JP2003289868A - 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 酢酸耐性に関与する新規な酢酸耐性遺伝子を
提供すること、及び該遺伝子を含む微生物並びに該微生
物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を
提供すること 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有する酢酸耐性を
有する蛋白質、これら蛋白質をコードするＤＮＡ、これ
らＤＮＡを含む微生物及びこれら微生物を用いた高酢酸
濃度の食酢の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物に由来する
酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードす
る遺伝子、該遺伝子を含む微生物、特にアセトバクター
属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Glu
conacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物
を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酢酸菌は食酢製造に広く利用されている
微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセ
トバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用
されている。

【０００３】酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸
菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸
が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっ
ても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢
酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力
は次第に低下する。

【０００４】そのため、酢酸発酵においては、より高い
酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、す
なわち酢酸耐性の強い酢酸菌を開発することが求められ
ており、その一手段として、酢酸耐性に関与する酢酸耐
性遺伝子(Acetic acid resistance gene）をクローニン
グし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良
することが試みられている。

【０００５】これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関す
る知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性
を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させ
ることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成す
る３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がク
ローニングされていた（ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J. Bacteriol.），１７２巻，２０９６頁，１
９９０年）。

【０００６】この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵
素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢
酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推
定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であ
った（ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アン
ド・バイオエンジニアリング（J. Ferment. Bioen
g.），７６巻，２７０頁，１９９３年）。

【０００７】これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝
子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、ア
セトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナムＩ
ＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO
3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐
性の向上程度が僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵で
の能力の向上の有無については不明であった（特開平３
−２１９８７８号公報）。

【０００８】一方、酢酸菌からクローニングされた膜結
合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺
伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵におい
て最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が特開平２−
２３６４号公報に開示されている。しかし、ＡＬＤＨは
アルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐
性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコ
ードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定で
きないものであった。

【０００９】このような実情から、酢酸耐性を実用レベ
ルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする
新規な酢酸耐性遺伝子を取得し、また取得した酢酸耐性
遺伝子を用いて、より強い酢酸耐性を有する酢酸菌を育
種することが望まれていた。

【００１０】

【発明が解決するための課題】本発明は、酢酸菌に属す
る微生物由来の酢酸耐性に関与する新規な酢酸耐性遺伝
子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の酢酸
耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の酢
酸耐性を向上させる方法、さらに酢酸耐性が向上した酢
酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造す
る方法を提供することを課題とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、酢酸存在
下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の
微生物には存在しない特異的な酢酸耐性に関与する酢酸
耐性遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子
を用いれば、従来以上に微生物の酢酸耐性を向上させる
ことができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢の効
率的な製造法を開発することが可能になると考えた。

【００１２】従来の酢酸耐性遺伝子の取得方法は、酢酸
菌の酢酸感受性の変異株を相補する遺伝子をクローニン
グする方法などが一般的であった。

【００１３】しかし、このような方法では産業上有用な
酢酸耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、鋭意
検討した結果、本発明者らは、酢酸菌から酢酸耐性遺伝
子を見出す方法として、酢酸の存在下で特異的に発現し
ているタンパク質を検索し、そのタンパク質をコードす
る遺伝子を取得するといった、従来全く行われていなか
った方法を開発した。

【００１４】この方法によって、実際に食酢製造に用い
られているアセトバクター属とグルコンアセトバクター
属に属する酢酸菌から、酢酸耐性を実用レベルで向上さ
せる機能を有する新規な酢酸耐性遺伝子をクローニング
することに成功した。

【００１５】得られた酢酸耐性遺伝子は、大腸菌などで
見出されており、ＡＴＰバインディングカセット（ATP
binding cassette）を有するＡＢＣトランスポーターと
称される一群のタンパク質に共通する特徴的な塩基配列
を有しており、酢酸菌のＡＢＣトランスポーターをコー
ドする遺伝子（ＡＢＣトランスポーター遺伝子）である
と推定された。

【００１６】しかし、取得された酢酸菌の酢酸耐性遺伝
子を、大腸菌などの他の微生物で見出されている既知の
ＡＢＣトランスポーター遺伝子と比較したところ、相同
性がきわめて低くかったことから、ＡＴＰ結合部位を有
する点では他のＡＢＣトランスポーター遺伝子と似てい
るものの該酢酸耐性遺伝子は酢酸菌に特異的な新規タン
パク質をコードする新規遺伝子であるこが判った。

【００１７】一方、取得された酢酸耐性遺伝子につい
て、食酢製造に使用されているアセトバクター属の酢酸
菌由来のものとグルコンアセトバクター属の酢酸菌由来
のもので比較したところ、両者の相同性は約７０％であ
り、酢酸菌間での相同性は高かった。

【００１８】さらに、取得された酢酸耐性遺伝子を用い
た相同組換えによって該酢酸耐性遺伝子を破壊した酢酸
菌は、酢酸に対する耐性が低下するが、類縁の各種有機
酸に対する耐性はほとんど変化しなかったことから、該
酢酸耐性遺伝子は酢酸に対する耐性に特異的に関与する
遺伝子であることが明らかとなった。

【００１９】また、該遺伝子をプラスミドベクターに連
結して酢酸菌に形質転換してコピー数を増幅させた形質
転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上し、その結
果、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場
合に、増殖誘導期が短縮する上に、増殖速度が向上し、
さらに最終到達酢酸濃度が顕著に向上し、より高酢酸濃
度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の
（１）〜（９）からなるものである。

【００２０】（１） 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
るタンパク質。

【００２１】（２） 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
るタンパク質。

【００２２】（３） 以下の(a)又は(b)のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
るタンパク質。

【００２３】（４） 以下の(a)又は(b)のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。 (b) 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
るタンパク質。

【００２４】（５） 以下の(a)又は(b)の塩基配列から
なるＤＮＡ。 (a)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０
１〜２０７３からなるＤＮＡ。 (b)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０
１〜２０７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
ＮＡ配列の一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢
酸耐性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００２５】（６） 以下の(a)又は(b)の塩基配列から
なるＤＮＡ。 (a)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３
１〜２１５４からなるＤＮＡ。 (b)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３
１〜２１５４からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
ＮＡ配列の一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢
酸耐性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００２６】（７） （３）、（４），（５）又は
（６）に記載のＤＮＡを細胞内に含む酢酸耐性を有する
微生物又は前記酢酸耐性を有しかつ酢酸耐性が増強され
た微生物。

【００２７】（８） 微生物がアセトバクター属、又は
グルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴と
する請求項（７）に記載の微生物。

【００２８】（９） （７）又は（８）に記載の微生物
を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢
酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方
法。

【００２９】本発明によれば、微生物に対して、酢酸に
対する耐性を付与し、増強することができる。そして、
アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌において
は、酢酸に対する耐性が顕著に向上し、培地中に高濃度
の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができ
る。

【００３０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、ＡＴＰバインディングカセット（AT
P binding cassette）を持つなど、ＡＢＣトランスポー
ターのモチーフを有し、且つ酢酸耐性を向上させる機能
を有する配列表配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質をコードする塩基配列を包含し、該塩
基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含むもの
である。

【００３１】本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列
番号１の塩基番号３０１〜２０７３又は配列表配列番号
３の３３１〜２１５４からなる塩基配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。

【００３２】配列番号1又は３に示す塩基配列は、ＤＤ
ＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋにおいて相同遺伝子を
検索したところ、大腸菌（Escherichia coli）のＡＢＣ
トランスポーター遺伝子の一つであるＵＵＰ遺伝子とア
ミノ酸配列レベルで３８．５％、ヘモフィルス・インフ
ルエンザエ（Haemophillus influenzae）のＵＵＰ遺伝
子ともアミノ酸配列レベルで３８．１％の相同性を示す
ことが分かったが、いずれも３０％台の低い相同性であ
り、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる
新規なものであることが明白であった。また、上記のＵ
ＵＰ遺伝子は機能が不明であり、当然ながら酢酸耐性と
関係していることは全く知られていない。

【００３３】本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかと
なったので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドをプライマー１（配列番号５）及びプライマー
２（配列番号６）として用い、酢酸菌、例えばアセトバ
クター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（Acetobacte
r altoacetigenes ＭＨ−２４:FERM BP-491)のゲノムＤ
ＮＡを鋳型としたポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（ＰＣＲ反応）（トレンズ・オブ・ジェネテェックス
（Trends Genet. ）５巻，１８５頁，１９８９年）によ
って、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドをプローブとして用い、前記酢酸菌のゲノムＤ
ＮＡイブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっ
ても得ることができる。

【００３４】オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市
販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って
合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシ
ステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイク
ラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）を使用して、定法に従って行な
うことができる。

【００３５】本発明の酢酸耐性を増強する機能を有する
タンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパ
ク質の酢酸耐性又は該酢酸耐性を増強する機能が損なわ
れない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸
が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするも
のであっても良い。

【００３６】このような酢酸耐性を増強する機能を有す
るタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする
ＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部
位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配
列を改変することによっても取得され得る。また、上記
のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変
異処理によっても取得することができる。

【００３７】また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列
およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異
体、変種間でわずかに異なることが知られているので、
実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸
菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバク
ター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能であ
る。

【００３８】具体的には、アセトバクター属やグルコン
アセトバクター属に属する酢酸菌、又は変異処理したア
セトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢
酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配
列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３０１
〜２０７３からなる塩基配列を有するＤＮＡや該塩基配
列の一部を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
かつＡＴＰバインディングカセットを有し、酢酸耐性又
は該酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質
と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得ら
れる。

【００３９】ここでいうストリンジェントな条件とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相
同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有す
るＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低
い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳ
Ｃで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が
行われる条件などが挙げられる。

【００４０】（２）本発明の酢酸菌 本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセト
バクター属に属する細菌をさし、酢酸耐性が増強された
アセトバクター属の細菌及びグルコンアセトバクター属
の細菌、または酢酸耐性が低下したアセトバクター属の
細菌及びグルコンアセトバクター属の細菌である。

【００４１】アセトバクター属の細菌として、具体的に
はアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙
げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acet
obacter aceti No.1023）株 （特許生物寄託センター
にＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）が例示され
る。

【００４２】また、グルコンアセトバクター属の細菌と
しては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Glucon
acetobacter entanii）が挙げられ、アセトバクター・
アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacet
igenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ
ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。

【００４３】酢酸耐性の増強は、例えば酢酸耐性遺伝子
の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の
構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属の酢酸
菌の中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して
得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属酢酸
菌を形質転換することによって増強することができる。

【００４４】また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモ
ーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバク
ター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター
配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造
社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ
２９８（宝酒造社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラ
スミドｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）のクロラムフェニ
コール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの
各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来
のプロモーター配列に置き換えることによっても、酢酸
耐性を増強することができる。

【００４５】該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺
伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター
属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことがで
きる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トラ
ンスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバク
ター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうこ
とができる。

【００４６】マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２
４（アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５
巻，１７１頁，１９８９年）やｐＴＡ５００１(a)、ｐ
ＴＡ５００１(b)（特開昭６０−９４８８号公報）など
が挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ
１（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agric. Biol. Chem.）５２巻，３１２５
頁，１９８８年）も挙げられる。また、トランスポゾン
としては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。

【００４７】アセトバクター属やグルコンアセトバクタ
ー属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法
（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Agric. Biol. Chem.）４９巻，p.２０９１，
１９８５年）やエレクトロポレーション法（バイオサイ
エンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミス
トリー（Biosci. Biotech. Biochem.）、５８巻、９７
４頁、１９９４年）等によって行うことができる。

【００４８】アルコール酸化能を有するアセトバクター
属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記
のようにしてその酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量
や生産効率を増大させることができる。

【００４９】該遺伝子を破壊して酢酸耐性を低下させた
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌
は、例えば、該遺伝子の一部を破壊して不完全な形にし
た遺伝子を有するＤＮＡ断片を該微生物に導入し、該微
生物の染色体上の該遺伝子との相同組換えにより、染色
体ＤＮＡに不完全な形の遺伝子を組み込むことにより得
ることができる。

【００５０】具体的には、例えば、該遺伝子内部にカナ
マイシン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子を挿入し
て組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでアセトバ
クター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌を形質転
換し、カナマイシン等の薬剤を含む培地で培養すること
により、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形
質転換株が得られる。こうして染色体に組換えＤＮＡが
組み込まれた株は、染色体上に元々存在する該遺伝子配
列との組換えを起こし、染色体上の該遺伝子が薬剤マー
カー遺伝子を挿入した不完全な形の該遺伝子と入れ替わ
ったものである。

【００５１】（３）食酢製造法 上記のようにして、酢酸耐性遺伝子のコピー数が増幅さ
れたことにより酢酸耐性が選択的に増強されたアセトバ
クター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であっ
て、アルコール酸化能を有するものをアルコール含有培
地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることに
より、食酢を効率よく製造することができる。

【００５２】本発明の製造法における酢酸発酵は、従来
の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行な
えば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、
窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使
用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するもので
あれば、合成培地でも天然培地でも良い。

【００５３】炭素源としては、グルコースやシュークロ
ースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げら
れる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物など
の天然窒素源を用いることができる。

【００５４】また、培養は、静置培養法、振盪培養法、
通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は
通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範
囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、
各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通
常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸
が蓄積する。以下に、本発明を実施例により具体的に説
明する。

【００５５】

【実施例】（実施例１）アセトバクター・アセチの酢酸
耐性遺伝子のクローニングと該遺伝子の塩基配列及びア
ミノ酸配列の決定 （１）酢酸耐性遺伝子のクローニング アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter
aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）を１
％の酢酸を含むＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％
酵母エキス、０．２％ポリペプトン）を用いて、３０℃
で２４時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離
（７，５００×ｇ、１０分）して菌体を得た。また、酢
酸を含まないＹＰＧ培地でも、同様にして培養して、菌
体を得た。

【００５６】得られたこれらの菌体を、それぞれソニケ
ーションにより破砕し、その菌体破砕液を遠心分離（１
２，０００×g、１０分間）して得られた上澄液を、さ
らに超遠心分離（４００，０００×ｇ、１時間）を行な
うことによって沈殿物（不溶性蛋白質）を得た。その
後、この沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
に懸濁した。

【００５７】この懸濁した沈殿物を２×ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ泳動緩衝液（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
６．８）、１０％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ
ｌ、４％ＳＤＳ、１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．００４％
Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）に１：１の比率で懸
濁し、沸騰水浴中で３分間加熱処理した。このサンプル
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＣＢＢ染色し、１
％の酢酸を含むＹＰＧ培地で生育したものと、酢酸を含
まないＹＰＧ培地で生育したものとを比較しところ、分
子量約７０ｋＤａのバンドが１％酢酸を含む培地で生育
したもので発現が増幅しているのが確認された。

【００５８】このように発現が増幅していたバンドをＰ
ＶＤＦ膜に転写し、アミノ末端のアミノ酸配列をプロテ
インシークエンサーにて決定した。決定したアミノ酸配
列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕであった。

【００５９】上記のアミノ酸配列を基にしてオリゴヌク
レオチドを合成し、これをアセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株から定法により染色体ＤＮＡを抽出し制
限酵素ＰｓｔＩで完全分解したものに対して、サザンハ
イブリダイゼーションを行なった。

【００６０】その結果、約２．５ｋｂｐの位置にポジテ
ィブなバンドを確認した。このバンドをアガロースゲル
より抽出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１９の制限酵素Ｐｓ
ｔＩ切断部位にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株
に形質転換し、１００μg／ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーをサザンハ
イブリダイゼーションで用いたと同じオリゴヌクレオチ
ドをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、ポジティブな形質転換体を単離した。

【００６１】その後、プラスミドＤＮＡをポジティブな
形質転換体より分離し、挿入断片の構造を制限酵素マッ
ピングにより解析し、その結果、図１に示した約２．５
ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を確認した。

【００６２】（２）クローン化された遺伝子断片の塩基
配列の決定 上記挿入断片の大部分について、塩基配列をサンガーの
ダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって
決定した。塩基配列の決定は、両方のＤＮＡ鎖の全領域
について行ない、切断点は全てオーバーラップする様に
して行なった。その結果、配列番号1に記載した塩基配
列が決定された。

【００６３】配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番
号３０１から塩基番号２０７３にかけて、配列番号２に
記載したような５９１個のアミノ酸をコードするオープ
ンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番
号２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−であり、先に決定した該タンパク
質のＮ末端側のアミノ酸配列と完全に一致することが確
認された。

【００６４】また、配列番号２に記載のアミノ酸配列の
タンパク質には、ＡＴＰバインディングカッセットをア
ミノ酸番号３９〜４６と３１４〜３２１の２個所に持つ
など、ＡＢＣトランスポーターのモチーフを有している
ことが確認された。

【００６５】（実施例２）グルコンアセトバクター・エ
ンタニイからの酢酸耐性遺伝子のクローニングと塩基配
列及びアミノ酸配列の決定 （１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製 グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobac
ter entanii）の１菌株であるアセトバクター・アルト
アセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes
MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４
％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、
０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃
にて振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離
（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた
菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方
法により、染色体ＤＮＡを調製した。

【００６６】上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ及
び酢酸―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（アプライ
ド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオ
ロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５巻、１７１
頁、１９８９年）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社
製）で切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ラ
イゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.
2，宝酒造社製）を用いて連結してグルコンアセトバク
ター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築し
た。

【００６７】（２）酢酸耐性遺伝子のクローニング 上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エ
ンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は酢酸濃
度１％程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセ
チＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイ
オサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケ
ミストリー(Biosci. Biotech. Biochem.) ,５８巻、９
７４頁、１９９４年）で形質転換し、２％酢酸、１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、
３０℃で４日間培養した。

【００６８】生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌
体からプラスミドを回収したところ、約３．５ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ断片がクローン化されており、該断片の構造
を制限酵素マッピングにより解析し、その結果を図２に
示した。また、クローン化されたＤＮＡ断片のうち、ア
セトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を２％酢酸を含
むＹＰＧ培地で生育可能にする断片は、Ｓｐｈｌ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片であった。

【００６９】このようにして通常は酢酸濃度１％程度ま
でしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０
２３株を２％酢酸含有培地でも増殖可能にする上記Ｓｐ
ｈｌ−ＥｃｏＲＩ断片からなる酢酸耐性遺伝子断片を取
得した。

【００７０】（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基
配列の決定 実施例１と同様に、酢酸耐性遺伝子を含有する断片の塩
基配列をサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネ
ーション法によって決定した。その結果、配列番号３に
記載した塩基配列が決定された。アセトバクター・アセ
チＮｏ．１０２３株の場合と同様に、配列決定は両方の
ＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバ
ーラップする様にして行なった。

【００７１】配列番号３記載の塩基配列中には、塩基番
号３３１から塩基番号２１５４にかけて、配列番号４に
記載したような６０８個のアミノ酸をコードするオープ
ンリーディング・フレームの存在が確認された。配列番
号４に記載のアミノ酸配列のタンパク質には、ＡＴＰバ
インディングカセットのモチーフをアミノ酸番号４１〜
４８と３１９〜３２６の２個所に有していた。

【００７２】（実施例３）相同組換で酢酸耐性遺伝子を
破壊させた遺伝子破壊株の造成と該遺伝子破壊株の酢酸
耐性の特異的な低下 （１）相同組換えによる遺伝子破壊株の造成 アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の酢酸耐性を
増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の
破壊を目的として、図１に示すＰｓｔＩ断片をベクター
ｐＵＣ１８のＰｓｔＩ切断部位へ組み込んだ組換えプラ
スミドｐＵＣＭ１８１を構築した後、このｐＵＣＭ１８
１の酢酸耐性遺伝子（Acetic acid resistance gene）
の中に存在するＥｃｏＲＶ切断部位に、プラスミドｐＨ
ＳＤ２９８（ジーン（Gene），６１巻，６３頁，１９８
７年）のカナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片
を組み込んだ組換えプラスミドｐＵＣＭＫ１８１を構築
した。

【００７３】このようにして構築したｐＵＣＭＫ１８１
を、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレク
トロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノ
ロジー・アンド・バイオケミストリー(Biosci.Biotech.
Biochem.),５８巻、９７４頁、１９９４年）で形質転換
し、形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹ
ＰＧ寒天培地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、
ポリペプトン０．２％、寒天２％、ｐＨ６．５）で選択
した。

【００７４】選択培地で増殖したカナマイシン耐性株か
ら定法に従って染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで切断した後、酢酸耐性遺伝子を含むＰｓｔＩ断片と
カナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片をプロー
ブとしたサザンハイブリダイゼーションを行なった。そ
の結果、カナマイシン耐性株の酢酸耐性遺伝子内にカナ
マイシン耐性遺伝子断片（１．６７ｋｂｐ）が挿入さ
れ、酢酸耐性遺伝子が破壊された酢酸耐性遺伝子破壊株
が確認された。

【００７５】（２）酢酸耐性遺伝子破壊株の有機酸耐性 上記で得られたカナマイシン耐性株、すなわち酢酸耐性
遺伝子破壊株について、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪
酸の有機酸に対する感受性を調べた。酢酸耐性遺伝子破
壊株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＹＰＧ
培地で、またその元株であるアセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株はカナマイシン無添加のＹＰＧ培地で、
３０℃で２４時間培養して得た培養液を、１．５％の酢
酸、０．０２％のギ酸、０．１％のプロピオン酸、また
は０．１％の酪酸を添加した各ＹＰＧ培地にそれぞれ１
％ずつ植菌し、また有機酸無添加のＹＰＧ培地にもそれ
ぞれ１％ずつ植菌した後、３０℃にて振盪培養して増殖
状況を比較した。増殖は６６０ｎｍにおける吸光度で測
定した。

【００７６】結果を図３に示したが、酢酸以外の有機酸
では、該遺伝子破壊株は元株アセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株とほぼ同等の増殖を示したが、酢酸を添
加した時のみ、該遺伝子破壊株において増殖誘導期の遅
延や増殖の低下が認められ、該遺伝子は酢酸に特異的な
耐性に関与することが確認できた。

【００７７】（実施例４）アセトバクター・アセチ由来
の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸耐
性の増強 （１）アセトバクター・アセチへの形質転換 アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株由来の酢酸耐
性遺伝子を酢酸菌―大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４
（アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）５５
巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素ＰｓｔＩ切断部
位に挿入したプラスミドｐＡＢＣ１を作製した。

【００７８】このｐＡＢＣ１をアセトバクター・アセチ
Ｎｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイオ
サイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミ
ストリー(Biosci. Biotech. Biochem.) ,５８巻、９７
４頁、１９９４年）によって形質転換した。形質転換株
は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添
加したＹＰＧ寒天培地で選択した。

【００７９】選択培地上で生育したアンピシリン耐性の
形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析
し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持してい
ることを確認した。

【００８０】（２）形質転換株の酢酸耐性 上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１を有す
るアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加
したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２
４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１
０２３株と比較した。

【００８１】具体的には、酢酸３％、エタノール３％、
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰ
Ｇ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行な
い、形質転換株と元株の酢酸添加培地での増殖を６６０
ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。

【００８２】その結果、図４に示すように、形質転換株
では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも比較
的短い誘導期の後に旺盛な増殖が可能であったのに対し
て、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では
誘導期が非常に長く、また増殖も比較的弱いことが確認
でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認でき
た。

【００８３】（実施例５）アセトバクター・アセチ由来
の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵
試験 実施例４で得られたプラスミドｐＡＢＣ１を有するアン
ピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクター
ｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮ
ｏ．１０２３株と酢酸醗酵能を比較した。

【００８４】具体的には、５Ｌのミニジャー（エイブル
社製；ＢＭＳ−０５） を用いて、酢酸４％、エタノー
ル３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２ＬのＹ
ＰＧ培地にて、３０℃、３００ｒｐｍ、０．１５ｖｖｍ
の通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の酢酸発酵
能を比較した。その結果を表１にまとめた。

【００８５】

【表１】

【００８６】表１の結果から、形質転換株の方が、最終
到達酢酸濃度、比増殖速度、生酸速度、増殖誘導期の何
れにおいても、顕著に優れていることが確認できた。

【００８７】（実施例６）グルコンアセトバクター・エ
ンタニイ由来の酢酸耐性遺伝子で形質転換した形質転換
株での酢酸耐性の増強 （１）セトバクター・アセチへの形質転換 グルコンアセトバクター・エンタニイの1菌株であるア
セトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株由来の
酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅
し、その結果得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉで切断し、この断片を酢酸菌―大腸菌シャトルベクタ
ーｐＭＶ２４（アプライド・オブ・エンバイロメント・
アンド・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Micro
biol.）５５巻，１７１頁，１９８９年）の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入したプラスミドｐ
ＡＢＣ１１を作製した。

【００８８】ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施
した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アセチゲ
ネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーと
してプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配
列番号６）を用いて、KOD−Plus−（東洋紡績社製）を
使用し、下記するPCR条件にてPCRを実施した。(PCR条
件）９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２分を１
サイクルとして、３０サイクル実施した。

【００８９】このｐＡＢＣ１１をアセトバクター・アセ
チＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（バイ
オサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケ
ミストリー（Biosci. Biotech. Biochem.），５８巻，
９７４頁，１９９４年）によって形質転換した。形質転
換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸
を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。

【００９０】選択培地上で生育したアンピシリン耐性の
形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析
し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持してい
ることを確認した。

【００９１】（２）形質転換株の酢酸耐性 上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１を有
するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添
加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ
２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．
１０２３株と比較した。

【００９２】具体的には、酢酸３％、エタノール３％、
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰ
Ｇ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行な
い、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０
ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。

【００９３】その結果、図５に示すように、形質転換株
では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも比較
的短い誘導期の後に旺盛な増殖が可能であったのに対し
て、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では
誘導期が非常に長く、また増殖も比較的弱いことが確認
でき、酢酸耐性遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認でき
た。

【００９４】

【発明の効果】本発明により、酢酸耐性に関与する新規
な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢
酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得するこ
とができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高
効率で製造する方法が提供できた。

【００９５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsukan Group Corporation <120> Acetic acid resistance gene, acetic acid bacteria transformed with said gene, and the method for producing vineger using said acetic acid bacteria <130> P02-0012 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2414 <212> DNA <213> Acetobacter aceti <220> <221> CDS <222> (301)..(2073) <400> 1 gctcgcgtac ccgggcgwtc ctctagagtc atcaaccttg gcccaggtgg ggatggcata 60 caggcggtgg cggaaattac ctcatctttc agtgtgccgg ttatatacgt aacggcgtat 120 ccagaacgtt tgctaactgg ggaaaccatg gagcccagtt ttgttattac caagccgttt 180 gaccccctta cccttgctgt tgcaacgtat caggcagtaa gcagcgcacg cacacaggcc 240 gtataagcaa aaaagcggcc tccatttcca gttctacaaa acggattatt tttttccagc 300 atg gcg cat cct ccc ctt ctt cat ctt cag gac att act ctt tca tta 348 Met Ala His Pro Pro Leu Leu His Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 gga ggg aac ccg ctg ctg gat ggc gcc ggt ttt gcc gtt ggg cgt ggt 396 Gly Gly Asn Pro Leu Leu Asp Gly Ala Gly Phe Ala Val Gly Arg Gly 20 25 30 gag cgc ctc tgc ctt gtg ggg cga aac ggt tcg gga aag tcc acc ctg 444 Glu Arg Leu Cys Leu Val Gly Arg Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu 35 40 45 ctc aaa att gct gcg ggt gtt att cag cca gat tcg ggg tct gtg ttt 492 Leu Lys Ile Ala Ala Gly Val Ile Gln Pro Asp Ser Gly Ser Val Phe 50 55 60 gtc cag ccc ggt gct tcc ctg cgc tat ctg ccg cag gag ccg gat tta 540 Val Gln Pro Gly Ala Ser Leu Arg Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Asp Leu 65 70 75 80 agc gct tat gcc aca acg gcg gat tac gtt gtg ggc cag att gga gac 588 Ser Ala Tyr Ala Thr Thr Ala Asp Tyr Val Val Gly Gln Ile Gly Asp 85 90 95 ccg gat atg gca tgg cgc gcc acg cca ttg ctg gat gct ctg ggc ctg 636 Pro Asp Met Ala Trp Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Ala Leu Gly Leu 100 105 110 aca ggt agg gaa agc acg caa aat ctt tca ggc ggt gaa ggt cgg cgt 684 Thr Gly Arg Glu Ser Thr Gln Asn Leu Ser Gly Gly Glu Gly Arg Arg 115 120 125 tgt gct att gct ggt gta ttg gcg gcg gcc ccc gat gtg ctg ctg ctg 732 Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala Pro Asp Val Leu Leu Leu 130 135 140 gat gag ccc acc aac cat ctg gat atg cct acc att gaa tgg ttg gag 780 Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp Met Pro Thr Ile Glu Trp Leu Glu 145 150 155 160 cgt gaa ctg ctg agc ctt ggc gcc atg gta att atc agc cat gat agg 828 Arg Glu Leu Leu Ser Leu Gly Ala Met Val Ile Ile Ser His Asp Arg 165 170 175 cgg ctg ctt tcc acc ctt tca cgt tct gtt gtg tgg ctg gat cgg ggt 876 Arg Leu Leu Ser Thr Leu Ser Arg Ser Val Val Trp Leu Asp Arg Gly 180 185 190 gta acc cgc agg ctt gat gaa gga ttt gga agg ttt gaa gcc tgg cga 924 Val Thr Arg Arg Leu Asp Glu Gly Phe Gly Arg Phe Glu Ala Trp Arg 195 200 205 gag gag gtt ctg gaa cag gaa gag cgt gat gcg cat aaa ctg gac cgg 972 Glu Glu Val Leu Glu Gln Glu Glu Arg Asp Ala His Lys Leu Asp Arg 210 215 220 aaa atc gcg cgg gaa gaa gac tgg atg cgt tat ggc gta acg gcg cgc 1020 Lys Ile Ala Arg Glu Glu Asp Trp Met Arg Tyr Gly Val Thr Ala Arg 225 230 235 240 cgc aaa cgc aat gta cgc cgt gtg cgg gaa cta gca gat ttg cgc aca 1068 Arg Lys Arg Asn Val Arg Arg Val Arg Glu Leu Ala Asp Leu Arg Thr 245 250 255 gcc cgt aag gag gcc att cgg gca ccc ggc acc ctt acc ttg aac acg 1116 Ala Arg Lys Glu Ala Ile Arg Ala Pro Gly Thr Leu Thr Leu Asn Thr 260 265 270 cag ctg cgg cca cat cgc aag ctg gtg gct gtg gcc gaa gat att agt 1164 Gln Leu Arg Pro His Arg Lys Leu Val Ala Val Ala Glu Asp Ile Ser 275 280 285 aag gca tgg ggt gaa aag cag gtt gtt cgc cat ttg gac ctg cgc att 1212 Lys Ala Trp Gly Glu Lys Gln Val Val Arg His Leu Asp Leu Arg Ile 290 295 300 tta cgt gga gac cgg ctt ggt att gtg ggg gcc aat ggt gca ggc aaa 1260 Leu Arg Gly Asp Arg Leu Gly Ile Val Gly Ala Asn Gly Ala Gly Lys 305 310 315 320 acc aca ttg ttg cgg atg cta aca ggg ctg gac caa ccc gat agt ggc 1308 Thr Thr Leu Leu Arg Met Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asp Ser Gly 325 330 335 aca atc tca ctt ggt cct tcc ctt aat atg gtc acg ctg gat cag cag 1356 Thr Ile Ser Leu Gly Pro Ser Leu Asn Met Val Thr Leu Asp Gln Gln 340 345 350 cga cgt acc ctg aac ccg gaa cgc aca cta gcc gat acc ttg aca gaa 1404 Arg Arg Thr Leu Asn Pro Glu Arg Thr Leu Ala Asp Thr Leu Thr Glu 355 360 365 ggc gga ggc gat atg gtg cag gtt ggc acg gaa aag cgc cac gtt gtg 1452 Gly Gly Gly Asp Met Val Gln Val Gly Thr Glu Lys Arg His Val Val 370 375 380 ggg tat atg aaa gac ttt ctg ttt cgg cca gaa cag gca cgc aca ccc 1500 Gly Tyr Met Lys Asp Phe Leu Phe Arg Pro Glu Gln Ala Arg Thr Pro 385 390 395 400 gta agt gcc ctt tct ggc ggg gag cga ggg cgg tta atg ctg gca tgc 1548 Val Ser Ala Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gly Arg Leu Met Leu Ala Cys 405 410 415 gca ttg gcc aag ccc tcc aac ctg ctg gtg ctg gat gaa ccc acc aat 1596 Ala Leu Ala Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val Leu Asp Glu Pro Thr Asn 420 425 430 gat ctg gat ctg gaa aca ctg gat att ttg caa gac atg ctc gcc agt 1644 Asp Leu Asp Leu Glu Thr Leu Asp Ile Leu Gln Asp Met Leu Ala Ser 435 440 445 tgt gaa ggc aca gtg ctg ctt gta agc cat gat cgt gat ttt ctg gat 1692 Cys Glu Gly Thr Val Leu Leu Val Ser His Asp Arg Asp Phe Leu Asp 450 455 460 cgg gtt gca aca tcc gtc ttg gcg aca gag gga gat ggc aac tgg ata 1740 Arg Val Ala Thr Ser Val Leu Ala Thr Glu Gly Asp Gly Asn Trp Ile 465 470 475 480 gaa tat gct ggc gga tac agt gac atg ctg gct cag cgg cac cag aaa 1788 Glu Tyr Ala Gly Gly Tyr Ser Asp Met Leu Ala Gln Arg His Gln Lys 485 490 495 ccg ttg aca acg gcc tct gtg gtg gaa aac gaa ccc aca aaa ccc aaa 1836 Pro Leu Thr Thr Ala Ser Val Val Glu Asn Glu Pro Thr Lys Pro Lys 500 505 510 gag aca act gct gcg cgt ggc ccg acc aaa aag ctg agt tat aag gac 1884 Glu Thr Thr Ala Ala Arg Gly Pro Thr Lys Lys Leu Ser Tyr Lys Asp 515 520 525 cag ttt gcg ctg gat aat ctg ccc aag gaa atg gaa aag ctg gaa gca 1932 Gln Phe Ala Leu Asp Asn Leu Pro Lys Glu Met Glu Lys Leu Glu Ala 530 535 540 cag gct gcc aac tgc gtg aaa aac tgg cag atc cag att tat atg gaa 1980 Gln Ala Ala Asn Cys Val Lys Asn Trp Gln Ile Gln Ile Tyr Met Glu 545 550 555 560 aaa acc ccg cgc agt ttg aga aac ttt cgg ctg att tac aga agc tcg 2028 Lys Thr Pro Arg Ser Leu Arg Asn Phe Arg Leu Ile Tyr Arg Ser Ser 565 570 575 aaa caa agc tgg cag aat ctg aag aac gct ggc tgg aac tgg aaa 2073 Lys Gln Ser Trp Gln Asn Leu Lys Asn Ala Gly Trp Asn Trp Lys 580 585 590 tgaagcgaga agccctacag gccaactaag gcaacgctat ttttcggtga accgcactct 2133 tgcaggcggg tgggtgcaat gcctatgttt tggcatgctc tgttttactg gttctcttta 2193 taagcgcacc cttcctgctg gcagtctggc attgcttgcc tttctgagcg tggcacacat 2253 tgcattcgcg caggatadac ccgccgctgc agtctcccta tagtgagtcg tattacgcgt 2313 tctaacgaat ccatatgact wtgtagaccc tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 2373 yccctatagt gagtcgtatt agagcttggc gtaatgcatg a 2414 <210> 2 <211> 591 <212> PRT <213> Acetobacter aceti <400> 2 Met Ala His Pro Pro Leu Leu His Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gly Asn Pro Leu Leu Asp Gly Ala Gly Phe Ala Val Gly Arg Gly 20 25 30 Glu Arg Leu Cys Leu Val Gly Arg Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu 35 40 45 Leu Lys Ile Ala Ala Gly Val Ile Gln Pro Asp Ser Gly Ser Val Phe 50 55 60 Val Gln Pro Gly Ala Ser Leu Arg Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Asp Leu 65 70 75 80 Ser Ala Tyr Ala Thr Thr Ala Asp Tyr Val Val Gly Gln Ile Gly Asp 85 90 95 Pro Asp Met Ala Trp Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Ala Leu Gly Leu 100 105 110 Thr Gly Arg Glu Ser Thr Gln Asn Leu Ser Gly Gly Glu Gly Arg Arg 115 120 125 Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu Ala Ala Ala Pro Asp Val Leu Leu Leu 130 135 140 Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp Met Pro Thr Ile Glu Trp Leu Glu 145 150 155 160 Arg Glu Leu Leu Ser Leu Gly Ala Met Val Ile Ile Ser His Asp Arg 165 170 175 Arg Leu Leu Ser Thr Leu Ser Arg Ser Val Val Trp Leu Asp Arg Gly 180 185 190 Val Thr Arg Arg Leu Asp Glu Gly Phe Gly Arg Phe Glu Ala Trp Arg 195 200 205 Glu Glu Val Leu Glu Gln Glu Glu Arg Asp Ala His Lys Leu Asp Arg 210 215 220 Lys Ile Ala Arg Glu Glu Asp Trp Met Arg Tyr Gly Val Thr Ala Arg 225 230 235 240 Arg Lys Arg Asn Val Arg Arg Val Arg Glu Leu Ala Asp Leu Arg Thr 245 250 255 Ala Arg Lys Glu Ala Ile Arg Ala Pro Gly Thr Leu Thr Leu Asn Thr 260 265 270 Gln Leu Arg Pro His Arg Lys Leu Val Ala Val Ala Glu Asp Ile Ser 275 280 285 Lys Ala Trp Gly Glu Lys Gln Val Val Arg His Leu Asp Leu Arg Ile 290 295 300 Leu Arg Gly Asp Arg Leu Gly Ile Val Gly Ala Asn Gly Ala Gly Lys 305 310 315 320 Thr Thr Leu Leu Arg Met Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asp Ser Gly 325 330 335 Thr Ile Ser Leu Gly Pro Ser Leu Asn Met Val Thr Leu Asp Gln Gln 340 345 350 Arg Arg Thr Leu Asn Pro Glu Arg Thr Leu Ala Asp Thr Leu Thr Glu 355 360 365 Gly Gly Gly Asp Met Val Gln Val Gly Thr Glu Lys Arg His Val Val 370 375 380 Gly Tyr Met Lys Asp Phe Leu Phe Arg Pro Glu Gln Ala Arg Thr Pro 385 390 395 400 Val Ser Ala Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gly Arg Leu Met Leu Ala Cys 405 410 415 Ala Leu Ala Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val Leu Asp Glu Pro Thr Asn 420 425 430 Asp Leu Asp Leu Glu Thr Leu Asp Ile Leu Gln Asp Met Leu Ala Ser 435 440 445 Cys Glu Gly Thr Val Leu Leu Val Ser His Asp Arg Asp Phe Leu Asp 450 455 460 Arg Val Ala Thr Ser Val Leu Ala Thr Glu Gly Asp Gly Asn Trp Ile 465 470 475 480 Glu Tyr Ala Gly Gly Tyr Ser Asp Met Leu Ala Gln Arg His Gln Lys 485 490 495 Pro Leu Thr Thr Ala Ser Val Val Glu Asn Glu Pro Thr Lys Pro Lys 500 505 510 Glu Thr Thr Ala Ala Arg Gly Pro Thr Lys Lys Leu Ser Tyr Lys Asp 515 520 525 Gln Phe Ala Leu Asp Asn Leu Pro Lys Glu Met Glu Lys Leu Glu Ala 530 535 540 Gln Ala Ala Asn Cys Val Lys Asn Trp Gln Ile Gln Ile Tyr Met Glu 545 550 555 560 Lys Thr Pro Arg Ser Leu Arg Asn Phe Arg Leu Ile Tyr Arg Ser Ser 565 570 575 Lys Gln Ser Trp Gln Asn Leu Lys Asn Ala Gly Trp Asn Trp Lys 580 585 590 <210> 3 <211> 2160 <212> DNA <213> Gluconacetobacter entanii <220> <221> CDS <222> (331)..(2154) <400> 3 atcttgtggc caaggaattc atcgcagccc aggatcctga aaatcccggc gtgctgatcc 60 tctcccgcct tgccggggcg gcaaagcagc ttgaggccgc cctgctggtc aacccgctgg 120 atcatgacgg catggccgat gcgctggaac gcgcgctggc catgtcgccc gaggaacggc 180 gcgaacgctg gcaggcatgc tggaacagca ttgccaaccg tacggccctt ggctgggggc 240 tgtcgttcct gaacatcctt gaaaacgcga agcggcgtta agccccacac cagccttgcg 300 cacggggtgg ttgagaatac ataagtgggc atg gcc tca cct ccc ctt ctt ctc 354 Met Ala Ser Pro Pro Leu Leu Leu 1 5 ctt cag gat atc acc ctg acc ctt ggc ggc gcg ccg ctg ctc aat ggc 402 Leu Gln Asp Ile Thr Leu Thr Leu Gly Gly Ala Pro Leu Leu Asn Gly 10 15 20 gcg ggc ttc ggc gtt ggc cct ggc gag cgc gtc tgc ctt gtc ggg cgc 450 Ala Gly Phe Gly Val Gly Pro Gly Glu Arg Val Cys Leu Val Gly Arg 25 30 35 40 aat ggc tgt ggc aag tcc acc ctg ctg cgc atc gcg gcg ggt gag ata 498 Asn Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu Leu Arg Ile Ala Ala Gly Glu Ile 45 50 55 cag gcc gat gac ggc acc gtt ttt gtc cag ccc ggc acc acc gtg cgc 546 Gln Ala Asp Asp Gly Thr Val Phe Val Gln Pro Gly Thr Thr Val Arg 60 65 70 tac ctg ccg cag gaa ccc gac ctg tcg ggc ttt gac acc acg ctg gat 594 Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Asp Leu Ser Gly Phe Asp Thr Thr Leu Asp 75 80 85 tac gtc cgc gcg ggc atg ggg ccg ggc gac ccg gaa tac cgc gcc gaa 642 Tyr Val Arg Ala Gly Met Gly Pro Gly Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu 90 95 100 ctg ctg ctg acc gaa ctg ggg ctg aac ggc acg gaa gac ccg gcc acc 690 Leu Leu Leu Thr Glu Leu Gly Leu Asn Gly Thr Glu Asp Pro Ala Thr 105 110 115 120 ctg tcg ggc ggg gaa gcg cgg cgc tgc gcg ctg gcc cgc gcc ctt gcg 738 Leu Ser Gly Gly Glu Ala Arg Arg Cys Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ala 125 130 135 ccc gaa ccc gac ctg ctt ttg ctg gac gaa ccc acc aac cac ctg gac 786 Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp 140 145 150 atg ccc acc att gaa tgg ctg gaa cgt gaa ctg ctg tcg ctg tca tcg 834 Met Pro Thr Ile Glu Trp Leu Glu Arg Glu Leu Leu Ser Leu Ser Ser 155 160 165 gcc atg gtc atc ata agc cat gac cgc agg ctg ctg gaa acg ctg tcg 882 Ala Met Val Ile Ile Ser His Asp Arg Arg Leu Leu Glu Thr Leu Ser 170 175 180 cgt tcg gtc gtg tgg ctg gac cgg ggt gtc acc cgc agg ctg gat cag 930 Arg Ser Val Val Trp Leu Asp Arg Gly Val Thr Arg Arg Leu Asp Gln 185 190 195 200 ggc ttc gcc cgg ttc gag aca tgg cgc gag gaa gtg ctg gag cag gaa 978 Gly Phe Ala Arg Phe Glu Thr Trp Arg Glu Glu Val Leu Glu Gln Glu 205 210 215 gag cgc gac agc cac aag ctg gac cgc cag atc gcg cgt gag gaa gac 1026 Glu Arg Asp Ser His Lys Leu Asp Arg Gln Ile Ala Arg Glu Glu Asp 220 225 230 tgg atg cgt tac ggc gtg acc gcg cgg cgc aag cgc aat gtc cgc cgc 1074 Trp Met Arg Tyr Gly Val Thr Ala Arg Arg Lys Arg Asn Val Arg Arg 235 240 245 gtg gct gaa ctg gcc gaa ctg cgc aat acc cgt cgc acc gcc ata agg 1122 Val Ala Glu Leu Ala Glu Leu Arg Asn Thr Arg Arg Thr Ala Ile Arg 250 255 260 cag ccc ggc ggc ctg aag atg gaa gcc cgc gaa agc gac ctg tcg ggc 1170 Gln Pro Gly Gly Leu Lys Met Glu Ala Arg Glu Ser Asp Leu Ser Gly 265 270 275 280 aag ctg gtt gcg gtg gca gaa gat atg tca cgc gcc tat gac cct gcc 1218 Lys Leu Val Ala Val Ala Glu Asp Met Ser Arg Ala Tyr Asp Pro Ala 285 290 295 cac ccg gtg gtc agc cat ctg gac ctg cgt gtc ctg cgc ggg gac cgg 1266 His Pro Val Val Ser His Leu Asp Leu Arg Val Leu Arg Gly Asp Arg 300 305 310 ctg ggg atc gtg ggg gcc aat ggc gcg ggc aag agc acc ctg ctg cgc 1314 Leu Gly Ile Val Gly Ala Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Arg 315 320 325 ctg ctg acg gga ctg gac agg ccg gat tcc ggc acc atc aat atc ggc 1362 Leu Leu Thr Gly Leu Asp Arg Pro Asp Ser Gly Thr Ile Asn Ile Gly 330 335 340 agc gcg ctc aat gtc gtc aca ctg gac cag cag cgc cgc tcg ctt gat 1410 Ser Ala Leu Asn Val Val Thr Leu Asp Gln Gln Arg Arg Ser Leu Asp 345 350 355 360 ccc gac acc acg ctg gcg gat acg ctg acg ggc ggc ggc ggg gac atg 1458 Pro Asp Thr Thr Leu Ala Asp Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Asp Met 365 370 375 gtg cag gtt ggc aat gag aaa cgc cat gtc atc ggc tac atg aag gac 1506 Val Gln Val Gly Asn Glu Lys Arg His Val Ile Gly Tyr Met Lys Asp 380 385 390 ttc ctg ttc cgc ccc gaa cag gcg cgt acc ccg gtg ggc gtg ctg tcg 1554 Phe Leu Phe Arg Pro Glu Gln Ala Arg Thr Pro Val Gly Val Leu Ser 395 400 405 ggg ggg gag cgc tgg cgg ctc atg ctg gcc tgc gcg ctg gcg cgg ccg 1602 Gly Gly Glu Arg Trp Arg Leu Met Leu Ala Cys Ala Leu Ala Arg Pro 410 415 420 tcc aac ctg ctg gtg ctg gac gag ccg acc aac gac ctt gac ctt gaa 1650 Ser Asn Leu Leu Val Leu Asp Glu Pro Thr Asn Asp Leu Asp Leu Glu 425 430 435 440 acg ctc gac ctg ctg cag gac atg ctg gcc agc tat tcc ggc acg gtg 1698 Thr Leu Asp Leu Leu Gln Asp Met Leu Ala Ser Tyr Ser Gly Thr Val 445 450 455 ctg ctg gtc agc cat gac cgt gac ttc ctc gac cgg gtc gcc tcc tcc 1746 Leu Leu Val Ser His Asp Arg Asp Phe Leu Asp Arg Val Ala Ser Ser 460 465 470 atc ctg atg gcg gaa ggc ggc gga aag tgg gtg gaa tat gcc ggt ggc 1794 Ile Leu Met Ala Glu Gly Gly Gly Lys Trp Val Glu Tyr Ala Gly Gly 475 480 485 tac agc gac atg ctg gcc cag cgg cag gac gcc aca ctg gcc gcc cgc 1842 Tyr Ser Asp Met Leu Ala Gln Arg Gln Asp Ala Thr Leu Ala Ala Arg 490 495 500 ccc cgg cag gac cgc gcg gaa acc aca ccg gcc aga acc gat gtg acc 1890 Pro Arg Gln Asp Arg Ala Glu Thr Thr Pro Ala Arg Thr Asp Val Thr 505 510 515 520 ccg tcc tcc tcc ccc cgg cag ccc gcg cgc aag atg tcg tac aag gac 1938 Pro Ser Ser Ser Pro Arg Gln Pro Ala Arg Lys Met Ser Tyr Lys Asp 525 530 535 aag cac gcg ctg gaa cag cta ccc aag cag atg gcg gcg ctg gag acg 1986 Lys His Ala Leu Glu Gln Leu Pro Lys Gln Met Ala Ala Leu Glu Thr 540 545 550 gaa atc gag cgc ctg cgc gcc atc ctg tcc gac ggg ggc ctg tat gcg 2034 Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Ile Leu Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Ala 555 560 565 cgc gac ccc gcc acc ttt acg gcc gcc acc acg gcg ctg gaa aag gca 2082 Arg Asp Pro Ala Thr Phe Thr Ala Ala Thr Thr Ala Leu Glu Lys Ala 570 575 580 gag gcc gac ctg acg gcg gcg gaa gaa cgg tgg ctg gaa ctc gaa atg 2130 Glu Ala Asp Leu Thr Ala Ala Glu Glu Arg Trp Leu Glu Leu Glu Met 585 590 595 600 ctg cgc gag acg ctt cag tct tcc tgaacg 2160 Leu Arg Glu Thr Leu Gln Ser Ser 605 <210> 4 <211> 608 <212> PRT <213> Gluconacetobacter entanii <400> 4 Met Ala Ser Pro Pro Leu Leu Leu Leu Gln Asp Ile Thr Leu Thr Leu 1 5 10 15 Gly Gly Ala Pro Leu Leu Asn Gly Ala Gly Phe Gly Val Gly Pro Gly 20 25 30 Glu Arg Val Cys Leu Val Gly Arg Asn Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu 35 40 45 Leu Arg Ile Ala Ala Gly Glu Ile Gln Ala Asp Asp Gly Thr Val Phe 50 55 60 Val Gln Pro Gly Thr Thr Val Arg Tyr Leu Pro Gln Glu Pro Asp Leu 65 70 75 80 Ser Gly Phe Asp Thr Thr Leu Asp Tyr Val Arg Ala Gly Met Gly Pro 85 90 95 Gly Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu Leu Leu Leu Thr Glu Leu Gly Leu 100 105 110 Asn Gly Thr Glu Asp Pro Ala Thr Leu Ser Gly Gly Glu Ala Arg Arg 115 120 125 Cys Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ala Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Leu 130 135 140 Asp Glu Pro Thr Asn His Leu Asp Met Pro Thr Ile Glu Trp Leu Glu 145 150 155 160 Arg Glu Leu Leu Ser Leu Ser Ser Ala Met Val Ile Ile Ser His Asp 165 170 175 Arg Arg Leu Leu Glu Thr Leu Ser Arg Ser Val Val Trp Leu Asp Arg 180 185 190 Gly Val Thr Arg Arg Leu Asp Gln Gly Phe Ala Arg Phe Glu Thr Trp 195 200 205 Arg Glu Glu Val Leu Glu Gln Glu Glu Arg Asp Ser His Lys Leu Asp 210 215 220 Arg Gln Ile Ala Arg Glu Glu Asp Trp Met Arg Tyr Gly Val Thr Ala 225 230 235 240 Arg Arg Lys Arg Asn Val Arg Arg Val Ala Glu Leu Ala Glu Leu Arg 245 250 255 Asn Thr Arg Arg Thr Ala Ile Arg Gln Pro Gly Gly Leu Lys Met Glu 260 265 270 Ala Arg Glu Ser Asp Leu Ser Gly Lys Leu Val Ala Val Ala Glu Asp 275 280 285 Met Ser Arg Ala Tyr Asp Pro Ala His Pro Val Val Ser His Leu Asp 290 295 300 Leu Arg Val Leu Arg Gly Asp Arg Leu Gly Ile Val Gly Ala Asn Gly 305 310 315 320 Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Arg Leu Leu Thr Gly Leu Asp Arg Pro 325 330 335 Asp Ser Gly Thr Ile Asn Ile Gly Ser Ala Leu Asn Val Val Thr Leu 340 345 350 Asp Gln Gln Arg Arg Ser Leu Asp Pro Asp Thr Thr Leu Ala Asp Thr 355 360 365 Leu Thr Gly Gly Gly Gly Asp Met Val Gln Val Gly Asn Glu Lys Arg 370 375 380 His Val Ile Gly Tyr Met Lys Asp Phe Leu Phe Arg Pro Glu Gln Ala 385 390 395 400 Arg Thr Pro Val Gly Val Leu Ser Gly Gly Glu Arg Trp Arg Leu Met 405 410 415 Leu Ala Cys Ala Leu Ala Arg Pro Ser Asn Leu Leu Val Leu Asp Glu 420 425 430 Pro Thr Asn Asp Leu Asp Leu Glu Thr Leu Asp Leu Leu Gln Asp Met 435 440 445 Leu Ala Ser Tyr Ser Gly Thr Val Leu Leu Val Ser His Asp Arg Asp 450 455 460 Phe Leu Asp Arg Val Ala Ser Ser Ile Leu Met Ala Glu Gly Gly Gly 465 470 475 480 Lys Trp Val Glu Tyr Ala Gly Gly Tyr Ser Asp Met Leu Ala Gln Arg 485 490 495 Gln Asp Ala Thr Leu Ala Ala Arg Pro Arg Gln Asp Arg Ala Glu Thr 500 505 510 Thr Pro Ala Arg Thr Asp Val Thr Pro Ser Ser Ser Pro Arg Gln Pro 515 520 525 Ala Arg Lys Met Ser Tyr Lys Asp Lys His Ala Leu Glu Gln Leu Pro 530 535 540 Lys Gln Met Ala Ala Leu Glu Thr Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Ile 545 550 555 560 Leu Ser Asp Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Asp Pro Ala Thr Phe Thr Ala 565 570 575 Ala Thr Thr Ala Leu Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Thr Ala Ala Glu 580 585 590 Glu Arg Trp Leu Glu Leu Glu Met Leu Arg Glu Thr Leu Gln Ser Ser 595 600 605 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Discription of Artificial sequence: primer <400> 5 tgaacatcct tgaattcgcg aagcggcgtt 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Discription of Artificial sequence: primer <400> 6 acggatccag gcgtccggcc tgatcat 27

【００９６】

【配列表フリーテキスト】配列番号５：プライマー 配列番号６：プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰｓｔＩを用いてクローニングされたアセトバ
クター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と酢酸
耐性遺伝子の位置、及びｐＡＢＣ１への挿入断片とｐＵ
ＣＭＫ１８１への挿入断片の概略図。

【図２】ＥｃｏＲＩを用いてクローニングされたグルコ
ンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限
酵素地図と酢酸耐性遺伝子の位置、及びＡＢＣ１１への
挿入断片の概略図。

【図３】酢酸耐性遺伝子破壊株の各種有機酸含有培地で
の培養特性を示す図面。

【図４】アセトバクター・アセチ由来の酢酸耐性遺伝子
のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地の培養
経過を示す図面。

【図５】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の酢
酸耐性遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含
有培地の培養経過を示す図面。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
   るタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
   るタンパク質。
3. 【請求項３】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
   るタンパク質。
4. 【請求項４】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
   て、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付
   加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸耐性を有す
   るタンパク質。
5. 【請求項５】 以下の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤ
   ＮＡ。 (a)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０
   １〜２０７３からなるＤＮＡ。 (b)配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０
   １〜２０７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
   ＮＡ配列の一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢
   酸耐性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 以下の(a)又は(b)の塩基配列からなるＤ
   ＮＡ。 (a)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３
   １〜２１５４からなるＤＮＡ。 (b)配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３
   １〜２１５４からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該Ｄ
   ＮＡ配列の一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢
   酸耐性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３、４，５又は６に記載のＤＮＡ
   を細胞内に含む酢酸耐性を有する微生物又は前記酢酸耐
   性を有しかつその耐性が増強された微生物。
8. 【請求項８】 微生物がアセトバクター属、又はグルコ
   ンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請
   求項７に記載の微生物。
9. 【請求項９】 請求項７又は８に記載の微生物を、アル
   コールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成
   蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。 【０００１】