JP2004121021A - 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】酢酸菌の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を含む微生物、特に酢酸菌の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供する。
【解決手段】酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、通常は増殖できない酢酸濃度の培地でも増殖を可能にさせる遺伝子を取得する方法により、グルコンアセトバクター属に属する実用酢酸菌から酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な遺伝子をクローニングした。また、該遺伝子を酢酸菌に導入した形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、エタノール存在下で形質転換株を培養した場合、最終到達酢酸濃度を顕著に向上させることを可能にした。
【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物に由来する酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）及びグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００３】
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００４】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｘｙｌｉｎｕｍ　ＩＦＯ３２８８）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００８】
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】
特開昭６０−９４８８号公報
【００１０】
【特許文献２】
特開平２−２３６４号公報
【００１１】
【特許文献３】
特開平３−２１９８７８号公報
【００１２】
【非特許文献１】
「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１７２巻，ｐ．２０９６−２１０４，１９９０年
【００１３】
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，７６巻，ｐ．２７０−２７５，１９９３年
【００１４】
【非特許文献３】
「平成１３年度日本生物工学会大会講演要旨集」，ｐ．３６４，２００１年
【００１５】
【非特許文献４】
「トレンズ・イン・ジェネテェックス（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，５巻，ｐ．１８５−１８９，１９８９年
【００１６】
【非特許文献５】
「アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，５５巻，ｐ．１７１−１７６，１９８９年
【００１７】
【非特許文献６】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年
【００１８】
【非特許文献７】
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，４９巻，ｐ．２０９１−２０９７，１９８５年
【００１９】
【非特許文献８】
「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，５８巻，ｐ．９７４−９７５，１９９４年
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来より酢酸菌の酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、酢酸耐性に優れた酢酸菌が開発されれば、従来より高濃度の酢酸発酵を行うことができ、高濃度酢酸、高濃度食酢の効率的製造が可能となることから、本発明者は、再度、酢酸菌の酢酸耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
【００２１】
そして本発明者は、各方面から検討した結果、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点にたち、酢酸菌に属する微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する従来得ることのできなかった新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
【００２３】
従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニングする方法などが一般的であった。
【００２４】
しかし、このような方法では産業上有用な酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意検討した結果、本発明者は、酢酸菌から酢酸耐性遺伝子を見出す方法として、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下でしか生育できない株を、２％の酢酸の存在下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上させる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。
【００２５】
得られた酢酸耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で見出されているｇｒｏＳ遺伝子や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇｒｏＥＳ遺伝子などによって生産される一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のｇｒｏＥＳ遺伝子であると推定された。
【００２６】
しかし、大腸菌のｇｒｏＳ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４６％の、また枯草菌のｇｒｏＥＳ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４９％の相同性であり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の原核生物のｇｒｏＳ遺伝子やｇｒｏＥＳ遺伝子などとはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＧｒｏＥＳということもある）をコードする新規遺伝子（ｇｒｏＥＳ遺伝子ということもある）であることが確認された。
【００２７】
さらに、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）からｇｒｏＥ遺伝子（ｇｒｏＥＳ遺伝子とｇｒｏＥＬ遺伝子からなる）及びｄｎａＫ遺伝子を取得し、酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　ＩＦＯ３２８３）中で多量発現させることによって、各種ストレス条件下（エタノール、酢酸が存在する条件下）での生育が著しく増加することが報告されていた（例えば、非特許文献３参照）が、この場合にはｇｒｏＥ遺伝子の塩基配列や、コードされているタンパク質のアミノ酸配列などは全く開示されていなかった。ましてや、ｇｒｏＥＳ遺伝子の塩基配列や、コードされているタンパク質いついての情報、そのアミノ酸配列については全く何も開示されていなかった。
【００２８】
これに対して、本発明においては、ｇｒｏＥＳ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株を、エタノール存在下で通気培養した場合に、酢酸発酵能が向上し、最終到達酢酸濃度が顕著に向上して、より高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、そして更に、これらを確認し、そのうえ、該遺伝子の塩基配列及びコードされるタンパク質のアミノ酸配列の決定に成功しただけでなく、該遺伝子の発現にも成功し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２９】
すなわち本発明は、下記の（１）〜（９）を、実施態様の例として、提供するものである。
（１）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧｒｏＥＳ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００３０】
（２）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００３１】
（３）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９１〜４９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９１〜４９０からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３２】
（４）上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、酢酸耐性が増強された微生物。
（５）微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする上記（４）に記載の微生物。
【００３３】
（６）上記（４）、又は（５）に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法、及び、それによって得られた酢酸含量が高い（１０〜１２．５％）新規な食酢。
【００３４】
（７）上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡを含んだ組換えプラスミドｐＧＲＳＥ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１８７）。
【００３５】
（８）少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ断片）、又は、そのコーディング領域を含むＰＣＲ増幅断片（塩基配列１０〜５２１）のＰＣＲ増幅断片を、（７）のようにベクターｐＵＣ１９ではなく、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４にそれぞれ挿入してなる組換えプラスミドｐＧＲＳ、又は、ｐＧＲＳ１。
【００３６】
（９）組換えプラスミドｐＧＲＳ、又は、ｐＧＲＳ１をアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２８７）に導入してなる形質転換体。
【００３７】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸に対する耐性を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、大腸菌などのｇｒｏＥＳ遺伝子とある程度の相同性を有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能を有する配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。更に詳細には、本発明は酢酸耐性遺伝子に関するものであって、本酢酸耐性遺伝子は、酢酸耐性に関与する遺伝子を指し、更に具体的には、少なくとも（ｉ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、又は、（ｉｉ）それに含まれ、ＧｒｏＥＳタンパク質をコードする遺伝子（ｇｒｏＥＳ遺伝子）の塩基配列から選ばれる少なくともひとつを包含するものである。
【００４０】
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ　ＭＨ−２４）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特許文献１参照。）により取得する。
【００４１】
次に、得られた染色体ＤＮＡから酢酸耐性遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＳａｕ３ＡＩを用いた。
【００４２】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００４３】
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００４４】
得られた組換えＤＮＡを用いて、通常は寒天培地上で１％よりも高濃度の酢酸の存在下では増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３株（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　Ｎｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−２２８７として寄託）を形質転換し、その後２％酢酸含有寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで酢酸耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００４５】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、塩基番号１９１〜４９０からなる塩基配列はコーディング領域である。
【００４６】
配列表の配列番号１に示す塩基配列（図６）もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：塩基番号１９１〜４９０に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のｇｒｏＳ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４６％の、また枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇｒｏＥＳ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４９％の相同性を示し、タンパク質ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも５０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
【００４７】
さらに、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）からｇｒｏＥ遺伝子（ｇｒｏＥＳ遺伝子とｇｒｏＥＬ遺伝子からなる）及びｄｎａＫ遺伝子を取得し、酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　ＩＦＯ３２８３）中で多量発現させることによって、各種ストレス条件下での生育が著しく増加することが報告されていた（例えば、非特許文献３参照）が、この場合にはｇｒｏＥ遺伝子の塩基配列や、コードされているタンパク質のアミノ酸配列などは全く開示されていなかった。
【００４８】
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列にに基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（例えば、非特許文献４参照。）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
【００４９】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００５０】
本発明の酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＧｒｏＥＳをコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００５１】
このような酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質ＧｒｏＥＳと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００５２】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００５３】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号１９１〜４９０からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００５４】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
【００５５】
アセトバクター属の細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　Ｎｏ．１０２３）株　（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
また、グルコンアセトバクター属の細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、現在特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ　ＭＨ−２４）株が例示される。
【００５６】
酢酸耐性の増強は、例えば酢酸耐性遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
【００５７】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸耐性を増強することができる。
【００５８】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００５９】
マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献５参照）やｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献１参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献６参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００６０】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、非特許文献７参照）やエレクトロポレーション法（非特許文献８参照）等によって行うことができる。
【００６１】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００６２】
（３）食酢製造法
上記のようにして、酢酸耐性遺伝子のコピー数が増幅されたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸　菌であってアルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。
【００６３】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００６４】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【００６５】
（４）本発明の実施態様
また、本発明に係るＯＲＦ又はそれを含有する酢酸耐性遺伝子（配列番号１）を大腸菌ベクター（マルチコピーベクタ−）ｐＵＣ１９に挿入してなる組換えプラスミドｐＧＲＳＥ（ｐＵＣ１９のＳｍａＩ切断部位にＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｔａｎｉｉの酢酸耐性遺伝子がクローニングされたプラスミド）は、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　ＢＰ−８１８７として寄託されているので、本発明に係る遺伝子のＤＮＡは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、この組換えプラスミドを用いて、本発明に係るＯＲＦ又はそれを含有する酢酸耐性遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターにのせかえ、これを酢酸菌に導入し、これを培養することにより酢酸含量の高い食酢を容易に製造することができる。
【００６６】
更にまた、上記したようにそしてまた後記する実施例からも明らかなように、酢酸耐性遺伝子源の寄託、ＰＣＲの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製及び寄託、宿主菌の寄託その他が明らかにされており、いずれも入手ないし操作、処理が容易であるので、実施例に従って各操作、処理を行えば、目的とする酢酸耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより高濃度の酢酸を製造することができる。したがって、この点からしても、本発明の実施は容易である。
【００６７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６８】
【実施例】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
【００６９】
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ　ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特許文献１参照）により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００７０】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２、宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００７１】
（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株に形質転換し、２％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で４日間培養した。
【００７２】
生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、約２ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ１と命名した。さらに２％酢酸を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を生育可能にする断片は、ｐＳ１にクローン化された約２ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片中の図１に示した約６００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ断片であることが確認できた。
【００７３】
このようにして通常は寒天培地上で酢酸濃度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸含有寒天培地でも増殖可能にする酢酸耐性遺伝子断片を取得した。
【００７４】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００７５】
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号１９１から塩基番号４９０にかけて、配列番号２に記載したような１００個のアミノ酸（図３）をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
【００７６】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐性の増強
【００７７】
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ　ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）由来の酢酸耐性遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献５参照。）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＧＲＳ１を作製した。ｐＧＲＳ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。この増幅断片は、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩ断片（酢酸耐性遺伝子：その塩基配列を配列番号１に示す）内に含まれ、塩基番号１９１〜４９０のコーディング領域（ＯＲＦ）の上流及び下流領域の一部を包含するものである。
【００７８】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃　１５秒、６０℃　３０秒、６８℃　３０秒を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７９】
このｐＧＲＳ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献８参照。）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００８０】
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００８１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＲＳ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００８２】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００８３】
その結果、図２に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
【００８４】
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
【００８５】
実施例２で得られたプラスミドｐＧＲＳ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸発酵能を比較した。
【００８６】
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して、酢酸、エタノールを含み、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ濃度で含有する１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％でエタノール４％の濃度に調製し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表１にまとめた。
【００８７】
【表１】

【００８８】
表１の結果から、形質転換株の方が、最終到達酢酸濃度、比増殖速度において、顕著に優れていることが確認できた。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、更に、該育種株を用いた、より高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
【００９０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びｐＧＲＳ１への挿入断片の概略図。
【図２】酢酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図面。
【図３】本酢酸耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図面。
【図４】プライマー１を示す。
【図５】プライマー２を示す。
【図６】本酢酸耐性遺伝子の塩基配列を示す。

Claims (7)

1. 下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧｒｏＥＳ。
   （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
   （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
2. 下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
   （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
3. 下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
   （Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９１〜４９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
   （Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９１〜４９０からなる塩基配列又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
4. 請求項２、又は請求項３に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、酢酸耐性が増強された微生物。
5. 微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項４に記載の微生物。
6. 請求項４、又は請求項５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
7. 請求項２、又は請求項３に記載のＤＮＡを含んだ組換えプラスミドｐＧＲＳＥ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１８７）。

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