl，10mM磷酸钠，pH 7.4)搅匀，于40,000rpm离心20分钟，收集沉淀。沉淀中加入1.5％胆酸钠，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％NaCl和10mM磷酸钠(pH7.4)，然后搅匀并于40,000rpm离心20分钟以收集沉淀。进一步在沉淀中加入10mM磷酸钠(pH 7.4)，搅匀，于40,000rpm离心20分钟以收集沉淀。

用胆酸洗涤的上述膜制备物被悬于含有浓度分别为1％的表面活性剂，正壬酰基-N-甲基葡糖酰胺，(n-nonanoyl-N-methylglucamide)(MEGA-9)和癸酰-N-葡糖酰胺(MEGA-10)。将此悬浮液在冰上搅匀，超声并于40,000rpm离心20分钟以获得上清。

用以1％MEGA-9，1％MEGA-10，10％甘油和10mM磷酸钠(pH7.4)平衡的羟基磷灰石柱吸收，用浓度逐步提高的磷酸钠梯度(0，50，150，250和400mM)洗脱以分级分离上述离心得到的上清。用还原减去氧化差示光谱(reduced minus oxidired difference spectrum)检测组分中的细胞色素。结果，以50mM磷酸钠洗脱的组分中检测到了细胞色素c和b，在150mM磷酸钠洗脱的组分中检测到了细胞色素c，b和a，在250mM磷酸钠洗脱的组分中检测到了细胞色素b和d。

以10％甘油和10mM磷酸钠(pH 7.4)透析以250mM磷酸钠洗脱的组分，然后用以相同缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl(Tohso)柱吸收，用浓度逐步提高的NaCl梯度(0，80，100，120，140和300mM)洗脱进行分级分离。用氧化减去还原差示光谱检测组分中的细胞色素。结果，以120mM浓度的NaCl洗脱的组分中检测到了细胞色素b和d。此组分用作细胞色素bd型醌醇氧化酶制备物。

用13.5％凝胶对上述酶制备物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将之转印到PVDF膜上。对膜上与亚单位I和亚单位II一致的部分进行氨基酸序列分析以测定N末端氨基酸序列。氨基酸序列分别示于SEQID NO：5(亚单位I)和SEQ ID NO：6(亚单位II)。

<2>分离乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因

用菌落杂交筛选乳发酵短杆菌染色体DNA文库以得到含有细胞色素bd型醌醇氧化酶基因的克隆。

根据上述黄色短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列，合成两种寡核苷酸。其一是根据细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I的N-末端氨基酸序列制备的(bbd1：SEQ ED NO：7)，另外一个是根据亚单位II的N-末端氨基酸序列制备的(bbd2：SEQ ID NO：8)。

用上述bbd1和bbd2作引物，ATCC 14067株的染色体DNA进行PCR。反应条件为，94℃变性1分钟后，进行35个循环，每个循环包括，95℃变性45秒，50℃退火60秒，62℃链延伸90秒。结果，产生了约1500bp，800bp和100bp的片段。根据纯化蛋白估计的亚单位I的分子量为56.4kD以及报道的其它细菌的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I的分子量，1500bp的片段被认为是所希望的PCR产物。所以，在2％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，从凝胶上切下约1.5kbp的片段以抽提DNA。

用DNA补平试剂盒(Takara Shuzo)将DNA片段末端补平，并用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将其连接到用Sama I消化及用碱性磷酸酶处理过的PUC 118载体中。用得到的重组引物转化大肠杆菌XL-1 Blue株。

从得到的转化子中制备质粒，测定插入的核苷酸序列。用荧光素标记的引物M4(Takara Shuzo，SEQ ID NO：9)作为正向引物，荧光素标记的引物RV-MF(Takara Shuzo，SEQ ID NO：10)作为反向引物根据热序列荧光标记的引物循环测序试剂盒(Amersham Life Science)的说明书，进行核苷酸测序。结果，根据与引物的同源性证实细胞色素bd型醌醇氧化酶基因包含于质粒中。将此部分克隆命名为BD1。

用前述的引物M4和RV-M用PCR方法扩增BD，用DIG DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)制备DIG(地高辛)标记的探针。

用前述探针筛选乳发酵短杆菌染色体DNA文库。用 Sau 3A1部分消化乳发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA，将产物插入pUC18的BamHI位点，用得到的重组质粒转化大肠杆菌XL-1 Blue以得到此文库。用上述以DIG标记的探针与转化子克隆进行菌落杂交。

用利用标有碱性磷酸酶的抗DIG抗体的DIG检测试剂盒(Boehringer Mannheim)检测探针。

从杂交阳性的克隆中制备质粒，并以 EcoRI和 PstI消化，然后用BD1作为探针对消化产物进行Southem印迹。结果，获得两个阳性克隆。含有插入片段的阳性克隆分别被命名为BD21和BD31。BD21约3.8kbp，BD31约为9.0kbp。这些克隆被亚克隆，核苷酸序列被测定。结果示于SEQ ID NO：1。期望的编码区及由其编码的蛋白质氨基酸序列示于SEQ ID NOS 1-4。

序列表

<110>Ajinomoto有限公司

<120> 乳发酵短杆菌细胞色素bd型醌醇氧化酶基因

<130>OP852

<140>

<141>

<150>JP 10-164019

<151>1998-06-11

<160>10

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>3936

<212>DNA

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(933)..(2483)

<400>1

ggatcctctc tgttcaaaac agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60

acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120

aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180

tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa 240

acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300

ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360

cgatccgaat acccttcatt ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420

caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt catgtttttg tgaagaagga cgatgccgaa 480

ggccttgatt tcttctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540

cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt cgacacaccc 600

gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctgagc acaaatctcg ccgtaacgga gtaaccaccg 660

caaccaagcg tcgaaaagca aaatcttttc gagtttttgg tgacttgtca acaagggggg 720

agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggtt gaccacaatc ggggttagcc tttctaaagt 780

taagctgtga gcgggaactt aggaataaac ttcaacgaca acctttaaga agctcttatt 840

ggttcttcgt tttgtatcga taaatacaat cggtttcctg gctcaataag gctgttcctg 900

tcaatctgta aagaagagga aggggaccta gc gtg gat gtc gtt gac atc gcg 953

Val Asp Val Val Asp Ile Ala

1 5

cgg tgg caa ttc gga att acc acc gtc tat cac ttc att ttt gtc cca 1001

Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val Tyr His Phe Ile Phe Val Pro

10 15 20

ctg acc att ggc tta gca ccg ctg gtc gcg atc atg caa acg ttt tgg 1049

Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp

25 30 35

caa gtt acc ggc aaa gag cac tgg tat cgg gct acg aga ttt ttt ggc 1097

Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly

40 45 50 55

act gtg ctg ctc atc aac ttc gcg gtt ggt gta gca acg ggc att gtg 1145

Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala Val Gly Val Ala Thr Gly Ile Val

60 65 70

cag gag ttc cag ttc ggt atg aac tgg tcg gaa tat tcg cgt ttc gtc 1193

Gln Glu Phe Gln Phe Gly Met Asn Trp Ser Glu Tyr Sar Arg Phe Val

75 80 85

ggt gat gtt ttc ggc gga ccg ctg gct ttg gag ggg ctc arc gcg ttc 1241

Gly Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe

90 95 100

ttc ctt gag tct gtg ttc tta ggt ctg tgg att ttc gga tgg ggg aag 1289

Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu Trp Ile Phe Gly Trp Gly Lys

105 110 115

att cct gga tgg ctg cat act gcg tcc att tgg atc gtt gct att gcg 1337

Ile Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser Ile Trp Ile Val Ala Ile Ala

120 125 130 135

acg aat att tct gcc tat ttc atc atc gtg gcc aac tcg ttt atg cag 1385

Thr Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile Val Ala Asn Ser Phe Met Gln

140 145 150

cat ccg gtg ggt gct gag tat aac cct gag act ggt cgg gcg gag ctt 1433

His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu

155 160 165

act gat ttc tgg gct ctt ctc aca aac tcc acc gcg ctg gct gcg ttc 1481

Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe

170 175 180

ccg cat gct gtt gcc ggt ggt ttt tta aca gct gga act ttc gtc ctc 1529

Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu

185 190 195

gga att tcg ggt tgg tgg att att cgt gcg cac cgc cag gcg aag aag 1577

Gly Ile Ser Gly Trp Trp Ile Ile Arg Ala His Arg Gln Ala Lys Lys

200 205 210 215

gct gag gcg gaa atc gag tcg aag cat tca atg cac agg ccg gcg ttg 1625

Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His Ser Met His Arg Pro Ala Leu

220 225 230

tgg gtt ggt tgg tgg acc aca gtt gtc tct tcc gtg gca ctg ttc atc 1673

Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile

235 240 245

act ggc gat aca cag gcg aag ctc atg ttc gtg cag cag ccg atg aag 1721

Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met Phe Val Gln Gln Pro Met Lys

250 255 260

atg gcg tcg gcg gaa tcc ttg tgt gaa acc gcc aca gat cca aac ttc 1769

Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe

265 270 275

tcc att ctg aca att ggt acg cac aac aac tgc gat acg gta acc cac 1817

Ser Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn Asn Cys Asp Thr Val Thr His

280 285 290 295

ctg atc gat gtt ccg ttt gtg ctt cca ttc ttg gct gaa gga aaa ttc 1865

Leu Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe

300 305 310

acc ggt gtg act ttg cag ggt gta aac cag ctc caa gct gca gcg gag 1913

Thr Gly Val Thr Leu Gln Gly Val Asn Gln Leu Gln Ala Ala Ala Glu

315 320 325

caa gca tac ggt cct ggc aac tac tcc cct aac ttg ttt gtc acc tac 1961

Gln Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr

330 335 340

tgg tca ttc cgc gca atg atc ggc cta atg ctt ggt tct ttg gct atc 2009

Trp Ser Phe Arg Ala Met Ile Gly Leu Met Leu Gly Ser Leu Ala Ile

345 350 355

gct gcg att gcg tgg ctg ttg ctg cgt aag aag cgc aca cca act gga 2057

Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly

360 365 370 375

aag att gct cgt ctc ttc caa atc ggc agc ctc att gcc att cca ttc 2105

Lys Ile Ala Arg Leu Phe Gln Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe

380 385 390

cca ttc ttg gct aac tct gct ggt tgg atc ttc acc gag atg ggc cgc 2153

Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp Ile Phe Thr Glu Met Gly Arg

395 400 405

cag cct tgg gtg gta cac ccg aat cct gaa tct gcc ggc gat gcc cga 2201

Gln Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg

410 415 420

aca gag atg atc cgg atg act gtt gat atg ggt gtg tct gat cat gcg 2249

Thr Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp Met Gly Val Ser Asp His Ala

425 430 435

ccg tgg caa gtc tgg ctg act cta att ggc ttc acg att ctc tat ctc 2297

Pro Trp Gln Val Trp Leu Thr Leu Ile Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu

440 445 450 455

atc ttg ttc gtg gtg tgg gtg tgg ctg att cgc cgc gca gtt ctg atc 2345

Ile Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu Ile Arg Arg Ala Val Leu Ile

460 465 470

gga cca cca gag gaa ggc gct cca tcc gtg gag gca aag act gga ccg 2393

Gly Pro Pro Glu Glu Gly Ala Pro Ser Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro

475 480 485

gca acc ccg att ggt tca gat atg ccc atg aca ccg ctg caa ttt acc 2441

Ala Thr Pro Ile Gly Ser Asp Met Pro Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr

490 495 500

gtg ccg ccc caa cca cac gtg aaa agg aat aac cat gga tct 2483

Val Pro Pro Gln Pro His Val Lys Arg Asn Asn His Gly Ser

505 510 515

taataccttt tggtttattc tcatcgcatt tttgtttgcg ggatactttc tcctcgaagg 2543

attcgacttc ggtgtcggaa ttttagcgcc gatcatcggt aaagattccg ccgctaaaaa 2603

cacgatcatc cgcaccatcg gccctgtctg ggacggaaat gaagtgtggc tgatcgtggc 2663

aggtggcgct ttgtttgctg cattccctga gtggtacgca acgatgttct ccggaatgta 2723

tctgccgctg ttcctcgtgc ttgtgtcgtt gatcatgcgc gtggtgggcc ttgaatggcg 2783

caagaaagtc gatgatcctc gttggcaaaa gtggtctgac cgggccatct ttattggttc 2843

ttggactcca ccgctgatgt ggggattcat cttcgccaat attttcaagc ttgcatgccc 2903

atcaaggcgg atcacaccat cgatgctgca gtggctctgc tgtgcaatgt tcaacgtctt 2963

cgccatcctg ggtgcacttg cattcactgc gctgttcgct cttcatggcc ttgcattcat 3023

ccgcctgaaa actgctggtc gggtgcgcac cgatgcggcg aaggcagctc cagtagtcgc 3083

acttcttgct gcggtgactg gtggaccttt cgtgttgtgg gctgccatcg catacggccg 3143

ttcctggtcc tggatcctcg cagtgctgat catcgcagcg gttctcggtg gagctttcgc 3203

actgatcaaa gaccgcgatg gattaagctt cctgtccact tccgtcgctg tcatcggtgt 3263

agttgcactg ctgtttagtt ccctattccc caacgtcatg ccaacaacgc ttgccgatgg 3323

cgtgactgga tatttggaac gcctccgcaa gccactacgc attgaccatc ctgacttgga 3383

ccgccactgt gatcgcaccg ctggttgtcc tctaccaagg ctggacctac tgggtgttcc 3443

gcaaacgact tcacgccgag ccagtgtctg cctaaaagtt ggaaaaattg agtactaaat 3503

ctgacgctcc ggctagtcgc cgcacaggcc ccgtcgatcc gcggcttttg cgcctatccc 3563

ctgctacccg ccgttgggtg ataatcgcag gtgttctcac cgcgttgaaa actctcgcga 3623

cagtcgcaat gggcttgctc atcggccaga tggcagcggg catcattgag gtttcgggaa 3683

gttctttgcc ccgaatggaa ctcatcgcgc tcgccatcac ggtggttgtg cgcggacttc 3743

ttgcgtgggc acaggatcgg ttcggagcgc gcatcgtccc aggtgactgt ggatcttcgg 3803

gagaaaaccc tgcggcacct ggcacaaagc gatccccgca ccatcgatca agccttgtgg 3863

cgcacccgtt tgacctctgg ccttgatggt ttggggcctt acctcaccgg atttttgccg 3923

cactggccgc cac 3936

<210>2

<211>517

<212>蛋白质

<213>乳发酵短杆菌

<400>2

Val Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val

1 5 10 15

Tyr His Phe Ile Phe Val Pro Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val

20 25 30

Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr

35 40 45

Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala Val

50 55 60

Gly Val Ala Thr Gly Ile Val Gln Glu Phe Gln Phe Gly Met Asn Trp

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val Gly Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala

85 90 95

Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu

100 105 110

Trp Ile Phe Gly Trp Gly Lys Ile Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser

115 120 125

Ile Trp Ile Val Ala Ile Ala Thr Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile

130 135 140

Val Ala Asn Ser Phe Met Gln His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro

145 150 155 160

Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn

165 170 175

Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu

180 185 190

Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu Gly Ile Ser Gly Trp Trp Ile Ile Arg

195 200 205

Ala His Arg Gln Ala Lys Lys Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His

210 215 220

Ser Met His Arg Pro Ala Leu Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val

225 230 235 240

Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met

245 250 255

Phe Val Gln Gln Pro Met Lys Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu

260 265 270

Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe Ser Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn

275 280 285

Asn Cys Asp Thr Val Thr His Leu Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro

290 295 300

Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe Thr Gly Val Thr Leu Gln Gly Val Asn

305 310 315 320

Gln Leu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser

325 330 335

Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr Trp Ser Phe Arg Ala Met Ile Gly Leu

340 345 350

Met Leu Gly Ser Leu Ala Ile Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg

355 360 365

Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly Lys Ile Ala Arg Leu Phe Gln Ile Gly

370 375 380

Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp

385 390 395 400

Ile Phe Thr Glu Met Gly Arg Gln Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro

405 410 415

Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp

420 425 430

Met Gly Val Ser Asp His Ala Pro Trp Gln Val Trp Leu Thr Leu Ile

435 440 445

Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Ile Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu

450 455 460

Ile Arg Arg Ala Val Leu Ile Gly Pro Pro Glu Glu Gly Ala Pro Ser

465 470 475 480

Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ile Gly Ser Asp Met Pro

485 490 495

Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr Val Pro Pro Gln Pro His Val Lys Arg

500 505 510

Asn Asn His Gly Ser

515

<210>3

<211>3936

<212>DNA

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(2476)..(3498)

<400>3

ggatcctctc tgttcaaaac agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60

acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120

aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180

tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa 240

acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300

ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360

cgatccgaat acccttcatt ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420

caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt catgtttttg tgaagaagga cgatgccgaa 480

ggccttgatt tcttctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540

cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt cgacacaccc 600

gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctgagc acaaatctcg ccgtaacgga gtaaccaccg 660

caaccaagcg tcgaaaagca aaatcttttc gagtttttgg tgacttgtca acaagggggg 720

agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggtt gaccacaatc ggggttagcc tttctaaagt 780

taagctgtga gcgggaactt aggaataaac ttcaacgaca acctttaaga agctcttatt 840

ggttcttcgt tttgtatcga taaatacaat cggtttcctg gctcaataag gctgttcctg 900

tcaatctgta aagaagagga aggggaccta gcgtggatgt cgttgacatc gcgcggtggc 960

aattcggaat taccaccgtc tatcacttca tttttgtccc actgaccatt ggcttagcac 1020

cgctggtcgc gatcatgcaa acgttttggc aagttaccgg caaagagcac tggtatcggg 1080

ctacgagatt ttttggcact gtgctgctca tcaacttcgc ggttggtgta gcaacgggca 1140

ttgtgcagga gttccagttc ggtatgaact ggtcggaata ttcgcgtttc gtcggtgatg 1200

ttttcggcgg accgctggct ttggaggggc tcatcgcgtt cttccttgag tctgtgttct 1260

taggtctgtg gattttcgga tgggggaaga ttcctggatg gctgcatact gcgtccattt 1320

ggatcgttgc tattgcgacg aatatttctg cctatttcat catcgtggcc aactcgttta 1380

tgcagcatcc ggtgggtgct gagtataacc ctgagactgg tcgggcggag cttactgatt 1440

tctgggctct tctcacaaac tccaccgcgc tggctgcgtt cccgcatgct gttgccggtg 1500

gttttttaac agctggaact ttcgtcctcg gaatttcggg ttggtggatt attcgtgcgc 1560

accgccaggc gaagaaggct gaggcggaaa tcgagtcgaa gcattcaatg cacaggccgg 1620

cgttgtgggt tggttggtgg accacagttg tctcttccgt ggcactgttc atcactggcg 1680

atacacaggc gaagctcatg ttcgtgcagc agccgatgaa gatggcgtcg gcggaatcct 1740

tgtgtgaaac cgccacagat ccaaacttct ccattctgac aattggtacg cacaacaact 1800

gcgatacggt aacccacctg atcgatgttc cgtttgtgct tccattcttg gctgaaggaa 1860

aattcaccgg tgtgactttg cagggtgtaa accagctcca agctgcagcg gagcaagcat 1920

acggtcctgg caactactcc cctaacttgt ttgtcaccta ctggtcattc cgcgcaatga 1980

tcggcctaat gcttggttct ttggctatcg ctgcgattgc gtggctgttg ctgcgtaaga 2040

agcgcacacc aactggaaag attgctcgtc tcttccaaat cggcagcctc attgccattc 2100

cattcccatt cttggctaac tctgctggtt ggatcttcac cgagatgggc cgccagcctt 2160

gggtggtaca cccgaatcct gaatctgccg gcgatgcccg aacagagatg atccggatga 2220

ctgttgatat gggtgtgtct gatcatgcgc cgtggcaagt ctggctgact ctaattggct 2280

tcacgattct ctatctcatc ttgttcgtgg tgtgggtgtg gctgattcgc cgcgcagttc 2340

tgatcggacc accagaggaa ggcgctccat ccgtggaggc aaagactgga ccggcaaccc 2400

cgattggttc agatatgccc atgacaccgc tgcaatttac cgtgccgccc caaccacacg 2460

tgaaaaggaa taacc atg gat ctt aat acc ttt tgg ttt att ctc atc gca 2511

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala

1 5 10

ttt ttg ttt gcg gga tac ttt ctc ctc gaa gga ttc gac ttc ggt gtc 2559

Phe Leu Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val

15 20 25

gga att tta gcg ccg atc atc ggt aaa gat tcc gcc gct aaa aac acg 2607

Gly Ile Leu Ala Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr

30 35 40

atc atc cgc acc atc ggc cct gtc tgg gac gga aat gaa gtg tgg ctg 2655

Ile Ile Arg Thr Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu

45 50 55 60

atc gtg gca ggt ggc gct ttg ttt gct gca ttc cct gag tgg tac gca 2703

Ile Val Ala Gly Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala

65 70 75

acg atg ttc tcc gga atg tat ctg ccg ctg ttc ctc gtg ctt gtg tcg 2751

Thr Met Phe Ser Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser

80 85 90

ttg atc atg cgc gtg gtg ggc ctt gaa tgg cgc aag aaa gtc gat gat 2799

Leu Ile Met Arg Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp

95 100 105

cct cgt tgg caa aag tgg tct gac cgg gcc atc ttt att ggt tct tgg 2847

Pro Arg Trp Gln Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp

110 115 120

act cca ccg ctg atg tgg gga ttc atc ttc gcc aat att ttc aag ctt 2895

Thr Pro Pro Leu Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu

125 130 135 140

gca tgc cca tca agg cgg atc aca cca tcg atg ctg cag tgg ctc tgc 2943

Ala Cys Pro Ser Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys

145 150 155

tgt gca atg ttc aac gtc ttc gcc atc ctg ggt gca ctt gca ttc act 2991

Cys Ala Met Phe Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr

160 165 170

gcg ctg ttc gct ctt cat ggc ctt gca ttc atc cgc ctg aaa act gct 3039

Ala Leu Phe Ala Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala

175 180 185

ggt cgg gtg cgc acc gat gcg gcg aag gca gct cca gta gtc gca ctt 3087

Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu

190 195 200

ctt gct gcg gtg act ggt gga cct ttc gtg ttg tgg gct gcc atc gca 3135

Leu Ala Ala Val Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala

205 210 215 220

tac ggc cgt tcc tgg tcc tgg atc ctc gca gtg ctg atc atc gca gcg 3183

Tyr Gly Arg Ser Trp Ser Trp Ile Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Ala

225 230 235

gtt ctc ggt gga gct ttc gca ctg atc aaa gac cgc gat gga tta agc 3231

Val Leu Gly Gly Ala Phe Ala Leu Ile Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser

240 245 250

ttc ctg tcc act tcc gtc gct gtc atc ggt gta gtt gca ctg ctg ttt 3279

Phe Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Phe

255 260 265

agt tcc cta ttc ccc aac gtc atg cca aca acg ctt gcc gat ggc gtg 3327

Ser Ser Leu Phe Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val

270 275 280

act gga tat ttg gaa cgc ctc cgc aag cca cta cgc att gac cat cct 3375

Thr Gly Tyr Leu Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg Ile Asp His Pro

285 290 295 300

gac ttg gac cgc cac tgt gat cgc acc gct ggt tgt cct cta cca agg 3423

Asp Leu Asp Arg His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg

305 310 315

ctg gac cta ctg ggt gtt ccg caa acg act tca cgc cga gcc agt gtc 3471

Leu Asp Leu Leu Gly Val Pro Gln Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val

320 325 330

tgc cta aaa gtt gga aaa att gag tac taaatotgac gctccggcta 3518

Cys Leu Lys Val Gly Lys Ile Glu Tyr

335 340

gtcgccgcac aggccccgtc gatccgcggc ttttgcgcct atcccctgct acccgccgtt 3578

gggtgataat cgcaggtgtt ctcaccgcgt tgaaaactct cgcgacagtc gcaatgggct 3638

tgctcatcgg ccagatggca gcgggcatca ttgaggtttc gggaagttct ttgccccgaa 3698

tggaactcat cgcgctcgcc atcacggtgg ttgtgcgcgg acttcttgcg tgggcacagg 3758

atcggttcgg agcgcgcatc gtcccaggtg actgtggatc ttcgggagaa aaccctgcgg 3818

cacctggcac aaagcgatcc ccgcaccatc gatcaagcct tgtggcgcac ccgtttgacc 3878

tctggccttg atggtttggg gccttacctc accggatttt tgccgcactg gccgccac 3936

<210>4

<211>34l

<212>蛋白质

<213>乳发酵短杆菌

<400>4

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val Gly Ile Leu Ala

20 25 30

Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr Ile Ile Arg Thr

35 40 45

Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu Ile Val Ala Gly

50 55 60

Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala Thr Met Phe Ser

65 70 75 80

Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Ile Met Arg

85 90 95

Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp Pro Arg Trp Gln

100 105 110

Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp Thr Pro Pro Leu

115 120 125

Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu Ala Cys Pro Ser

130 135 140

Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys Cys Ala Met Phe

145 150 155 160

Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr Ala Leu Phe Ala

165 170 175

Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala Gly Arg Val Arg

180 185 190

Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Val

195 200 205

Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Ser

210 215 220

Trp Ser Trp Ile Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Ala Val Leu Gly Gly

225 230 235 240

Ala Phe Ala Leu Ile Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser Phe Leu Ser Thr

245 250 255

Ser Val Ala Val Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Phe Ser Ser Leu Phe

260 265 270

Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Thr Gly Tyr Leu

275 280 285

Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg Ile Asp His Pro Asp Leu Asp Arg

290 295 300

His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg Leu Asp Leu Leu

305 310 315 320

Gly Val Pro Gln Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val Cys Leu Lys Val

325 330 335

Gly Lys Ile Glu Tyr

340

<210>5

<211>19

<212>蛋白质

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>

<222>(18)

<400>5

Met Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Ala Val

1 5 10 15

Tyr Xaa Phe

<210>6

<211>20

<212>蛋白质

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>不清楚

<222>(16，17)

<400>6

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Xaa

1 5 10 15

Xaa Tyr Phe Leu

20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9，12)

<223>n＝a或c或g或T

<400>7

atggaygtng tngayatygc 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>8

caraargtrt tvarrtccat 20

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>9

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：PCR引物

<400>10

gagcggataa caatttcaca cagg 24

Claims

1.编码具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的DNA片段。

2.权利要求1的DNA片段，具有包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸的核苷酸序列。

3.由下述(a)或(b)定义的DNA；

(b)在60℃，1×SSC，0.1％SDS的严谨条件下可与上述(a)的核苷酸序列杂交的DNA，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

4.编码具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽的DNA片段。

5.权利要求4的DNA片段，具有包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列。

6.由下述(c)或(d)定义的DNA：

(d)在60℃，1×SSC，0.1％SDS的严谨条件下可与上述(c)的核苷酸序列杂交的DNA，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位I联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。

7.编码下述(A)定义的多肽和下述(B)定义的多肽的DNA片段；

(A)具有序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，

(B)具有序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

8.权利要求7的DNA片段，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第933至3498位核苷酸的核苷酸序列。

9.一种DNA，包含下述(a)或(b)定义的DNA和下述(c)或(d)定义的DNA：

(b)在60℃，1×SSC，0.1％SDS的严谨条件下可与上述(a)的核苷酸序列杂交的DNA，它编码的多肽可组成能够与具有SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的细胞色素bd型醌醇氧化酶亚单位II联合表现细胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白、并且