KR20000006104A - 브레비박테리움락토퍼멘툼의사이토크롬ｂｄ타입퀴놀옥시다제유전자 - Google Patents
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Abstract
서브유니트 I의 N-말단의 아미노산 서열, 및 브레비박테리움 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II의 N-말단을 기본으로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 프라이머로서 상기 올리고뉴클레오티드, 및 주형으로서 비. 플라붐의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여, 비. 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를 암호화하는 유전자를 상기 수득한 증폭 단편을 프로브로 사용하여 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 염색체 DNA 라이브러리로부터 수득한다.
Description
본 발명은 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 및 이를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.
대부분의 유기체는 호흡에 의해 생명 활성에 필수적인 에너지를 필요로 한다. 고등 유기체에서는, 탄수화물, 단백질 및 지방족 산이 세포질에서 해당경로 및 β-산화에 의해 아세틸-CoA로 분해되고, 아세틸-CoA는 미토콘드리아에서 시트르산 사이클에 의해 분해된다. 생성된 에너지는 NADH 및 FADH2의 환원력으로 저장된다. 최종적으로, NADH는 미토콘드리아의 내막에 존재하는, 후속의 전자 전달계에 의해 물로 완전하게 산화되고, 양성자 농도 구배가 산화에 커플링된 방식으로 형성되며, ATP 합성의 추진력으로 제공된다.
세균성 호흡 연쇄는 일반적으로 종 및 성장 환경에 따라서 여러가지 작용성 효소 복합체를 포함하므로, 에너지 보존 효율은 크게 변화될 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 콜리는 2종류 이상의 퀴놀 옥시다제, bo 타입 및 bd 타입을 함유하며, 이는 호흡 연쇄에서 말단 옥시다제에서 작용한다. 상기 2개 타입의 효소를 포함하는 야생형 균주, bo 타입만을 포함하는 돌연변이주 및 bd 타입만을 포함하는 돌연변이주를 호기성 배양시 관찰되는 성장 수율에 대해 비교할 경우, 성장 수율은 bd 타입 효소만을 포함하는 돌연변이체에서 최저이며, 말단 옥시다제의 종류 및 이들의 에너지 보존 효율에 따른다[참조: Lecture Abstract for The Conference of The Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, 1995, Subject No. 357].
브레비박테리움 락토페멘툼 및 브레비박테리움 플라붐(Brevibacteriumflavum)과 같은 코리네포름 세균(Coryneform bacteria)은 아미노산 생산용으로 산업적으로 이용되는 그램-양성 및 호기성 세균이다. 호흡 연쇄의 말단 옥시다제는 코리네포름 세균과는 계통적으로 크게 다른 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 것들, 및 코리네포름 세균과 같은 그램-양성 세균이지만 이들과는 계통적으로 약간 상이한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 것들 및 친열성(thermophilic) 바실러스에 대해 철저하게 조사되어 있지만, 코리네포름 세균중의 호흡 연쇄의 전자전달계는 상세하게 조사되지 않았다. 유용한 물질의 생산성을 향상시키기 위해서는 기초적인 데이타를 수집한다는 관점에서 코리네포름 세균에서의, 에너지 대사에 있어서 중요한, 호흡 연쇄의 전자전달계를 명료화하는 것이 중요한 것으로 생각된다. 또한, 코리네포름 세균의 호흡 연쇄의 전자전달계에 관련된 효소 및 이에 대한 유전자가 확인된다면, 이들은 예를 들면, 에너지 효율이 더 높은 균주를 생성시키는데 유용할 수 있다.
지금까지, 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 호흡이 양성자 전달과 커플링되고, 사이토크롬 a, b 및 c를 포함한다는 것이 보고되어 있다[참조: Kawahara, Y., et al. (1988) Agric. Biol. Chem., 52(8), 1979-1983). 브레비박테리움 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제가 또한 정제되어 특징화되어 있다[참조: Kusumoto, Sone and Sakamoto, "Respiratory Chain of Amino Acid Fermenting Bacterium, Brevibacterium flavum, and Characteristics of Its Cytochrome bd Type Menaquinol Oxidase", Abstracts of the 23th Symposium of Bioenergy Study Group, 1997]. 그러나, 코리네포름 세균의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를암호화하는 유전자에 관한 보고서는 없다.
본 발명은 상기 언급한 관점으로부터 수행하였으며, 본 발명의 목적은 코리네포름 세균의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 유전자를 수득하고, 이의 구조를 밝히는 것이다.
본 발명자들은 브레비박테리움 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I의 N-말단, 및 서브유니트 II의 N-말단의 아미노산 서열을 기본으로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며, 프라이머로서 상기 올리고뉴클레오티드, 및 주형으로서 브레비박테리움 플라붐의 염색체 DNA를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 단편을 수득하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 증폭된 단편을 프로브로 사용하여 야생형 브레비박테리움 락토퍼멘툼 균주의 염색체 DNA 라이브러리를 선별하고, 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를 암호화하는 유전자를 성공적으로 수득하였다. 따라서, 본 발명이 완결되었다.
즉, 본 발명은
(1) 하기 (A) 또는 (B)에 정의된 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편:
(A) 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는
(B) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드;
(2) 하기 (C) 또는 (D)에 정의된 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편:
(C) 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는
(D) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드;
(3) 하기 (A) 또는 (B)에 정의된 폴리펩타이드, 및 하기 (C) 또는 (D)에 정의된 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편:
(A) 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는
(B) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드, 및
(C) 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는
(D) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지며,서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드;
(4) 하기 (a) 또는 (b)에 정의된 DNA인, 상기 (1)의 DNA:
(a) 서열 목록중 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는
(b) 엄격한 조건(stringent condition)하에서 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA;
(5) 하기 (c) 또는 (d)에 정의된 DNA인, 상기 (2)의 DNA:
(c) 서열 목록중 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는
(d) 엄격한 조건하에서 상기 (c)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화되며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA;
(6) 하기 (a) 또는 (b)에 정의된 DNA, 및 하기 (c) 또는 (d)에 정의된 DNA를 포함하는, 상기 (3)의 DNA:
(a) 서열 목록중 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는
(b) 엄격한 조건하에서 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA; 및
(c) 서열 목록중 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는
(d) 엄격한 조건하에서 상기 (c)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화되며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA;
(7) 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 상기 (1)에 정의된 DNA 단편;
(8) 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 상기 (2)에 정의된 DNA 단편; 및
(9) 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 상기 (3)에 정의된 DNA 단편을 제공한다.
본 설명에 있어서, 용어 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성이란 환원된 타입 퀴논 화합물(퀴놀)을 산소를 소모하면서 산화시키기 위한, 사이토크롬 b 및 사이토크롬 d의 산화환원 시차 흡수 스펙트럼(oxidoreduction differential absorption spectrum)을 나타내는 활성을 의미한다. 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 또는 이의 서브유니트를 암호화하는 DNA 단편은 언급될 경우 "본 발명의 DNA"로 언급된다.
도 1은 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli)의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I의 수치 분석(hydropathy analysis) 결과를 나타낸다. 기호 "*"는 3종의 옥시다제에 의해 공유되는 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 2는 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Br. l로 기술), 바실러스 스테아로써모필러스(B. st로 기술) 및 에스케리키아 콜리(E. co로 기술)의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Br. l로 기술), 바실러스 스테아로써모필러스(B. st로 기술) 및 에스케리키아 콜리(E. co로 기술)의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
이후 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 DNA는 비. 플라붐(B. flavum)의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 부분적 아미노산 서열을 기본으로 하여 비. 락토퍼멘툼 염색체 DNA로부터 수득할 수 있다. 상세하게, 프라이머로서 상기 아미노산 서열을 기본으로 하여 합성된 올리고뉴클레오티드와, 주형으로서 비. 플라붐의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 비. 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 부분적 서열을 수득한다. 이어서, 수득한 부분적 서열을 프로브로 사용하여 비. 락토퍼멘툼의 염색체 DNA 라이브러리를 선별하여, 비. 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를 암호화하는 유전자를 수득할 수 있다.
비. 플라붐 및 비. 락토퍼멘툼의 염색체 DNA는 예를 들어, 사이토와 미우라의 방법[참조: Saito and Miura; Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)], 및 커비의 방법[참조: K. S. Kirby; Biochem. J., 64, 405, (1956)]으로 제조할 수 있다. 염색체 DNA 라이브러리는 염색체 DNA를 적합한 제한 효소로 부분적으로 분해하고, 수득한 DNA 단편 각각을 에스케리키아 콜리 세포중에서 자체적으로 복제가능한 벡터 DNA에 연결시켜 재조합 DNA를 제조하고, 상기 DNA를 이. 콜리중으로 도입시켜 수득할 수 있다. 상기 벡터는 유전 클로닝용으로 통상적으로 사용되는 것이라면 특별하게 제한되지 않으며, pUC19, pUC18, pUC118 및 pUC119와 같은 플라스미드 벡터, 람다 파아지 DNA와 같은 파아지 벡터 등이 사용될 수 있다.
PCR용으로 사용되는 프라이머는 예를 들어, 서열 7 또는 서열 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 수득한 PCR 생성물이 목적하는 서열을 갖고 있는지 확인하기 위하여, 뉴클레오티드 서열분석에 의해 프라이머에 상응하는 서열을 함유하는지, 또는 뉴클레오티드 서열로부터 추론되는 아미노산 서열이 비. 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 부분적인 아미노산 서열을 함유하는지 확인할 수 있다.
상기 PCR에서 수득한 DNA 단편을 프로브로 이용하는 비. 락토퍼멘툼의 염색체 DNA 라이브러리의 선별은 라이브러리 제조를 위하여 플라스미드 벡터를 사용할 경우 콜로니 하이브리드화에 의해, 또는 라이브러리 제조를 위하여 파아지 벡터를 사용할 경우 플라크 하이브리드화(plaque hybridization)에 의해 수행할 수 있다. 하이브리드화 양성 클론은 상기 클론으로부터 제조된 DNA의 뉴클레오티드 서열분석에 의해 목적하는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자를 함유하는지 확인할 수 있다. 또한 프로브를 사용하여 하이브리드화 양성 클론에 대해 써던 분석을 예비적으로 수행할 수 있다.
상기한 바와 같은 방식으로 실시예에서 수득한 비. 락토퍼멘툼 ATCC 13869 균주의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 나타내었다. 이에 의해 암호화되는 단백질의 예측되는 암호화 영역과 아미노산 서열을 서열 1 내지 4에 나타내었다. 암호화 영역 및 오페론 구조의 평가, 및 바실러스 스테아로써모필러스 K1041 및 에스케리키아 콜리의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제에 대한 상동성 분석은 GENETYX-Homology Version 2.2.2 (Software Development Co., Ltd.)를 사용하여 수행한다.
사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자는 2개의 개방 판독 프레임 (5' 말단으로부터 cydA 및 cydB 판독)을 함유하며, 이들은 각각 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I (이후 또한 단순히 "서브유니트 I"로도 언급됨) 및 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II (이후 또한 단순히 "서브유니트 II"로도 언급됨)를 암호화한다. cydA 및 cydB는 각각 1551 bp 및 1023 bp를 포함하며, 서브유니트 I은 517개의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며, 서브유니트 II는 341개의 아미노산 잔기로 이루어져 있음이 추정된다. 프로모터-유사 서열은 cydA의 상부에 존재하며, SD-유사 서열은 cydA 및 cydB 각각의 상부에 존재하고, 터미네이터-유사 서열은 cydB의 하부에 존재한다. 그러므로, cydA와 cydB는 cyd 오페론을 형성하는 것으로 생각된다.
서브유니트 I의 N-말단 아미노산 잔기의 코돈을 GTG로 표시하고, 서열 목록에서 상응하는 아미노산을 Val로 표시한 반면, 실제적으로는 Met이다. 이는 GTG가 개시 메티오닌으로 인지되기 때문에 일어나는 것으로 생각된다. 상기와 같은 경우는 다른데서도 발표된 바 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 및 바실러스 스테아로써모필러스와 이. 콜리의 서브유니트 I의 구조, 및 아미노산 서열의 정렬을 비교하기 위해 수행한 수치 분석을 나타낸다. 표시 I 내지 VII은 전이막 나사선 영역(transmembrane helix region)을 나타내며, 따라서 7개 이상의 전이막 나사선 영역이 존재하는 것으로 확인되었다. 그래프에 나타낸 패턴으로부터 이들이 서로 닮았음을 알 수 있다. 또한, Q 루프로 불리우는 퀴놀 결합 부위를 함유하는 영역이 이. 콜리의 서브유니트 I의 V와 VI 사이에 존재하는 반면, 비. 스테아로써모필러스 cydA와 같이 비. 락토퍼멘툼에서 Q 루프의 나머지 절반 부위와의 상동성을 나타내는 영역은 없으며, 따라서 Q 루프 영역이 단축되어 있다. 이점을 고려하여, 비. 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제는 이. 콜리 보다는 비. 스테아로써모필러스의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 것과 더욱 유사한 구조를 갖는 것으로 생각된다. 서브유니트 I의 아미노산 서열을 비교하면 비. 락토퍼멘툼이 비. 스테아로써모필러스에 대해 약 24.7%의 상동성을 가지며, 이. 콜리에 대해 약 38.6%의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 전체적으로 서브유니트 I의 경우, 비. 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제는 비. 스테아로써모필러스의 것 보다는 이. 콜리의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제와 더욱 유사한 구조를 갖는 것으로 판단된다.
hem b558의 리간드라는 관점에서 작용적으로 중요한 잔기로서 이. 콜리 cydA의 경우 H19, H186 및 M393, 및 비. 스테아로써모필러스의 경우 H21, H184 및 H326이 보고되어 있다. 이들 아미노산은 비. 락토퍼멘툼의 cydA에서도 H18, H185 및 M350으로 보존된다.
도 3은 3개 종류의 세균 서브유니트 II의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 서브유니트 II의 경우, 비. 락토퍼멘툼은 비. 스테아로써모필러스에 대해 약 25.9% 상동성을, 및 이. 콜리에 대해 약 34.8%의 상동성을 나타낸다.
본 발명의 DNA는 서열 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서브유니트 I, 서열 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서브유니트 II, 또는 이들 서브유니트 I 및 서브유니트 II를 함유하는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 단백질을 암호화하는 DAN이다. 서브유니트 I, 서브유니트 II 또는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 단백질은 상기와 같은 DNA를 적합한 숙주 세포중으로 도입시키고, 수득한 형질전환체를 DNA가 발현되도록 배양시켜 생산할 수 있다. 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 서브유니트 I을 암호화하는 DNA로 언급할 수 있으며, 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 서브유니트 II를 암호화하는 DNA로 언급할 수 있고, 뉴클레오티드 번호 933 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 상기 서브유니트 I 및 II 모두를 암호화하는 DNA로 언급할 수 있다.
생산된 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 단백질 또는 이의 서브유니트는 염석, 용매 침전법, 겔 여과 크로마토그라피, 및 이온 교환 크로마토그라피와 같은단백질 정제에 통상적으로 사용되는 방법으로 배양물로부터 수집하여 정제할 수 있다.
서브유니트 I을 암호화하는 본 발명의 DNA는 아미노산 서열중 아미노산 잔기 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다.
서브유니트 II를 암호화하는 본 발명의 DNA는 아미노산 서열중 아미노산 잔기 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다.
또한, 서브유니트 I, 서브유니트 II 또는 둘다에서의 돌연변이를 함유하는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를 암호화하는 DNA가 또한 본 발명의 DNA에 포함된다.
용어 "아미노산 잔기 다수"는 바람직하게는 아미노산 잔기 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개를 의미한다.
상기한 바와 같이 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을, 예를 들면, 특정 부위에서의 아미노산 잔기 1개 이상이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하도록 하는 부위-지시된 돌연변이 유발의 방법으로 변형시켜 수득한다. 상기한 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리법으로 수득할 수 있다. 돌연변이 처리법으로는 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II를 암호화하는 DNA를 예를 들면, 하이드록실아민으로 처리하는 방법, 및 미생물, 예를 들면, 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II를 암호화하는 DNA를 함유하는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 돌연변이 처리에 통상적으로 사용되는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 아질산과 같은 돌연변이제로 처리하는 방법이 있다.
상기한 바와 같은 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위는 예를 들어, 각각의 차이 또는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제를 함유하는 코리네포름 세균 종 또는 세균 속에 있어서의 차이를 기본으로 하여, 자연적으로 일어나는 돌연변이(돌연변이체 또는 변이체)를 또한 포함한다.
서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 적절한 세포중에서 상기한 바와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 발현시키고, 발현된 생성물의 활성을 조사하여 수득한다. 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 또한 예를 들어, 엄격한 조건하에서 서열 목록중 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA와 하이브리드화할 수 있으며, 돌연변이를 갖는 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II를 암호화하는 DNA 또는 이를 함유하는 세포로부터, 서브유니트 I 및/또는 서브유니트 II의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 수득한다.
본 명세서에서 언급된 "엄격한 조건"은 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비-특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건이다. 수치를 사용하여 상기 조건을 명확하게 표현하기는 어렵다. 그러나, 예를 들면, 엄격한 조건은 상동성이 높은 DNA, 예를 들어, 상동성이 50% 이상인 DNA가 서로 하이브리드화되고, 상동성이 상기 수치보다 더 낮은 DNA는 서로 하이브리드화되지 않는 조건이다. 달리, 엄격한 조건은 써던 하이브리드화에 있어서 통상의 세척 조건, 즉, 60℃, 1xSSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1xSSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 DNA가 서로 하이브리드화되는 조건을 예로 들수 있다.
상기한 바와 같은 조건하에서 하이브리드화될 수 있는 유전자로는 상기 유전자의 암호화 영역내에서 발생된 종결 코돈을 갖는 것들, 및 활성 중심의 돌연변이로 인하여 활성을 갖지 않는 것들이 있다. 그러나, 상기와 같은 불편은 유전자를 상업적으로 입수가능한 활성 발현 벡터와 연결시키고, 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 조사함으로써 용이하게 제거할 수 있다.
본 발명의 DNA의 발현용 숙주의 예로는 이. 콜리를 포함한 여러가지 세균, 비. 락토퍼멘툼 및 비. 플라붐과 같은 코리네포름 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진핵 세포 등이 있다. 본 발명의 DNA를 상기 언급한 바와 같은 숙주내로 도입시키기 위해서는, 본 발명의 DNA를 발현시킬 수 있는 숙주의 종류에 따라 선택된 벡터내로 삽입시켜 수득한 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기 공정은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있는 유전자 재조합 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 DNA 및 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 또는 이에 의해 암호화되는 이의 서브유니트가 코리네포름 세균의 전자 전달계를 명료히 하는데 있어서 유용한 것으로 생각된다. 본 발명의 DNA는 또한 에너지 효율이 우수한 유용한 물질을 생산하는 코리네포름 세균의 배양에 유용할 것으로 생각된다.
본 발명을 하기 실시예를 참고로 하여 상세하게 설명한다.
실시예 1
브레비박테리움 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 정제
정지상 말기까지 배양시킨 비. 플라붐 ATCC 14067 균주의 세균 세포(약 120g 습중량)를 완충액(0.5% NaCl, 10mM 인산나트륨, pH 7.4) 200㎖에 현탁시키고, 0.5㎜의 유리 입자의 존재하에서 비드 비이터(bead beater: Biospec 제조원)를 사용하여 고속에서 교반시켜 즉시 파괴시킨다. 이후 파괴된 세포의 현탁액을 5,000rpm에서 10분간 원심분리시켜 파괴되지 않은 세균 세포를 제거하고, 상층액을 15,000rpm에서 10분간 원심분리시키고 생성된 상층액을 15,000rpm에서 30분간 다시 원심분리시킨다. 2회의 원심분리에서 수득한 침전물을 합하여, 상기 언급한 바와 동일한 완충액에 현탁시켜 막 제제를 수득한다.
상기 막 제제(5㎎/㎖, 0.5% NaCl, 10mM 인산나트륨, pH 7.4)를 테플론 균질화기(Teflon homogenizer)로 균질화시키고, 40,000rpm에서 20분간 원심분리시켜,침전물을 수거한다. 침전물에 1.5% 나트륨 콜레이트, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% NaCl 및 10mM 인산나트륨(pH 7.4)을 가한 다음, 균질화시키고 40,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 침전물을 수거한다. 침전물에 10mM 인산나트륨(pH 7.4)을 추가로 가하고, 균질화시킨 다음, 40,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 침전물을 수거한다.
상기한 바와 같이 콜산으로 세척한 막 제제를 각각 1%의 계면활성제, n-노나노일-N-메틸글루카미드(MEGA-9) 및 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10)를 함유하는 완충액중에 현탁시킨다. 상기 현탁액을 빙상에서 균질화시켜, 초음파파쇄시키고, 40,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 상층액을 수득한다.
원심분리로 수득한 상기 상층액을 1% MEGA-9, 1% MEGA-10, 10% 글리세롤 및 10mM 인산나트륨(pH 7.4)으로 평형화시킨 하이드록시아파타이트 컬럼상에 흡착시키고, 단계식으로(0, 50, 150, 250 및 400mM) 증가되는 인산 나트륨 농도로 용출시켜 분획화시킨다. 상기 분획물중 사이토크롬은 환원 시차 - 산화 시차 스펙트럼으로 검출한다. 결과, 사이토크롬 c 및 b가 50mM의 인산나트륨에서 용출된 분획에서 검출되었으며, 사이토크롬 c, b 및 a가 150mM에서 용출시킨 분획에서 검출되었고, 사이토크롬 b 및 d가 250mM에서 용출시킨 분획에서 검출되었다.
250mM의 인산나트륨 농도에서 용출된 분획을 10% 글리세롤 및 10mM 인산나트륨(pH 7.4)에 대해 투석한 다음, 동일한 완충액으로 평형시킨 DEAE-Toyopearl (Tohso) 컬럼상에 흡착시키고, 단계식으로 (0, 80, 100, 120, 140 및 300mM) 증가하는 NaCl의 농도로 용출시켜 분획화시킨다. 상기 분획물중 사이토크롬은 환원 시차 - 산화 시차 스펙트럼으로 검출한다. 그 결과, 사이토크롬 b 및 d가 120mM의 NaCl 농도에서 용출된 분획에서 검출되었다. 이 분획을 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 효소 제제로서 사용한다.
상기 효소 제제를 13.5% 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜 PVDF 막에 블로팅시킨다. 서브유니트 I 및 서브유니트 II에 상응하는 막의 부위를 아미노산 서열 분석하여 N-말단 아미노산 서열을 결정한다. 아미노산 서열을 각각 서열 5 (서브유니트 I) 및 서열 6 (서브유니트 II)에 나타낸다.
실시예 2
브레비박테리움 락토퍼멘툼의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자의 분리
사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자를 함유하는 클론에 대한 비. 락토퍼멘툼의 염색체 DNA 라이브러리 선별을 콜로니 하이브리드화로 수행한다.
비. 플라붐의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 상기 부분적 아미노산 서열을 기본으로 하여 2개 종류의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 하나는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I의 N-말단 아미노산 서열 (bbd1; 서열 7)을 기본으로 하여 제조하고, 다른 하나는 서브유니트 II의 N-말단 아미노산 서열 (bbd2; 서열 8)을 기본으로 하여 제조한다.
상기 프라이머 bbd1 및 bbd2와 주형으로서 균주 ATCC 14067의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 상기 반응 조건으로서, 94℃에서 1분간 변성시킨후, 95℃에서 45초간 변성, 50℃에서 60초간 어닐링(annealing) 및 62℃에서 90초간의 쇄연장 반응을 포함하는 사이클을 35회 반복한다. 결과, 약 1500bp, 800bp 및 100bp의 단편이 제공된다. 정제된 단백질로부터 평가된 서브유니트 I의 분자량 56.4kD 및 다른 세균의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I의 보고된 분자량을 기준으로 하여, 약 1500bp의 단편이 목적하는 PCR 생성물인 것으로 고려된다. 따라서, 상기 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔상에서 전기영동시키고, 약 1.5kbp의 단편 부위를 상기 겔로부터 절개하여 DNA를 추출한다.
상기 DNA 단편을 DNA 평활말단화 키트(제조원: Takara Shuzo)를 사용하여 평활말단화시키고, SmaI로 분해시킨 pUC118 벡터에 연결하여 DNA 연결 키트 Ver. 2 (제조원: Takara Shuzo)를 사용하여 알칼린 포스파타제로 처리한다. 이. 콜리 XL-1 블루 균주를 상기 수득한 재조합 프라이머로 형질전환시킨다.
상기 수득한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 삽입된 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 뉴클레오티드 서열분석은 써모 서열 형광 표지된 프라이머 사이클 서열분석 키트(Thermo Sequence fluorescent labelled primer cycle sequencing kit; 제조원: Amersham Life Science)의 프로토콜에 따라서 전방 프라이머로서의 플루오레세인 표지된 프라이머 M4(제조원: Takara Shuzo, 서열 9), 및 역 프라이머로서의 플루오레세인 표지된 프라이머 RV-MF(제조원: Takara Shuzo, 서열 10)를 사용하여 수행한다. 결과, 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 유전자가 상기 프라이머와의 상동성을 기본으로 하여 플라스미드중에 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 상기 부분적인 클론을 BD1으로 표시한다.
상기 BD1을 상기 언급한 프라이머 M4 및 RV-M을 사용하는 PCR에 의해 증폭시키고, DIG(디곡시게닌)로 표지시킨 프로브는 DIG DNA 표지화 키트(제조원: Boehringer Mannheim)를 사용하여 제조한다.
상기 언급한 프로브를 사용하여 비. 락토퍼멘툼의 염색체 DNA 라이브러리를 선별한다. 비. 락토퍼멘툼 ATCC 13869의 염색체 DNA를 Sau3A1으로 부분적으로 분해시키고, 생성물을 pUC18의 BamHI 부위에 삽입시켜, 이. 콜리 XL-1 블루를 상기 수득한 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 라이브러리를 수득한다. 상기 언급한 DIG로 표지시킨 프로브를 사용하여 형질전환체의 클론에 대해 콜로니 하이브리드화를 수행한다. 알칼린 포스파타제로 표지시킨 항-DIG 항체를 이용하는 DIG 검출 키트(제조원: Boehringer Mannheim)를 사용하여 프로브의 검출을 수행한다.
하이브리드화 포지티브 콜로니로부터 플라스미드를 제조하여, EcoRI 및 PstI로 분해시키고, 프로브로서 BD1을 사용하여 써던 블롯화시킨다. 결과, 2개의 양성 클론이 수득된다. 이들 양성 클론의 삽입된 단편을 각각 BD21 및 BD31로 표시한다. BD21은 약 3.8kbp를 포함하며, BD31은 약 9.0kbp를 포함한다. 이들 클론을 아클로닝하고, 이들의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 결과를 서열 1에 나타내었다. 예측되는 암호화 영역과 이에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 서열 1 내지 4에 나타낸다.
본 발명에 의해 코리네포름 세균의 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 유전자가 수득되었으며, 이의 구조가 밝혀졌다.
Claims (9)
- (A) 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는(B) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편.
- (C) 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는(D) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편.
- (A) 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는(B) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드, 및(C) 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는(D) 아미노산 서열중 아미노산 잔기중 하나 또는 다수의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하는 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편.
- 제1항에 있어서,(a) 서열 목록중 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는(b) 엄격한 조건하에서 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II와 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA인 DNA 단편.
- 제2항에 있어서,(c) 서열 목록중 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는(d) 엄격한 조건하에서 상기 (c)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA인 DNA 단편.
- 제3항에 있어서,(a) 서열 목록중 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 2483에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는(b) 엄격한 조건하에서 상기 (a)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 II과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA; 및(c) 서열 목록중 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는(d) 엄격한 조건하에서 상기 (c)의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제의 서브유니트 I과 함께 사이토크롬 bd 타입 퀴놀 옥시다제 활성을 나타내는 단백질을 구성할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 DNA 단편.
- 제1항에 있어서, 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호933 내지 2483의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편.
- 제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 2476 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편.
- 제3항에 있어서, 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 번호 933 내지 3498의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편.
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