JP2571119B2 - 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法 - Google Patents
細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアセトバクター属の微生物に由来する細胞膜
結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子、これを含む
プラスミドおよびその利用に関するものである。
結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子、これを含む
プラスミドおよびその利用に関するものである。
アセトバクター属に属する微生物の生産する細胞膜結
合型アルデヒド脱水素酵素は、ピロロキノリンキノンを
補欠分子族とし、アルデヒドを対応する酸に酸化する酵
素である。該酵素は、酢酸発酵でのエタノールから酢酸
を生成する酸化発酵に関与しており、また、アルデヒド
の定量や食品の不快臭の原因物質であるアルデヒドの酸
化分解に利用され、産業上有用な酵素である。
合型アルデヒド脱水素酵素は、ピロロキノリンキノンを
補欠分子族とし、アルデヒドを対応する酸に酸化する酵
素である。該酵素は、酢酸発酵でのエタノールから酢酸
を生成する酸化発酵に関与しており、また、アルデヒド
の定量や食品の不快臭の原因物質であるアルデヒドの酸
化分解に利用され、産業上有用な酵素である。
また、該酵素を菌体内に多量産生する酢酸菌は酢酸発
酵の速度が速くなり、酢酸の生産効率を高めることがで
きるので、本発明は酢酸発酵界に益するところ大なるも
のがある。
酵の速度が速くなり、酢酸の生産効率を高めることがで
きるので、本発明は酢酸発酵界に益するところ大なるも
のがある。
従来、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素は、アセト
バクター属やグルコノバクター属の微生物を培養し、培
養菌体そのまま又は菌体から抽出精製され利用されてき
た（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第44巻，第503頁,1980年，第45巻，第1889
頁,1981年）。
バクター属やグルコノバクター属の微生物を培養し、培
養菌体そのまま又は菌体から抽出精製され利用されてき
た（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第44巻，第503頁,1980年，第45巻，第1889
頁,1981年）。
しかし、該酵素は、菌体中の含量が低く、また不安定
な酵素であるため、抽出精製の操作中に失活してしま
い、十分な収率で精製できず、多量に調製することが困
難であった。一方、変異処理により、菌体中の酵素含量
の高くなった変異株を取得することも考えられるが、い
まだ十分量の酵素含量に達しているとの報告はない。
な酵素であるため、抽出精製の操作中に失活してしま
い、十分な収率で精製できず、多量に調製することが困
難であった。一方、変異処理により、菌体中の酵素含量
の高くなった変異株を取得することも考えられるが、い
まだ十分量の酵素含量に達しているとの報告はない。
本発明者らは、上述した問題点を解決するため、遺伝
子組み換え技術により菌体中の酵素含量を高める方法を
鋭意検討した結果、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素
の構造遺伝子を単離し、プラスミドに含ませることに成
功した。さらに単離した遺伝子を含むプラスミドを用い
ることにより、該酵素の菌体内含量を高め、酢酸発酵の
効率を高めることができることを見出し、本発明を完成
するに至った。
子組み換え技術により菌体中の酵素含量を高める方法を
鋭意検討した結果、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素
の構造遺伝子を単離し、プラスミドに含ませることに成
功した。さらに単離した遺伝子を含むプラスミドを用い
ることにより、該酵素の菌体内含量を高め、酢酸発酵の
効率を高めることができることを見出し、本発明を完成
するに至った。
すなわち、本発明はアセトバクター属の微生物に由来
し、分子サイズが約3.6キロベースである細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子を含むプラスミドお
よび該プラスミドによって形質転換されたアセトバクタ
ー属またはグルコノバクター属の微生物に関し、更には
該微生物を用いて酢酸発酵する方法に関するものであ
る。
し、分子サイズが約3.6キロベースである細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子を含むプラスミドお
よび該プラスミドによって形質転換されたアセトバクタ
ー属またはグルコノバクター属の微生物に関し、更には
該微生物を用いて酢酸発酵する方法に関するものであ
る。
本発明における細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素
（以下ALDHと略）は特開昭63−12279に記載される新規
なアルデヒドデヒドロゲナーゼ複合体で、分子量が約7
5,000の蛋白質をさし、アルデヒドデヒドロゲナーゼ複
合体の活性の本体をなす酵素である。該酵素は、アセト
バクター・アルトアセチゲネスMH−24（FERM BP−491）
に代表される一群のアセトバクター属の微生物によって
生産される。該酵素の構造遺伝子を含む遺伝子断片は、
該酵素を生産するアセトバクター属の微生物の保有する
全DNAから単離することができる。全DNAは、例えば特開
昭60−9489に開示された方法により、調製することがで
きる。この全DNAから、たとえば、実施例１に示されて
いるような方法、すなわち該酵素に対する抗体を調製
し、抗原抗体反応を利用して目的の遺伝子をもつクロー
ンを選択する方法などにより、ALDH構造遺伝子を含む遺
伝子断片を単離することができる。
（以下ALDHと略）は特開昭63−12279に記載される新規
なアルデヒドデヒドロゲナーゼ複合体で、分子量が約7
5,000の蛋白質をさし、アルデヒドデヒドロゲナーゼ複
合体の活性の本体をなす酵素である。該酵素は、アセト
バクター・アルトアセチゲネスMH−24（FERM BP−491）
に代表される一群のアセトバクター属の微生物によって
生産される。該酵素の構造遺伝子を含む遺伝子断片は、
該酵素を生産するアセトバクター属の微生物の保有する
全DNAから単離することができる。全DNAは、例えば特開
昭60−9489に開示された方法により、調製することがで
きる。この全DNAから、たとえば、実施例１に示されて
いるような方法、すなわち該酵素に対する抗体を調製
し、抗原抗体反応を利用して目的の遺伝子をもつクロー
ンを選択する方法などにより、ALDH構造遺伝子を含む遺
伝子断片を単離することができる。
該酵素に対する抗体は、特開昭63−12279に開示され
た方法により、精製されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ
複合体をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り、２つのサブユニットに分離後、分子量75,000に相当
する蛋白質をゲルから抽出し、抗原として用いて作成す
ることができる。具体的には、たとえば“Methods in E
nzymology"第73巻，第46頁（1981年）の方法に従えば、
抗ALDH抗体を得ることができる。最初の免疫から約２週
間後、２回目の免疫をおこなうことにより、１ヵ月ない
し１ヵ月半でALDHに特異的な抗体の生成がみられる。抗
体は血清を硫安分画などにより粗精製するか、さらにイ
オン交換グロマトグラフィーにより精製度の高い標品を
調製できるが、遺伝子の単離に用いる場合には、血清を
適宜希釈して使用することも可能である。
た方法により、精製されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ
複合体をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り、２つのサブユニットに分離後、分子量75,000に相当
する蛋白質をゲルから抽出し、抗原として用いて作成す
ることができる。具体的には、たとえば“Methods in E
nzymology"第73巻，第46頁（1981年）の方法に従えば、
抗ALDH抗体を得ることができる。最初の免疫から約２週
間後、２回目の免疫をおこなうことにより、１ヵ月ない
し１ヵ月半でALDHに特異的な抗体の生成がみられる。抗
体は血清を硫安分画などにより粗精製するか、さらにイ
オン交換グロマトグラフィーにより精製度の高い標品を
調製できるが、遺伝子の単離に用いる場合には、血清を
適宜希釈して使用することも可能である。
一方、全DNAを適当な制限酵素で切断したものと発現
ベクターを全DNAと連結可能な制限酵素で切断したもの
とをT4 DNAリガーゼにより連結し、その連結物を大腸菌
宿主に形質転換する。この場合の発現ベクターとして
は、たとえばpUC18のような大腸菌のβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のオペレーター、プロモーターをもつベクタ
ーのプロモーターの下流に融合蛋白として生成させ、イ
ソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシドによ
り、遺伝子の誘導発現が可能なベクターがあげられる。
ベクターを全DNAと連結可能な制限酵素で切断したもの
とをT4 DNAリガーゼにより連結し、その連結物を大腸菌
宿主に形質転換する。この場合の発現ベクターとして
は、たとえばpUC18のような大腸菌のβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のオペレーター、プロモーターをもつベクタ
ーのプロモーターの下流に融合蛋白として生成させ、イ
ソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシドによ
り、遺伝子の誘導発現が可能なベクターがあげられる。
大腸菌の形質転換は常法にしたがえばよいが、なるべ
く遺伝子導入効率の高い形質転換法（たとえば、“DNA
cloning"第１巻，第109頁、IRL Press（1985）に記載の
方法）で形質転換した方が望ましい。得られた形質転換
株の中から、目的とする遺伝子をもつ株の検出は、たと
えば、ジーン、第37巻，第267頁（1985年）の方法に準
じておこなえばよい。すなわち、得られた形質転換株の
菌体破砕物を抗体と反応させ、特異的な反応性を示す株
を検出することによって可能である。このようにして得
られた抗体と反応性を示す株は、目的とする遺伝子全長
を有する場合もあるが、遺伝子の一部しか有していない
場合もある。
く遺伝子導入効率の高い形質転換法（たとえば、“DNA
cloning"第１巻，第109頁、IRL Press（1985）に記載の
方法）で形質転換した方が望ましい。得られた形質転換
株の中から、目的とする遺伝子をもつ株の検出は、たと
えば、ジーン、第37巻，第267頁（1985年）の方法に準
じておこなえばよい。すなわち、得られた形質転換株の
菌体破砕物を抗体と反応させ、特異的な反応性を示す株
を検出することによって可能である。このようにして得
られた抗体と反応性を示す株は、目的とする遺伝子全長
を有する場合もあるが、遺伝子の一部しか有していない
場合もある。
一部の遺伝子しか有していない場合には、さらに得ら
れている遺伝子をプローブとしてサザン・ハイブリダイ
ゼーションなどの手法により、プローブと相同性を示す
断片を単離することによって遺伝子全長を得ることがで
きる。
れている遺伝子をプローブとしてサザン・ハイブリダイ
ゼーションなどの手法により、プローブと相同性を示す
断片を単離することによって遺伝子全長を得ることがで
きる。
このようにして単離したALDHの構造遺伝子を含む遺伝
子断片を用いて、ALDHを生産するためには、通常遺伝子
断片と宿主内で機能するプロモーター活性をもつ遺伝子
とを発現可能な形で連結させる必要がある。アセトバク
ター属やグリコノバクター属の微生物内でALDH蛋白を生
成させるために用いるプロモーターとしては、ALDH遺伝
子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の他
のプロモーター活性をもつ遺伝子や酢酸菌で発現可能な
大腸菌のプロモーターも使用できる。大腸菌プロモータ
ーとしては、大腸菌プラスミドpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子や大腸菌プラスミドpACYC177のカナマイシン耐
性遺伝子、大腸菌プラスミドpACYC184のクロラムフェニ
コール耐性遺伝子、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子のプロモーターなどが使用できる。過剰量にALDHが生
産されて宿主の生育等に影響を及ぼす場合には、遺伝子
の発現量をコントロールするため、適当なプロモーター
を選択する必要がある。また、発現させた場合、本来の
ALDHの分子量と大きさの異なる蛋白の生成が見られる場
合がある。これは、ALDH蛋白と他の蛋白が融合した融合
蛋白の形で宿主内で生産されているためであるが、酵素
活性が発現できるような形で融合蛋白が生成していれ
ば、なんら差しつかえない。
子断片を用いて、ALDHを生産するためには、通常遺伝子
断片と宿主内で機能するプロモーター活性をもつ遺伝子
とを発現可能な形で連結させる必要がある。アセトバク
ター属やグリコノバクター属の微生物内でALDH蛋白を生
成させるために用いるプロモーターとしては、ALDH遺伝
子本来のプロモーターも使用できるが、酢酸菌由来の他
のプロモーター活性をもつ遺伝子や酢酸菌で発現可能な
大腸菌のプロモーターも使用できる。大腸菌プロモータ
ーとしては、大腸菌プラスミドpBR322のアンピシリン耐
性遺伝子や大腸菌プラスミドpACYC177のカナマイシン耐
性遺伝子、大腸菌プラスミドpACYC184のクロラムフェニ
コール耐性遺伝子、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子のプロモーターなどが使用できる。過剰量にALDHが生
産されて宿主の生育等に影響を及ぼす場合には、遺伝子
の発現量をコントロールするため、適当なプロモーター
を選択する必要がある。また、発現させた場合、本来の
ALDHの分子量と大きさの異なる蛋白の生成が見られる場
合がある。これは、ALDH蛋白と他の蛋白が融合した融合
蛋白の形で宿主内で生産されているためであるが、酵素
活性が発現できるような形で融合蛋白が生成していれ
ば、なんら差しつかえない。
また、酢酸菌内にALDHの構造遺伝子を含む遺伝子断片
を保持させるためのベクターとしては、たとえば、特開
昭60−9488に開示されているpTA5001（Ａ）,pTA5001
（Ｂ）や酢酸菌に導入可能な広宿主域ベクターRP4::Mu,
RP4,pRK2013,RSF1010などが利用できる。
を保持させるためのベクターとしては、たとえば、特開
昭60−9488に開示されているpTA5001（Ａ）,pTA5001
（Ｂ）や酢酸菌に導入可能な広宿主域ベクターRP4::Mu,
RP4,pRK2013,RSF1010などが利用できる。
以上のようにして、ALDHの構造遺伝子を含むプラスミ
ドを単離することができ、形質転換した後、遺伝子を発
現することにより、ALDH蛋白を菌体内に著量生産させる
ことができる。
ドを単離することができ、形質転換した後、遺伝子を発
現することにより、ALDH蛋白を菌体内に著量生産させる
ことができる。
ALDHを生産させる宿主として、大腸菌、枯草菌など遺
伝子組み換え技術が確立されている微生物を用いること
もできるが、ALDHをもともと生産する能力を有する酢酸
菌、すなわちアセトバクター属およびグルコノバクター
属の微生物を用いる方が有利である。
伝子組み換え技術が確立されている微生物を用いること
もできるが、ALDHをもともと生産する能力を有する酢酸
菌、すなわちアセトバクター属およびグルコノバクター
属の微生物を用いる方が有利である。
ALDHは、PQQを補欠分子族としてもっており、活性型
の酵素を生産させるためには、培地等にPQQを加え、ALD
H蛋白を生産させることもできるが、宿主がPQQ合成能を
有している方が有利である。アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー、第48巻，第561頁
（1984年）に記載のごとく、大腸菌や枯草菌のPQQ合成
能は低く、酢酸菌の合成能力が高いことが明らかになっ
ている。また、酵素反応を効率的に進めるためには、補
欠分子族であるPQQの酸化型と還元型のリサイクリング
がうまく進行することが必要で、酸化反応により生産す
る電子が、電子伝達系と共役して効率よくリサイクリン
グしている酢酸菌を宿主とすることが有利である。
の酵素を生産させるためには、培地等にPQQを加え、ALD
H蛋白を生産させることもできるが、宿主がPQQ合成能を
有している方が有利である。アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー、第48巻，第561頁
（1984年）に記載のごとく、大腸菌や枯草菌のPQQ合成
能は低く、酢酸菌の合成能力が高いことが明らかになっ
ている。また、酵素反応を効率的に進めるためには、補
欠分子族であるPQQの酸化型と還元型のリサイクリング
がうまく進行することが必要で、酸化反応により生産す
る電子が、電子伝達系と共役して効率よくリサイクリン
グしている酢酸菌を宿主とすることが有利である。
又、酢酸発酵においてALDHは、アセトアルデヒドを酢
酸に酸化する反応を担っている。このため、酢酸菌体内
のALDHの量を高めることにより、酢酸発酵の効率化が期
待できる。実施例３に示すごとく、酢酸菌の形質転換株
を用いることによりALDH活性を高めることにより、酢酸
発酵の効率化ができる。
酸に酸化する反応を担っている。このため、酢酸菌体内
のALDHの量を高めることにより、酢酸発酵の効率化が期
待できる。実施例３に示すごとく、酢酸菌の形質転換株
を用いることによりALDH活性を高めることにより、酢酸
発酵の効率化ができる。
本発明を用いれば、従来、菌の生産性が低いため精製
単離が困難であったALDHを容易に調製することができ、
定量用酵素や脱臭用酵素としての途を開くことができ
る。また、該酵素の含量の高まった酢酸菌を用いること
により、ALDHの効率的な生産のみならず、酢酸発酵の効
率化が可能となる。
単離が困難であったALDHを容易に調製することができ、
定量用酵素や脱臭用酵素としての途を開くことができ
る。また、該酵素の含量の高まった酢酸菌を用いること
により、ALDHの効率的な生産のみならず、酢酸発酵の効
率化が可能となる。
（実施例１） 〔抗ALDH抗体の調製法〕 アセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24（FERM B
P−491）株をグルコース３％、エタノール４％（V/
V）、酢酸６％（W/V）、酵母エキス（大五栄養化学株式
会社製）0.5％、ポリペプトン（大五栄養化学株式会社
製）0.2％を加えた培地で30℃にて振とう培養した。培
養後、遠心分離により菌体を得た後、常法（特開昭63−
12279に開示された方法）により、ALDH複合体4mgを得
た。この複合体をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供し、分子量約75,000の蛋白質と分子量約20,000の
蛋白質とに分離後、75,000の位置にある蛋白質をゲルか
ら溶出させ、ALDH標品とした。
P−491）株をグルコース３％、エタノール４％（V/
V）、酢酸６％（W/V）、酵母エキス（大五栄養化学株式
会社製）0.5％、ポリペプトン（大五栄養化学株式会社
製）0.2％を加えた培地で30℃にて振とう培養した。培
養後、遠心分離により菌体を得た後、常法（特開昭63−
12279に開示された方法）により、ALDH複合体4mgを得
た。この複合体をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供し、分子量約75,000の蛋白質と分子量約20,000の
蛋白質とに分離後、75,000の位置にある蛋白質をゲルか
ら溶出させ、ALDH標品とした。
得られたALDH0.1mgを完全フロインドのアジュバント
と共にウサギの皮下に注射した。約２週間後、さらに0.
1mgのALDH標品を注射した。最初の注射から１ヵ月後、
ウサギの血液を耳から抜きとり、遠心分離し得た血清と
ALDHとの反応性を見たところ、沈降反応が認められ、ま
た、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ウエス
タン法にてその特異性を調べたところ、ALDH以外の蛋白
との反応性はほとんど見られず、特異性の高い抗ALDH抗
体が生産されていた。
と共にウサギの皮下に注射した。約２週間後、さらに0.
1mgのALDH標品を注射した。最初の注射から１ヵ月後、
ウサギの血液を耳から抜きとり、遠心分離し得た血清と
ALDHとの反応性を見たところ、沈降反応が認められ、ま
た、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ウエス
タン法にてその特異性を調べたところ、ALDH以外の蛋白
との反応性はほとんど見られず、特異性の高い抗ALDH抗
体が生産されていた。
上記と同様な方法で培養して得たアセトバクター・ア
ルトアセチゲネスMH−24の菌体から、常法（特開昭60−
9489に開示された方法）により、全DNAを調製した。調
製した全DNAを制限酵素Pst I（宝酒造株式会社製）で切
断後、同じく制限酵素Pst Iで切断した後、細菌性アル
カリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化
した大腸菌ベクターpUC18（宝酒造株式会社製）とT4 DN
Aリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。連
結反応液を大腸菌宿主E.coli JM109にHanahanの方法
（“DNA cloning."第１巻，第109頁,IRL Press（1985
年））で形質転換した後、形質転換株をアン ピシリン
30μg/mlの濃度で含むLB寒天培地（“A Manual for Gen
etic Engineering."第201頁,Cold Spring Harbor Labor
atory,1980年）で選択した。この時の組み換え体の出現
頻度は、約60％であった。Wangら（Gene,第37巻，第267
頁，（1985年））の方法に準じて、得られた形質転換株
約5,000株について抗ALDH抗体との反応性をみた。ま
ず、LB寒天培地上に生育させた形質転換株をニトロセル
ロースフィルターにレプリカし、37℃で３〜５時間、フ
ィルター上でコロニーを生育させた後、10mMのIPTG（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）水溶液
で湿めらせpUC18のもつlacのプロモーターを誘導し、宿
主大腸菌に融合蛋白を著量生産させるようにした。IPTG
による誘導を37℃で３〜５時間おこなった後、フィルタ
ーをクロロホルムの蒸気に10分間さらし、コロニーを弱
く溶解させた後、5mM MgCl2、５μg/ml DNase,0.1mg/ml
のリゾチームおよび0.5％のBSAを含むバッファーＡ（50
mMトリスー塩酸,150mM NaCl,pH7.5）中で一晩放置し、
コロニーを完全に溶解させ、ニトロセルロースフィルタ
ーに菌体蛋白を吸着させ、同時にブロッキング反応をお
こなった。反応終了後、バッファ−Ａで３回フィルター
を洗浄し、上記方法で調製した抗ALDH抗体を1,000倍希
釈し（バッファーＡで希釈）、希釈液中で室温で５時間
反応させた。抗体との反応終了後、フィルターをバッフ
ァーＡで５回洗浄した後、抗原抗体反応の有無を検出す
るため、２次抗体として、パーオキシダーゼ標識した抗
ウサギIgG抗体（バイオラッド社製）の2,000倍希釈液を
フィルターに室温で１時間反応させた。反応後、バッフ
ァーＡで３回フィルターを洗浄し、発色剤として過酸化
水素と４−クロロ−１−ナフトールを含む反応液にフィ
ルターを浸し、発色をみた。アンピシリン耐性株約5,00
0株から反応性を示すコロニーが２つ得られた。これら
２株のプラスミドをアルカリ溶菌法（Nucleic Acids Re
s,第７巻，第1513頁，（1979年））で抽出し、制限酵素
で切断し解析したところ、２株ともベクターのpUC18のP
st I部位に約2.0キロベースのDNA断片を有していた。ま
た、形質転換株をLB培地にアンピシリン30μg/ml、IPTG
10mMを加えた液体培地で１晩37℃で培養して得られた菌
体を超音波破砕し、得られた菌体破砕液を上記したSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ウエスタン
法（Anal.Biochem.,第112巻，第195頁（1981年））で抗
ALDH抗体と反応する蛋白質の分子量を調べたところ、約
４万の分子量の蛋白が抗体と反応した。ALDHの分子量は
75,000であり、分離した遺伝子は、ALDH蛋白の約半分を
コードする遺伝子であることがわかった。
ルトアセチゲネスMH−24の菌体から、常法（特開昭60−
9489に開示された方法）により、全DNAを調製した。調
製した全DNAを制限酵素Pst I（宝酒造株式会社製）で切
断後、同じく制限酵素Pst Iで切断した後、細菌性アル
カリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）で脱リン酸化
した大腸菌ベクターpUC18（宝酒造株式会社製）とT4 DN
Aリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。連
結反応液を大腸菌宿主E.coli JM109にHanahanの方法
（“DNA cloning."第１巻，第109頁,IRL Press（1985
年））で形質転換した後、形質転換株をアン ピシリン
30μg/mlの濃度で含むLB寒天培地（“A Manual for Gen
etic Engineering."第201頁,Cold Spring Harbor Labor
atory,1980年）で選択した。この時の組み換え体の出現
頻度は、約60％であった。Wangら（Gene,第37巻，第267
頁，（1985年））の方法に準じて、得られた形質転換株
約5,000株について抗ALDH抗体との反応性をみた。ま
ず、LB寒天培地上に生育させた形質転換株をニトロセル
ロースフィルターにレプリカし、37℃で３〜５時間、フ
ィルター上でコロニーを生育させた後、10mMのIPTG（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）水溶液
で湿めらせpUC18のもつlacのプロモーターを誘導し、宿
主大腸菌に融合蛋白を著量生産させるようにした。IPTG
による誘導を37℃で３〜５時間おこなった後、フィルタ
ーをクロロホルムの蒸気に10分間さらし、コロニーを弱
く溶解させた後、5mM MgCl2、５μg/ml DNase,0.1mg/ml
のリゾチームおよび0.5％のBSAを含むバッファーＡ（50
mMトリスー塩酸,150mM NaCl,pH7.5）中で一晩放置し、
コロニーを完全に溶解させ、ニトロセルロースフィルタ
ーに菌体蛋白を吸着させ、同時にブロッキング反応をお
こなった。反応終了後、バッファ−Ａで３回フィルター
を洗浄し、上記方法で調製した抗ALDH抗体を1,000倍希
釈し（バッファーＡで希釈）、希釈液中で室温で５時間
反応させた。抗体との反応終了後、フィルターをバッフ
ァーＡで５回洗浄した後、抗原抗体反応の有無を検出す
るため、２次抗体として、パーオキシダーゼ標識した抗
ウサギIgG抗体（バイオラッド社製）の2,000倍希釈液を
フィルターに室温で１時間反応させた。反応後、バッフ
ァーＡで３回フィルターを洗浄し、発色剤として過酸化
水素と４−クロロ−１−ナフトールを含む反応液にフィ
ルターを浸し、発色をみた。アンピシリン耐性株約5,00
0株から反応性を示すコロニーが２つ得られた。これら
２株のプラスミドをアルカリ溶菌法（Nucleic Acids Re
s,第７巻，第1513頁，（1979年））で抽出し、制限酵素
で切断し解析したところ、２株ともベクターのpUC18のP
st I部位に約2.0キロベースのDNA断片を有していた。ま
た、形質転換株をLB培地にアンピシリン30μg/ml、IPTG
10mMを加えた液体培地で１晩37℃で培養して得られた菌
体を超音波破砕し、得られた菌体破砕液を上記したSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ウエスタン
法（Anal.Biochem.,第112巻，第195頁（1981年））で抗
ALDH抗体と反応する蛋白質の分子量を調べたところ、約
４万の分子量の蛋白が抗体と反応した。ALDHの分子量は
75,000であり、分離した遺伝子は、ALDH蛋白の約半分を
コードする遺伝子であることがわかった。
上記の方法で得たALDHの構造遺伝子の一部を含む遺伝
子（大きさ約2.0キロ・ベース）をプローブとしてサザ
ン・ハイブリダイゼーション法（J.Mol.Biol.第98巻，
第503頁（1975年））により、以下のようにして全長を
含む遺伝子を単離した。まず、上記した方法でアセトバ
クター・アルトアセチゲネスMH−24の全DNAを調製し、
制限酵素Bam HIで部分分解した。この時の部分分解は、
分解により生成するDNA断片が、主に20〜30キロベース
の大きさとなるような条件でおこなった。一方、大腸菌
コスミドベクターpHC79（Gene,第11巻，第291頁，（198
0年））をBam HIで切断し、全DNAの部分分解物とT4 DNA
ガーゼにより連結した。次に連結物をイン・ビトロ・パ
ッケージング・キット（プロメガバイオテック社製）を
用いてパッケージングした。大腸菌宿主E.coli HB101を
LB培地にマルトース0.2％を加えた液体培地で30℃で１
晩培養し、遠心分離後、LB培地にMg Cl2 10mMを含む培
地に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液0.5mlにパッケー
ジング反応物0.5mlを加え、軽く混合し、室温で20分間
静置した。その後、この混合物に4mlのLB培地を加え、3
7℃で１時間振とう培養し、培養液をアンピシリン30μg
/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗沫した。37℃で１晩培
養し生育してきた形質転換株のうち、約1,000株につい
て、サザンハイブリダイゼーション法でプローブとハイ
ブリダイズするプラスミドを有する形質転換株を調べ
た。1,000株のうち、３株がプローブとハイブリダイズ
するDNAを含んでおり、そのうちの１株から、ALDHの構
造遺伝子全長を含む断片のクローン化をおこなった。サ
ザンハイブリダイゼーションにより、約10キロベースの
EcoRIで切断される遺伝子断片にプローブDNA部分が存在
していることから、まず約10キロベースのEcoRIで切り
出される断片をpUC18をベクターとして単離した。さら
に、このEcoRIで切り出される断片の制限酵素解析をお
こない、AvaIで部分分解することにより、ALDH構造遺伝
子の全長を含む断片を単離した。単離した遺伝子断片は
大きさ約3.6キロベースで、第１図に示すような制限酵
素地図であった。この遺伝子断片は、大腸菌ベクターpU
C18のEcoRI−Ava I部位に組みこまれ、大腸菌宿主E.col
i JM109に形質転換され、E.coli AL25菌株名で微工研に
FERM BP−2288（FERM P−9911）として寄託されてい
る。第１図に示す遺伝子断片をpUC18のAva I部位にlac
プローモーターの制御がかかる方向に組みこみ、E.coli
JM109に上記した方法で形質転換した。形質転換株をLB
培地にアンピシリン30μg/ml、IPTG10mMを含む液体培地
で37℃１晩培養した菌体をウエスタン法にて解析したと
ころ、分子量約79,000の抗ALDH抗体と特異的に反応する
蛋白を著量生産していた。IPTGを加えないと特異的な蛋
白の生産はみとめられなかったことから、形質転換株で
は、lacプロモーターの制御下でALDH蛋白が合成されて
いると認められる。又ALDHの本来の分子量よりも生産さ
れた蛋白の分子量が大きいのは、ALDH蛋白がlacプロモ
ーターのすぐ後にある遺伝子の一部に由来する蛋白との
融合蛋白の形で生産されているためと考えられる。大腸
菌形質転換株のALDHの酵素活性を酢酸菌の方法（アグリ
カルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第44巻，第503頁，（1980年））に準じて測定した
が、活性は検出できなかった。
子（大きさ約2.0キロ・ベース）をプローブとしてサザ
ン・ハイブリダイゼーション法（J.Mol.Biol.第98巻，
第503頁（1975年））により、以下のようにして全長を
含む遺伝子を単離した。まず、上記した方法でアセトバ
クター・アルトアセチゲネスMH−24の全DNAを調製し、
制限酵素Bam HIで部分分解した。この時の部分分解は、
分解により生成するDNA断片が、主に20〜30キロベース
の大きさとなるような条件でおこなった。一方、大腸菌
コスミドベクターpHC79（Gene,第11巻，第291頁，（198
0年））をBam HIで切断し、全DNAの部分分解物とT4 DNA
ガーゼにより連結した。次に連結物をイン・ビトロ・パ
ッケージング・キット（プロメガバイオテック社製）を
用いてパッケージングした。大腸菌宿主E.coli HB101を
LB培地にマルトース0.2％を加えた液体培地で30℃で１
晩培養し、遠心分離後、LB培地にMg Cl2 10mMを含む培
地に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液0.5mlにパッケー
ジング反応物0.5mlを加え、軽く混合し、室温で20分間
静置した。その後、この混合物に4mlのLB培地を加え、3
7℃で１時間振とう培養し、培養液をアンピシリン30μg
/mlの濃度で含むLB寒天培地に塗沫した。37℃で１晩培
養し生育してきた形質転換株のうち、約1,000株につい
て、サザンハイブリダイゼーション法でプローブとハイ
ブリダイズするプラスミドを有する形質転換株を調べ
た。1,000株のうち、３株がプローブとハイブリダイズ
するDNAを含んでおり、そのうちの１株から、ALDHの構
造遺伝子全長を含む断片のクローン化をおこなった。サ
ザンハイブリダイゼーションにより、約10キロベースの
EcoRIで切断される遺伝子断片にプローブDNA部分が存在
していることから、まず約10キロベースのEcoRIで切り
出される断片をpUC18をベクターとして単離した。さら
に、このEcoRIで切り出される断片の制限酵素解析をお
こない、AvaIで部分分解することにより、ALDH構造遺伝
子の全長を含む断片を単離した。単離した遺伝子断片は
大きさ約3.6キロベースで、第１図に示すような制限酵
素地図であった。この遺伝子断片は、大腸菌ベクターpU
C18のEcoRI−Ava I部位に組みこまれ、大腸菌宿主E.col
i JM109に形質転換され、E.coli AL25菌株名で微工研に
FERM BP−2288（FERM P−9911）として寄託されてい
る。第１図に示す遺伝子断片をpUC18のAva I部位にlac
プローモーターの制御がかかる方向に組みこみ、E.coli
JM109に上記した方法で形質転換した。形質転換株をLB
培地にアンピシリン30μg/ml、IPTG10mMを含む液体培地
で37℃１晩培養した菌体をウエスタン法にて解析したと
ころ、分子量約79,000の抗ALDH抗体と特異的に反応する
蛋白を著量生産していた。IPTGを加えないと特異的な蛋
白の生産はみとめられなかったことから、形質転換株で
は、lacプロモーターの制御下でALDH蛋白が合成されて
いると認められる。又ALDHの本来の分子量よりも生産さ
れた蛋白の分子量が大きいのは、ALDH蛋白がlacプロモ
ーターのすぐ後にある遺伝子の一部に由来する蛋白との
融合蛋白の形で生産されているためと考えられる。大腸
菌形質転換株のALDHの酵素活性を酢酸菌の方法（アグリ
カルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第44巻，第503頁，（1980年））に準じて測定した
が、活性は検出できなかった。
（実施例２） 〔ALDH構造遺伝子を含む遺伝子断片の酢酸菌宿主への形
質転換〕 実施例１で単離した第１図で示すALDHの構造遺伝子を
含む遺伝子断片をpUC18のAvaI部位に、ALDH蛋白が合成
されるような方向で組みこんだ。次に、アセトバクター
・アセチ・サブスピーシズ・キシリナムIFO3288の有す
るプラスミドのうち、分子サイズ約2.1キロベースのプ
ラスミドを調製し制限酵素AccIで切断し、T4 DNAポリメ
ラーゼで切断末端を平滑化した。一方、pUC18に第１図
で示される遺伝子断片を組みこんだ組み換えプラスミド
を制限酵素SalIで切断し、同じくT4 DNAポリメラーゼで
切断末端を平滑化した。両者をT4 DNAリガーゼにより、
連結し組み換え体を得た後、アセトバクター・アセチN
o.1023（FERM BP−2287（FERM P−7122）からアグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー第
49巻，第2485頁（1985年）に開示された方法により得ら
れたALDH活性の低下した変異株10−812株に、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、
第49巻，第2091頁，（1985年）に記載の方法にしたが
い、形質転換した。形質転換株は、アンピシリン50μg/
mlを含むYPG寒天培地（グルコース３％、酵母エキス0.5
％、ポリペプトン0.2％、寒天２％、pH6.5）で選択し
た。選択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミ
ドをアグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第49巻，第2083頁，（1985年）の方法に準
じて調べた。導入されたプラスミドの大きさは約8.3キ
ロベースで、制限酵素解析より、pUC18と第１図に示さ
れた遺伝子断片およびアセトバクター・アセチ・サブス
ピーシズ・キシリナムIF03288の約2.1キロベースの大き
さのプラスミドの３者のキメラプラスミドであることを
確認した。
質転換〕 実施例１で単離した第１図で示すALDHの構造遺伝子を
含む遺伝子断片をpUC18のAvaI部位に、ALDH蛋白が合成
されるような方向で組みこんだ。次に、アセトバクター
・アセチ・サブスピーシズ・キシリナムIFO3288の有す
るプラスミドのうち、分子サイズ約2.1キロベースのプ
ラスミドを調製し制限酵素AccIで切断し、T4 DNAポリメ
ラーゼで切断末端を平滑化した。一方、pUC18に第１図
で示される遺伝子断片を組みこんだ組み換えプラスミド
を制限酵素SalIで切断し、同じくT4 DNAポリメラーゼで
切断末端を平滑化した。両者をT4 DNAリガーゼにより、
連結し組み換え体を得た後、アセトバクター・アセチN
o.1023（FERM BP−2287（FERM P−7122）からアグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー第
49巻，第2485頁（1985年）に開示された方法により得ら
れたALDH活性の低下した変異株10−812株に、アグリカ
ルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、
第49巻，第2091頁，（1985年）に記載の方法にしたが
い、形質転換した。形質転換株は、アンピシリン50μg/
mlを含むYPG寒天培地（グルコース３％、酵母エキス0.5
％、ポリペプトン0.2％、寒天２％、pH6.5）で選択し
た。選択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミ
ドをアグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第49巻，第2083頁，（1985年）の方法に準
じて調べた。導入されたプラスミドの大きさは約8.3キ
ロベースで、制限酵素解析より、pUC18と第１図に示さ
れた遺伝子断片およびアセトバクター・アセチ・サブス
ピーシズ・キシリナムIF03288の約2.1キロベースの大き
さのプラスミドの３者のキメラプラスミドであることを
確認した。
上記で得られたアセトバクター・アセチの形質転換株
について、ウエスタン法でALDH蛋白の生成量を調べた。
まず、YPG液体培地（上記のYPG寒天培地から寒天を除い
た組成の培地）に30μg/mlの濃度でアンピシリンを加
え、30℃で36時間振とう培養した。培養後、集菌し、マ
クイルバインバッファー（pH6.0）に菌体を懸濁し、フ
レンチ・プレスで菌体を破砕した。破砕液から、未破砕
菌体を遠心分離（5,000rpm,10分）で除き、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ウエスタ
ン法で、抗ALDH抗体と特異的に反応する蛋白質の生成を
調べたところ、分子量約79,000の蛋白と抗体が強く反応
していた。一方、プラスミドを有しない株では、抗体と
反応する蛋白の生成はほとんど見られなかった。また、
形質転換株のALDHの酵素活性を実施例１に記載の方法で
測定したところ、プラスミドをもたない株の比活性が0.
15に対し、形質転換株では、0.43であり、約３倍の活性
の上昇が認められた。生産された抗ALDH抗体と反応する
蛋白の分子量が本来のALDHの分子量より大きいのは、実
施例１の大腸菌と同じく融合蛋白の形で生産されている
ためと考えられる。分子量は、本来の大きさよりも大き
いが、酵素活性を示しており、実用上問題はない。上記
のごとく酢酸菌をALDHの構造遺伝子を含む遺伝子で形質
転換することにより、活性をもったALDHの菌体含量を高
めることができる。
について、ウエスタン法でALDH蛋白の生成量を調べた。
まず、YPG液体培地（上記のYPG寒天培地から寒天を除い
た組成の培地）に30μg/mlの濃度でアンピシリンを加
え、30℃で36時間振とう培養した。培養後、集菌し、マ
クイルバインバッファー（pH6.0）に菌体を懸濁し、フ
レンチ・プレスで菌体を破砕した。破砕液から、未破砕
菌体を遠心分離（5,000rpm,10分）で除き、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ウエスタ
ン法で、抗ALDH抗体と特異的に反応する蛋白質の生成を
調べたところ、分子量約79,000の蛋白と抗体が強く反応
していた。一方、プラスミドを有しない株では、抗体と
反応する蛋白の生成はほとんど見られなかった。また、
形質転換株のALDHの酵素活性を実施例１に記載の方法で
測定したところ、プラスミドをもたない株の比活性が0.
15に対し、形質転換株では、0.43であり、約３倍の活性
の上昇が認められた。生産された抗ALDH抗体と反応する
蛋白の分子量が本来のALDHの分子量より大きいのは、実
施例１の大腸菌と同じく融合蛋白の形で生産されている
ためと考えられる。分子量は、本来の大きさよりも大き
いが、酵素活性を示しており、実用上問題はない。上記
のごとく酢酸菌をALDHの構造遺伝子を含む遺伝子で形質
転換することにより、活性をもったALDHの菌体含量を高
めることができる。
（実施例３） 〔酢酸菌形質転換株を用いた酢酸発酵〕 実施例２で得られたALDHの構造遺伝子を含む遺伝子断
片と大腸菌プラスミドpUC18と酢酸菌プラスミドの３者
のキメラ・プラスミドをアセトバクター・アセチ・サブ
スピーシズ・キシリナムIF03288にアグリカルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、第49巻，第
2091頁（1985年）に記載の方法にしたがい、形質転換し
た。形質転換株は、アンピシリン500μg/mlを含む実施
例２で組成の示されているYPG寒天培地で選択した。選
択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミドを実
施例２の方法に準じて調べたところ、約8.3キロベース
の大きさのキメラプラスミドを保持していることを確認
した。キメラプラスミドを保持する形質転換株とプラス
ミドをもたない元株との酢酸発酵能を比較した。5l容ミ
ニ・ジャーでの発酵経過を第２図に示す。
片と大腸菌プラスミドpUC18と酢酸菌プラスミドの３者
のキメラ・プラスミドをアセトバクター・アセチ・サブ
スピーシズ・キシリナムIF03288にアグリカルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、第49巻，第
2091頁（1985年）に記載の方法にしたがい、形質転換し
た。形質転換株は、アンピシリン500μg/mlを含む実施
例２で組成の示されているYPG寒天培地で選択した。選
択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミドを実
施例２の方法に準じて調べたところ、約8.3キロベース
の大きさのキメラプラスミドを保持していることを確認
した。キメラプラスミドを保持する形質転換株とプラス
ミドをもたない元株との酢酸発酵能を比較した。5l容ミ
ニ・ジャーでの発酵経過を第２図に示す。
培地は、実施例２のYPG寒天培地にエタノール、酢酸
を適当量添加したものを使用した。ジャーの実液量は3l
とし、500rpm,0.2vvmの条件で通気攪拌培養した。培養
温度は、30℃であった。第２図の発酵経過の結果から、
形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。第１表に示
すように、菌の比増殖速度、単位液量あたりの生酸速
度、最終到達酸度のいずれにおいても形質転換株では、
顕著に向上していた。また、酸度４％で連続酢酸発酵を
おこなったところ、元株では、毎時150mlの流量で、足
常状態になったのに対し、形質転換株では、毎時250ml
の流量まで連続発酵が可能であった。
を適当量添加したものを使用した。ジャーの実液量は3l
とし、500rpm,0.2vvmの条件で通気攪拌培養した。培養
温度は、30℃であった。第２図の発酵経過の結果から、
形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。第１表に示
すように、菌の比増殖速度、単位液量あたりの生酸速
度、最終到達酸度のいずれにおいても形質転換株では、
顕著に向上していた。また、酸度４％で連続酢酸発酵を
おこなったところ、元株では、毎時150mlの流量で、足
常状態になったのに対し、形質転換株では、毎時250ml
の流量まで連続発酵が可能であった。
実施例4.細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝
子の塩基配列およびアミノ酸配列の決定 実施例１で得た大腸菌形質転換株E.coli AL25の保有
するプラスミドを実施例１のアルカリ溶菌法で抽出し得
た。得られたプラスミドをEco RIで切断して得られる第
１図に制限酵素地図を示す約3.6キロベースの遺伝子断
片についてM13ファージを用いたジデオキシ法（Methods
in Enzymology、第10巻、第20頁、Academic Press,New
York,1983年）によって、その塩基配列を決定した。決
定した塩基配列をもとに翻訳可能領域を検索したとこ
ろ、第３図に示すようなATG翻訳開始コドンから翻訳さ
れる2319塩基からなるアミノ酸773残基（分子量84,13
5）をコードする翻訳可能領域が見出された。（第３図
の塩基配列から決定されたアミノ酸配列を第３図の塩基
配列の下段に示した。）第３図の塩基配列で示されるポ
リペプチドが、本発明の細胞膜結合型アルデヒド脱水素
酵素と一致することは、精製した本発明の細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素をエドマン分解によって決定され
たアミノ末端側アミノ酸配列10個（Asn−Gln−Ile−Phe
−Pro−Leu−Asp−Arg−Ser−Leu）と塩基配列から見出
されたアミノ末端側から第45番目以降のアミノ酸配列と
完全に一致することから、確認された。塩基配列から見
出されたアミノ末端側から第44番目までのアミノ酸配列
は、エドマン分解によって決定されたアミノ酸配列には
見られないことから、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵
素の分泌に関与する領域と思われた。
子の塩基配列およびアミノ酸配列の決定 実施例１で得た大腸菌形質転換株E.coli AL25の保有
するプラスミドを実施例１のアルカリ溶菌法で抽出し得
た。得られたプラスミドをEco RIで切断して得られる第
１図に制限酵素地図を示す約3.6キロベースの遺伝子断
片についてM13ファージを用いたジデオキシ法（Methods
in Enzymology、第10巻、第20頁、Academic Press,New
York,1983年）によって、その塩基配列を決定した。決
定した塩基配列をもとに翻訳可能領域を検索したとこ
ろ、第３図に示すようなATG翻訳開始コドンから翻訳さ
れる2319塩基からなるアミノ酸773残基（分子量84,13
5）をコードする翻訳可能領域が見出された。（第３図
の塩基配列から決定されたアミノ酸配列を第３図の塩基
配列の下段に示した。）第３図の塩基配列で示されるポ
リペプチドが、本発明の細胞膜結合型アルデヒド脱水素
酵素と一致することは、精製した本発明の細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素をエドマン分解によって決定され
たアミノ末端側アミノ酸配列10個（Asn−Gln−Ile−Phe
−Pro−Leu−Asp−Arg−Ser−Leu）と塩基配列から見出
されたアミノ末端側から第45番目以降のアミノ酸配列と
完全に一致することから、確認された。塩基配列から見
出されたアミノ末端側から第44番目までのアミノ酸配列
は、エドマン分解によって決定されたアミノ酸配列には
見られないことから、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵
素の分泌に関与する領域と思われた。
第１図は細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝
子の制限酵素地図を示し、第２図は実施例３における元
株と形質転換株の酢酸発酵の比較を示す図であり、第３
図は、上段は細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造
遺伝子の塩基配列を示す図で、下段は細胞膜結合型アル
デヒド脱水素酵素の構造遺伝子のアミノ酸配列を示す図
である。 アミノ酸配列における略記号の意味は次のとおりであ
る。 MET……メチオニン、Ala……アラニン Arg……アルギニン、Asn……アスパラギン Asp……アスパラギン酸、Cys……システイン Gln……グルタミン、Glu……グルタミン酸 Gly……グリシン、His……ヒスチジン Ile……イソロイシン、Leu……ロイシン Lys……リシン、Phe……フエニルアラニン Pro……プロリン、Ser……セリン Thr……スレオニン、Trp……トリプトフアン Tyr……チロシン、Val……バリン
子の制限酵素地図を示し、第２図は実施例３における元
株と形質転換株の酢酸発酵の比較を示す図であり、第３
図は、上段は細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造
遺伝子の塩基配列を示す図で、下段は細胞膜結合型アル
デヒド脱水素酵素の構造遺伝子のアミノ酸配列を示す図
である。 アミノ酸配列における略記号の意味は次のとおりであ
る。 MET……メチオニン、Ala……アラニン Arg……アルギニン、Asn……アスパラギン Asp……アスパラギン酸、Cys……システイン Gln……グルタミン、Glu……グルタミン酸 Gly……グリシン、His……ヒスチジン Ile……イソロイシン、Leu……ロイシン Lys……リシン、Phe……フエニルアラニン Pro……プロリン、Ser……セリン Thr……スレオニン、Trp……トリプトフアン Tyr……チロシン、Val……バリン
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 7/54 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:02） (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132
Claims (4)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項の構造遺伝子を含む
プラスミド。 - 【請求項３】特許請求の範囲第２項のプラスミドによっ
て形質転換した酢酸菌。 - 【請求項４】特許請求の範囲第２項のプラスミドによっ
て形質転換したアセトバクター属またはグルコノバクタ
ー属の微生物を用いて酢酸発酵せしめてなることを特徴
とする酢酸発酵法。
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| DE68921354T DE68921354T4 (de) | 1988-03-08 | 1989-03-06 | Strukturgen für membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase, Plasmid, das es enthält, mit diesem Plasmid transformierte Essigsäurebakterien und Essigsäuregärung mittels dieser Transformanten. |
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| DE68921354A DE68921354D1 (de) | 1988-03-08 | 1989-03-06 | Strukturgen für membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase, Plasmid, das es enthält, mit diesem Plasmid transformierte Essigsäurebakterien und Essigsäuregärung mittels dieser Transformanten. |
| US07/987,260 US5914257A (en) | 1988-03-08 | 1992-12-07 | Structural gene for membrane-bound aldehyde dehydrogenase |
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| WO2008034071A2 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | The Johns Hopkins University | Method of identifying patients suitable for high-dose cyclophosphamide treatment |
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-
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- 1992-12-07 US US07/987,260 patent/US5914257A/en not_active Expired - Fee Related
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