WO2004081216A1 - 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子 - Google Patents

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Shigeru Nakano
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    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a protein having a growth-promoting function derived from a microorganism, a microorganism having an amplified copy number thereof, and particularly to a gene belonging to the genus Acetobacter and the genera Gluconacetobacter.
  • the present invention relates to an acetic acid bacterium and a method for efficiently producing vinegar containing a high concentration of acetic acid using these microorganisms.
  • Acetic acid bacteria are microorganisms widely used in the production of vinegar, and in particular, acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter and the genus Dalcon acetic acid are used for industrial acetic acid fermentation.
  • acetic acid fermentation In acetic acid fermentation, ethanol in the culture medium is oxidized by acetic acid bacteria and converted to acetic acid, which results in the accumulation of acetic acid in the medium, which is also inhibitory for acetic acid bacteria and accumulates acetic acid. As the amount increases and the acetic acid concentration in the medium increases, the growth ability and fermentation ability of acetic acid bacteria gradually decrease.
  • the period from the start of fermentation until the actual growth of acetic acid bacteria actually starts and the accumulation of acetic acid tends to become longer as the acetic acid concentration increases. is there.
  • Patent Document 2 JP-A-60-9488
  • Patent Document 3 JP-A-60-9489
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application No. 2003-350265
  • Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 2
  • Non-Patent Document 3
  • Non-Patent Document 4 “Agricaltural and Biological Chemistry”, Vol. 52, p. 3125—3129, 1988 Non-Patent Document 4:
  • Non-Patent Document 5 “Agricultural and Biological Chemistry J” Vol. 49, p. 20 91-209 7, 1 985 Non-Patent Document 5::
  • Non-Patent Document 6 (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry ;, 58 p. 974-975, Non-Patent Document 6:
  • Non-Patent Document 7
  • Non-Patent Document 8
  • Non-Patent Document 9
  • the present inventors isolated a novel alcohol dehydrogenase gene encoding a protein capable of improving the growth promoting function at a practical level according to the present invention.
  • the purpose was to breed acetic acid bacteria having a better growth promoting function, and to provide a method for efficiently producing vinegar having a higher acetic acid concentration using the acetic acid bacteria.
  • A a protein ADH having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence obtained by substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, and having alcohol dehydrogenase activity Protein ADH.
  • a gene comprising the DNA of (A), (B) or (C) below.
  • microorganism (7) The microorganism according to (6), wherein the microorganism is an acetic acid bacterium of the genus Acetobacter or the genus Dalcon acetopector.
  • a method for producing vinegar which comprises culturing the microorganism according to (6) or (7) in a medium containing alcohol, and producing and accumulating acetic acid in the medium.
  • the present invention it is possible to impart and enhance a growth promoting function to a microorganism.
  • a microorganism having an alcohol oxidizing ability, in particular, an acetic acid bacterium the induction period for growth is significantly shortened, and the ability to efficiently accumulate a high concentration of acetic acid in a medium can be imparted.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a restriction enzyme map and the like of a gene fragment (p P 1) derived from Dalconacetopactor enthanii.
  • FIG. 2 is a diagram showing the culture process of a transformant in which the copy number of the NAD-dependent alcohol dehydrogenase gene derived from Dalconacetopactor entanii was amplified.
  • FIG. 3 is a view showing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of a protein encoded by a NAD-dependent alcohol dehydrogenase gene derived from Dalconacetopactor entanii.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of primer 1.
  • FIG. 5 is a diagram showing the nucleotide sequence of primer 2.
  • the present invention will be described in detail.
  • This application claims the priority of Japanese Patent Application 2003-66697, filed on March 12, 2003, and includes the contents described in the description and Z or drawings of the patent application. .
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for finding a growth-promoting gene from acetic acid bacteria.As a result, a chromosomal DNA library of acetic acid bacteria was constructed, and this chromosomal DNA library was transformed into acetic acid bacteria.
  • a growth-promoting gene from acetic acid bacteria by screening for a strain that requires 4 days to grow on an agar medium in the presence of 1% acetic acid and a gene that allows growth on the same medium in 3 days.
  • adh gene a novel alcohol dehydrogenase gene that can improve the growth promotion function at a practical level from acetic acid bacteria of the genus Dalconacetopactor, which is actually used in vinegar production. Crawling) And succeeded for the first time.
  • the obtained adh gene was homologously searched in DDB J / EMB L / Genbank and SWI SS-PROT / PIR, and as a result, the adh P gene found in Escheirchia coli was found in Escheirchia coli. It has a certain degree of homology to a group of proteins produced by the adh A gene of Shinorhizobium nieliloti, etc., and was presumed to be the alcohol dehydrogenase gene (adh gene) of acetic acid bacteria. .
  • the adh gene of the present invention has an extremely low homology of 6.4% at the amino acid sequence level with the adh gene of acetic acid bacterium (Acetobacter polyoxogenes) reported so far (for example, see Non-Patent Document 1). And a large difference in the expected molecular weight, confirming that it is clearly different from the adh gene as a membrane protein reported so far.
  • the adh P gene of Escherichia coli has a homology of 39% at the amino acid sequence level, and the adh A gene of Shinorhizobium meliloti (Shinorhizobium meliloti) has 56% homology at the amino acid sequence level. Since the degree of sex was extremely low, a new gene coding for a novel protein (sometimes called protein ADH) specific to acetic acid bacterium, although somewhat similar to the adh gene of other prokaryotes, It was confirmed to be a gene.
  • a novel protein sometimes called protein ADH
  • the alcohol-dehydrogenase activity is increased about 54-fold in the copy number-amplified transformant produced by linking the adh gene to a plasmid vector and transforming it into acetic acid bacteria. It was confirmed that the gene encodes a protein having alcoholic dehydrogenase activity of acetic acid bacteria.
  • the DNA of the present invention has a certain degree of homology with the adh gene of Escherichia coli and the like, and has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 which can improve the growth promoting function. It includes a base sequence capable of encoding alcohol dehydrogenase, and includes elements for preparing the base sequence, and a structural portion of the gene.
  • the DNA of the present invention can be obtained from the chromosome DNA of Dalcon acetopactor 'Gentonaii (Gluconacetobacter entanii) as follows.
  • the dalconacetopactor 'enthanii for example, the strain Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) (accession number F ERM BP-491, dated February 23, 1984
  • a chromosomal DNA library is prepared from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (deposited at 1-6-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan).
  • the chromosomal DNA is obtained by an ordinary method (for example, see Patent Document 3).
  • chromosomal DNA library is prepared.
  • chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme to obtain a mixture of various fragments.
  • restriction enzymes can be used by adjusting the degree of cleavage by adjusting the cleavage reaction time.
  • Sau3AI acts on chromosomal DNA at a temperature of 30 ° C or more, preferably about 37 ° C, and an enzyme concentration of 1 to 10 units Zm1 for various times (1 minute to 2 hours). Digest. In the examples described later, P st I was used.
  • the cut chromosomal DNA fragment is ligated to a vector DNA capable of autonomous replication in acetic acid bacteria to prepare a recombinant vector.
  • a restriction enzyme that generates a terminal base sequence complementary to the restriction enzyme PstI used for cutting chromosomal DNA, for example, PstI at a temperature of 37 ° C and an enzyme concentration of 1 to 100 units 1 below, it is allowed to act on the vector DNA for at least one hour to completely digest it and cleave it.
  • an acetic acid bacterium usually required for 4 days for growth in the presence of 1% acetic acid on an agar medium, for example, Acetobacter.
  • DNA of the present invention examples include a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Among them, the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers from 359 to 1390 is a coding region.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (FIG. 3: corresponding to nucleotide numbers 359 to 1390) is obtained from DDB J / EMBL / Genbank and SWI SS-PROT /
  • a homologous search in PIR revealed that the adh P gene of Escheirchia coli was 39% at the amino acid sequence level, and the adh P gene of Shinorhizobium 'melorlotti (Shinorhizobium moliloti) was 56% at the amino acid sequence level. It was presumed that they were genes encoding the protein ADH, but they all had low homology of less than 60% and were clearly different from these genes.
  • Shinorhizobium moliloti Shinorhizobium moliloti
  • the adh gene was obtained from Acetobacter polyoxogenes (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the adh gene corresponds to the amino acid sequence of the encoded protein.
  • the homology with the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleotide sequence consisting of nucleotides 359-1390 is as low as only 6.4%, which is clearly different from the known adh gene, The adh gene was evident.
  • nucleotide sequence of the DNA of the present invention Since the nucleotide sequence of the DNA of the present invention has been clarified, for example, an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence using genomic DNA of acetic acid bacterium Dalcon acetopactor entanii as type III is used. It can also be obtained by volimerase-chain reaction (PCR reaction) used as a primer, or by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence as a probe.
  • PCR reaction volimerase-chain reaction
  • Oligonucleotide synthesis can be performed, for example, using various commercially available DNA synthesizers. And can be synthesized according to a conventional method.
  • the PCR reaction was performed using a Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bayo, Inc.) using a thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems. ) Or KOD—P 1 us— (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • the DNA encoding the protein ADH having a growth promoting function of the present invention may comprise one or several amino acids at one or more positions, as long as the alcohol dehydrogenase activity and the growth promoting function of the encoded protein ADH are not impaired. May be any as long as it encodes a protein with a deletion, substitution, insertion, or addition, or inversion.
  • the DNA encoding the protein ADH which is substantially the same as the alcohol dehydrogenase having such a growth-promoting function, can be obtained by deletion, substitution, insertion, It can also be obtained by adding or modifying the base sequence as an inversion.
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • amino acid sequence of a protein and the nucleotide sequence encoding it are slightly different between species, strains, mutants, and variants, so DNA encoding substantially the same protein is used.
  • DNA encoding substantially the same protein is used.
  • acetobacterium of the genus Acetobacter ⁇ dalconacetopactor or acetic acid bacterium of the genus Acetobacter ⁇ dalconacetopactor, or a naturally-occurring mutant or variant thereof, such as,
  • a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 359 to 1390 or the nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence number 359 to 1390 DNA that encodes a protein having a function to enhance acetic acid resistance by hybridizing under stringent conditions with DNA comprising a nucleotide sequence that can serve as a probe prepared from a portion of DNA encoding a protein substantially identical to the protein is obtained.
  • the stringent condition here is a so-called special condition.
  • nucleic acids with high homology for example, DNAs with 70% or more homology
  • hybridize and have lower homology for example, DNAs with 70% or more homology.
  • the acetic acid bacterium of the present invention refers to a bacterium belonging to the genus Acetobacter and the genus Dalconacetopactor, and includes aceto1, bacterium bacterium, and bacterium belonging to the genus Dalconaceta with enhanced acetic acid resistance.
  • bacterium belonging to the genus Acetobacter include Acetobacter aceti (Acetobacter aceti No. 1023) (Acetobacter aceti No. 1023) (Patent Organism Depositary Center).
  • FERM BP-22887 Acetobacter aceti subsp. Zylinum IFO 3288 (Acetobacter aceti subsp. Xylinum IF03288), acetobacter aceti IF ⁇ 283 (Acetobactor aceti IFO3283) .
  • examples of the bacterium belonging to the genus Dalconacetopactor include, for example, the dalconacetobacter. 1.
  • Euronoeus DSM 610 (Gluconacetobacter europaeus DSM6160) strain, and the dalconacetopactor 'Gentonaii (Gluconacetobacter entanii).
  • An example is Acetobacter altoacetigenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain, which is deposited as FE RM BP-491 at the deposit center.
  • the enhancement of the growth promoting function can be attained, for example, by amplifying the intracellular copy number of the adh gene, or by linking a DNA fragment containing the structural gene of the gene to a promoter sequence that functions efficiently in Acetobacter bacteria.
  • the recombinant DNA is used to transform an Acetobacter bacterium.
  • the promoter sequence of the gene on the chromosomal DNA may be replaced with another promoter sequence that functions efficiently in acetic acid bacteria of the genus Acetobacter or the genus Dalcon, such as E. coli plasmid pBR322 (Takara Bio Inc.).
  • Ampicillin resistance Sex genes, the kanamycin resistance gene of Plasmid pHSG298 (Takara Bio Inc.), the gloram phenolicol resistance gene of Plasmid pHSG396 (Takara Bio Inc.), and the gene for ⁇ -galactosidase gene transfer It can also be enhanced by replacing it with a promoter sequence derived from a microorganism other than acetic acid bacteria, such as a promoter.
  • Amplification of the intracellular copy number of the gene can be carried out by introducing a multicopy vector carrying the gene into cells of Acetobacter acetic acid bacteria. That is, it can be carried out by introducing a plasmid, transposon, or the like that retains the gene into cells of an acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or the genus dalconacetopactor.
  • Examples of the multicopy vector include pMV24 (for example, see Non-Patent Document 2), pGI18 (for example, see Patent Document 4), and pUF106 (for example, Non-Patent Document 9).
  • examples of transposons include Mu and IS 1452.
  • the introduction of DNA into acetic acid bacteria of the genus Acetobacter dalconacetobacter is carried out by the calcium chloride method (for example, see Non-Patent Document 4) or the electoporation method (for example, see Non-Patent Document 5). be able to.
  • the transformant is a recombinant plasmid comprising at least a DNA fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the transformant is an acetic acid bacterium-E. Coli shuttle vector (multicopy vector) pMV24. Plasmid pADH1 into which this DNA fragment has been inserted, and this plasmid pADH1 are added to Acetobacter aceti No. 1023 (FERMBP-22887). It can be obtained by introducing.
  • the copy number of the adh gene has been amplified, and as a result, the acetic acid bacterium belonging to the genus Acetobacter or the genus Dalcon acetopactor, which has a selective enhancement of the reproduction promoting function, has an alcohol oxidizing ability.
  • the vinegar having a high concentration of acetic acid can be efficiently produced by culturing the vinegar having the acetic acid in an alcohol-containing medium and producing and accumulating acetic acid in the medium.
  • the acetic acid fermentation in the production method of the present invention may be performed in the same manner as in the conventional vinegar production method by the fermentation method of acetic acid bacteria.
  • the medium used for acetic acid fermentation may be a synthetic medium or a natural medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and ethanol and, if necessary, contains an appropriate amount of a nutrient required by the strain used for growth. But it's fine.
  • the carbon source examples include various carbohydrates such as glucose-sucrose, and various organic acids.
  • a natural nitrogen source such as peptone or a fermentation cell digest can be used.
  • Cultivation is performed under aerobic conditions such as stationary culture, shaking culture, and aeration / agitation culture, and the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C, and usually 30 to 30 ° C. Perform in.
  • the pH of the medium is usually in the range of 2.5 to 7, preferably in the range of 2.7 to 6.5, and can be adjusted with various acids, various bases, buffers and the like.
  • a high concentration of acetic acid accumulates in the medium after culturing for 1 to 21 days.
  • the acetic acid concentration of vinegar by this method is 10 ⁇ : I 3%.
  • Chromosomal DNA was prepared from the obtained cells by a chromosomal DNA preparation method (for example, see Patent Document 3).
  • the chromosome DNA obtained as described above was partially digested with the restriction enzyme PstI (manufactured by Takara Bio Inc.), and the E. coli monoacetic acid shuttle vector pMV24 was completely digested with the restriction enzyme PstI and cut. These DNAs are mixed in an appropriate amount, and ligated using a ligation kit (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2, manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a chromosome DNA library of Dalconacetopactor enteranii. One built.
  • the chromosome DNA library of Darcon Aseptobacter entaniii obtained as described above is required to grow on an agar medium usually containing 1% acetic acid for 4 days.
  • the strain was transformed into 23 strains and cultured at 30 ° C. for 3 days on a YPG agar medium containing 1% acetic acid and 100 ⁇ m of Zm1 ampicillin.
  • the colonies formed on day 3 were inoculated and cultured in YPG medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin, and plasmid was recovered from the obtained cells.
  • the PstI fragment has been cloned and this plasmid was named pPl. Further, a fragment that allows the Acetobacter aceti No.
  • the fragmented PstI fragment was inserted into the PstI site of pUC19, and the nucleotide sequence of the fragment was determined by Sanger's didoxy-chain termination method. The nucleotide sequence described in 1 was determined. Sequencing is performed on the entire region of both DNA strands, and all breaks overlap. It was done.
  • Example 2 Effect of shortening the induction period in a transformant transformed with a gene having a growth-promoting function derived from Dalconacetopactor .enthanii (1) Transformation into Acetopactor acetii
  • Figure 1 shows the restriction enzyme map of the gene fragment (pPl) derived from Dalcon acetate vector, cloned using PstI, the location of the gene having a growth promoting function, and the inserted fragment into pADH1. Is shown.
  • the PCR method was specifically performed as follows. Specifically, the genomic DNA of Acetobacter.Altoacetigenes MH-24 strain was used as the ⁇ type, and primers 1 (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 4)) and Primer 1 (the base sequence Using SEQ ID NO: 4 (shown in FIG. 5)), PCR was carried out using KOD-P 1 us-(manufactured by Toyobo Co., Ltd.) under the following PCR conditions.
  • This pADH1 was transformed into Acetobacter aceti No. 123 strain by the electroporation method (for example, see Non-patent Document 5). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 1% acetic acid.
  • Plasmids were extracted and analyzed by a standard method for ampicillin-resistant transformants grown on selective media for 3 days. It was confirmed that Sumi was held.
  • the ampicillin-resistant transformant having the plasmid pADH1 obtained as described above was grown on a YPG medium supplemented with acetic acid, and was transformed into the original strain Acetobacter containing only the shuttle vector pM24. Comparison with Asechi No. 1023 strain.
  • shaking culture 150 rpm was performed at 30 ° C in a 100 ml YPG medium containing 3% acetic acid, 3% ethanol, and 100 ⁇ g / m1 ampicillin.
  • the growth of the transformed strain and the original strain in an acetic acid-containing medium were compared by measuring the absorbance at 660 nm.
  • the transformed strain grew faster in the transformed medium supplemented with 3% acetic acid and 3% ethanol than in the original strain Acetobacter 'Aceti No. 1023.
  • the effect of enhancing the growth promoting function of the gene was confirmed.
  • Non-Patent Document 6 25 mM sodium phosphate buffer to the reaction system of 1 m 1 (p H 7. 5 ), 500 mM ethanol, comprises 1. 5 mM NA D +, adding an appropriate amount of cell lysate The absorbance at 340 nm was measured at 25 ° C. The activity was defined as 1 U of 1 imolNADH produced per minute.
  • the membrane-bound alcohol dehydrogenase is diverted to the method of acetic acid bacteria (for example, see Non-Patent Document 7), and the membrane-bound aldehyde dehydrogenase activity is degraded to the method of acetic acid bacteria (for example, see Non-patent Document 8). It measured according to each. The results are shown in Table 1.
  • the transformed strain is a membrane-bound alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrated.
  • the activity of the enzyme was at the same level as that of the original strain Acetobacter p.Acetii No. 1023, but the transformed strain was about 54 times higher in NAD-dependent alcohol dehydrogenase activity, and the cloned gene was It was confirmed that the adh gene encodes NAD-dependent alcohol dehydrogenase.
  • the ampicillin-resistant transformed strain having the plasmid pADH1 obtained in Example 2 was compared with the original strain Acetobacter aceti No. 1023 having only the shuttle vector pMV24 for acetic acid fermentation ability.
  • YPG containing 1% of acetic acid, 4% of ethanol and 100 g / m1 of ampicillin was prepared using a 5 L mini-jar (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc .; KM J-5A).
  • the medium was subjected to aeration and stirring culture at 30 ° C, 400 rpm, and 0.20 vvm, and fermentation was performed until the acetic acid concentration reached 3%.
  • Acetobacter Phanoletoacetogenes MH-24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) strain (FERM BP—49 1) was used to express a gene having a growth promoting function using KOD-P 1 us-(manufactured by Toyobo Co., Ltd.). After the amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme SmaI, the amplified DNA fragment was digested with the acetic acid bacterium-E. Coli shuttle vector pGI18 (see, for example, Patent Document 4), and the amplified DNA fragment was Was introduced to produce plasmid pADH2. The outline of the amplified fragment inserted into pADH2 is shown in FIG.
  • Figure 1 shows the restriction enzyme map of the gene fragment ( ⁇ ⁇ ⁇ ) derived from Dalconacetobacter entannii cloned using PstI, the location of the gene having a growth promoting function, and the fragment inserted into pADH2. Show.
  • the PCR method was specifically performed as follows. Specifically, genomic DNA of the strain Acetobacter altoacetigenes MH_24 was used as type I, and primers 1 (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 4)) and Primer 1 (the base sequence 4 (shown in Fig. 5)), and PCR was performed using KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) under the following PCR conditions.
  • the ⁇ 1 method was carried out for 30 cycles, each cycle consisting of 94 ° ⁇ 15 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 68 ° C 1 minute.
  • This PADH2 was transformed into an acetopactor 'Altoacetigenes MH-24 strain by the electroporation method (for example, see Non-patent Document 5). Transformants were selected on YPG agar medium supplemented with 100 ⁇ g Zm1 of ampicillin, 4% acetic acid, and 3% ethanol.
  • Plasmid was extracted from the ampicillin-resistant transformant grown on the selection medium by a conventional method and analyzed, and it was confirmed that the transformant retained the plasmid carrying the adh gene.
  • the ampicillin-resistant transformant having the plasmid pADH2 obtained in (1) was compared with the original strain Acetobacter p. Altasetigenes MH-24 strain having only the shuttle vector pGI18 for acetic acid fermentation ability. Specifically, using a 5 L mini jar (manufactured by Mitsui Chemicals, Inc .; KMJ-5A), containing 2.5 g of ampicillin 100 gZm1, 2.5 L of a feed medium (acetic acid 7%, ethanol 3%, Culture with aeration and agitation at 500 ° C. and 0.20 v vm at 30 ° C. was performed using yeast extract 0.2% and glucose 0.2%).
  • Example 5 acetic acid fermentation test of transformed strain transformants conversion at a dh genes from Dar con ⁇ Seto Park Tha Entanii
  • Plasmid was extracted from the ampicillin-resistant transformant grown on the selection medium by a conventional method and analyzed, and it was confirmed that the plasmid retained the plasmid containing the gene for enhancing acetate resistance.
  • a novel gene involved in acetic acid resistance is provided, and a breeding strain capable of producing vinegar having a higher acetic acid concentration with high efficiency can be obtained by using the gene. Furthermore, a method for producing vinegar with a high acetic acid concentration with high efficiency was provided. Sequence listing free text

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Description

明 細 書 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子 技術分野
本発明は、 微生物に由来する増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遣 伝子、 これのコピー数を増幅した微生物、 特にァセトパクター属 (Acetobacter) 及ぴダルコンァセトパクター属 (Gluconacetobacter) に属する酢酸菌、 及びこ れらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関 する。 背景技術
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、 特にァセトパクター属 及びダルコンァセトパクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されて いる。
酢酸発酵では、 培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換さ れ、 その結果、 酢酸が培地中に蓄積することになるが、 酢酸は酢酸菌にとっても 阻害的であり、 酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢 酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
特に、 発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、 酢酸の蓄積が確認で きるようになるまでの期間、 すなわち増殖誘導期は、 酢酸濃度が高くなればなる ほど長くなる傾向がある。
そのため、 酢酸発酵においては、 高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短くする ことが求められており、 その一手段として、 発酵液中に P Q Q ( 4 , 5—ジヒ ド ロー 4， 5—ジォキソ一 1 H—ピロ口 [ 2 , 3— f ] キノリン _ 2 , 7 , 9ート リカルボン酸） を添加して増殖を促進し、 いわゆる増殖誘導期を短縮する方法が 報告されている (例えば、 特許文献 1参照)
しかし、 P Q Qを大量に入手することは難しく、 かつ、 高価であるため、 工業 的な規模での実施には障害がつきまとうなどの問題があったことから、 酢酸菌の 増殖を促進して、 いわゆる増殖誘導期を短縮できる機能を有するタンパク質をコ ードする遺伝子 （増殖促進遺伝子） をクローユングし、 その増殖促進遺伝子を用 いて酢酸菌を育種、 改良することが試みられてきた。
しかし、 これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子については、 全く分離されたこと がなく、 このような実情から、 酢酸菌の増殖を実用レベルで促進し、 増殖誘導期 を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖促進遺伝子の分離、 及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖機能を有する酢酸菌を育種するこ とが望まれていた。 特許文献 1 ：特開昭 6 1— 585 84号広報
特許文献 2 ：特開昭 60— 9488号公報
特許文献 3 ：特開昭 6 0— 948 9号公報
特許文献 4 ：特願 2003— 350265号明細書
非特許文献 1 ：
「パイォキミカ 'アト 'パイオフィジカ 'ァクタ （Biochimica et Biophysica Acta) 」 ， 1 08 8卷， p. 292— 300， 1 99 1年
非特許文献 2 ：
「アプライ ド · ォブ · エンバイロメ ト ' アンド ' マイク口バイオロジー ^Applied of Environment and Microbiology)」， 5 5 ， p. 1 7 1— 1 76， 1 98 9年
非特許文献 3 ：
「ァグリカルチュラル'アンド 'バイオロジカル'ケミストリ一 (Agricaltural and Biological Chemistry) 」 ， 52卷， p. 3 1 25— 3 1 29, 1 988年 非特許文献 4 ：
「ァグリカルチュラル'アンド 'バイオ口ジカル ·ケミストリー (Agricaltural and Biological Chemistry) J ' 49卷, p. 20 9 1 - 209 7, 1 98 5年 非特許文献 5 ： ：
「バイオサイエンス ·バイオテクノ口ジー 'アンド 'バイオケミストリー
(Bioscience, Biotechnology and Biochemistry;， 58 p.974— 975， 非特許文献 6 ：
「ユーロビアン'ジャーナノレ'ォブ 'バイオケミストリー (European Journal of Biochemistry) 」 ， 254卷， p.3 5 6— 36 2， 1 998年
非特許文献 7 ：
「メソッド 'イン 'ェンザィモ口ジー (Methods in Enzymology.) J , 8 9 卷， p. 450 -45 7, 1 9 82年
非特許文献 8 ：
「メソッド ·イン ·ェンザィモ口ジー (Methods in Enzymology.) 」 ， 89 卷， p. 49 1 -49 6, 1 9 82年
非特許文献 9 ：
「セルロース （Cellulose) 」 ， p. 1 5 3— 1 58、 1 98 9年 発明の開示
前述のとおり、 これまでに酢酸菌の増殖促進機能を遺伝子レベルで解明し、 高 レ、増殖促進機能を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。 そ こで、 本発明者らは、 本発明により実用レベルで増殖促進機能を向上させ得るタ ンパク質をコードする新規なアルコール脱水素酵素遺伝子を分離すること、 この アルコール脱水素酵素遺伝子を用いてより優れた増殖促進機能を有する酢酸菌を 育種すること、 この酢酸菌を用いて、 より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する 方法を提供することを目的とした。
本発明者らは、 酢酸存在下でも増殖し、 発酵することができる酢酸菌には、 他 の微生物には存在しない特異的な増殖促進遺伝子が存在するとの仮説を立て、 こ. うした遺伝子を用いれば、 従来以上に微生物の増殖促進機能を向上させることが でき、 さらには高濃度の酢酸を含有する食酢を従来よりも効率的に製造する方法 を開発することが可能になるとの新規着想を得、 本発明を完成するに至った。 即ち、 本発明は次のとおりである。
(1) 下記の （A) 、 又は （B) に示すタンパク質 ADH。
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 ADH。 (B) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ァ ルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 A D H。
(2) 下記の (A) 、 又は （B) に示すタンパク質 AD Hをコードする遗伝子の DNA。
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 ADH。
(B) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位とされたァミノ酸配列からなり、 かつ、 ァ ルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 A D H。
(3) 下記の （A) 、 (B) 又は （C) の DNAからなる遺伝子。
(A) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜 1 390からな る塩基配列を含む DNA。
(B) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜 1 3 90の塩基 配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと、 ストリジヱントな条 件下でハイブリダィズし、 かつ、 アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 ADHをコードする DNA。
(C) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜1 390の塩基 配列からなる D N Aの一部から作製したプローブとなり うる塩基配列からなる D NAと、 ストリジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 アルコール脱水素 酵素活性を有するタンパク質 ADHをコードする DNA。
(4) (2) 又は （3) に記載の DNAを含む組換えベクター。
(5) (4) に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(6) (2) 又は （3) に記載の DNAの細胞内でのコピー数が増幅されたこと により、 アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
(7) 微生物がァセトパクター属又はダルコンァセトパクター属の酢酸菌である ことを特徴とする （6) に記載の微生物。
(8) (6) 又は （7) に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し、 該培地 中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
(9) (8) に記載の方法により得られる酉乍酸を高濃度に含む食酢。 ( 1 0 ) 酢酸濃度が 1 0〜 1 3 %である （ 9 ) に記載の食酢。
本発明によれば、 微生物に対して、 増殖促進機能を付与し増強することができ る。 そして、 アルコール酸化能を有する微生物、 特に酢酸菌においては、 増殖誘 導期が顕著に短縮し、 培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与する ことができる。 図面の簡単な説明
図 1はダルコンァセトパクター♦ェンタニイ由来の遺伝子断片 ( p P 1 ) の制 限酵素地図等の概略図である。
図 2はダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の N A D依存型アルコール脱 水素酵素遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。 図 3はダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の N A D依存型アルコール脱 水素酵素遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) を示す図 である。
図 4はプライマー 1の塩基配列を示す図である。
図 5はプライマー 2の塩基配列を示す図である。 以下、 本発明を詳細に説明する。 なお、 本願は 2003年 3月 12日に出願された 日本国特許出願 2003-66697の優先権を主張するものであり、 該特許出願の明細 書及ぴ Z又は図面に記載される内容を包含する。 本発明者らは、 酢酸菌から増殖促進遺伝子を見出す方法について、 鋭意研究を 行った結果、 酢酸菌の染色体 D N Aライブラリーを構築し、 この染色体 D N Aラ ィブラリ一を酢酸菌に形質転換し、 通常寒天培地上で 1 %の酢酸の存在下で生育 に 4日必要な株を、 同培地上で 3日での生育を可能にする遺伝子をスクリーニン グすることによつて酢酸菌から増殖促進遺伝子を分離する方法を開発した。 この方法によって、 実際に食酢製造に用いられているダルコンァセトパクター 属の酢酸菌から、 増殖促進機能を実用レベルで向上させうる新規なアルコール脱 水素酵素遺伝子 （以下、 a d h遺伝子ということもある） をクローユングするこ とに初めて成功した。
得られた a d h遺伝子は、 DDB J /EMB L/G e n b a n k及び SWI S S - P R OT/P I Rにおいてホモロジ一検索した結果、 大腸菌 (Escheirchia coli) で見出されている a d h P遺伝子ゃシノ リゾビゥム · メ リ 口ッティ (Shinorhizobium nieliloti) の a d h A遺伝子などによって生産される一群のタ ンパク質とある程度の相同性を有しており、 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝 子 （a d h遺伝子） であると推定された。
但し、本発明の a d h遺伝子は、これまでに報告されている酢酸菌（Acetobacter polyoxogenes) の a d h遺伝子 （例えば、 非特許文献 1参照） とは、 アミノ酸配 列レベルで 6. 4%の極めて低い相同性であり、 また予想される分子量にも大き な違いがあることから、 これまでに報告されている膜タンパク質としての a d h 遺伝子とは明らかに異なるものであることが確認された。
また、 大腸菌の a d h P遺伝子とはァミノ酸配列レベルで 3 9 %の、 またシノ リゾビゥム 'メリロッティ （Shinorhizobium meliloti) の a d h A遺伝子とはァ ミノ酸配列レベルで 56 %の相同性であり、 その相同性の程度は極めて低いもの であったことから、他の原核生物の a d h遺伝子とはある程度は似ているものの、 酢酸菌に特異的な新規タンパク質 （タンパク質 ADHということもある） をコー ドする新規遺伝子であることが確認された。
本発明において、 a d h遺伝子をプラスミ ドベクターに連結して酢酸菌に形質 転換して作製した、 コピー数を増幅させた形質転換株においては、 アルコール脱 水素酵素活性が約 54倍に増大し、 該遺伝子が酢酸菌のアルコール脱水素酵素活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
さらに、 エタノール存在下で通気培養した場合に、 酢酸発酵能、 特に增殖促進 機能が著しく向上し、 誘導期が短縮されて、 高酢酸濃度の食酢を効率的に製造で きることなどを見出し、 本発明を完成するに至った。
以下、 本発明を詳細に説明する。
(1) 本発明の DNA
本発明の DNAは、 大腸菌などの a d h遺伝子とある程度の相同性を有し、 且 つ増殖促進機能を向上させうる配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する アルコール脱水素酵素をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、 及び該遺伝子の構造部分を含む。
本発明の DNAは、 ダルコンァセトパクター 'ェンタニイ (Gluconacetobacter entanii) の染色体 D N Aから次のようにして取得することができる。
まず、 ダルコンァセトパクター 'ェンタニイ、 例えばァセ卜パクター · アルト ァセチゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) 株 （受託番号 F ERM B P— 49 1で、 1984年 2月 23'日付 （原寄託） で独立行政法人 産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託されている）の染色体 DNAライブラリ一を調製する。なお、 染色体 DNAは、 常法 （例えば、 特許文献 3参照） により取得する。
次に得られた染色体 D N Aからアルコール脱水素酵素遺伝子を単離するために、 染色体 DNAライプラリーを作製する。 まず、 染色体 DNAを適当な制限酵素で 部分分解して種々の断片混合物を得る。 切断反応時間などを調節して切断の程度 を調節すれば、 幅広い種類の制限酵素が使用できる。 例えば、 S a u 3 A Iを温 度 30°C以上、 好ましくほ 37°C、 酵素濃度 1〜1 0ュニット Zm 1で様々な時 間 （1分〜 2時間） 、 染色体 DNAに作用させてこれを消化する。 なお、 後記実 施例では P s t Iを用いた。
次いで、 切断された染色体 DNA断片を、 酢酸菌内で自律複製可能なベクター DNAに連結し、 組換えベクターを作製する。 具体的には、 染色体 DNAの切断 に用いた制限酵素 P s t Iと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、 例え ば P s t Iを温度 37°C、 酵素濃度 1〜 100ュニット 1の条件下で、 1時 間以上ベクター DN Aに作用させてこれを完全消化し、 切断開裂する。
次に、 上記のようにして得た染色体 DN A断片混合物と切断開裂されたべクタ 一 DNAを混合し、 これに T4DNAリガーゼを温度 4〜 1 6°C、 酵素濃度 1〜 100ユニット/ m 1の条件下で 1時間以上、 好ましくは 6〜 24時間作用させ て組換えベクターを得る。
得られた組換えベクターを用いて、 通常は寒天培地上で 1 %濃度の酢酸の存在 下では増殖に 4 日必要な酢酸菌、 例えばァセ トパクター . ァセチ 1 0 2 3
(Acetobacter aceti No.1023) 株 （受託番号 F ERM BP— 2287で、 1 9 8 3年 6月 2 7日付 （原寄託） で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物 寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に寄託されて いる） を形質転換し、 その後 1 %酢酸含有寒天培地に塗布し、 3日間培養する。 生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、 得られる菌体からプラスミ ドを回 収することで a d h遗伝子を含む D N A断片を得ることができる。
本発明の DNAとして、 具体的には、 配列表の配列番号 1の塩基配列を有する DNAが挙げられるが、 その内、 塩基番号 3 5 9〜1 390からなる塩基配列は コーディング領域である。
配列表の配列番号 1に示す塩基配列もしくは配列番号 2に示すァミノ酸配列 (図 3 ：塩基番号 3 5 9〜： 1 390に対応） は、 DDB J/EMBL/G e n b a n k及び SWI S S—PROT/P I Rにおいてホモロジ一検索したところ、 大腸菌（Escheirchia coli)の a d h P遺伝子とはァミノ酸配列レベルで 3 9 %の、 またシノリゾビゥム 'メリロッティ （Shinorhizobium moliloti) の a d h A遺伝 子とはアミノ酸配列レベルで 56%の相同性を示し、 タンパク質 ADHをコード する遺伝子であることが推定されたが、いずれも 6 0%以下の低い相同性であり、 これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
さらに、酢酸菌ァセトパクター 'ポリオキソゲネス（Acetobacter polyoxogenes) から a d h遺伝子を取得したことが報告されている （例えば、非特許文献 1参照） が、 この場合の a d h遺伝子はそのコ一ドするタンパク質のアミノ酸配列と塩基 番号 3 5 9〜 1 390からなる塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列 との相同性はわずか 6. 4%と非常に低く、 既知の a d h遺伝子とは明らかに異 なり、 酢酸菌の新規な a d h遺伝子であることが明白であった。
本発明の DNAはその塩基配列が明らかとなったので、 例えば、 鎳型として酢 酸菌ダルコンァセトパクター .ェンタニイのゲノム DN Aを用い、 該塩基配列に に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるボリメラーゼ-チ エーン 'リアクション (P CR反応) によって、 または該塩基配列に基づいて合成 したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによつ ても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、 例えば、 市販されている種々の DNA合成機を 用いて定法に従って合成できる。 また、 P CR反応は、 アプライ ドバイオシステ ムズ社 （Ap p l i e d B i o s y s t em s) 製のサーマルサイクラ一 G e n e Am p P CR S y s t em 9 700を用い、 T a qDNAポリメラ ーゼ （タカラバイォ社製) や K O D— P 1 u s — （東洋紡績社製） などを使用し て、 定法に従って行なうことができる。
本発明の増殖促進機能を有するタンパク質 ADHをコードする DNAは、 コー ドされるタンパク質 A D Hのアルコール脱水素酵素活性や増殖促進機能が損なわ れない限り、 1又は複数の位置で 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 又 は付加された、 あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであればいず れでも良い。
このような増殖促進機能を有するアルコール脱水素酵素と実質的に同一のタン パク質 ADHをコードする DNAは、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の 部位のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入又は付加し、 あるいは逆位として塩基配列を 改変することによつても取得され得る。また、上記のような改変された DNAは、 従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、 種間、 株間、 変異体、 変種間でわずかに異なることが知られているので、 実質的 に同一のタンパク質をコードする DNAは、 酢酸菌全般、 中でもァセトパクター 属ゃダルコンァセトパクター属の種、 株、 変異体、 変種から得ることが可能であ る。
具体的には、 ァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌、 又は変 異処理したァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌、 これらの自 然変異株若しくは変種から、 例えば配列表の配列番号 1に記載の塩基配列の塩基 配列番号 3 5 9〜1 3 90からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなる DN A 又は塩基配列番号 3 59〜1 390からなる塩基配列 DN Aの一部から作製した プローブとなりうる塩基配列からなる DNAと、 ストリンジヱントな条件下でハ イブリダィズし、 酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする DN Aを単離することによつても、 該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコー ドする DNAが得られる。 ここでいうストリンジェントな条件とは、 いわゆる特 異的なハイプリッドが形成され、 非特異的なハイプリッドが形成されない条件を いう。 この条件を明確に数値化することは困難であるが、 一例を示せば、 相同性 が高い核酸同士、 例えば 70%以上の相同性を有する DN A同士がハイブリダィ ズし、 それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、 あるいは通 常のハイブリダイゼーシ.ョンの洗浄条件、 例えば 1 X S S Cで 0 · 1 % S D Sに 相当する塩濃度にて 6 0°Cで洗浄が行われる条件などが挙げられる。
(2) 本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はァセトパクター属及ぴダルコンァセトパクター属の細菌を指 し、 酢酸耐性が増強されたァセ 1、パクター厲細菌及びダルコンァセ卜パクター属 細菌である。
ァセ トパクター属の細菌と して具体的には、 ァセ トパクター . ァセチ (Acetobacter aceti) が挙げられ、 ァセトパクター · ァセチ N o . 1 0 2 3 (Acetobacter aceti No.1023) 株 （特許生物寄託センターに F E RM B P— 2 28 7として寄託） 、 ァセトパクター .ァセチ 'サブスピーシーズ 'ザイリナム I F O 3288 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IF03288) 株、 ァセトバタ ター 'ァセチ I F〇 3 28 3 (Acetobactor aceti IFO3283) 株が挙げられる。 また、 ダルコンァセトパクター属の細菌としては、 例えば、 ダルコンァセトバ クタ一 . ユウロ ノ ェウス D S M 6 1 6 0 ( Gluconacetobacter europaeus DSM6160) 株、 ダルコンァセ トパクター ' ェンタニイ （Gluconacetobacter entanii) が挙げられ、 現在特許生物寄託センターに F E RM B P— 49 1とし て寄託されているァセトパクター'アルトアセチゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) 株が例示される。
増殖促進機能の増強は、 例えば a d h遺伝子の細胞内のコピー数を増幅するこ と、 又は、 該遺伝子の構造遺伝子を含む DNA断片をァセトパクター属細菌中で 効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換え DN Aを用いて、 ァセトバクター属細菌を形質転換することによって行われる。
また、 染色体 D N A上の該遺伝子のプロモータ一配列を、 ァセトパクター属ゃ ダルコンァセトパクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモータ一配列、 例えば大腸菌のプラスミ ド p B R 322 (タカラバイオ社製） のアンピシリン耐 性遺伝子、 プラスミ ド pHSG 298 (タカラバイオ社製） のカナマイシン耐性 遺伝子、 プラスミ ド pHSG 3 96 (タカラバイオ社製） のグロラムフヱニコー ル耐性遺伝子、 β一ガラクトシダーゼ遣伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、 酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによつても増強す ることができる。
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、 該遺伝子を保持するマルチコピーべクタ 一をァセトパクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。 すなわち、 該遗伝子を保持するプラスミ ド、 トランスポゾン等をァセトパクター 属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうこ とができる。
マルチコピーベクター （酢酸菌ー大腸菌シャトルベクター） としては、 pMV 24 (例えば、 非特許文献 2参照） 、 p G I 1 8 (例えば、 特許文献 4参照） 、 p UF 1 06 (例えば、 非特許文献 9参照） 、 p TA500 1 (A) 、 p TA 5 00 1 (B) (例えば、 特許文献 2参照） などが挙げられ、 染色体組み込み型べ クタ一である pMVL l (例えば、 非特許文献 3参照） も挙げられる。 また、 ト ランスポゾンとしては、 Muや I S 1 45 2などが挙げられる。
ァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢酸菌への DN Aの導入は、 塩化カルシュゥム法 （例えば、 非特許文献 4参照） やエレクト口ポレーシヨン法 (例えば、 非特許文献 5参照） 等によって行うことができる。
形質転換体は少なくとも配列表の配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA断 片を含んでなる組換えプラスミ ドであって、 例えば、 酢酸菌ー大腸菌シャトルべ クタ一 （マルチコピーベクター） pMV 24にこの DNA断片を挿入してなるプ ラスミ ド p A D H 1、及びノ又は、このプラスミ ド p ADH 1をァセ卜バタター · ァセチ （Acetobacter aceti) No. 1 0 23 (F E RM B P - 228 7) に導 入することによりえられる。
アルコール酸化能を有するァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢 酸菌において、上記のようにしてそのアルコール脱水素酵素活性を増大させると、 増殖促進機能が増強され、 誘導期が短縮されて、 高濃度の酢酸を含有する食酢を 効率良く生産することができる。 (3) 食酢製造法
上記のようにして、 a d h遺伝子のコピー数が増幅されたことにより、 增殖促 進機能が選択的に増強されたァセトパクター属ゃダルコンァセトパクター属の酢 酸菌であってアルコール酸化能を有するものを、 アルコール含有培地で培養し、 該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、 高濃度の酢酸を含有する食酢を 効率よく製造することができる。
本発明の製造法における酢酸発酵は、 従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造 法と同様にして行なえば良い。 酢酸発酵に使用する培地としては、 炭素源、 窒素 源、 無機物、 エタノールを含有し、 必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養 源を適当量含有するものであれば、 合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、 グルコースゃシユークロースをはじめとする各種炭水化物、 各種有機酸が挙げられる。 窒素源としては、 ペプトン、 発酵菌体分解物などの天 然窒素源を用いることができる。
また、 培養は、 静置培養法、 振とう培養法、 通気攪拌培養法等の好気的条件下 で行ない、 培養温度は 20〜 40 °C、 好ましくは 25〜 3 5 °C、 通常は 30 で 行なう。 培地の pHは通常 2. 5〜7の範囲であり、 2. 7〜6. 5の範囲が好 ましく、 各種酸、 各種塩基、 緩衝液等によって調整することもできる。 通常 1〜 2 1日間の培養によって、 培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。 この方法による食 酢の酢酸濃度は 1 0〜： I 3 %である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を実施例により具体的に説明する。
(実施例 1) ダルコンァセトパクター ·ェンタニイからの増殖促進機能を有する 遺伝子のクローニングと塩基配列及ぴアミノ酸配列の決定
(1) 染色体 DNAライブラリ一の作製
グノレコンァセトパクター ·ェンタニイ ( Gluconacetobacter entanii) の 1株で あるァセトパクター 'アルトアセ トゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetige nes MH-24) 株 （ F E RM B P— 49 1) を 6 %酢酸、 4 %ェタノールを添加 した YPG培地 （3%グルコース、 0. 5%酵母エキス、 0. 2%ポリペプトン ) で 30°Cにて振とう培養を行なった。 培養後、 培養液を遠心分離 （7， 500 X g、 1 0分） し、 菌体を得た。 得られた菌体より、 染色体 DNA調製法 （例え ば、 特許文献 3参照） により、 染色体 DNAを調製した。
上記のようにして得られた染色体 D N Aを制限酵素 P s t I (タカラバイオ社 製） で部分消化し、 また大腸菌一酢酸菌シャトルベクター pMV24を制限酵素 P s t Iで完全消化して、 切断した。 これらの DNAを適量ずつ混合し、 ライゲ ーシヨンキット （T a Ka R a DNA L i g a t i o n K i t V e r . 2、 タカラバイオ社製) を用いて連結してダルコンァセトパクター ·ェンタニイ の染色体 DNAライブラリ一を構築した。
(2) 増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたダルコンァセトパクター ·ェンタニイの染色体 DN Aライブラリ一を、 通常は 1 %酢酸を含有する寒天培地上で増殖に 4日間必要な ァセトパクター 'ァセチ N o . 1 0 23株に形質転換し、 1%酢酸、 1 00 μ § Zm 1のアンピシリンを含む YP G寒天培地にて、 30°Cで 3日間培養した。 3日で生じたコロニーを 1 00 μ g/m 1のアンピシリン含む YPG培地に接種 して培養し、得られた菌体からプラスミ ドを回収したところ、図 1に示した約 1. 7 k b pの P s t I断片がクローン化されており、 このプラスミ ドを p P lと命 名した。 さらに 1%酢酸を含有する YPG寒天培地でァセトパクター ·ァセチ N o . 1 023株を 3日間で生育可能にする断片は、 p P 1にクローン化された約 1. 7 k b pの P s t I断片中の約 1. 2 k b pの B g 1 I断片であることが確 認できた。
このようにして通常は 1 %酢酸を含有する寒天培地上で増殖に 4日間必要なァ セトパクター ·ァセチ N o . 102 3株を、 1 %酢酸含有寒天培地において 3日 間で増殖を可能にする遺伝子断片を取得した。
(3) クローン化された DN A断片の塩基配列の決定
上記のク口一ン化された P s t I断片を pUC l 9の P s t I部位に挿入し、 該断片の塩基配列を、 サンガーのダイデォキシ ·チェ一ン ·ターミネーション法 によって決定した結果、 配列番号 1に記載した塩基配列が決定された。 配列決定 は両方の DN A鎖の全領域について行ない、 切断点は全てオーバーラップする様 にして行なった。
配列番号 1記載の塩基配列中には、 塩基番号 3 5 9から塩基番号 1 3 90にか けて、 配列番号 2に記載したような 344個のアミノ酸 （図 3) をコードするォ —プンリーディング 'フレームの存在が確認された。
(実施例 2) ダルコンァセトパクター .ェンタニイ由来の増殖促進機能を有する 遺伝子で形質転換した形質転換株での誘導期の短縮効果 (1) ァセトパクター ·ァセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたァセトパクター ·アルトアセトゲネス MH —24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) 株 （FERM B P— 49 1) 由来 の増殖促進機能を有する遺伝子を、 KOD— P l u s— （東洋紡績社製） を用い て P CR法により増幅し、 増幅した DN A断片を酢酸菌一大腸菌シャトルべクタ 一 PMV24 (例えば、 非特許文献 2参照） の制限酵素 S ma I切断部位に挿入 したプラスミ ド pADHlを作製した。 p ADH 1に挿入された増幅断片の概略 を図 1に示した。 図 1は P s t Iを用いてクローニングされたダルコンァセトバ クタ一 ·ェンタ -ィ由来の遺伝子断片 （p P l) の制限酵素地図と増殖促進機能 を有する遺伝子の位置、 及び p ADH 1への挿入断片を示す。
P CR法は具体的には次のようにして実施した。 すなわち、 铸型としてァセト パクター .アルトアセチゲネス MH— 24株のゲノム DN Aを用い、 プライマー としてプライマー 1 (その塩基配列を配列番号 3 (図 4) に示す） 及びプライマ 一 2 (その塩基配列を配列番号 4 (図 5) に示す） を用いて、 KOD— P 1 u s - (東洋紡績社製） を使用し、 下記する PC R条件にて PC Rを実施した。
すなわち、 じ1 法は94¾ 1 5秒、 60°C 30秒、 6 8 °C 1分を 1サイ クルとして、 30サイクル実施した。
この p ADH 1をァセトバクタ一'ァセチ N o . 1 02 3株にエレク トロポレ ーシヨン法 （例えば、 非特許文献 5参照） によって形質転換した。 形質転換株は 1 00 μ g/m 1のアンピシリン及び 1 %の酢酸を添加した Y P G寒天培地で選 択した。
選択培地上で 3日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、 定法に よりプラスミ ドを抽出して解析し、 増殖促進機能を有する遺伝子を保有するブラ スミ ドを保持していることを確認した。
(2) 形質転換株の増殖促進機能
上記のようにして得られたプラスミ ド p ADH 1を有するアンピシリン耐性の 形質転換株について、 酢酸を添加した Y P G培地での生育を、 シャ トルベクター pM 24のみを導入した元株ァセ卜バクター ·ァセチ N o . 1 023株と比較 した。
具体的には、 酢酸 3 %、 ェタノール 3 %とアンピシリン 1 00 μ g /m 1を含 む 1 00 m 1の Y P G培地にて、 30°Cで振とう培養 ( 1 5 0 r p m)を行ない、 形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を 6 60 nmにおける吸光度を測定す ることで比較した。
その結果、 第 2図に示すように、 形質転換株では 3%酢酸と 3%エタノールを 添加した培地において、 元株ァセトパクター 'ァセチ N o . 1 023株よりも形 質転換株の方が早く増殖することが確認でき、 該遺伝子の増殖促進機能の増強効 果が確認できた。
(3) 形質転換株と元株の各種酵素活性
プラスミ ド p ADH 1を有するアンピシリン耐性の形質転換株と、 シャトルべ クタ一 pMV24のみを導入した元株ァセトパクター .ァセチ No. 1 02 3株 で NAD依存型アルコール脱水素酵素活性をバクテリアの方法 （例えば、 非特許 文献 6参照） を変法して測定した。 具体的には、 1 m 1の反応系に 25 mMリン 酸ナトリウム緩衝液 （p H 7. 5) 、 500 mMエタノール、 1. 5 mM NA D +を含み、 適当量の細胞破砕液を添加し、 2 5°Cで 340 nmの吸光度を測定 した。 活性は 1分あたりの 1 imolNADH生成量を 1 Uとした。 また、 膜結合 型アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法 （例えば、 非特許文献 7参照） 、 膜結合 型アルデヒ ド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法 （例えば、 非特許文献 8参照） にそ れぞれ準じて測定した。 その結果を表 1に示した。
Figure imgf000016_0001
元株 0. 1 7 2. 1 7 8. 6 3 形質転換株 9. 1 9 1. 82 7. 0 1 表 1の結果より、 形質転換株は膜結合型のアルコール脱水素酵素、 アルデヒ ド 脱水素酵素の活性は元株ァセトパクター ·ァセチ No. 1 0 2 3株と同レベルで あつたが、 NAD依存型のアルコール脱水素酵素活性については形質転換株が約 54倍高く、 クローユングされた遺伝子は NAD依存型アルコール脱水素酵素を コードしている a d h遺伝子であることが確認された。
(実施例 3 ) ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の a d h遣伝子で形質転 換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例 2で得られたプラスミ ド p AD H 1を有するァンピシリン耐性の形質転 換株について、 シャトルベクター pMV 24のみを有する元株ァセトパクター · ァセチ No. 1 023株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、 5 Lのミニジャー （三ッヮ理化学工業社製； KM J— 5 A) を用 いて、 酢酸 1%、 エタノール 4%、 アンピシリン 1 00 g/m 1を含む 2. 5 Lの YPG培地にて、 30°C、 400 r pm、 0. 20 v v mの通気攪拌培養を 行ない、 酢酸濃度 3 %まで発酵させた。 その後、 70 OmLの培養液をミニジャ 一中に残して培養液を取り出し、 残った 700m 1に対して酢酸、 エタノール、 アンピシリン 1 00 g/m 1を含む 1.8 Lの YP G培地を添加して、酢酸 3 %、 エタノール 4%の濃度に調整し、 再び酢酸発酵を開始させ、 途中培地中のエタノ ール濃度が 1 %を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続し て、 形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。 その結果を表 2にまとめた。 表 2
Figure imgf000017_0001
表 2の結果から、 形質転換株の方が、 増殖誘導期が顕著に短縮され、 効率的に 酢酸発酵を行えることが確認できた。
(実施例 4) ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の a d h遺伝子で形質転 換した形質転換株の酢酸発酵試験
( 1 ) ァセトパクター 'アルトアセチゲネスへの形質転換
ァセトパクター 'ァノレトァセトゲネス MH— 24 (Acetobacter altoacetigenes MH-24) 株 （FERM B P— 4 9 1) 由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、 KOD-P 1 u s - (東洋紡績社製） を用いて P CR法により増幅し、 増幅した DNA断片を酢酸菌ー大腸菌シャ トルベクター p G I 1 8 (例えば、 特許文献 4 参照） を制限酵素 Sma Iで切断した後、 その部位に、 増幅した DNA断片を揷 入してプラスミ ド pADH2を作製した。 p ADH 2に挿入された増幅断片の概 略を図 1に示した。 図 1は P s t Iを用いてクローニングされたダルコンァセト パクター ·ェンタニイ由来の遺伝子断片 （ρ ρ ι) の制限酵素地図と増殖促進機 能を有する遺伝子の位置、 及び p ADH 2への揷入断片を示す。
P CR法は具体的には次のようにして実施した。 すなわち、 铸型としてァセト パクター ·アルトアセチゲネス MH_ 24株のゲノム DNAを用い、 プライマー としてプライマー 1 (その塩基配列を配列番号 3 (図 4) に示す） 及びプライマ 一 2 (その塩基配列を配列番号 4 (図 5) に示す） を用いて、 KOD—P l u s— (東洋紡績社製） を使用し、 下記する PC R条件にて PC Rを実施した。
すなわち、 ？〇1 法は94°〇 1 5秒、 60°C 30秒、 6 8 °C 1分を 1サイ クルとして、 30サイクル実施した。
この PADH2をァセトパクター 'アルトアセチゲネス MH— 24株にエレク トロポレーシヨン法 （例えば、 非特許文献 5参照） によって形質転換した。 形質 転換株は 100 μ gZm 1のアンピシリン及ぴ 4%の酢酸、 3%のエタノールを 添加した Y P G寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、 定法によりプ ラスミ ドを抽出して解析し、 a d h遺伝子を保有するプラスミ ドを保持している ことを確認した。
(2) 形質転換株の酢酸発酵試験
(1) で得られたプラスミ ド p ADH2を有するアンピシリン耐性の形質転換 株について、 シャトルベクター p G I 18のみを有する元株ァセ卜パクター .ァ ルトァセチゲネス MH— 24株と酢酸発酵能を比較した。 具体的には、 5 Lのミニジャー （三ッヮ理化学工業社製； KMJ— 5 A) を用 いて、 アンピシリン 1 00 gZm 1を含む 2. 5 Lの原料培地 （酢酸 7%、 ェ タノール 3 %、 酵母エキス 0.2 %、 グルコース 0.2%) にて、 30°C 5 00 r p m 0. 20 v vmの通気攪拌培養を行なった。 菌体の明らかな増殖が認め られ、残留エタノール濃度が 2 %になった段階で、ェタノール含有液（酢酸 1% エタノール 5 0%、 酵母エキス 0.2%、 グルコース 0.2%) を流加し、 発酵液 のエタノール濃度が 2%になるように制御した。 この酢酸発酵をさせる方法で、 形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。 その結果を表 3にまとめた。
^€ o
Figure imgf000019_0001
表 3の結果から、 形質転換株の方が、 最終到達酸度において顕著にすぐれてい ることが確認できた。
(実施例 5) ダルコンァセトパクター ·ェンタニイ由来の a d h遺伝子で形質転 換した形質転換株の酢酸発酵試験
( 1 ) ァセトパクター · ァセチ ·サブスピーシズ .ザィリナムへの形質転換 実施例 4で得られたプラスミ ド p ADH 2をァセトパクター ·ァセチ ·サブス ピ一シズ'ザイリナム （Acetobacter aceti subsp. xylinum) の 1株であるァセト パクター.ァセチ.サプスピーシズ.ザィリナム I F03288 (Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288) 株にエレクトロポレーション法 （非特許文献 5参照） によって形質転換した。 形質転換株は 1 00 μ g/m 1のアンピシリンを添加し た Y P G寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、 定法によりプ ラスミ ドを抽出して解析し、 酢酸耐性増強遺伝子を保有するプラスミ ドを保持し ていることを確認した。
(2) 酢酸発酵試験 ( 1 ) で得られたプラスミ ド p A D H 2を有するアンピシリン耐性の形質転換 株について、 シャトルベクター p G I 1 8のみを導入した元株ァセトパクター · ァセチ 'サブスピーシズ 'ザィリナム I F O 3 2 8 8株と酢酸発酵能を比較した。 具体的には、 米糖化液を 1 7 . 9 %、 発酵諸味を 3 . 2 %、 醸造用アルコール を 7 . 8 %、 水を 7 1 . 1 %の割合で混合して作成した原料培地 （アルコール濃 度 7 . 8 %、 酢酸濃度 0 . 2 6 % ) を用いて、 5 Lのミニジャー （三ッヮ理化学 工業社製； KM J - 5 A) において、 3 0。C、 5 0 0 r p m、 0 . 2 0 v v mの 通気攪拌培養を行ない、 酢酸濃度 7 . 3 %での連続発酵を行なった。 酢酸濃度 7 . 2 %の連続発酵での原料培地の添加速度を比較し、 その結果を表 4に示した。 ま た、 形質転換株の原料培地添加速度を元株の酢酸濃度 7 . 3 %での連続発酵時の 原料培地添加速度に合わせた場合の酢酸発酵能を比較し、 その結果を表 4に示し た。
表 4
Figure imgf000020_0001
表 4、 及び表 5の結果から、 形質転換株の方が、 連続酢酸発酵においても、 生 産性 （原料培地添加速度） と生産酢酸濃度においても顕著にすぐれていることが 確認できた。 本発明で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として組み 入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、 さらに該遺伝子 を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することがで き、 該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供でき た。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ： プライマー
配列番号 4 ： プライマー

Claims

請求の範囲
1. 下記の (A) 、 又は （B) に示すタンパク質 ADH。
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 ADH。
(B) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 アル コール脱水素酵素活性を有するタンパク質 A DH。
2. 下記の (A) 、 又は (B) に示すタンパク質 A D Hをコードする遗伝子 の DNA。
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 AD H。
(B) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ァ ルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 ADH。
3. 下記の （A) 、 (B) 又は （C) の DNAからなる遺伝子。
(A) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜 1 3 9 0からな る塩基配列を含む DNA。
(B) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜1 390の塩基 配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと、 ストリジェントな条 件下でハイプリダイズし、 かつ、 アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 ADHをコードする DNA。
(C) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 3 5 9〜1 3 90の塩基 配列からなる D N Aの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなる D NAと、 ス トリジ工ントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 アルコール脱水素 酵素活性を有するタンパク質 A D Hをコードする D N A。
4. 請求項 2又は請求項 3に記載の DNAを含む組換えベクター。
5. 請求項 4に記載の組換えべクターを含む形質転換体。
6. 請求項 2又は請求項 3に記載の DNAの細胞内でのコピー数が増幅さ れたことにより、 アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
7. 微生物がァセトパクター属又はダルコンァセトパクター属の酢酸菌で あることを特徴とする請求項 6に記載の微生物。
8 . 請求項 6又は請求項 7に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し, 該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
9 . 請求項 8に記載の方法により得られる酢酸を高濃度に含む食酢。
1 0 . 酢酸濃度が 1 0〜 1 3 %である請求項 9に記載の食酢。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006230329A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
WO2007100036A1 (ja) * 2006-03-03 2007-09-07 Mizkan Group Corporation 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP4551978B1 (ja) * 2010-05-12 2010-09-29 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
CN110628662A (zh) * 2019-07-29 2019-12-31 贵州亮欢寨生物科技有限公司 一株醋酸杆菌及其应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8901268B2 (en) * 2004-08-03 2014-12-02 Ahila Krishnamoorthy Compositions, layers and films for optoelectronic devices, methods of production and uses thereof
CN101603044B (zh) * 2008-06-10 2012-05-23 上海医药工业研究院 一种乙醇脱氢酶及其基因和重组酶
US8557877B2 (en) 2009-06-10 2013-10-15 Honeywell International Inc. Anti-reflective coatings for optically transparent substrates
CA2784903A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Alcohol dehydrogenases (adh) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
JP2014505059A (ja) 2011-01-18 2014-02-27 ジェネラル アトミクス ヒドロラーゼ酵素基質およびその使用
US8864898B2 (en) 2011-05-31 2014-10-21 Honeywell International Inc. Coating formulations for optical elements
WO2015151216A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 キユーピー 株式会社 酵素剤
JP6803842B2 (ja) 2015-04-13 2020-12-23 ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッドＨｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． オプトエレクトロニクス用途のためのポリシロキサン製剤及びコーティング
CN117820472B (zh) * 2024-03-05 2024-05-10 南京诺唯赞医疗科技有限公司 p-Tau 181特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61205475A (ja) * 1985-03-08 1986-09-11 Nakano Vinegar Co Ltd 高濃度食酢の製造方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0669368B2 (ja) 1983-06-29 1994-09-07 輝彦 別府 酢酸菌の形質転換方法
JPS609488A (ja) 1983-06-29 1985-01-18 Teruhiko Beppu 酢酸菌ベクタ−
JPS6158584A (ja) 1984-08-30 1986-03-25 Ube Ind Ltd 細胞増殖促進剤及び細胞増殖促進方法
JP2571119B2 (ja) * 1988-03-08 1997-01-16 株式会社中埜酢店 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法
JP3968918B2 (ja) 1998-07-30 2007-08-29 味の素株式会社 酢酸菌のキシリトールデヒドロゲナーゼ及びその遺伝子
CN2437691Y (zh) 2000-06-10 2001-07-04 云南爱地生物技术研究所 一种快速酿醋生物反应器
GB0024554D0 (en) * 2000-10-06 2000-11-22 Agrol Ltd Ethanol production
JP2005110597A (ja) 2003-10-09 2005-04-28 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌由来の新規プラスミドとその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61205475A (ja) * 1985-03-08 1986-09-11 Nakano Vinegar Co Ltd 高濃度食酢の製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADACHI O.: "Shinki hokoso pqq to sanka hakko no shintenkai", VITAMIN, vol. 76, no. 2, 2002, pages 65 - 77, XP002986820 *
See also references of EP1602728A4 *
TAMAKI T. ET AL: "NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE MEMBRANE-BOUND ALDEHYDE DEHYDROGENASE GENE FROM ACETOBACTER POLYOXOGENES", J BIOCHEM, vol. 106, 1989, pages 541 - 544, XP000070868 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006230329A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
WO2007100036A1 (ja) * 2006-03-03 2007-09-07 Mizkan Group Corporation 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2007236203A (ja) * 2006-03-03 2007-09-20 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP4528270B2 (ja) * 2006-03-03 2010-08-18 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
US8067538B2 (en) 2006-03-03 2011-11-29 Mizkan Group Corporation Gene related to growth promoting function of acetic acid bacterium, acetic acid bacterium bred using the gene and method for producing vinegar using the acetic acid bacterium
JP4551978B1 (ja) * 2010-05-12 2010-09-29 株式会社ミツカングループ本社 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2010213714A (ja) * 2010-05-12 2010-09-30 Mitsukan Group Honsha:Kk 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
CN110628662A (zh) * 2019-07-29 2019-12-31 贵州亮欢寨生物科技有限公司 一株醋酸杆菌及其应用
CN110628662B (zh) * 2019-07-29 2021-04-02 贵州亮欢寨生物科技有限公司 一株醋酸杆菌及其应用

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