WO2006064746A1 - 短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法 - Google Patents

短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006064746A1
WO2006064746A1 PCT/JP2005/022742 JP2005022742W WO2006064746A1 WO 2006064746 A1 WO2006064746 A1 WO 2006064746A1 JP 2005022742 W JP2005022742 W JP 2005022742W WO 2006064746 A1 WO2006064746 A1 WO 2006064746A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chain fatty
short
cell
base
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/022742
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeru Nakano
Masahiro Fukaya
Original Assignee
Mitsukan Group Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsukan Group Corporation filed Critical Mitsukan Group Corporation
Priority to US11/793,145 priority Critical patent/US20080138904A1/en
Priority to EP05814767A priority patent/EP1842912A4/en
Publication of WO2006064746A1 publication Critical patent/WO2006064746A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for breeding a cell having improved short-chain fatty acid resistance. Specifically, a cell having improved short-chain fatty acid resistance by introducing and expressing a short-chain fatty acid resistance gene into cells such as microorganisms.
  • the present invention relates to a method for breeding, a high-density cell culture method for producing useful substances, and an efficient production of a fermentation broth containing a short-chain fatty acid as a use of microbial cells obtained by the method. .
  • microorganisms when these nutrient sources are consumed by the growth of microorganisms, the microorganisms produce short-chain fatty acids in the medium that are toxic to the growth of the microorganisms, such as formic acid and acetic acid. There was a problem that growth stopped.
  • Escherichia coli which is often used for recombinant protein production, is widely used as a host bacterium in high-density aerobic fermentation.
  • aerobic high density culture of E. coli it is common to add an appropriate amount of dalcose to the growth medium. Generated.
  • These short-chain fatty acids are major factors that inhibit high-density culture and also inhibit the production of recombinant proteins (see, for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • the fed-batch culture method it is possible to arbitrarily control the concentration of a specific component in the medium.
  • the sugar concentration can be kept constant within the optimum range of the microorganisms cultured in the medium. For this reason, the target microorganism can be efficiently cultured and is widely adopted.
  • the production of organic acid cannot be suppressed, and there are many problems such as a decrease in growth rate and a decrease in the yield of recombinant protein due to the generated organic acid.
  • non-patent document 5 describes the lack of these enzyme (PTA and ACK) genes for E. coli. Mutant strains have been created. However, in these mutant strains, even if the biosynthesis system of acetic acid (PTA and ACK) is inactivated, there are still other pathways for the production of acetic acid. Although it was possible to lower the value, it was not possible to generate completely. Further, the above-mentioned defective mutant strains accumulated excessive organic acids other than acetic acid such as lactic acid and pyruvic acid (see, for example, Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7).
  • microorganisms that do not produce any short-chain fatty acids that are harmful to growth, such as formic acid and acetic acid produced during the cultivation of microorganisms, are still in development and have not been successful.
  • ATP binding cassette ATP binding cassette
  • binding cassette a gene group having a motif of (binding cassette)
  • Genes having these ATP binding cassette motifs are generally referred to as the ABC transporter family, and metabolites and drugs can be transferred from the inside of the cell to the outside of the cell, or from the outside of the cell to the inside of the cell. It is presumed that it encodes a protein having the function of a transporter to transport.
  • ABC transporter gene When one of these ABC transporter family genes (ABC transporter gene) is linked to a multicopy vector and introduced into acetic acid bacteria, the resulting transformant (acetic acid bacteria) is acetic acid. Although the resistance was improved, the resistance to other organic acids was not affected (for example, see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-289868
  • Non-Patent Document 1 "Applied 'Environmental Mental' Microbiology", 56 ⁇ , p. 1004-1011 (1990)
  • Non-Patent Document 2 “Biotechnol. Bioengine.”, 39 ⁇ , p. 663—671 (1992)
  • Non-Patent Document 3 "Trends Biotechnol.”, 14 ⁇ , p. 98-100 (1996)
  • Non-Patent Document 4 “Appl. Microbiol. Biotechnol.”, 48 ⁇ , p. 597—601 (1997)
  • Non-Patent Literature 5 “Biotechnol. Bioengineering”, 35 ⁇ , p. 732-738 (1990)
  • Non-Patent Document 6 “Biotechnol. Bioengine.”, 38 ⁇ , p. 1318-1324 (1991)
  • Non-Patent Document 7 “Bioscience, Biotechnology, and Neochemistry (Biosci. Biotechnol. Biochem.)”, 58 ⁇ , p. 2232-2235 (1994)
  • the present invention firstly provides a raw material such as acetic acid and acetic acid while suppressing the growth of cells including microorganisms and maintaining high productivity of useful substances. It aims at providing the method of providing tolerance with respect to the short chain fatty acid harmful to growth.
  • the second aspect of the present invention also provides a means for efficiently culturing a microorganism in the presence of a short-chain fatty acid and a means for producing a useful short-chain fatty acid by fermentation. Objective.
  • acetic acid which is one of short-chain fatty acids.
  • acetic acid bacteria which is presumed to be the ABC transporter family possessed by acetic acid bacteria that are used in the production of acetic acid fermentation.
  • ABC transporter genes that make up the ABC transporter family could be introduced and expressed in heterologous cells other than the original acetic acid bacteria.
  • acetic acid bacteria belongs to a genus completely different from that of acetic acid bacteria, and originally has low alcoholic acid ability, such as Escherichia coli, and Dalconacetobacter, which is acetic acid bacteria but has low ability to ferment acetic acid.
  • Gluconacetobacter It was also found that transformants can be obtained from diazotrophicus). Unlike the case of acetic acid bacteria, the transformant is not unexpectedly inhibited from growth inhibition by short-chain fatty acids other than acetic acid (carbon number of 5 or less), that is, has resistance to short-chain fatty acids. The result was also found. It was also confirmed that the productivity of useful substances originally produced by these microorganisms by gene transfer and recombinant proteins introduced from outside did not decrease.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • the present invention includes the following forces (1) to (11).
  • a method for breeding a cell with improved short-chain fatty acid resistance characterized by introducing a gene encoding a protein having a function of discharging short-chain fatty acids from the inside of the cell to the outside of the cell.
  • a DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 301 to 2073 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 301 to 2073, or the DNA of the nucleotide sequence that can serve as a probe with at least a partial force of the nucleotide sequence, and stringent conditions DNA containing a base sequence that hybridizes underneath, and that encodes a protein having a function of enhancing acetic acid resistance.
  • a DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 331 to 2154 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 331 to 2154 or the DNA of the nucleotide sequence that can serve as a probe with at least a partial force of the nucleotide sequence, and stringent conditions DNA containing a base sequence that hybridizes underneath, and that encodes a protein having a function of enhancing acetic acid resistance.
  • a gene encoding a protein having a function of discharging a short-chain fatty acid from the inside of the cell to the outside of the cell is the DNA shown in the following (a), (b), (c) or (d) The method for breeding cells according to (1) above, wherein (a) A DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 1002 to 1724 and a base sequence consisting of base numbers 1724 to 2500 among the base sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing the nucleotide sequences having the nucleotide numbers 1002 to 1724, or the DNA of the nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence, and the stringent A protein having a function of enhancing acetic acid resistance, comprising a nucleotide sequence that is noisy under conditions and a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1724 to 2500 among the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing DNA encoding the complex.
  • nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing the nucleotide sequences having the nucleotide numbers 1002 to 1724, or the DNA of the nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence, and the stringent Base sequence that can be neutralized under various conditions, and a base sequence consisting of base numbers 1724 to 2500 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, or a base that can be used as a probe with at least a partial strength of the base sequence
  • a DNA comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions and a DNA that encodes a protein complex having a function of enhancing acetic acid resistance.
  • nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 249 to 1025 or a nucleotide sequence that can serve as a probe with at least a partial strength of the nucleotide sequence
  • a DNA comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and that encodes a protein having a function of enhancing acetate resistance.
  • (11) A method for producing a fermentation broth containing a short-chain fatty acid, wherein the cell according to (8) is cultured under conditions under which the cell produces a short-chain fatty acid.
  • the present invention it is possible to breed cells having resistance to short chain fatty acids and improved short chain fatty acid resistance.
  • the breeding method of the present invention is applied to microbial cells, cells that are not affected by short-chain fatty acids that are harmful to the growth produced during culture can be efficiently bred.
  • the microbial cells resistant to short-chain fatty acids obtained by the present invention can also be applied to high-density cell culture that produces short-chain fatty acids. It can also be used for the production of fermentation broth containing high concentrations of short-chain fatty acids. In particular, in the case of Escherichia coli or the like to which resistance to short chain fatty acids is imparted, the growth ability in culture is remarkably improved, and high concentrations of short chain fatty acids can be accumulated efficiently, which is industrially useful.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the construction of an E. coli acetic acid bacteria shuttle vector pGI18.
  • FIG. 2 Growth amounts of transformant and non-transformant in Example 1 on (a) non-added medium, (b) formic acid-containing medium, (c) acetic acid-added medium, and (d) propionic acid-added medium. Shows change over time.
  • FIG. 3 Changes in growth over time of transformant and non-transformant in (a) butyric acid-containing medium, (b) isobutyric acid-containing medium, and (c) n-valeric acid-added medium in Example 1. Indicates.
  • FIG. 4 shows changes over time in the amount of growth of transformants and non-transformants in Example 2 in (a) formic acid-containing medium and (b) acetic acid-added medium.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a restriction enzyme map of a gene fragment derived from Dalconacetopacter entaniii, the position of a short-chain fatty acid resistance gene, and a fragment inserted into plasmid pABC31.
  • FIG. 6 shows time-dependent changes in growth amounts of transformants and non-transformants in Example 3 in (a) formic acid-containing medium and (b) acetic acid-added medium.
  • FIG. 7 shows time-dependent changes in the amount of growth of transformants and non-transformants in Example 4 in (a) formic acid-containing medium and (b) acetic acid-added medium.
  • FIG. 8 shows a restriction enzyme map of a cloned gene fragment derived from Dalconacetopacter 'entanyi, the position of a short-chain fatty acid resistance gene, and a schematic diagram of an inserted fragment into plasmid PABC41.
  • FIG. 9 shows the growth of each cell in Example 6 (1) and the transition of the total organic acid content and the acetic acid content in the culture solution.
  • FIG. 10 shows changes in the amount of growth in fed-batch culture of glucose in Example 6 (2).
  • FIG. 11 shows the culturing process of the transformant and non-transformant in Example 7 in an acetic acid-containing medium.
  • FIG. 12 shows a restriction map of DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the position of the short-chain fatty acid resistance gene, and a schematic diagram of the inserted fragment into plasmid pABCl.
  • An object of the present invention is to breed a cell into which a gene (short chain fatty acid resistance gene) having a function of discharging a short chain fatty acid from the inside of the cell to the outside of the cell, a cell bred by the breeding method, and the cell It is an object of the present invention to provide a high-density cell culture method using cells and a method for producing a fermentation broth containing useful short-chain fatty acids.
  • a gene short chain fatty acid resistance gene
  • the method for breeding cells with improved short-chain fatty acid resistance according to the present invention is described in claim 1.
  • a gene short chain fatty acid resistance gene
  • encoding a protein having a function of discharging a short chain fatty acid from inside the cell to the outside of the cell is introduced into the cell and expressed.
  • the protein having a function of discharging a short-chain fatty acid from the inside of the cell to the outside of the cell is taken into the cell which is the object of the breeding method of the present invention and is taken into the cell or metabolized in the cell such as metabolism.
  • a protein that can exert the function of discharging short-chain fatty acids produced by the function to the outside of the cell For example, in a culture medium to which an acetic acid concentration that affects growth is added, It means a protein that lowers the concentration of acetic acid by 15-20% or more.
  • Specific examples of such a protein include a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, or 9 in the sequence listing, and a protein complex having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7. .
  • mutation such as substitution, deletion, insertion, addition, inversion, etc. with 1 or multiple, preferably 1 or several amino acids
  • mutations such as substitution, deletion, insertion, addition, inversion, etc.
  • 1 or multiple, preferably 1 or several amino acids As long as it is a protein having a function of excreting short-chain fatty acids from the inside of the cell to the outside of the cell, it is also included in the above protein.
  • one or more, preferably 1 or several amino acids include mutations such as substitution, deletion, insertion, addition, inversion, etc.
  • the protein complex is also included in the above protein.
  • the gene encoding the protein means a gene that contains the protein coding region and can be introduced and expressed in cells.
  • a typical example of such a gene is an ABC transporter gene constituting a gene group derived from acetic acid bacteria presumed to be the ABC transporter family.
  • the ABC transporter gene means a gene having an ATP-binding cassette motif or a gene encoding a protein complex by forming an operon with the gene having the motif.
  • Genes having the ATP-binding cassette motif are generally referred to as the ABC transporter family, and metabolites and drugs can be transferred from the inside of the cell to the outside of the cell. Functions of transporters that transport into cells It is presumed that it encodes a protein having
  • ABC transporter genes include, for example, SEQ ID NOs: 2, 4, and
  • Examples thereof include a gene containing a coding region encoding a protein having the amino acid sequence shown in 6, 7, or 9.
  • Base No. 1, 3, 5, or 8 [of J, the base sequence consisting of base numbers 301 to 2073 of U number 1 and base numbers 331 to 2154 of SEQ ID NO: 3
  • Examples thereof include a DNA comprising a base sequence, a base sequence consisting of base numbers 1002 to 1724 of SEQ ID NO: 5 and a base sequence consisting of base numbers 1724 to 2500, or a base sequence consisting of base numbers 249 to 1025 of SEQ ID NO: 8. .
  • DNAs only need to contain the above-mentioned specific base sequence.For example, use a DNA having the full-length ability of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 8 in the sequence listing. Is also possible.
  • DNAs are acetic acid bacteria (acetobacteria belonging to the genus Acetobacter and Dalconacetobacter) based on a primer designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 8. ) Can be easily obtained by PCR using the ⁇ gene.
  • DNA consisting of each base sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 3 is Acetobacter aceti No. 1023 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Ibaraki, Japan)).
  • Tsukuba Rakuhito 1-chome 1 1-Chuo 6) (Former name: Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Microbiological Technology Research Institute, former address: Tsukuba Rakuto 1-chome 1-3, Ibaraki, Japan) 1983 The deposit number is FERM BP-2287 dated June 27 (transferred from the original deposit dated February 13, 1989).
  • DNA comprising each nucleotide sequence described in SEQ ID NOs: 5 and 8 in the Sequence Listing is a kind of (Gluconacetobacter entanii) Acetobacter altoacetigenes MH-2 24 strain (Incorporated Administrative Agency Research Institute Patent Biological Deposit Center (Ibaraki, Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-Chuo 6) (Former name: Ministry of International Trade and Industry, Institute of Microbial Technology, Institute of Microbiology, former address: Yatabe, Tsukuba-gun, Ibaraki, Japan No. 1-3 (Machihigashi) was deposited as the deposit number FERM BP—491 on February 23, 1984.
  • nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1724 to 2500 or a nucleotide sequence that can be a probe prepared from at least part of the nucleotide sequence, and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions
  • DNA encoding a protein complex having a function of enhancing acetate resistance can be used in the same manner.
  • the stringent condition means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • Typical hybridization conditions include, for example, conditions in which washing is performed at 60 ° C at a salt concentration corresponding to 0.1% SDS with 1 X SSC.
  • the short-chain fatty acid resistance gene described above encodes a protein having a function of discharging short-chain fatty acids from the inside of the cell to the outside of the cell is, for example, as described in Examples below. Is actually introduced into a cell and expressed, and the presence or absence of growth when the cell (transformant) is cultured in a medium containing a short-chain fatty acid and an increase in the amount of growth (the degree of proliferation) in the medium are determined. This can be confirmed by discrimination.
  • the short-chain fatty acid means a fatty acid having a straight or branched chain structure having 1 to 5 carbon atoms, and may or may not have an unsaturated bond.
  • Cells obtained by the breeding method of the present invention are particularly saturated fatty acids having a linear or branched structure having 1 to 5 carbon atoms, that is, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, or It has strong V ⁇ resistance to valeric acid.
  • the subject of the breeding method of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell into which the short-chain fatty acid resistance gene is introduced and can be expressed.
  • the cells include bacterial cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and lactic acid bacteria, yeast cells, and microbial cells such as fungal cells such as microorganisms belonging to the genus Aspergillus.
  • Examples of microbial cells include bacterial cells belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli or Bacillus, as described in claim 8.
  • bacterial cells when targeting bacterial cells with low alcohol oxidation ability, such as Escherichia coli and acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconacetobacter, the production and production efficiency of the short chain fatty acids and the growth of the cells are reduced. This is preferable because it can be significantly increased.
  • Examples of acetic acid bacteria include acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and the genus Glue onacetobacter.
  • Acetobacter aceti As a bacterium belonging to the genus Acetobacter, specifically, Acetobacter aceti is mentioned. Specifically, Acetobacter aceti No. 1023 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 1st 6th) (Former name: Institute of Microbial Technology, Ministry of International Trade and Industry, former address: 1st, Tsukuba, 1st, Ibaraki, Japan) No.
  • bacteria belonging to the genus Dalconacetopacter examples include Gluconacetobacter europaeus, Gluconacetobacter diazotrophicus, and Gluconacetobacter diazotrophicus.
  • E. coli bacteria belonging to the genus Escherichia are preferred.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli, specifically, Escherichia coli K12 strain, Escherichia coli JM109 strain, Escherichia coli DH5 o; strain, Escherichia coli C600 strain, Escherichia coli BL21 strain, Escherichia coli W3110. You can use stocks.
  • bacteria belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtili. s) and Bacillus subtilis, and specifically, Bacillus subtilis Marburg 168 strain and the like can be used.
  • yeast cells examples include Saccharomyces cerevisiae and Shizosaccharomyces pombe.
  • Escherichia coli and Gluconacetobacter diazotrophicus are targeted. It is preferable to do.
  • Escherichia coli inherently has a very low ability to oxidize alcohol, and Dalconacetobacter diazotrophicus is an acetic acid bacterium, but its ability to ferment short-chain fatty acids is conferred on these microorganisms. By doing so, its usefulness can be sufficiently enhanced.
  • the introduction and expression of a short-chain fatty acid resistance gene into cells in the breeding method of the present invention can be performed using a recombinant vector. That is, by transforming cells with a recombinant vector in which a short chain fatty acid resistance gene is linked to an appropriate vector, a method for amplifying the intracellular copy number of the gene, or an appropriate vector with a short vector. By transforming cells using a recombinant vector in which a structural gene of a chain fatty acid resistance gene is linked to a promoter sequence that functions efficiently in the cell, the number of copies of the gene in the cell is amplified. It can be realized by the method.
  • a phage vector or a plasmid vector that can be autonomously propagated in a host can be used as a vector for use in the production of a recombinant vector.
  • plasmid vectors examples include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pET16b, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast (eg, Yepl3, Ycp50, etc.).
  • plasmid vector examples include ⁇ phage ( ⁇ gtlO, ⁇ ZAP, etc.).
  • transformants should be prepared using animal winoles betaters such as retrowinoles or vaccinia winoles, insect virus vectors such as noculovirus, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), etc. You can also.
  • animal winoles betaters such as retrowinoles or vaccinia winoles
  • insect virus vectors such as noculovirus, bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), etc. You can also.
  • the target DNA can also be introduced into a host using a multicopy vector or transposon.
  • a multicopy vector or transposon can be used.
  • a poson is also included in the recombinant vector of the present invention.
  • Multi-copy vectors include pUF106 (see, for example, “Cellulose, p. 15 3—158 (1989)”, 1 ⁇ ⁇ 24 (for example, “Applied 'and' Environmental Romantic • Microbiology ( Appl. Environ. Microbiol.), 55 ⁇ , p. 171—176 (1989)), PGI18 (see, for example, Production Example 1 below), pTA5001 (A), pTA5001 ( ⁇ ) (see, for example, JP (See, for example, Sho 60-9488) pMVLl (for example, “Agricultural and Biologic Chemistry”), 52 ⁇ , which is a chromosomal integration vector. p. 3125-3129 (1988)).
  • pUF106 see, for example, “Cellulose, p. 15 3—158 (1989)”
  • 1 ⁇ ⁇ 24 for example, “Applied 'and' Environmental Romantic • Microbiology ( Appl. Environ. Microbiol.), 55 ⁇ , p. 171—176
  • transposons include Mu and IS1452.
  • a recombinant vector is produced by linking a short-chain fatty acid resistance gene to a vector
  • the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the restriction enzyme site or multicloning of the appropriate vector DNA is cut.
  • a method such as inserting into a site and linking to a vector is adopted.
  • recombinant vectors when the obtained recombinant vector is introduced into a cell, it expresses a protein having a function of discharging a short-chain fatty acid from the inside of the cell encoded by the short-chain fatty acid resistance gene to the outside of the cell. It is necessary to be demonstrated. Therefore, in addition to short-chain fatty acid resistance genes and promoter sequences, recombinant vectors include cis-elements such as an enzyme, splicing signal, poly-A-linked signal, selection marker, and liposome binding sequence (SD). Array) etc. can also be connected and inserted.
  • cis-elements such as an enzyme, splicing signal, poly-A-linked signal, selection marker, and liposome binding sequence (SD). Array) etc.
  • examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
  • the promoter sequence of the short-chain fatty acid resistance gene on the chromosomal DNA is replaced with an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or Dalconacetopacter, or another promoter sequence that functions efficiently in E. coli.
  • a vector for homologous recombination may be constructed, and the vector may be used to cause homologous recombination on the microorganism chromosome.
  • promoter sequences e.g., Kuroramufue plasmid pBR322 of E.
  • coli ampicillin resistance gene (Takara Noio Co.), the kanamycin resistance gene of plasmid pHSG298 (Takara Bio Inc.), the plasmid P HSG396 (Takara Bio) -
  • promoter sequences derived from microorganisms other than acetic acid bacteria such as promoters of genes such as call resistance gene and ⁇ -galactosidase gene.
  • Vector construction for homologous recombination is well known to those skilled in the art.
  • an endogenous short-chain fatty acid resistance gene in a microorganism under the control of a strong promoter, the copy number from the short-chain fatty acid resistance gene is amplified and expression is enhanced.
  • DNAs having the respective base sequence strengths described in SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 8 in the sequence listing are respectively converted into acetic acid bacteria-Escherichia coli shuttle vectors (multi-copy).
  • Vector pABCl11, pABC112, pABC31, and PABC41 obtained by ligation to pGI18 can be mentioned.
  • the introduction and expression of a short-chain fatty acid resistance gene into cells in the breeding method of the present invention can be performed according to a conventional method using the above-described recombinant vector.
  • a method using calcium ions see, for example, “Agricultural and Biologic Chemistry”, 49 ⁇ , p. 2091-2097 (1985)
  • Elect mouth position method eg, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA”, 87 ⁇ , p. 8130-8134 (1990), bioscience Biotechnology I. and Biochemistry. (See Biosci. Biotech. Biochem.), 58 ⁇ , 974, 1994, etc.
  • a host cell examples thereof include an elect mouth position method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
  • the selection of the transformant can be performed by utilizing the property of the marker gene constituted in the gene to be introduced. For example, when an ampicillin resistance gene is used, cells showing resistance to an ampicillin drug can be selected. Specifically, an appropriate amount of ampicillin (for example, about 100 gZml) is added as a selection medium. Using the resulting product, apply transformant, culture, and transform colonies that have grown on the selective medium. can do. When neomycin resistance gene is used, cells that are resistant to G418 drug can be selected.
  • cells with improved short-chain fatty acid resistance can be obtained by introducing and expressing a short-chain fatty acid resistance gene in the cells as described above.
  • a short-chain fatty acid resistance gene in the cells as described above.
  • the ability of the cultivated cells to improve the resistance to short-chain fatty acids can be confirmed by culturing for 15 hours or longer in a medium supplemented with about 0.01 to 3% short-chain fatty acids. This can be done by measuring the absorbance and the dry cell weight and confirming that the original cells that have not been transformed show a production that is much higher than if they did not grow at all or not.
  • the present inventors introduced the above-described thread-replacement vector pABCl 11 into the acetic acid bacteria Setobacter no. 1023 strain as shown in the Examples below. No. 1023ZpABCl ll strain obtained by recombination and the recombinant vector pABCl 11 introduced into E.
  • JM109 strain JM109ZpABCl ll strain obtained in the same manner as the recombinant vector pABCl 11 ATCC49037ZpABCl11 strain obtained by introduction into the strain
  • JM109ZpABC112 strain obtained by introducing the recombinant vector p ABC112 into Escherichia coli JM109 strain
  • JM109ZpABC31 strain obtained by introducing the recombinant vector pABC31 into E. coli JM109 strain in the same manner JM109 / pABC41 strain obtained by introducing recombinant vector p ABC41 into E. coli strain JM109 was actually obtained.
  • the high-density cell culture method of the present invention uses the cell of claim 8, that is, the short-chain fatty acid by the breeding method of the present invention described in [1] above. Expressed by introducing a resistance gene into bacterial cells belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli or Bacillus Bacterial cells belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli or Bacillus having improved short-chain fatty acid resistance are used.
  • the high-density cell culture method means a method of culturing bacterial cells (cells) at a high density, generally 50 to 200 g (dry cell) ZL in the medium.
  • the medium, culture time, and culture conditions can be set as appropriate depending on the cell type.
  • any medium such as a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • Aeration culture at 37 ° C can be used.
  • the high-density cell culture method of the present invention is resistant to short chain fatty acids. Since improved bacterial cells are used, growth inhibition can be prevented. That is, as described in claim 10, growth is inhibited even if cells are cultured in the presence of short-chain fatty acids that are toxic to growth, such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, or valeric acid. Therefore, it is possible to maintain the productivity of useful substances originally produced by microbial forces and recombinant proteins introduced with external forces.
  • the useful substance is not particularly limited as long as it is a substance that can be produced by using microorganisms.
  • One example is the microbial cell itself.
  • the final density of cells can be improved by using the cells of the present invention, even substances produced by normal metabolism can be produced very efficiently. Examples include fatty acids, amino acids, antibiotics, enzymes, vitamins and alcohols. As shown in Example 6, the amount of organic acid produced in the medium can be increased.
  • the recombinant protein include human growth hormone and peptide, interleukin 113, and interferon.
  • Escherichia coli can efficiently produce organic acids such as citrate, malic acid, succinic acid and pyroglutamic acid in addition to the above short-chain fatty acids having 5 or less carbon atoms.
  • Examples of the high-density cell culture method widely used from the laboratory level to the industrial production level include fed-batch culture and dialysis culture.
  • the fed-batch culture is a method in which a specific nutrient source is fed continuously or intermittently to a medium according to the culturing time.
  • a nutrient source for fed-batch cell growth Or a carbon source such as glucose or glycerol, which is a direct raw material for short-chain fatty acids that inhibit protein production.
  • the schedule of fed-batch is a method of increasing the flow acceleration exponentially so that the concentration of carbon source in the medium and the growth concentration of Z or fungus can be kept constant, the concentration of carbon source in the medium
  • the flow acceleration (feed amount) can be increased stepwise (generally every 2 to 5 hours) while keeping the concentration below the specified concentration.
  • the culture conditions such as the type of medium, temperature, humidity, pH, time, presence / absence of agitation can be appropriately determined according to the type and state of bacterial cells.
  • dialysis culture is a method in which an extracellular product such as acetic acid is removed from the culture system using a dialysis membrane or the like.
  • the bacterial cells belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli or Bacillus of the present invention with improved resistance to short-chain fatty acids are not affected by short-chain fatty acids. Therefore, even simple equipment (for example, a jersey mentor) can be implemented.
  • the method for producing a fermentation broth according to the present invention is characterized in that the cells according to claim 8 are cultured under conditions under which the cells produce short chain fatty acids.
  • the cell according to claim 8 is expressed by introducing a short-chain fatty acid resistance gene into a bacterial cell belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli or Bacillus by the breeding method of the present invention described in [1] above.
  • Bacterial cells belonging to the genus Acetic acid bacteria, Escherichia coli, or Bacillus having improved short-chain fatty acid resistance, which are bred, can be selected and used as bacterial cells having the desired ability to produce short-chain fatty acids.
  • E. coli can produce all short chain fatty acids, and acetic acid bacteria can selectively produce acetic acid.
  • Short chain fatty acids are formic acid, acetic acid, propylene. In addition to on acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, it also means lactic acid.
  • the method for producing a fermentation broth according to the present invention requires that the bacterial cells to be cultured are cultured under conditions for producing short-chain fatty acids. Such conditions are the types of bacterial cells and the production target. Although it can be determined as appropriate depending on the type of short chain fatty acid, an appropriate amount of short chain alcohol corresponding to the short chain fatty acid is usually added.
  • the acetic acid bacteria E. coli shuttle vector pGI 18 was prepared from about 3. lkb of plasmid pGI 1 and pUC 18 derived from Acetobacter altoacetigenes MH 24 strain (FERM BP 491).
  • Figure 1 outlines the construction of plasmid pGI18.
  • the plasmid pGIl was also prepared with the ability of Acetopacter altoacetigenes.
  • the cells were collected from the culture solution of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), lysed using sodium hydroxide sodium dodecyl sulfate, and then treated with phenol. Furthermore, the plasmid DNA was purified with ethanol.
  • the obtained plasmid was a circular double-stranded DNA plasmid having 3 recognition sites in Hindi and 1 in Sfil, and the total length of the plasmid was about 3100 base pairs (3. Ikbp). In addition, it did not have recognition sites for EcoRI, Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sail, Pstl, Sphl, and Hindi II. This plasmid was named pGIl and used to construct the vector pGI18.
  • the plasmid pGIl obtained as described above was amplified by PCR and cleaved with Aatll. This fragment was inserted into the restriction enzyme Aatll cleavage site of pUC18 (2.7 kbp, manufactured by Takara Bio Inc.) to prepare plasmid pGI18.
  • the PCR method was performed as follows. Plasmid pGIl is used as a cage type, and primer A (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) and primer B (refer to SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) are used as primers. Base sequence). Perform PCR with the above kite and primers using KOD-P1 Using us- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), it was carried out under the conditions of 30 cycles, with 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 3 minutes.
  • the resulting plasmid pGI18 contained 11-18 and 011 as shown in FIG. 1, and the total length was about 5800 base pairs (5.8 kbp). .
  • the base sequence of this plasmid pGI 18 was as shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • Example 1 Acetic acid excretion in a vaccine that is transformed with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • PABC 1 (FIG. 12) cleaved with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was cleaved with the restriction enzyme Pstl, and the resulting fragment of about 2.5 Kb was prepared in Production Example 1.
  • the plasmid pABClll was prepared by ligation to the restriction enzyme Pstl cleavage site of the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector PGI18.
  • the pABClll prepared in this way was transferred to the Acetobacter aceti No. 1023 strain (FERM BP-2287) using the electo mouth position method (“Procedures 'National' Academic ⁇ ⁇ "Science” of USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ", 87 ⁇ , p. 8130-8134 (1990)). Transformants were selected on YPG medium supplemented with 100 ⁇ g Zml ampicillin and 2% acetic acid.
  • the ampicillin-resistant transformant grown on the above selection medium is extracted and analyzed by a conventional method, and a plasmid carrying the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is retained. ,I was sure that.
  • the ampicillin resistant transformant (No. 1023 / pABClll strain) carrying the plasmid pABCl11 obtained as described above was grown in YPG medium supplemented with acetic acid, and the intracellular acetic acid concentration was determined. Comparison was made with Acetovata'Acetii No. 1023 strain (No. 1023ZpGI18 strain) into which only the shuttle vector pGI18 was introduced.
  • Table 1 shows the results of intracellular potassium acetate concentration in each culture solution.
  • both the transformed strain No. 1023ZpABClll and the non-transformed strain No. 1023ZpGI18 strain showed increased intracellularity as the potassium acetate concentration in the culture solution increased. had potassium acetate concentration increases, the degree of increase is transformed strain (No. 1023ZpABClll Ltd.) it is relatively slow device particularly when potassium acetate concentration of the culture of 4 wt Z capacitance 0 / o, the The No. 1023ZpABClll strain had only 84% accumulation of the No. 1023ZpGI18 strain. This indicates that in the transformed strain 1023ZpABClll, acetic acid in the cells is excreted outside the cell.
  • the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a gene encoding a protein having a function of discharging acetic acid from the inside of the cell to the outside of the cell.
  • Example 2 Resistance to short chain fatty acids of Escherichia coli transformed with DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the pABClll prepared in Example 1 was transformed into Escherichia coli JM109 according to a conventional method by an electroboration method, and a transformant was selected on an LB agar medium supplemented with 100 ⁇ g / ml ampicillin.
  • Ampicillin-resistant transformants that grew on the selective medium were analyzed by extracting plasmids by a conventional method and confirmed that they retain the plasmid carrying the acetate-resistant gene.
  • the transformation m3 ⁇ 4FM109ZpABCl 11 strain obtained in this way is an Deposited at the Research Center for Biological Biology (1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on December 14, 2004, the deposit number is FERM BP— 10184 .
  • JM109ZPABC111 For the ampicillin resistant transformant (JM109ZPABC111) having the plasmid pABCl11 obtained as described above, LB medium supplemented with formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, and valeric acid short chain fatty acids.
  • the growth of E. coli was compared with E. coli (JM109ZPGI18 strain) into which only the shuttle vector pGI18 was introduced.
  • LB medium pH 5.0: medium supplemented with short chain fatty acids
  • ampicillin 100 / ⁇ 8 ⁇ 1 ampicillin 100 / ⁇ 8 ⁇ 1, ImM IPTG (isopropyl 1-1-thio-13-D-galactobilanoside) at 37 ° C
  • JM109ZPABC The 111 strain and the JM109ZpGI18 strain were subjected to shaking culture (150 rpm).
  • the same culture was performed in a non-added medium having the same composition as the medium containing short chain fatty acids except that no short chain fatty acid was added.
  • the absorbance at 660 nm was measured over time, and each medium was compared as an index of the degree of growth (growth) of each cell.
  • Figures 2 and 3 show the changes over time in the amount of growth (absorbance (660 nm)) in each medium.
  • Escherichia coli having improved resistance to various short-chain fatty acids can be bred by introducing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing into E. coli cells.
  • the PCR method was performed as follows. As a type, using genomic DNA of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), and as a primer, primer 1 (refer to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing) and Primer 2 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) was used. Perform PCR using the above saddle type and primers using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) with 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes. It was carried out under the conditions of Kuru.
  • KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the pABC 112 produced in this way was transferred to Escherichia coli JM109 strain by the electroporation method (Biosci. Biotech. Biochem., 58 ⁇ , 974). P. 1994). Transformants were selected on LB agar medium supplemented with 100 ⁇ g Zml ampicillin.
  • the ampicillin-resistant transformant grown on the above selection medium is extracted and analyzed by a conventional method, and a plasmid carrying the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is retained. ,I was sure that.
  • the transformed m3 ⁇ 4FM109ZpABCl 12 strain obtained in this way was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Rinto, 1-chome, 1-chome, 1-cir. 6), December 14, 2004. Deposited by date, the deposit number is FERM BP-10185.
  • the ampicillin resistant transformant ( ⁇ 11097 88112) having the plasmid pABCl12 obtained as described above was grown in LB medium supplemented with formic acid and acetic acid short-chain fatty acids. Comparison was made with E. coli (JM109ZPGI 18 strain) into which only the shuttle vector pGI 18 was introduced.
  • the transformed strain JM109ZpABC112 was able to grow even though each short-chain fatty acid-added medium was a non-transformed strain.
  • Some J M109ZpGI18 strains failed to grow. That is, the non-transformed strain (JM109ZPGI18 strain) was affected by the presence of short-chain fatty acids, whereas the transformed strain CFM109Z pABCl 12 strain) was resistant to formic acid and acetic acid! And then.
  • Escherichia coli having improved resistance to short-chain fatty acids can be bred by introducing DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing into E. coli cells.
  • the PCR method was performed as follows. As a type, using genomic DNA of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491), as a primer, primer 3 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing) and Primer 4 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing) was used. PCR with the above mold and primers using KOD-Plus-(Toyobo Co., Ltd.), 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute The conditions were as follows.
  • FIG. 5 shows a restriction enzyme map of the described base sequence, the position of the base sequence described in SEQ ID NO: 5, and a schematic diagram of the inserted fragment into plasmid PABC31.
  • the pABC31 prepared as described above was transformed into Escherichia coli JM109 strain by the electoral position method. Transformants were selected on LB agar medium supplemented with 100 gZml ampicillin.
  • the ampicillin-resistant transformant grown on the above selection medium is extracted and analyzed by a conventional method, and a plasmid carrying the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is retained. ,I was sure that.
  • the transformation m3 ⁇ 4FM109ZpABC31 strain obtained in this way was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on December 14, 2004.
  • the deposit number is FERM BP-10182.
  • the ampicillin resistant transformant (JM109ZPABC31) having the plasmid PABC31 obtained as described above was grown in LB medium supplemented with short-chain fatty acids of formic acid and acetic acid, and Escherichia coli into which only the shuttle vector pGI18 was introduced. (JM109ZPGI18 strain).
  • C static culture or shaking culture (150 rpm) of the JM109ZpABC31 strain and the JM109ZpGI18 strain was performed.
  • the absorbance at 660 nm was measured over time and used as an indicator of the degree of growth (growth) of each cell and compared between each medium added with short chain fatty acids.
  • Fig. 6 shows the amount of growth (absorbance (660 nm)) in each medium.
  • the transformed strain M109ZPABC31 was able to grow in any of the mediums supplemented with short chain fatty acids, whereas the E. coli strain JM109ZpGI18 was unable to grow.
  • the non-transformed mtt CFM109ZpGI18 strain was affected by the presence of short-chain fatty acids, whereas the transformed ⁇ 3 ⁇ 4 (jM109ZpABC31 strain) Formic acid and acetic acid! / Resistant to discrepancy! /
  • Escherichia coli having improved resistance to short-chain fatty acids can be bred by introducing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 of the Sequence Listing into E. coli cells.
  • the DNA shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was amplified by PCR, and the resulting fragment was ligated to the restriction enzyme Smal cleavage site of the acetic acid bacteria-E. Coli shuttle vector PGI18 prepared in Production Example 1 to obtain plasmid P ABC41. Produced.
  • the PCR method was performed as follows. Using the genomic DNA of Acetobacter altoacetigenes MH-24 strain (FERM BP-491) as a cage type, and as a primer, primer 5 (refer to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing) and Primer 6 (see the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing) was used. PCR using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using the above saddle type and primers, with 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute It carried out on condition of this.
  • KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the pABC41 prepared in this way was transformed into Escherichia coli JM109 strain by the electopore method. Transformants were selected on LB agar medium supplemented with 100 gZml ampicillin.
  • the ampicillin-resistant transformant grown on the above selection medium is extracted and analyzed by a conventional method, and a plasmid carrying the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is retained. ,I was sure that.
  • Acetobacterin MH A restriction map of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 and the position of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 in the genomic DNA of 24 strains, and a schematic diagram of the inserted fragment into plasmid PABC41 This is shown in Fig. 8.
  • transformation 3 ⁇ 4JM109ZpABC41 strain was founded on December 27, 2004 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan).
  • the deposit number is FERM BP_10194.
  • LB medium pH 5.0 containing 0.15% formic acid or acetic acid as a short-chain fatty acid, ampicillin 100 / gZ ml, and ImM IPTG (isopropyl 1-1j-j-galatatopyranoside) ) 37.
  • the JM109 / PABC41 strain and the JM109ZpGI18 strain were subjected to static culture or shaking culture (150 rpm).
  • the absorbance at 660 nm was measured over time, and was compared between the mediums supplemented with short chain fatty acids as an index of the degree of growth (growth) of each cell.
  • FIG. 7 shows the amount of growth (absorbance (660 nm) over time) in each medium.
  • the transformed 3 ⁇ 4IM109ZpABC41 strain was able to grow in any of the short-chain fatty acid-added media, whereas the Escherichia coli JM109 / pGI18 strain was unable to grow. That is, the non-transformed strain CiM109ZpGI18) was affected by the presence of short-chain moon fatty acid, while the transformed JM109 strain pABC41 was resistant to formic acid and acetic acid.
  • Escherichia coli having improved resistance to short-chain fatty acids can be bred by introducing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 of the Sequence Listing into E. coli cells.
  • the transformant of E. coli strain JM109 carrying plasmid pABCl11 (JM109ZPABC111 strain) obtained in Example 2 was grown in a medium in which glucose was added to LB medium, and the E. coli strain into which only the shuttle vector pGI18 was introduced. (JM109ZPGI18 strain).
  • LB medium pH 7.0
  • aeration culture at 37 ° C, 500 rpm, 0.3 vvm was performed. The amount of growth during and at the end of the culture, and the amount of acetic acid and total organic acid in the culture were compared between the transformed and non-transformed strains.
  • Figure 9 shows the growth of each cell and the changes in total organic acid and acetic acid in the culture.
  • Table 2 summarizes the amount of growth at 22 hours after the start of culture, and the total amount of short-chain fatty acids and acetic acid in the culture solution.
  • E. coli obtained by introducing DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing into E. coli cells is not subject to growth inhibition by short-chain fatty acids in high-density cell culture, and As a result, it became clear that a large amount of organic acids can be produced using only short-chain fatty acids such as acetic acid.
  • a 2-liter mini jar manufactured by Mitsuru Rigaku Kogyo Co., Ltd .; KMJ-2A
  • a pH controller manufactured by Mitsuru Kagaku Kogyo Co., Ltd .; digital pH controller MPH-2C
  • mineral medium (2. Og Na 2 SO 4, 2. 468 g)
  • Culturing was performed while controlling the temperature, pH, stirring speed, and aeration rate to be 35 ° C, 6.8, 700 rpm, and 0.51 / min, respectively.
  • the pH was adjusted by adding 29% ammonia solution.
  • the 50% glucose solution was continuously added until 26.5 hours, and the schedule shown in Table 3 was applied.
  • the feed is fed while increasing the flow acceleration and the fed amount, and the culture is performed while performing aeration and agitation culture (aeration rate: 0.5 wm, agitation speed: 700 rpm). It was.
  • the proliferation of the bacterial cells was confirmed by measuring the amount of growth at an absorbance at 660 nm (OD660 nm) and the dry weight of the bacterial cells.
  • Fig. 10 shows the transition of the growth (OD660nm) in the fed-batch culture of glucose. As is clear from FIG. 10, it was confirmed that the transformed strain (JM109ZPABC111 strain) exceeded the growth potential SJM109ZPGI18 strain.
  • the final cell mass dry cell weight (g: DCW (Dried Cell Wei ght)) and glucose consumption was measured, and the cell concentration (dry cell weight gZ 1 per liter of medium) The cell yield (wZw%) was calculated, and the average growth rate (gZh) was calculated as the growth rate of the cells per unit time.
  • the transformed strain CiM109ZpABClll is the JM109ZpGI18 strain in terms of the amount of cells, the concentration of the cells, the yield of the cells, and the growth rate per unit time. The value was stronger.
  • the pABC 111 prepared in Example 1 was transferred to the Gluconacetobacter diazotrophicus ATC C49037 strain, which is one of the acetic acid fermentation bacteria! Transformation was performed by the position method. Transformation was selected on YPG medium supplemented with 100 ⁇ g Zml ampicillin.
  • the ampicillin-resistant transformant grown on the above selection medium is extracted and analyzed by a conventional method, and a plasmid carrying the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is retained. ,I was sure that.
  • Ampicillin-resistant transformation (ATCC49037ZpABClll strain) with plasmid pABCl11 obtained as described above was grown in YPG medium supplemented with acetic acid, and darkon into which only the shuttle vector pGI18 was introduced. It was compared with Acetobacter diazotrophicus ATCC49037 strain (ATCC49037ZpGI18 strain).
  • the transformant (ATCC49037ZpABClll strain) can grow on YPG medium supplemented with 0.05% acetic acid, whereas the ATCC49037 / pG118 strain It was confirmed that they could not grow. Therefore, by introducing the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing into Dalconacetobacter diazotrophicus, which is an acetic acid bacterium that does not produce acetic acid, its acetic acid resistance is reduced. It has been shown that it can be enhanced.
  • the present invention it is possible to breed cells that are imparted with resistance to short-chain fatty acids and have improved resistance to short-chain fatty acids.
  • the breeding method of the present invention is applied to microbial cells, cells that are not affected by short-chain fatty acids that are harmful to the growth produced during culture can be efficiently bred.
  • the microbial cells resistant to short-chain fatty acids obtained by the present invention can also be applied to high-density cell culture that produces short-chain fatty acids. It can also be used for the production of fermentation broth containing high concentrations of short-chain fatty acids. In particular, in the case of Escherichia coli or the like to which resistance to short chain fatty acids is imparted, the growth ability in culture is remarkably improved, and high concentrations of short chain fatty acids can be accumulated efficiently, which is industrially useful.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、微生物をはじめとする細胞の生育を抑制することなく、しかも有用物質について高い生産性を保持したまま、ギ酸や酢酸をはじめとする生育に有害な短鎖脂肪酸に対して耐性を付与する方法、及び、短鎖脂肪酸存在下において微生物を効率良く培養する手段や、発酵により有用な短鎖脂肪酸を製造するための手段を、提供することを目的とするものである。 　本発明は、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法、該細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法、及び、該細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法を提供するものである。

Description

明 細 書
短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法
技術分野
[0001] 本発明は、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法に関し、詳しくは、短鎖脂 肪酸耐性遺伝子を微生物等の細胞に導入し発現させて短鎖脂肪酸耐性の向上した 細胞を育種するための方法、並びに、該方法により得られる微生物細胞の用途とし ての、有用物質を生産するための高密度菌体培養法、及び短鎖脂肪酸を含有する 発酵液の効率的な製造に関する。
背景技術
[0002] 従来、微生物の工業的培養時には、栄養源としてグルコースなどの炭素源、ぺプト ンなどの窒素源、硫酸塩やリン酸塩、ナトリウムなどの無機物質、カルシウムや亜鉛な どの微量元素、プリン、ピリミジンなどの生育因子等の栄養源を、培地中に添加して いる。
し力しながら、これらの栄養源が微生物の増殖によって消費されてしまうと、微生物 はギ酸ゃ酢酸など微生物の生育にとって毒性のある短鎖脂肪酸を培地中に生成し、 その結果、更なる微生物の生育が停止してしまうという課題があった。
[0003] 特に、組換えタンパク質生産によく使用される大腸菌（Escherichia coli)は、高密度 での好気的発酵における宿主菌として広く用いられている。大腸菌の好気的な高密 度培養の際には、増殖培地に適当量のダルコースを添加することが一般的であるが 、これに起因して培養中に酢酸を主成分とする短鎖脂肪酸が生成される。これらの短 鎖脂肪酸は、高密度培養を阻害する主要因子であり、組換えタンパク質の生成をも 阻害する (例えば、非特許文献 1及び非特許文献 2参照)。
[0004] この課題を解消するために、微生物の培養においては、培養時間の経過に応じて 連続的または間欠的に栄養源を培地へ流加する流加培養法 (例えば、非特許文献 3参照)や、菌体外生産物を培養系の外へ透析膜などを用いて除去させる透析培養 法 (例えば、非特許文献 4参照)などが用いられて 、る。
流加培養法によれば、培地中の特定成分の濃度を任意に制御することが可能であ り、例えば、糖濃度を、該培地で培養される微生物の至適範囲に一定に保持すること ができる。このため、目的とする微生物を効率的に培養することができ、広く採用され ている。しかし、この流加培養法においても、有機酸の生成を抑えることはできず、生 成した有機酸による増殖率の低下や組換えタンパク質の収量の低下が起こるなど、 問題点は多い。
また、透析培養においては、菌体外生産物を除去することにより、生成した短鎖脂 肪酸の影響を少なくすることができるものの、装置が特殊で工程が複雑ィ匕する等の 問題点がある。
[0005] また、大腸菌における好気的条件下でのグルコース代謝にぉ 、て、 TCAサイクル の処理能力を超える量の炭素源が添加された場合、酢酸が生成され細胞外へと排 出され、これにより生育の阻害や組換えタンパク質の生成が阻害される（例えば、非 特許文献 5参照)。
酢酸は、ホスホトランスァセチラーゼ（PTA)および酢酸キナーゼ (ACK)によってァ セチル—CoAから生合成されることから、非特許文献 5においては、大腸菌について これらの酵素 (PTA及び ACK)遺伝子の欠損変異株が作製されて ヽる。しかしなが ら、これらの変異株においては、酢酸の生合成系（PTA及び ACK)を不活性ィ匕して も、酢酸の生成のための他の経路が依然として存在するので、酢酸の生成量を低下 させられるものの、完全に生成しないことはな力つた。また、上記欠損変異株は、乳酸 やピルビン酸など酢酸以外の有機酸を過剰に蓄積するものであった (例えば、非特 許文献 6及び非特許文献 7参照)。
このように、微生物の培養の際に生成されるギ酸ゃ酢酸などの生育に有害な短鎖 脂肪酸を全く生成しない微生物は、いまだ開発途上にあり、成功していない。
一方、微生物の発酵により、これらの短鎖脂肪酸を工業的に生産しょうとする場合 に、短鎖脂肪酸を効率良く大量に生産できる方法の開発が望まれている。その場合 には、短鎖脂肪酸に対し充分な耐性を有する微生物が必要であるが、そのような微 生物もまだ開発されて 、な 、。
[0006] 一方、本発明者らによって酢酸菌由来の酢酸耐性向上機能を有する遺伝子が数 多く取得されている力 これらの遺伝子の中には、 ATPバインディングカセット (ATP- binding cassette)のモチーフを有する遺伝子群がある（例えば、特許文献 1参照）。 これらの ATPバインディングカセットのモチーフを有する遺伝子は、一般的に ABC トランスポーターファミリー（ABC transporter family)と総称され、代謝産物や薬剤な どを細胞内から細胞外へ、あるいは細胞外から細胞内へと輸送するトランスポーター の機能を有するタンパク質をコードして 、ると推定されて 、る。
これらの ABCトランスポーターファミリーを構成する遺伝子 (ABCトランスポーター 遺伝子）の一つを、多コピー数ベクターに連結し、酢酸菌に導入した場合に、得られ る形質転換株 (酢酸菌）は、酢酸耐性が向上するものの、他の有機酸への耐性には 影響がな力つた (例えば、特許文献 1参照)。
[0007] 特許文献 1：特開 2003— 289868号公報
非特許文献 1 :「アプライド'アンド'エンバイ口メンタル 'マイクロバイオロジー（Appl. E nviron. Microbiol. )」、 56卷、 p. 1004— 1011 (1990年）
非特許文献 2 :「バイオテクノロジ一'アンド'バイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioe ng. )」、 39卷、 p. 663— 671 (1992年）
非特許文献 3 :「トレンズ'ォブ 'バイオテクノロジー（Trends Biotechnol. )」、 14卷、 p. 98— 100 (1996年）
非特許文献 4：「アプライド ·アンド ·マイクロバイオロジカル ·バイオテクノロジー (Appl. Microbiol. Biotechnol. )」、48卷、 p. 597— 601 (1997年）
非特許文献 5 :「バイオテクノロジ一'アンド'バイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioe ng.)」、 35卷、 p. 732— 738 (1990年）
非特許文献 6 :「バイオテクノロジ一'アンド'バイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioe ng.)」、 38卷、 p. 1318— 1324 (1991年）
非特許文献 7：「バイオサイエンス ·バイオテクノロジー ·アンド ·ノィオケミストリ一 (Bios ci. Biotechnol. Biochem.；)」、 58卷、 p. 2232— 2235 (1994年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] そこで、本発明は、第一に、微生物をはじめとする細胞の生育を抑制することなぐ し力も有用物質について高い生産性を保持したまま、ギ酸ゃ酢酸をはじめとする生 育に有害な短鎖脂肪酸に対して耐性を付与する方法の提供を目的とする。
また、本発明は、第二に、上記微生物の用途として、短鎖脂肪酸存在下において 微生物を効率良く培養する手段や、発酵により有用な短鎖脂肪酸を製造するための 手段を提供することをも目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するための手段を模索する過程で、短鎖脂肪酸の 1つである酢酸に注目し、この酢酸に対して強力な耐性を持ち、かつ食酢の製造に ぉ ヽて酢酸発酵を行う際に利用されて!ヽる酢酸菌の保有する ABCトランスポーター ファミリーと推定される酢酸菌由来の遺伝子群に着目した。そして ABCトランスポータ 一ファミリーを構成する ABCトランスポーター遺伝子を、もとの酢酸菌以外の異種細 胞に導入して発現させることができるかどうか、検討を重ねた。
その結果、酢酸菌とは全く異なる属に属し、本来アルコール酸ィ匕能が低い大腸菌（ Escherichia coli)や、酢酸菌であるが酢酸発酵能の低いダルコンァセトバクタ一.ジァ ゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus)においても、形質転換体を得ること ができることを見出した。そして、該形質転換体は、酢酸菌の場合とは異なり、酢酸以 外の短鎖脂肪酸 (炭素数 5以下）による生育阻害を受けないこと、すなわち、短鎖脂 肪酸耐性を有するという予想外の結果をも見出した。また、遺伝子導入によりこれら の微生物がもともと生産する有用物質や、外部から導入した組換えタンパク質の生産 性が低下しな 、ことも確認された。
[0010] また、 ABCトランスポーター遺伝子の短鎖脂肪酸に対する耐性増強機能がどのよう に発揮されるのか、酢酸菌の形質転赚を用いてそのメカニズムを解明したところ、 細胞内の酢酸濃度が元株に対して低下したことから、細胞内から細胞外である培地 へ酢酸を排出する機能が付与されたことを確認することができ、この機能は酢酸菌だ けでなく異種細胞の短鎖脂肪酸耐性向上のメカニズムとして敷衍できるものと推測さ れた。
[0011] そして、該遺伝子の導入された微生物を高密度菌体培養したところ、遺伝子の導 入されて 、な 、微生物と比べて、短鎖脂肪酸の存在下でも充分に生育することがで きたことから、工業的培養において有用であることをも見出した。 更に、プロピオン酸などの短鎖脂肪酸の蓄積濃度を向上させることができることをも 見出した。
本発明は、係る知見に基くものである。
[0012] すなわち本発明は、以下の（1)〜（11)力もなるものである。
(1)細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した 細胞の育種方法。
[0013] (2)細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする上記（1)に記載 の細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 301〜2073からなる 塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 301〜2073からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[0014] (3)細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする上記（1)に記載 の細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列のうち、塩基番号 331〜2154からなる 塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列のうち、塩基番号 331〜2154からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[0015] (4)細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子が下記の（a)、 (b)、 (c)又は（d)に示す DNAであることを特徴とする上記（ 1)に記載の細胞の育種方法。 (a)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列、及び塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配 列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列、及び、配列表 の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列を 含む DNAであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードす る DNA。
(c)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列、及び、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724 〜2500からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブと なりうる塩基配列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノ、イブリダィズする塩基配列 を含む DNAであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコード する DNA。
(d)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜 1724力らな る塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配 列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列、及び、配列表 の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列 又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列の DNAと 、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであって、かつ 、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードする DNA。
(5)細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする上記（1)に記載 の細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 8に記載の塩基配列のうち、塩基番号 249〜1025からなる DNA0
(b)配列表の配列番号 8に記載の塩基配列のうち、塩基番号 249〜1025からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[0017] (6)短鎖脂肪酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸である ことを特徴とする上記（1)〜（5)の 、ずれかに記載の細胞の育種方法。
(7)細胞が微生物細胞であることを特徴とする上記（1)〜（5)の 、ずれかに記載の 方法で育種された細胞。
[0018] (8)微生物細胞が、酢酸菌、大腸菌、又はバチルス属に属する細菌細胞であることを 特徴とする上記（7)に記載の細胞。
(9)上記（8)に記載の細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法。
(10)細胞を短鎖脂肪酸存在下で培養することを特徴とする上記 (8)に記載の高密 度菌体培養法。
(11)上記 (8)に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養する ことを特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法。
発明の効果
[0019] 本発明によれば、短鎖脂肪酸に対する耐性を付与し、短鎖脂肪酸耐性の向上した 細胞を育種することができる。また、微生物細胞に本発明の育種方法を適用した場 合には、培養中に生成する生育に有害な短鎖脂肪酸による影響を受けない細胞を 効率的に育種することができる。
本発明により得られる短鎖脂肪酸耐性の微生物細胞は、短鎖脂肪酸が生成する高 密度菌体培養に適用することも可能である。また、短鎖脂肪酸を高濃度に含有する 発酵液の製造に利用することも可能である。特に短鎖脂肪酸耐性が付与された大腸 菌などの場合には、培養における増殖能が顕著に向上し、高濃度の短鎖脂肪酸を 効率良く蓄積することができるので、産業上有用である。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]大腸菌 酢酸菌シャトルベクター pGI18の構築を示した概略図である。
[図 2]実施例 1における形質転換体及び未形質転換体の (a)未添加培地、 (b)ギ酸 含有培地、（c)酢酸添加培地及び (d)プロピオン酸添加培地での生育量の経時的 変化を示す。 [図 3]実施例 1における形質転換体及び未形質転換体の (a)酪酸含有培地、 (b)イソ 酪酸含有培地、及び (c) n—吉草酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
[図 4]実施例 2における形質転換体及び未形質転換体の (a)ギ酸含有培地、及び (b )酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
[図 5]ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と短鎖 脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミド pABC31への挿入断片の概略図である。
[図 6]実施例 3における形質転換体及び未形質転換体の (a)ギ酸含有培地、及び (b )酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
[図 7]実施例 4における形質転換体及び未形質転換体の (a)ギ酸含有培地、及び (b )酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
[図 8]クローニングされたダルコンァセトパクター'ェンタニイ由来の遺伝子断片の制 限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミド PABC41への挿入断 片の概略図を示す。
[図 9]実施例 6 (1)における各細胞の生育量、並びに培養液中の全有機酸量及び酢 酸量の推移を示す。
[図 10]実施例 6 (2)におけるグルコースの流加培養における生育量の推移を示す。
[図 11]実施例 7における形質転換体及び未形質転換体の酢酸含有培地での培養経 過を示す。
[図 12]配列表の配列番号 1記載の塩基配列力 なる DNAの制限酵素地図と短鎖脂 肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミド pABClへの挿入断片の概略図を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の目的は、細胞内から細胞外へ短鎖脂肪酸を排出する機能を有する遺伝 子 (短鎖脂肪酸耐性遺伝子)を導入した細胞の育種方法、該育種方法により育種さ れた細胞、並びに該細胞を用いた高密度菌体培養法並びに有用短鎖脂肪酸を含 有する発酵液の製造方法を提供することにある。
[0022] 〔1〕本発明の育種方法
本発明の短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法は、請求項 1に記載するよう に、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードす る遺伝子 (短鎖脂肪酸耐性遺伝子)を細胞に導入して発現させることを特徴とする。 ここで、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質とは、 本発明の育種方法の対象である細胞にぉ 、て、該細胞に取り込まれた又は代謝な ど細胞内の機能により生産された短鎖脂肪酸を細胞外に排出する機能を発揮するこ とができるタンパク質を意味し、例えば、生育に影響を与える酢酸濃度を添加した培 地において、元株に対して、細胞内の酢酸濃度を 15〜20%以上低下させるタンパ ク質を意味する。このようなタンパク質として、具体的には、配列表の配列番号 2、 4、 又は 9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号 6及び 7に示すアミノ酸 配列を有するタンパク質複合体を挙げることができる。
尚、配列表の配列番号 2、 4、及び 9に示される各アミノ酸配列において、 1又は複 数個、好ましくは 1若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異 を含んでいるタンパク質も、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有す るタンパク質である限り、上記タンパク質に含まれる。また、配列番号 6及び Z又は 7 に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、 1又は複数個、好ましくは 1若しくは数 個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異を含んでいるタンパク質複合 体も、同様に、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質 である限り、上記タンパク質に含まれる。
また、上記タンパク質をコードする遺伝子 (短鎖脂肪酸耐性遺伝子)とは、上記タン パク質のコード領域を含み、かつ細胞内に導入し発現させることの可能な遺伝子を 意味する。このような遺伝子の代表的なものとしては、 ABCトランスポーターファミリー と推定される酢酸菌由来の遺伝子群を構成する ABCトランスポーター遺伝子を挙げ ることができる。 ABCトランスポーター遺伝子は、 ATPバインディングカセット（ATP-b inding cassette)のモチーフを有する遺伝子、または該モチーフを有する遺伝子とォ ペロンを形成しタンパク質複合体をコードする遺伝子を意味する。 ATPバインディン グカセット（ATP- binding cassette)のモチーフを有する遺伝子は、一般的に ABCトラ ンスポーターファミリー（ABC transporter family)と称され、代謝産物や薬剤などを細 胞内から細胞外へ、あるいは細胞外力 細胞内へと輸送するトランスポーターの機能 を有するタンパク質をコードしてレ、ると推定されてレ、る。
[0024] このような ABCトランスポーター遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号 2、 4、
6、 7又は 9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするコード領域を含む遺 伝子を挙げることができ、具体的には、請求項 2〜5の（a)に記載するように、配列番 号 1、 3、 5、又は 8に記載の塩基酉己歹 [Jのうち、酉己歹 U番号 1の塩基番号 301〜2073力 らなる塩基配列、配列番号 3の塩基番号 331〜2154からなる塩基配列、配列番号 5 の塩基番号 1002〜1724からなる塩基配列及び塩基番号 1724〜2500からなる塩 基配列、又は配列番号 8の塩基番号 249〜1025からなる塩基配列を含む DNAを 挙げることができる。
これらの DNAは、上記特定の塩基配列を含むものであれば良ぐ例えば、配列表 の配列番号 1、 3、 5又は 8のそれぞれに記載の塩基配列の全長力もなる DNAを用 レ、ることも可能である。
[0025] これらの DNAは、配列番号 1、 3、 5又は 8に示される塩基配列をもとに設計したプ ライマーをもとに、酢酸菌（ァセトバクター属ゃダルコンァセトバクター属の酢酸菌）の 遺伝子を鐯型とした PCR法にて容易に取得できる。特に、配列表の配列番号 1及び 3記載の各塩基配列からなる DNAは、ァセトバクタ一'ァセチ (Acetobacter aceti) No. 1023株 (独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本 国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) (旧名称:通商産業省工業技術院微生 物工業技術研究所、旧住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に 1983年 6 月 27日付 (原寄託より 1989年 2月 13日付で移管）で受託番号 FERM BP— 2287 として寄託されている。）を錶型としてそれぞれ入手することができる。また、配列表の 配列番号 5及び 8記載の各塩基配列からなる DNAは（Gluconacetobacter entanii)の 一種であるァセトパクター ·ァノレトァセチゲネス (Acetobacter altoacetigenes) MH— 2 4株 (独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県 つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) (旧名称:通商産業省工業技術院微生物工業技 術研究所、旧住所：日本国茨城県筑波郡谷田部町東 1丁目 1番 3号）に 1984年 2月 23日付で受託番号 FERM BP— 491として寄託されている。 )を鐃型としてそれぞ れ人手することができる。
釭 された诩紙 (規则 91) [0026] また、本発明においては、短鎖脂肪酸耐性遺伝子として、請求項 2, 3及び 5の (b) に記載するように、配列番号 1、 3、又は 8に記載の塩基配列のうち、配列番号 1の塩 基番号 301〜2073からなる塩基配列、配列番号 3の塩基番号 331〜2154からなる 塩基配列、若しくは該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基 配列の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNA であって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNAをも、同様 に用いることができる。
そして、請求項 4の (b)、 （c)又は (d)に記載するように、（b)配列表の配列番号 5に 記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724からなる塩基配列又は該塩基配列 の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列の DNAと、ストリンジェント な条件下でハイブリダィズする塩基配列、又は、配列表の配列番号 5に記載の塩基 配列のうち、塩基番号 1724〜2500力もなる塩基配列を含む DNAであって、酢酸 耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードする DNAや、 (c)配列表の 配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724からなる塩基配列、及 び、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードする DNAや、 (d) 配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724からなる塩 基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列の DNAと、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする塩基配列、及び、配列表の配 列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列又は 該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列の DNAと、スト リンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであって、かつ、酢 酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードする DNAをも、同様に用 いることがでさる。
[0027] なお、ここで 、うストリンジェントな条件とは、 、わゆる特異的なハイブリッドが形成さ れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕す ることは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 70%以上 の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低 、DNA同士 がハイブリダィズしない条件、あるいは通常のハイブリダィゼーシヨンの洗浄条件、例 えば 1 X SSCで 0. 1%SDSに相当する塩濃度にて 60°Cで洗浄が行われる条件など が挙げられる。
[0028] 上記した短鎖脂肪酸耐性遺伝子が、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する 機能を有するタンパク質をコードすることの確認は、例えば、後述の実施例で説明す るように、遺伝子を実際に細胞に導入して発現させ、該細胞 (形質転換体)を、短鎖 脂肪酸を含有する培地で培養した際の生育の有無や、該培地における生育量の増 加 (増殖程度)を判別することにより確認することができる。
ここで、短鎖脂肪酸とは、炭素数 1〜5の直鎖又は分岐鎖構造の脂肪酸を意味し、 不飽和結合を有して 、ても有して ヽなくても良 ヽ。本発明の育種方法により得られる 細胞は、特に炭素数 1〜5の直鎖又は分岐鎖構造の飽和脂肪酸、つまり請求項 6に 記載するようにギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸に対し、強 Vヽ耐性を有するものである。
[0029] 本発明の育種方法の対象は、上記短鎖脂肪酸耐性遺伝子が導入され発現可能な 細胞であれば、特に限定されるものではない。細胞としては、大腸菌、枯草菌、乳酸 菌等の細菌細胞、酵母細胞、ァスペルギルス属に属する微生物などの真菌細胞とい つた微生物細胞が挙げられる。
中でも、請求項 7に記載するように微生物細胞を対象とすることにより、短鎖脂肪酸 耐性機能を増強して工業的培養、特に高密度菌体培養法による培養における培養 効率や、短鎖脂肪酸の発酵生産における生産効率を向上させることができる点で好 ましい。
微生物細胞としては、特に、請求項 8に記載するように、酢酸菌、大腸菌又はバチ ルス属に属する細菌細胞を挙げることができる。細菌細胞のうち、大腸菌や、ダルコ ンァセトパクター（Gluconacetobacter)属の酢酸菌など、本来アルコール酸化能が低 い細菌細胞を対象とすると、その短鎖脂肪酸の生産量や生産効率、菌体の生育量を 著しく増大させることができるので、好ましい。 [0030] 酢酸菌としては、ァセトパクター（Acetobacter)属及びダルコンァセトパクター（Glue onacetobacter)属に属する酢酸菌を挙げることができる。
ァセトパクター属の細菌として、具体的にはァセトバクタ一'ァセチ（Acetobacter ace ti)が挙げられ、具体的には、ァセトバクタ一'ァセチ（Acetobacter aceti) No. 1023 株 (独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) (旧名称:通商産業省工業技術院微生物工業技術 研究所、旧住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に 1983年 6月 27日付（ 原寄託より 1989年 2月 13日付で移管）で受託番号 FERM BP— 2287として寄託 されてレ、る。；)、ァセトパクター'ァセチ 'サブスぺシィズ'ザイリナム 3288 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IF03288)株、ァセトパクター'ァセチ（Acetobacter aceti) IF03 283株などを用レ、ることができる。
ダルコンァセトパクター属の細菌としては、例えば、ダルコンァセトバクタ一'ョ一口 ノ ェウス (Gluconacetobacter europaeus)、グノレコンァセトノ クタ一'ジァゾトロフィカス (Gluconacetobacter diazotrophicus)、グルコンァセトノ クタ一'ェンタニイ (Gluconace tobacter entanii)が挙げられ、具体的には、ダルコンァセトバクタ一'ョ一口パェウス（ Gluconacetobacter europaeus) DSM6160株、グノレコンァセトバクタ^ ~·ジァゾトロフィ カス（Gluconacetobacter diazotrophicus) ATCC49037株、ダルコンァセトバクタ一' ェンタニイ（Gluconacetobacter entanii)の一種であるァセトバクタ一'アルトアセチゲ ネス（Acetobacter altoacetigenes) MH— 24株（独立行政法人 産業技術総合研究 所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) (旧名 称:通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所、旧住所：日本国茨城県筑波郡 東 1丁目 1番 3号）に 1984年 2月 23日付で受託番号 FERM BP— 491として寄託さ れている。）を用レ、ることができる。
[0031] 大腸菌としては、ェシエリチア（Escherichia)属に属する細菌が好ましい。
ェシエリチア属に属する細菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli)が挙げら れ、具体的には、大腸菌 K12株、大腸菌 JM109株、大腸菌 DH5 o;株、大腸菌 C60 0株、大腸菌 BL21株、大腸菌 W3110株などを用レ、ることができる。
また、バチルス属（Bacillus)に属する細菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtili s)や納豆菌（Bacillus subtilis)が挙げられ、具体的には、枯草菌 Marburg 168株など を用いることができる。
酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス'セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) 、シゾサッカロミセス ·ボンべ（Shizosaccharomyces pombe)などを用いることができる。 特に、短鎖脂肪酸耐性遺伝子として本発明の請求項 2又は請求項 3に係る DNAを 用いる場合は、これらの細胞のうち、大腸菌やダルコンァセトパクター'ジァゾトロフィ カス（Gluconacetobacter diazotrophicus)を対象とすることが好ましい。大腸菌は、本 来アルコール酸化能が極めて低ぐまた、ダルコンァセトバクタ一'ジァゾトロフィカス は酢酸菌であるが酢酸発酵能が低いことから、これらの微生物に短鎖脂肪酸耐性を 付与することによりその有用性を充分に高めることができる。
[0032] 本発明の育種方法における細胞への短鎖脂肪酸耐性遺伝子の導入'発現は、組 換えベクターを利用して行うことができる。すなわち、適当なベクターに、短鎖脂肪酸 耐性遺伝子を連結した組換えベクターを用いて細胞を形質転換することによって、該 遺伝子の細胞内のコピー数を増幅する方法、または、適当なベクターに、短鎖脂肪 酸耐性遺伝子の構造遺伝子と、該細胞中で効率良く機能するプロモーター配列とを 連結した組換えベクターを用いて細胞を形質転換することによって、該遺伝子の細 胞内のコピー数を増幅する方法により、実現することができる。
[0033] 組換えベクターの作製に用いるためのベクターとしては、宿主で自律的に増殖し得 るファージベクター又はプラスミドベクターなどを使用することができる。
プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322、 pBR325、 p UC118、 pET16b等）、枯草菌由来のプラスミド (例えば pUB110、 pTP5等）、酵母 由来のプラスミド（例えば Yepl3、 Ycp50等）などが挙げられ、ファージベクターとし ては λファージ（ λ gtlO、 λ ZAP等）などが挙げられる。
さらに、レトロウイノレス又はワクシニアゥイノレスなどの動物ウイノレスベタター、ノ キュロ ウィルスなどの昆虫ウィルスベクター、細菌人工染色体 (BAC)、酵母人工染色体 (Y AC)などを用いて形質転換体を作製することもできる。
[0034] また、マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的の DNAを宿主に 導入することもでき、本発明にお ヽてはそのようなマルチコピーベクター又はトランス ポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。
マルチコピーベクターとしては、 pUF106 (例えば、「セルロース（Cellulose)、 p. 15 3— 158 (1989年）参照」、 1^¥24 (例ぇば、「アプライド'アンド'エンバイロマンタル •マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. )」、 55卷、 p. 171— 176 (1989 年)参照）、 PGI18 (例えば、後述の製造例 1参照）、 pTA5001 (A)、 pTA5001 (Β) (例えば、特開昭 60— 9488号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み 型ベクターである pMVLl (例えば、「ァグリカルチュラル ·アンド'バイオロジカル ·ケミ ストリー（Agric. Biol. Chem. )」、 52卷、 p. 3125— 3129 (1988年）参照）も挙げられ る。
更に、トランスポゾンとしては、 Muや IS1452などが挙げられる。
[0035] 短鎖脂肪酸耐性遺伝子をベクターに連結して組換えベクターを作製する際には、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部 位又はマルチクローユングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用され る。
ここで、得られる組換えベクターは、細胞に導入された際に、短鎖脂肪酸耐性遺伝 子のコードする細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質 を発現して前記機能が発揮されることが必要である。そのため、組換えベクターには 、短鎖脂肪酸耐性遺伝子やプロモーター配列のほかに、所望によりェンノヽンサ一な どのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付カ卩シグナル、選択マーカー、リ ポソーム結合配列（SD配列）などをも連結して挿入することができる。
ここで、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン 耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐 性遺伝子等が挙げられる。
[0036] また、染色体 DNA上の、短鎖脂肪酸耐性遺伝子のプロモーター配列を、ァセトバ クター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌、または大腸菌中で効率よく機能する 他のプロモーター配列に置き換えることもでき、その際は、相同組換え用のベクター を構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすれば よい。 そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミド pBR322 (タカラ ノィォ社製)のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミド PHSG298 (タカラバイオ社製)の カナマイシン耐性遺伝子、プラスミド PHSG396 (タカラバイオ社製)のクロラムフエ- コール耐性遺伝子、 β ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターな ど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。
相同組換えのためのベクター構築に関しては、当業者に周知である。このようにし て微生物における内因性の短鎖脂肪酸耐性遺伝子を強力なプロモーターの制御下 に配置することによって、該短鎖脂肪酸耐性遺伝子からのコピー数が増幅され、発 現が増強される。
[0037] このような糸且換えベクターとして、具体的には、配列表の配列番号 1、 3、 5及び 8記 載の各塩基配列力もなる DNAを、それぞれ酢酸菌—大腸菌シャトルベクター（マル チコピーベクター） pGI18に連結して得られる pABCl 11、 pABC112、 pABC31、 及び PABC41を挙げることができる。
[0038] 本発明の育種方法における細胞への短鎖脂肪酸耐性遺伝子の導入'発現は、上 記組換えベクターを用いて常法に従って行うことができる。例えば、細菌細胞の場合 、カルシウムイオンを用いる方法 (例えば、「ァグリカルチュラル 'アンド'バイオロジカ ル 'ケミストリー（Agric. Biol. Chem. )」、49卷、 p. 2091— 2097 (1985年）参照）、 エレクト口ポレーシヨン法（例えば、「プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·ァカデミツ ク.サイエンス USA(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 」、 87卷、 p. 8130— 8134 ( 1990年）、バイオサイエンス 'バイオテクノロジ一.アンド'バイオケミストリー（Biosci. B iotech. Biochem. ) , 58卷， 974頁， 1994年等参照）等によることができる。また、酵 母細胞に用いる（宿主とする）場合は、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプ ラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
尚、形質転換体の選択は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質 を利用して実施することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を用いた場合に は、アンピシリン薬剤に抵抗性を示す細胞を選択することができ、具体的には、選択 培地としてアンピシリンを適当量 (例えば、 100 gZml程度）を添カ卩したものを用い て、形質転 ·を塗布し、培養し、選択培地上に生育したコロニーを形質転 ·と することができる。また、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、 G418薬剤に 抵抗性を示す細胞を選択することができる。
[0039] 本発明の育種方法においては、このようにして短鎖脂肪酸耐性遺伝子を細胞に導 入して発現させることにより、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を得ることができる。育 種された細胞の短鎖脂肪酸耐性が向上した力どうかの確認は、細菌細胞の場合に は、短鎖脂肪酸を 0. 01〜3%程度添加した培地において 15時間以上培養し、生育 度を吸光度や乾燥菌体重量を測定して、形質転換をしなかった元の細胞が全く又は 充分に生育しないのと比べて大きく上回る生産量を示すことを確認することにより行う ことができる。
このように短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞として、本発明者らは、後述の実施例に 示すように、上述した糸且換えベクター pABCl 11を酢酸菌ァセトバクタ一'ァセチ N o. 1023株へ導入して得られる No. 1023ZpABCl l l株、組換えベクター pABCl 11を大腸菌 JM109株へ導入して得られる JM109ZpABCl l l株、同様に組換え ベクター pABCl 11をダルコンァセトバクタ一'ジァゾトロフィカス ATCC49037株へ 導入して得られる ATCC49037ZpABCl 11株、組換えベクター p ABC 112を大腸 菌 JM109株へ導入して得られる JM109ZpABC112株、同様に組換えベクター pA BC31を大腸菌 JM109株へ導入して得られる JM109ZpABC31株、組換えべクタ 一 p ABC41を大腸菌 JM 109株へ導入して得られる JM 109/pABC41株を実際に 得ることができた。これらの形質転 ·のうち 5株は、独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄 託されており、その寄託番号は、 JM109ZpABCl l l株が FERM BP— 10184、 ATCC49037/pABCl l l株が FERM BP— 10186、 JM109/pABC112株が FERM BP— 10185、 JM109/pABC31株が FERM BP— 10182、 JM109Z pABC41株が FERM BP— 10194である。
[0040] 〔2〕本発明の高密度培養法
本発明の高密度菌体培養法は、請求項 9に記載するように、請求項 8に記載の細 胞を用いること、すなわち、前記〔1〕で説明した本発明の育種方法により短鎖脂肪酸 耐性遺伝子を酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞に導入して発現さ せて育種される、短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属 する細菌細胞を用いることを特徴とする。
ここで、高密度菌体培養法とは、細菌細胞 (菌体)を高密度、一般には培地におけ る密度が 50〜200g (乾燥菌体) ZLとなる条件で培養する方法を意味する。培地、 培養時間、培養条件については細胞の種類などにより適宜設定でき、例えば大腸菌 の場合には、天然培地や合成培地のいずれの培地でもよぐ例えば、グルコース添 カロ LB培地において、 28°C〜37°Cにおける通気培養とすることができる。
細菌細胞により培地中の栄養源が消費されてしまうと、通常、培地中に短鎖脂肪酸 が生成され生育阻害の原因となるが、本発明の高密度菌体培養法は、短鎖脂肪酸 耐性の向上した細菌細胞を用いるので、生育阻害を阻むことができる。すなわち、請 求項 10に記載するように、細胞をギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、 吉草酸など生育にとって毒性のある短鎖脂肪酸存在下で培養しても生育が阻害され ず、微生物力もともと生産する有用物質や、外部力 導入した組換えタンパク質の生 産性を維持することができる。ここで、有用物質としては、微生物を利用することにより 製造できる物質であればどのような形態のものでも良ぐ特に制限されない。 1つの例 としては、微生物菌体そのものが挙げられる。また、本発明の細胞を用いれば、細胞 の最終密度を向上させることができるため、通常の代謝によって生産される物質であ つてもきわめて効率良く製造することができる。この例としては、脂肪酸、アミノ酸、抗 生物質、酵素、ビタミンおよびアルコールなどが挙げられる。実施例 6で示したように 、培地中への有機酸の生成量を上げることができる。また、組換えタンパク質としては 、例えば、ヒトの成長ホルモンやペプチド、インターロイキン 1 13、インターフェロンなど が挙げられる。
特に、大腸菌の場合は、上記の炭素数 5以下の短鎖脂肪酸以外にクェン酸、リンゴ 酸、コハク酸、ピログルタミン酸などの有機酸を効率良く生産することができる。
高密度菌体培養法として実験室レベルから工業的生産レベルまで広く用いられて いるものとして、流加培養、透析培養を例示することができる。
流加培養は、培養時間の経過に応じて特定の栄養源を培地へ連続的または間欠 的に流加して培養する方法である。流加の対象となる栄養源としては、細胞の増殖 やタンパク質生産を阻害する短鎖脂肪酸の直接的な原料となるグルコース、グリセ口 ールなどの炭素源であることが好ましい。流加のスケジュールは、培地中の炭素源の 濃度および Zまたは菌体の生育濃度を一定に保つことができるように、指数関数的 に流加速度を増加していく方式、培地中の炭素源濃度を規定濃度以下に保ちなが ら段階的（一般的には、 2〜5時間おきに）に流加速度 (流加量)を増加していく方式 とすることができる。培地の種類、温度、湿度、 pH、時間、攪拌の有無など培養条件 については、細菌細胞の種類や状態により適宜定めることができる。
従来の流加培養においては、微生物培養中に生成する酢酸を初めとする短鎖脂 肪酸による細胞の増殖阻害や、タンパク質生産阻害などを避けるため、生成する短 鎖脂肪酸を抑えるべくグルコース等の流加速度を調整するだけでなぐ培地中の溶 存酸素量を細力べ調整する必要があつたが、本発明の短鎖脂肪酸耐性の向上した 酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞は、短鎖脂肪酸の影響を受けず に生産性を維持することができるので、従来のような調整の手間を省くことができる。
[0042] また、透析培養は、酢酸等の菌体外生産物を、培養系の外へ透析膜などを用いて 除去しながら培養を行う方法である。
従来の透析培養においては、特殊な装置が必要であつたが、本発明の短鎖脂肪 酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞は、短鎖脂肪 酸の影響を受けずに生産性を維持することができるので、単純な装置 (例えば、ジャ ーフアーメンター）でも実施することができる。
[0043] 〔3〕短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法
本発明の発酵液の製造方法は、請求項 8に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸 を生成する条件下で培養することを特徴とする。
請求項 8に記載の細胞とは、前記〔1〕で説明した本発明の育種方法により短鎖脂 肪酸耐性遺伝子を酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞に導入して発 現させて育種される、短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に 属する細菌細胞を意味し、この中力 所望の短鎖脂肪酸生産能を有する細菌細胞を 選択して用いることができる。例えば、大腸菌は短鎖脂肪酸全般を生産でき、酢酸菌 は、酢酸を選択的に生産することができる。尚、短鎖脂肪酸とは、ギ酸、酢酸、プロピ オン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸の他、乳酸をも意味する。
[0044] 本発明の発酵液の製造方法は、対象である細菌細胞が短鎖脂肪酸を生成する条 件下で培養する必要があり、このような条件は、細菌細胞の種類や生成対象である 短鎖脂肪酸の種類によって適宜定めることができるが、通常は、短鎖脂肪酸に対応 する短鎖アルコールを適量添加することになる。
実施例
[0045] 以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
[0046] (製造例 1)大腸菌 酢酸菌シャトルベクター pGI18の開発
酢酸菌 大腸菌シャトルベクター pGI 18は、ァセトバクタ一'アルトアセチゲネス（A cetobacter altoacetigenes) MH 24株（FERM BP 491)由来の約 3. lkbのプ ラスミド pGI 1と pUC 18とから作製した。図 1にプラスミド pGI 18作製の概略を示す。
[0047] まず、ァセトパクター ·アルトアセチゲネス力もプラスミド pGIlを作製した。
すなわち、ァセトパクター 'アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes) MH —24株 (FERM BP— 491)の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムゃドデ シル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フエノール処理し、更にエタノールによりプラスミ ド DNAを精製した。
得られたプラスミドは、 Hindiで 3ケ所、また、 Sfilで 1ケ所の認識部位を有する環状 二本鎖 DNAプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約 3100塩基対（3. Ikbp)であ つた。また、 EcoRI、 Sacl、 Kpnl、 Smal、 BamHI、 Xbal、 Sail, Pstl、 Sphl、 Hindi IIの認識部位は有していなかった。このプラスミドを pGIlと命名して、ベクター pGI18 の作製に用いた。
[0048] 上記のようにして得られたプラスミド pGIlを、 PCR法によって増幅し、 Aatllで切断 した。この断片を pUC18 (2. 7kbp、タカラバイオ (株)製)の制限酵素 Aatll切断部 位に挿入し、プラスミド pGI 18を作製した。
PCR法は、具体的には以下のようにして実施した。铸型として、プラスミド pGIlを用 いて、また、プライマーとして、制限酵素 Aatll認識部位を有するプライマー A (配列 表の配列番号 10記載の塩基配列参照)及びプライマー B (配列表の配列番号 11記 載の塩基配列参照）を用いた。上記の铸型及びプライマーによる PCRを、 KOD-P1 us— (東洋紡績 (株)製)を用いて、 94°C 30秒、 60°C 30秒、 68°C 3分を 1サイク ルとして、 30サイクルの条件で実施した。
その結果得られたプラスミド pGI 18は、図 1に示すように、 11じ18及び 011のぃず れをも含有しており、全体の長さは約 5800塩基対（5. 8kbp)であった。
このプラスミド pGI 18の塩基配列は、配列表の配列番号 12に示す通りであった。
[0049] (実施例 1)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換したァ セトパクター'ァセチにおける酢酸の排出
(1)形質転換株の取得
配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAがクローユングされた pABC 1 (図 12)を制限酵素 Pstlで切断し、得られた約 2. 5Kbの断片を、製造例 1で調製し た酢酸菌—大腸菌シャトルベクター PGI18の制限酵素 Pstl切断部位にライゲーショ ンして、プラスミド pABCl l lを作製した。
このようにして作製した pABCl l lを、ァセトバクタ一 ·ァセチ（Acetobacter aceti) No. 1023株（FERM BP— 2287)にエレクト口ポレーシヨン法（「プロシーデイング ス'ォブ'ナショナル'アカデミ^ ~ ·ォブ'サイエンス'ォブ 'USA (Proc. Natl. Acad. Sci . U. S. A. )」、 87卷、 p. 8130— 8134 (1990年）参照）によって形質転換した。形 質転換株は 100 μ gZmlのアンピシリン及び 2%の酢酸を添カ卩した YPG培地で選択 した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株にっ 、て、定法により プラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNA を保有するプラスミドを保持して 、ることを確認した。
[0050] (2)形質転換株の酢酸排出
上記のようにして得られたプラスミド pABCl 11を保有するアンピシリン耐性の形質 転換株（No. 1023/pABCl l l株）について、酢酸を添カ卩した YPG培地で生育さ せ、細胞内の酢酸濃度について、シャトルベクター pGI18のみを導入したァセトバタ タ一'ァセチ No. 1023株（No. 1023ZpGI18株）と比較した。
すなわち、スティナ一らの方法 (例えば、「バイオテクノロジー'アンド'バイオェンジ ニアリング（Biotechnol. Bioeng. )」、 84卷、 p. 40—44、 2003年参照）に従って、酢 酸カリウムを 1、 2、 3及び 4重量 Z容量％の各濃度で含有する 100mlの YPG培地で No. 1023/pABClll株および No. 1023/pGI18株を培養した。 50mlの培養 液から集菌、アルカリ溶菌を行った後、各培養液から得られた細胞内の酢酸濃度 (M )を F—キット（ロッシュ）を用いて測定し比較した。
表 1に、各培養液における細胞内の酢酸カリウム濃度の結果を示す。
[0051] [表 1]
Figure imgf000023_0001
[0052] 表 1に示すように、形質転換株である No. 1023ZpABCl ll株、及び非形質転換 株である No. 1023ZpGI18株のいずれも、培養液中の酢酸カリウム濃度が高くなる に従って細胞内の酢酸カリウム濃度も上昇していたが、その上昇度は、形質転換株（ No. 1023ZpABClll株）の方が比較的遅ぐ特に、培養時の酢酸カリウム濃度が 4重量 Z容量0 /oの時には、 No. 1023ZpABClll株は No. 1023ZpGI18株の 8 4%の蓄積しかなかった。このことは、形質転 ·Νο. 1023ZpABClll株は、細 胞内の酢酸が細胞外へ排出されていることを示すものである。
このことから、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAは、酢酸を細 胞内から細胞外へ排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが 示された。
[0053] (実施例 2)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換した大 腸菌の短鎖脂肪酸耐性
(1)形質転換株の取得
実施例 1で作製した pABClllを、大腸菌 JM109株へ定法に従ってエレクトロボレ ーシヨン法により形質転換し、 100 μ g/mlのアンピシリンを添カ卩した LB寒天培地に て形質転換株を選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽 出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持して ヽることを確認した。 このようにして得られた形質転 m¾FM109ZpABCl 11株は、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6)に 2004年 12月 14日付で寄託されており、その寄託番号は、 FERM BP— 10184である。
[0054] (2)形質転換株の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミド pABCl 11を有するアンピシリン耐性の形質転 換株 (JM109ZPABC111株）について、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸 、吉草酸の各短鎖脂肪酸を添加した LB培地での生育を、シャトルベクター pGI18の みを導入した大腸菌 (JM109ZPGI18株）と比較した。
すなわち、短鎖脂肪酸として、ギ酸 0. 10%、酢酸 0. 15%、プロピオン酸 0. 10% 、酪酸 0. 10%、イソ酪酸 0. 15%、および n—吉草酸 0. 25%のいずれか、アンピシ リン 100 /ζ 8Ζπι1、 ImM IPTG (イソプロピル一 1—チォ一 13—D—ガラクトビラノシ ド）を含む LB培地 (pH5. 0 :短鎖脂肪酸添加培地）にて、 37°Cで、 JM109ZPABC 111株および JM109ZpGI18株の振盪培養（150rpm)を行った。また、比較のた め短鎖脂肪酸を添加しない他は上記短鎖脂肪酸添加培地と同様の組成とした未添 加培地で同様の培養を行った。各培地において、経時的に 660nmにおける吸光度 を測定し、各細胞の増殖の程度 (生育量)の指標として各培地間で比較した。図 2及 び図 3に、各培地における生育量（吸光度（660nm) )の経時的変化を示す。
[0055] 図 2及び図 3に示すように、未添加培地ではいずれの細胞も生育可能であつたのに 対し、各短鎖脂肪酸添加培地においては、非形質転換株である JM109ZPGI18株 は生育ができないまたは非常に弱力つたのに対し、形質転^ ¾である JM109ZPA BC111株では、増殖が可能であった。すなわち、非形質転換株 (JM109ZPGI18 株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株 CFM109Z p ABC 111株）は 、ずれの短鎖脂肪酸に対しても耐性を備えて 、た。
このことから、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAを大腸菌細胞 に導入することにより、各種の短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種す ることができることが示された。
[0056] (実施例 3)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換した大 腸菌の短鎖脂肪酸耐性 (1)形質転換株の取得
配列表の配列番号 3に記載の塩基配列力 なる DNAを PCR法により増幅し、得ら れる断片を、製造例 1で調製した酢酸菌ー大腸菌シャトルベクター PGI18の制限酵 素 Smal切断部位にライゲーシヨンして、プラスミド pABCl 12を作製した。
PCR法は、具体的には以下のようにして実施した。铸型として、ァセトパクター'ァ ルトァセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes) MH— 24株（FERM BP— 491) のゲノム DNAを用いて、また、プライマーとして、プライマー 1 (配列表の配列番号 13 記載の塩基配列参照)及びプライマー 2 (配列表の配列番号 14記載の塩基配列参 照）を用いた。上記の铸型及びプライマーによる PCRを、 KOD-Plus- (東洋紡績 ( 株）製）を用いて、 94°C 15秒、 60°C 30秒、 68°C 2分を 1サイクルとして、 30サイ クルの条件で実施した。
[0057] このようにして作製した pABC 112を、大腸菌（Escherichia coli)JM109株にエレク トロポレーシヨン法（バイオサイエンス ·バイオテクノロジ一.アンド.バイオケミストリ一 ( Biosci. Biotech. Biochem. ) , 58卷， 974頁， 1994年参照）によって形質転換した。 形質転換株は 100 μ gZmlのアンピシリンを添加した LB寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株にっ 、て、定法により プラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列力 なる DNA を保有するプラスミドを保持して 、ることを確認した。
このようにして得られた形質転 m¾FM109ZpABCl 12株は、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6)に 2004年 12月 14日付で寄託されており、その寄託番号は、 FERM BP— 10185である。
[0058] (2)形質転換株の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミド pABCl 12を有するアンピシリン耐性の形質転 換株(^11097 八8じ112株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添カ卩した LB培地での生育を、シャトルベクター pGI 18のみを導入した大腸菌 (JM109ZPGI 18株）と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸 0. 10%または酢酸 0. 15%、アンピシリン 100 μ g/ml、 ImM IPTG (イソプロピル一 1 チォー β—D—ガラタトピラノシド）を含 む LB培地（pH5. 0)にて、 37。Cで、 JM109ZpABC112株および JM109ZpGIl 8株の静置培養、または振盪培養（150rpm)を行った。各短鎖脂肪酸添加培地にお いて、経時的に 660nmにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量)の 指標として各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図 4に、各培地における生育量（ 吸光度（660nm) )の経時的変化を示す。
[0059] 図 4に示すように、形質転赚である JM109ZpABC112株は、各短鎖脂肪酸添 加培地の 、ずれにお 、ても増殖が可能であつたのに対して、非形質転換株である J M109ZpGI18株は生育できなかった。すなわち、非形質転換株 (JM109ZPGI18 株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株 CFM109Z pABCl 12株）はギ酸及び酢酸の!/、ずれに対しても耐性を有して 、た。
このことから、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列力 なる DNAを大腸菌細胞 に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することが できることが示された。
[0060] (実施例 4)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換した大 腸菌の短鎖脂肪酸耐性
(1)大腸菌形質転換株の取得
配列表の配列番号 5に記載の塩基配列力 なる DNAを PCR法により増幅し、得ら れる断片を、製造例 1で調製した酢酸菌ー大腸菌シャトルベクター PGI18の制限酵 素 Smal切断部位にライゲーシヨンして、プラスミド pABC31を作製した。
PCR法は具体的には次のようにして実施した。铸型として、ァセトパクター 'アルトア セチゲネス（Actobacter altoacetigenes) MH— 24株（FERM BP— 491)のゲノム DNAを用いて、また、プライマーとして、プライマー 3 (配列表の配列番号 15記載の 塩基配列参照)及びプライマー 4 (配列表の配列番号 16記載の塩基配列参照）を用 いた。上記の铸型及びプライマーによる PCRを、 KOD-Plus - (東洋紡績 (株)製） を用いて、 94°C 15秒、 60°C 30秒、 68°C 1分を 1サイクルとして、 30サイクルの 条件で実施した。
ァセトバクタ一'アルトアセチゲネス MH— 24株のゲノム DNAにおける配列番号 5 記載の塩基配列の制限酵素地図と配列番号 5記載の塩基配列の位置、及びプラスミ ド PABC31への挿入断片の概略図を、図 5に示す。
[0061] このようにして作製した pABC31を、大腸菌（Escherichia coli)JM109株にエレクト 口ポレーシヨン法により形質転換した。形質転換株は 100 gZmlのアンピシリンを添 カロした LB寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株にっ 、て、定法により プラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列力 なる DNA を保有するプラスミドを保持して 、ることを確認した。
このようにして得られた形質転 m¾FM109ZpABC31株は、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6)に 2004年 12月 14日付で寄託されており、その寄託番号は、 FERM BP— 10182である。
[0062] (2)形質転換体の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミド PABC31を有するアンピシリン耐性の形質転換 株 (JM109ZPABC31株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添加した LB 培地での生育を、シャトルベクター pGI18のみを導入した大腸菌 (JM109ZPGI18 株）と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸 0. 10%または酢酸 0. 15%、アンピシリン 100 μ g/ml、 ImM IPTG (イソプロピル一 1 チォー β—D—ガラタトピラノシド）を含 む LB培地（ρΗ5. 0)〖こて、 37。Cで、 JM109ZpABC31株および JM109ZpGI18 株の静置培養、または振盪培養（150rpm)を行った。各短鎖脂肪酸添加培地にお いて、経時的に 660nmにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量)の 指標とし、各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図 6に、各培地における生育量 (吸 光度（660nm) )を示す。
[0063] 図 6に示すように、形質転換お M109ZPABC31株では各短鎖脂肪酸添加培地 のいずれにおいても増殖が可能であつたのに対して、大腸菌 JM109ZpGI18株で は生育ができな力つた。すなわち、非形質転 mtt CFM109ZpGI18株）は短鎖脂肪 酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転^ ¾ (jM109ZpABC31株）は ギ酸及び酢酸の！/ヽずれに対しても耐性を有して！/ヽた。
このことから、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列力 なる DNAを大腸菌細胞 に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することが できることが示された。
[0064] (実施例 5)配列表の配列番号 8に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換した大 腸菌の短鎖脂肪酸耐性
(1)大腸菌形質転換株の取得
配列表の配列番号 8に記載の DNAを PCR法により増幅し、得られる断片を、製造 例 1で調製した酢酸菌ー大腸菌シャトルベクター PGI18の制限酵素 Smal切断部位 にライゲーションして、プラスミド PABC41を作製した。
PCR法は、具体的には以下のようにして実施した。铸型としてァセトパクター 'アル トァセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes) MH— 24株（FERM BP— 491)の ゲノム DNAを用いて、また、プライマーとして、プライマー 5 (配列表の配列番号 17記 載の塩基配列参照)及びプライマー 6 (配列表の配列番号 18記載の塩基配列参照） を用いた。上記の铸型及びプライマーによる PCRを、 KOD-Plus- (東洋紡績 (株) 製）を使用し、 94°C 15秒、 60°C 30秒、 68°C 1分を 1サイクルとして、 30サイクル の条件で実施した。
[0065] このようにして作製した pABC41を大腸菌（Escherichia coli)JM109株へエレクト口 ポレーシヨン法により形質転換した。形質転換株は 100 gZmlのアンピシリンを添 カロした LB寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株にっ 、て、定法により プラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号 8に記載の塩基配列力 なる DNA を保有するプラスミドを保持して 、ることを確認した。
配列表の配列番号 8に記載の塩基配列中には、塩基番号 249〜1025に力 4ナて、 配列番号 9記載のアミノ酸 259個力 なるアミノ酸配列をコードするオープン 'リーディ ング 'フレーム（ORF)の存在が確認された。また、配列表の配列番号 9に記載のアミ ノ酸配列は、既知の配列との相同性は、 30%と低力つたことから、配列表の配列番 号 8に記載の塩基配列からなる遺伝子は本発明者がはじめて発見した、新規な遺伝 子であることが明らカ^なつた。
ァセトバクタ一.ァノレトァセチゲネス MH— 24株のゲノム DNAにおける配列番号 8 記載の塩基配列の制限酵素地図と配列番号 8記載の塩基配列の位置、及びプラスミ ド PABC41への揷入断片の概略図を、図 8に示す。
このようにして得られた形質転換 ¾JM109ZpABC41株は、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6)に 2004年 12月 27日付で寄託されており、その寄託番号は、 FERM BP_ 10194である。
[0066] (2)形質転換体の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミド PABC41を有するアンピシリン耐性の形質転換 株 (JM109/PABC41株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添加した LB 培地での生育を、シャトルベクター pGIl 8のみを導入した大腸菌 CiM109ZpGI18 株)と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸または酢酸を 0. 15%、アンピシリン 100 / gZ ml、 ImM IPTG (イソプロピル一 1一チォ一 j3—D—ガラタトピラノシド）を含む LB 培地 (pH5. 0)にて、 37。Cで、 JM109/PABC41株および JM109ZpGI18株の静 置培養、または振盪培養（150rpm)を行った。各短鎖脂肪酸添加培地において、経 時的に 660nmにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標とし 、各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図 7に、各培地における生育量 (吸光度 (6 60nm)の経時的変ィヒ）を示す。
[0067] 図 7に示すように、形質転換 ¾IM109ZpABC41株では、各短鎖脂肪酸添加培 地のいずれにおいても増殖が可能であつたのに対して、大腸菌 JM109/pGI18株 では生育ができなかった。すなわち、非形質転換株 CiM109ZpGI18株)は短鎖月旨 肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換 ¾JM109ノ pABC41株は ギ酸及び酢酸に対し耐性を有してレヽた。
このことから、配列表の配列番号 8に記載の塩基配列力 なる DNAを大腸菌細胞 に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することが できることが示された。
訂正された用¾ (規則 9υ [0068] (実施例 6)大腸菌形質転換体の高密度培養
(1)グルコース添加 LB培地での培養
実施例 2で得られた、プラスミド pABCl 11を有する大腸菌 JM109株の形質転赚 (JM109ZPABC111株）について、 LB培地にグルコースを添カ卩した培地での生育 を、シャトルベクター pGI18のみを導入した大腸菌株 (JM109ZPGI18株）と比較し た。
具体的には、 5リツターのミニジャー（三ッヮ理ィ匕学工業社製; KMJ— 2A)を用いて 、グルコース 20%、アンピシリン 100 g/mlを含む LB培地（pH7. 0)をフィルター 滅菌にて、 37°C、 500rpm、 0. 3vvmの通気培養を行った。培養中及び培養終了時 の生育量、並びに培養液中の酢酸量及び全有機酸量を、形質転換株と非形質転換 株とで比較した。
生育量は、 660nmにおける吸光度 (OD660nm)として測定した。一方、培養液中 の全有機酸量及び酢酸量は、培養液から菌体を遠心分離し、上清液を適当に希釈 し、島津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システム (カラム： ShodexRSpak KC-811、 移動相： 4mM p—トルエンスルホン酸、反応液： 4mM p—トルエンスルホン酸、 80 μ Μ EDTA、 16mM Bis—Tris)にて、上清液中の全短鎖脂肪酸 (有機酸)濃度 (タエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸、ピログルタミン酸の各濃度の合計値）、 及び酢酸濃度として測定した。
図 9に各細胞の生育量、並びに培養液中の全有機酸量及び酢酸量の推移を示し た。また、表 2に培養開始後 22時間目の生育量、並びに培養液中の全短鎖脂肪酸 量及び酢酸量をまとめた。
[0069] [表 2]
Figure imgf000030_0001
図 9の結果から、生育量、全短鎖脂肪酸 (有機酸)量及び酢酸量ともに、形質転換 株である JM 109/pABC 111株の方が非形質転換株である JM 109/pGIl 8株より も高いことが確認できた。 また、表 2の結果から、培養開始後 22時間目の生育量、全有機酸量及び酢酸量に ついても、形質転換株 (JM109ZPABC111株）のほうが、非形質転換株 (JM109 ZpGI 18株)よりも高いことが確認できた。
このことから、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAを大腸菌細胞 に導入して得られる大腸菌は、高密度菌体培養において、短鎖脂肪酸による生育阻 害を受けないこと、及び、酢酸をはじめとする短鎖脂肪酸だけでなぐ有機酸を多く 生成できることが明ら力となった。
[0071] (2)グルコース流加培養
実施例 2で得られたプラスミド pABCl 11を有する大腸菌 JM109株の形質転赚 ( JM109/pABCl l 1株）を用いて、培養中に培地へグルコースを添加する流加培養 での生育を、シャトルベクター pGI18のみを導入した大腸菌 (JM109ZPGI18株）と 比較した。
培養には、 2リツターのミニジャー（三ッヮ理ィ匕学工業社製; KMJ— 2A)、 pHコント ローラー（三ッヮ理化学工業社製；デジタル pHコントローラー MPH—2C)を用いた。
[0072] また、培養培地としては、ミネラル培地（Mineral medium: 2. Og Na SO , 2. 468g
2 4
(NH ) SO , 0. 5g NH CI, 14. 6g K HPO , 3. 6g NaH PO -H O, 1. 0
4 2 4 4 2 4 2 4 2 g (NH ) —H— citrate, 0. 05g Thiamin/1) 1リツターに対して、 1Mの MgSOを
4 2 4
3ml、微量元素溶液（Trace element solution : 0. 5g CaCl , 0. 18g ZnSO - 7H
2 4 2
O, 0. lg MnSO -H O, 20. lg EDTA— Na , 16. 7g FeCl - 6H O, 0. 16g
4 2 2 3 2
CuSO - 5H O, 0. 18g CoCl - 6H 0 (培養培地 11あたり））を 3ml添カ卩したもの
4 2 2 2
を用いた。
温度、 pH、攪拌速度、及び通気量が、それぞれ 35°C、 6. 8、 700rpm、 0. 51/mi nとなるように制御しながら培養を行った。 pHの調整は、 29%アンモニア溶液を添カロ して行った。
[0073] 100 μ gZmlのアンピシリンを添カ卩した LB培地 5mlにて 6時間培養した培養液を集 菌し、前記の培養培地 5mlで再懸濁したものを、 1リツターの培地に接種し、 16. 5時 間通気攪拌培養した。
その後、 26. 5時間目まで 50%グルコース溶液を連続的に、表 3に示したスケジュ ールに従って、培養時間の経過に伴い、順次、流加速度及び流加量を上げながら 流加していき、通気攪拌培養 (通気量; 0. 5wm、攪拌速度； 700rpm)を行いながら 培養を行った。
[0074] [表 3]
Figure imgf000032_0001
[0075] 菌体の増殖は、 660nmにおける吸光度（OD660nm)における生育量、及び菌体 乾燥重量を測定することにより確認した。
グルコースの流加培養における生育量（OD660nm)の推移を、図 10に示した。 図 10から明らかなように、形質転換株 (JM109ZPABC111株）のほうが、生育量 力 SJM109ZPGI18株を上回ることが確認できた。
また、培養終了時において、最終菌体量（乾燥菌体重量 (g:DCW (Dried Cell Wei ght) )及び消費グルコース量を測定し、菌体濃度 (培地 1Lあたりの乾燥菌体重量 gZ 1)及び菌体収率 (wZw%)を算出した。更に、単位時間あたりの菌体の増殖速度と して平均増殖速度 (gZh)を算出した。各菌におけるこれらの結果を表 4にまとめた。
[0076] [表 4]
Figure imgf000032_0002
[0077] 表 4の結果から、形質転換株 CiM109ZpABClll株）のほうが、菌体量、菌体濃 度、菌体収率、単位時間あたりの増殖速度のいずれにおいても JM109ZpGI18株 より値が高力つたこと。
このことから、グルコースの流加培養による高密度培養の有用性が確認できた。
[0078] (実施例 7)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAで形質転換したグ ルコンァセトパクター'ジァゾトロフィカスの短鎖脂肪酸耐性
(1)形質転換株の取得
実施例 1で作製した pABC 111を、酢酸発酵能力を有しな!/ヽ酢酸菌の 1つであるグ ルコンァセトパクター ·ジァゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus) ATC C49037株に、エレクト口ポレーシヨン法によって形質転換した。形質転^ ¾は 100 μ gZmlのアンピシリンを添カ卩した YPG培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株にっ 、て、定法により プラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNA を保有するプラスミドを保持して 、ることを確認した。
このようにして得られた形質転^ ¾ATCC49037ZpABCl 11株は、独立行政法 人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番地 1中央第 6)に 2004年 12月 14日付で寄託されており、その寄託番号は、 FER M BP— 10186である。
[0079] (2)形質転換体の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミド pABCl 11を有するアンピシリン耐性の形質転 • (ATCC49037ZpABCl l l株）について、酢酸を添カ卩した YPG培地での生 育を、シャトルベクター pGI 18のみを導入したダルコンァセトバクタ一'ジァゾトロフィ カス ATCC49037株（ATCC49037ZpGI18株）と比較した。
具体的には、酢酸 0. 05%、アンピシリン 100 /z gZmlを含む YPG培地にて、 30°C で振盪培養（150rpm)を行い、経時的に 660nmにおける吸光度を測定し、各細胞 の増殖の程度 (生育量)の指標として比較した。図 11に、各培地における生育量 (吸 光度（660nm)の経時的変化）を示す。
[0080] その結果、図 11に示すように、形質転^ ¾ (ATCC49037ZpABCl l l株）では 酢酸 0. 05%添カ卩した YPG培地で増殖が可能であるのに対し、 ATCC49037/pG 118株は生育できな 、ことが確認できた。 このことから、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列力 なる DNAを、酢酸を生産 しない酢酸菌であるダルコンァセトバクタ一'ジァゾトロフィカスに導入することにより、 その酢酸耐性を増強させることができることが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、短鎖脂肪酸に対する耐性を付与し、短鎖脂肪酸耐性の向上した 細胞を育種することができる。また、微生物細胞に本発明の育種方法を適用した場 合には、培養中に生成する生育に有害な短鎖脂肪酸による影響を受けない細胞を 効率的に育種することができる。
本発明により得られる短鎖脂肪酸耐性の微生物細胞は、短鎖脂肪酸が生成する高 密度菌体培養に適用することも可能である。また、短鎖脂肪酸を高濃度に含有する 発酵液の製造に利用することも可能である。特に短鎖脂肪酸耐性が付与された大腸 菌などの場合には、培養における増殖能が顕著に向上し、高濃度の短鎖脂肪酸を 効率良く蓄積することができるので、産業上有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した細 胞の育種方法。
[2] 細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする請求項 1に記載の 細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 301〜2073からなる 塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 301〜2073からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[3] 細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする請求項 1に記載の 細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列のうち、塩基番号 331〜2154からなる 塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列のうち、塩基番号 331〜2154からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[4] 細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が下記の（a)、（b)、（c)又は (d)に示す DNAであることを特徴とする請求項 1 に記載の細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列、及び塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列を含む DNA。
(b)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配 列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列、及び、配列表 の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列を 含む DNAであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードす る DNA。
(c)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜1724力もな る塩基配列、及び、配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724 〜2500からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブと なりうる塩基配列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノ、イブリダィズする塩基配列 を含む DNAであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコード する DNA。
(d)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1002〜 1724力らな る塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配 列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列、及び、配列表 の配列番号 5に記載の塩基配列のうち、塩基番号 1724〜2500からなる塩基配列 又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列の DNAと 、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであって、かつ 、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードする DNA。
[5] 細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子が下記の（a)又は (b)に示す DNAであることを特徴とする請求項 1に記載の 細胞の育種方法。
(a)配列表の配列番号 8に記載の塩基配列のうち、塩基番号 249〜1025からなる DNA0
(b)配列表の配列番号 8に記載の塩基配列のうち、塩基番号 249〜1025からなる 塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部力も作製したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む DNAであ つて、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[6] 短鎖脂肪酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸であるこ とを特徴とする請求項 1〜請求項 5のいずれかに記載の細胞の育種方法。
[7] 細胞が微生物細胞であることを特徴とする請求項 1〜請求項 5の 、ずれかに記載 の方法で育種された細胞。
[8] 微生物細胞が、酢酸菌、大腸菌、又はバチルス属に属する細菌細胞であることを 特徴とする請求項 7に記載の細胞。
[9] 請求項 8に記載の細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法。
[10] 細胞を短鎖脂肪酸存在下で培養することを特徴とする請求項 9に記載の高密度菌 体培養法。
[11] 請求項 8に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養すること を特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法。
PCT/JP2005/022742 2004-12-17 2005-12-12 短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法 WO2006064746A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/793,145 US20080138904A1 (en) 2004-12-17 2005-12-12 Method Of Breeding Cells To Improve Tolerance To Short Chain Fatty Acids
EP05814767A EP1842912A4 (en) 2004-12-17 2005-12-12 METHOD FOR CELL-LIVING CELLS WITH IMPROVED TOLERANCE AGAINST SHORT-CHAINED FATTY ACIDS

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-365521 2004-12-17
JP2004365521 2004-12-17
JP2005014984A JP2006191908A (ja) 2004-12-17 2005-01-24 短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法
JP2005-014984 2005-01-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006064746A1 true WO2006064746A1 (ja) 2006-06-22

Family

ID=36587801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/022742 WO2006064746A1 (ja) 2004-12-17 2005-12-12 短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080138904A1 (ja)
EP (1) EP1842912A4 (ja)
JP (1) JP2006191908A (ja)
WO (1) WO2006064746A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015039348A (ja) * 2013-08-22 2015-03-02 国立大学法人 筑波大学 微生物変異株、当該微生物変異株を用いた廃水処理方法及び廃水処理装置

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003078635A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene favorisant la tolerance a l'acide acetique, bacterie d'acide acetique obtenue au moyen du gene, et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie d'acide acetique
WO2003078622A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie
JP2003289868A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004121021A (ja) * 2002-09-30 2004-04-22 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004305209A (ja) * 2003-03-27 2004-11-04 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子
JP2005040065A (ja) * 2003-07-23 2005-02-17 Mitsukan Group Honsha:Kk タンパク質複合体ａｂｃ３、その遺伝子、高度な酢酸耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003078635A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene favorisant la tolerance a l'acide acetique, bacterie d'acide acetique obtenue au moyen du gene, et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie d'acide acetique
WO2003078622A1 (fr) * 2002-03-15 2003-09-25 Mitsukan Group Corporation Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie
JP2003289868A (ja) * 2002-04-01 2003-10-14 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004121021A (ja) * 2002-09-30 2004-04-22 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2004305209A (ja) * 2003-03-27 2004-11-04 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子
JP2005040065A (ja) * 2003-07-23 2005-02-17 Mitsukan Group Honsha:Kk タンパク質複合体ａｂｃ３、その遺伝子、高度な酢酸耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1842912A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1842912A1 (en) 2007-10-10
EP1842912A4 (en) 2008-03-12
US20080138904A1 (en) 2008-06-12
JP2006191908A (ja) 2006-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Comparison of recombinant Escherichia coli strains for synthesis and accumulation of poly‐(3‐hydroxybutyric acid) and morphological changes
Porro et al. Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts
ES2573980T3 (es) Materiales y métodos para la producción eficaz de ácido láctico
KR101511639B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 사용 방법
JP7125477B2 (ja) グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法
CN112725210B (zh) 抑制乳酸代谢和乙醇产生的重组耐酸酵母及使用其生产乳酸的方法
Wang et al. Metabolic engineering for ethylene production by inserting the ethylene-forming enzyme gene (efe) at the 16S rDNA sites of Pseudomonas putida KT2440
JP6562374B1 (ja) 乳酸を生成するヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体
KR20210128742A (ko) 글리세롤 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
JP4627778B2 (ja) 加水分解物原料からコハク酸を生産する方法
JP2019030316A (ja) Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたｌ−リシンの生産方法
JPWO2010032698A6 (ja) 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌
BRPI0811501B1 (pt) Sistema de expressão para a produção de um ou mais polipeptídeo(s)-alvo, seu uso, e método para produção de um polipeptídeo-alvo livre de antibióticos
WO2004081216A1 (ja) 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子
CN106635945B (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l-苏氨酸的方法
CN110592084B (zh) 一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用
ES2702930T3 (es) Microorganismo modificado con un comportamiento de separación de biomasa mejorado
US20210324391A1 (en) Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10
CN110846333A (zh) 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
KR20160111947A (ko) 재조합 미생물의 생산 방법
WO2006064746A1 (ja) 短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法
JP2006230329A (ja) 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
WO2016030373A1 (en) Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose
ES2394749T3 (es) Fermentación de bacilos moderadamente termofílicos en sacarosa
JP4551870B2 (ja) 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005814767

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11793145

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580045764.1

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005814767

Country of ref document: EP