CN110172431A - 一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法 - Google Patents

一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法 Download PDF

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Abstract

发明先通过对晒醋中的杂菌进行分离纯化后，对分离出的菌种进行针对性培养和产气增粘实验后确认产气和增粘菌，并通过DNA提取和测序构建系统发育树，各菌株鉴定结果为：导致晒醋产气的微生物为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)，导致赤水新工艺晒醋粘度增加的4株微生物分别是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)。

Description

一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法。
背景技术
赤水晒醋历史悠久，风味独特，品质优良，享誉中外，是中华民族先祖留给我们的一块酿造艺术瑰宝。其主要特色为：采用百余种名贵中草药配方制作药曲；精选优质大米、糯米进行蒸煮，加入麦麸、小麦及醋曲，再与大米粥拌醅；醋醅室内发酵、装坛，长期室外日晒夜露；最后经浸淋、精酿、杀菌等共计三十六道工序得到最后产品，整个生产周期要经过两、三年以上。正是这一独特的酿造工艺使得赤水晒醋有着色、香、味为一体的独特风格。然而传统的赤水晒醋酿造工艺周期长，产量低，难以满足市场需求，因此部分企业对传统工艺进行了改进，以提高产量，但是工艺的改变也给产品质量带来了挑战，部分新工艺产品出现了产气、粘度增加等问题，不仅影响了产品质量安全，也给企业信誉和形象造成了损害，而且类似问题在其他食醋企业中也时有发生。因此进行食醋中污染杂菌的相关研究成为食醋行业较为迫切的问题，这对于保障食醋产品质量安全，促进食醋行业发展都具有积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法。
本发明一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，具体包括以下步骤：
(1)微生物分离：无菌条件下将产气和变粘稠的晒醋A稀释成10-1,吸取0.1-0.3ml，分别加入装有平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂和乳酸细菌培养基的培养皿中，用无菌涂布棒在培养及表面轻轻涂抹均匀，将培养皿密封，分别倒置于恒温培养箱和厌氧培养箱中，30℃温度下培养3-5天，以正常晒醋B同样接种到上述培养基中作为对照；
(2)纯化：选择菌落数在20-30之间的平板，用相应的固体培养基进行划线分离纯化3次，纯化后用相应斜面培养基在4℃温度下保存备用；
(3)杂菌筛选：将LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中并加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，选择正常的晒醋分装到试管中，加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，将分离纯化的微生物接种到装有培养基和晒醋的试管中，30℃培养3-5天，观察杜氏小管中是否有气泡和检测培养基的粘度，确定产气和增粘的主要微生物；
(4)形态观察和生理化测定：将筛选出的主要微生物进行菌落形态观察及个体形态观察，同时对筛选出的主要微生物进行生理生化实验；
(5)基因序列分析：提取实验菌株DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，在25μL标准反应体系中进行聚合酶连反应扩增；
(6)16S rDNA测序：将纯化后的目的基因进行测序，校正后构建系统发育树，具体确定菌株的种属。
本发明一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其中步骤(1)所述的培养基均购买获得。
本发明一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其中步骤(3)所述的黏度检测使用旋转黏度检测计检测。
本发明一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其中步骤(4)所述的生理生化实验包括：甲基红实验、过氧化氢酶酶实验、明胶液化实验、淀粉水解实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐实验、石蕊牛奶实验、葡萄糖发酵实验、木糖发酵实验、L-阿拉伯糖发酵实验、D-甘露醇发酵实验。
本发明一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其中步骤(5)所述的反应程序为95℃变性5分钟；95℃变性50秒，56℃复性50秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后于72℃延伸10分钟。
与现有技术相比，具有明显有益效果，从以上技术方案可知：本发明先通过对晒醋中的杂菌进行分离纯化后，对分离出的菌种进行针对性培养和产气增粘实验后确认产气和增粘菌，并通过DNA提取和测序构建系统发育树，各菌株鉴定结果为：导致晒醋产气的微生物N9为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)，导致赤水新工艺晒醋粘度增加的4株微生物分别是N3是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、N5为解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)、N7为索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、N11为酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)。
附图说明
图1菌落形态图；
图2菌株镜检图；
图3菌株芽孢染色图；
图4菌株N3基于16S rDNA建立的系统发育树；
图5菌株N5基于16S rDNA建立的系统发育树；
图6菌株N7基于16S rDNA建立的系统发育树；
图7菌株N9基于16S rDNA建立的系统发育树；
图8菌株N11基于16S rDNA建立的系统发育树。
具体实施方式
一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，具体包括以下步骤：
(1)微生物分离：无菌条件下将产气和变粘稠的晒醋A稀释成10-1,吸取0.2ml，分别加入装有平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂和乳酸细菌培养基的培养皿中，用无菌涂布棒在培养及表面轻轻涂抹均匀，将培养皿密封，分别倒置于恒温培养箱和厌氧培养箱中，30℃温度下培养4天，以正常晒醋B同样接种到上述培养基中作为对照如表1所示；
表1食醋中微生物的分离结果
注：“－”表示无菌长出，“cfu”为菌落数单位表示个/皿。
从表1可以看出，用营养琼脂培养基通过好氧和厌氧方式，从样品食醋A中分离出了微生物，说明样品A中含有细菌，有好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌；从样品食醋B中没有长出微生物，说明样品B中不含有细菌。样品食醋A、B在MRS培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、孟加拉红培养基中，通过好氧和厌氧培养方式，均没有分离出微生物，说明了在样品食醋A、B中不含有乳酸菌、放线菌、大肠杆菌、真菌；
从样品食醋A(产气，粘稠增加的食醋)中分离出细菌，从样品B(正常的食醋)中没有分离出微生物，猜测从食醋A中分离出的细菌是导致食醋产气、粘稠增加的微生物；
(2)纯化：选择菌落数在30之间的平板，用相应的固体培养基进行划线分离纯化3次，纯化后用相应斜面培养基在4℃温度下保存备用，将分离到的微生物经过转接纯化，共得到11株细菌，分别命名为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11；
(3)杂菌筛选：将LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中并加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，选择正常的晒醋分装到试管中，加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，将分离纯化的微生物接种到装有培养基和晒醋的试管中，30℃培养4天，观察杜氏小管中是否有气泡和检测培养基的粘度，确定产气和增粘的主要微生物：
接种在产气、粘稠增加验证培养基中，进行产气验证实验，实验结果如表2、表3和图1；
表2产气验证结果
注:“－”代表无产气现象，“+－”代表产气现象很弱，“+”代表有明显产气，小导管中的气泡越大，“+”的个数越多代表产气越明显即小。“d”代表天数。
表3晒醋粘稠增加验证结果
从表2可得，N1～N11这十一株菌中，只有接种了菌株N9的试管中产气了，其他的试管中均没有产气，随着时间的延长，接种了菌株N9的试管中产气也不断增多，而其他菌株的试管还是不产气,又从接种了菌株N9的试管中分离出了N9菌株，说明导致食醋产气的微生物就是N9菌株了；
从表3可以看出，接种了N1～N11菌株的培养基粘度都增加了，其中，接种了N3、N5、N7、N9、N11菌株的培养基粘度增加很明显，增加了30.17％～39.66％；接种了其他的菌株的培养基的粘度幅度均小于10％，N3、N5、N7、N9、N11菌株明显使食醋粘度增加，说明导致食醋粘度增加的主要菌株是N3、N5、N7、N9、N11菌株，并主要针对菌株N3、N5、N7、N9、N11这5株菌株进行鉴定、分析；
(4)形态观察和生理化测定：将筛选出的主要微生物进行菌落形态观察及个体形态观察如图1所示，同时对筛选出的主要微生物进行生理生化实验；
(5)基因序列分析：提取实验菌株DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，在25μL标准反应体系中95℃变性5分钟；95℃变性50秒，56℃复性50秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后于72℃延伸10分钟，进行聚合酶连反应扩增；
(6)DNA测序：将纯化后的目的基因进行测序，校正后构建系统发育树如图4-8所示，具体确定菌株的种属。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，具体包括以下步骤：
（1）微生物分离：无菌条件下将产气和变粘稠的晒醋A稀释成10-1,吸取0.1-0.3ml，分别加入装有平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂和乳酸细菌培养基的培养皿中，用无菌涂布棒在培养及表面轻轻涂抹均匀，将培养皿密封，分别倒置于恒温培养箱和厌氧培养箱中，30℃温度下培养3-5天，以正常晒醋B同样接种到上述培养基中作为对照；
（2）纯化：选择菌落数在20-30之间的平板，用相应的固体培养基进行划线分离纯化3次，纯化后用相应斜面培养基在4℃温度下保存备用；
（3）杂菌筛选：将LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中并加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，选择正常的晒醋分装到试管中，加入杜氏小管，在121℃温度下湿热灭菌20分钟，将分离纯化的微生物接种到装有培养基和晒醋的试管中，30℃培养3-5天，观察杜氏小管中是否有气泡和检测培养基的粘度，确定产气和增粘的主要微生物；
（4）形态观察和生理化测定：将筛选出的主要微生物进行菌落形态观察及个体形态观察，同时对筛选出的主要微生物进行生理生化实验；
（5）基因序列分析：提取实验菌株DNA，以提取的DNA为模板，利用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3’）和反向引物1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），在25μL标准反应体系中进行聚合酶连反应扩增；
（6）16S rDNA测序：将纯化后的目的基因进行测序，校正后构建系统发育树，具体确定菌株的种属。
2.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养基均购买获得。
3.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（3）所述的黏度检测使用旋转黏度检测计检测。
4.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（4）所述的生理生化实验包括：甲基红实验、过氧化氢酶酶实验 、明胶液化实验 、淀粉水解实验 、硝酸盐还原实验 、柠檬酸盐实验 、石蕊牛奶实验 、葡萄糖发酵实验 、木糖发酵实验 、L-阿拉伯糖发酵实验 、D-甘露醇发酵实验。
5.如权利要求1所述的一种分离、鉴定晒醋杂菌的方法，其特征在于：步骤（5）所述的反应程序为95℃变性5分钟；95℃变性50秒，56℃复性50秒，72℃延伸90秒，30个循环，最后于72℃延伸10分钟。
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