JPH0253488A - ウリカーゼのｄｎａ配列および製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウリカーゼのＤＮＡ配列および製法に関し、詳
しくはウリカーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
配列、該ＤＮＡ配列を有するプラスミド。

該プラスミドを有する形質転換体および該形質転換体を
用いてウリカーゼを製造する方法に関する。

ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ、　ＥＣ１，７，３，３）
は尿酸を加水分解してアラントインと過酸化水素および
炭酸ガスを生成する作用を触媒する酵素であり、血中あ
るいは尿中の尿酸の測定に使用される。

〔従来の技術、発明が解決しようとする課題〕従来、ウ
リカーゼは、例えばキャンデイダ（Ｃａｎｄ　１ｄａ）
属に属し、ウリカーゼ生産能を有する微生物を尿酸存在
下に培養し、培養物からウリカーゼを採取することによ
り製造されている（特公昭４２−５１９２）。

しかしながら、この方法はウリカーゼの収率が十分でな
く、効率よくウリカーゼを製造する方法の開発が望まれ
ている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有するプラスミド、該プ
ラスミドを有する形質転換体および該形質転換体を用い
てウリカーゼを製造する方法について検討した。まず、
本発明者らが自然界より分離した、安定性のよいウリカ
ーゼを生産する好熱性微生物であるバチルス・エスピー
ＴＢ−９０（ＦＥＲＭＢＰ−７９５、特開昭６ｌ−２８
０２７２）の有するウリカーゼ遺伝子をクローニングし
、該遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。次いで、該ＤＮＡ
配列を有するプラスミドを得、さらに該プラスミドを含
む形質転換体を創製し、該形質転換体を用いるウリカー
ゼの製造方法について検討し、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち本発明は、ウリカーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有するプラスミド、
該プラスミドを有する形質転換体および該形質転換体を
用いてウリカーゼを製造する方法に関する。

本発明のウリカーゼをコードする遺伝子は下記のアミノ
酸配列および塩基配列で特定される。

ＰｈｅＳｅｒＡｓｐＧｌｕＰｒｏＡｓｐＨ１ｓＬｙｓＧ
ｌｙ＾ｌａ　ＬｅｕＬｙｓＡＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣ品
八へ＾＾ＡＧ　ＡＧＴＧＡＴにＴＡＴ　ＴＡＴＧＧＡ＾
晶Ｇ　ＧＴＧＡＣＧＴＡＴＴ　ＴＧＣＴＴＡＴＣＧＣＱ
Ｏ ＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＴＧ＾八Ｔ八　ＴＧへＣ
へＣＣＧＣＴ　　ＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡ　　ＴＧＧＴＴ
ＣＧＴ八Ａ　　ＴＧＡへＧＡＴ＾＾ＣＴＴＣＴＣＴＧ八
ＴＧ　　ＡへＣＣＣＧＡＴＣＡ　　ＴＡＡＡＧＧＡＧＣ
Ａ　　ＣＴＴＡＡＡＴＧＡ本発明のウリカーゼ遺伝子を
含むプラスミドは、前記バチルス・エスピー　ＴＢ−９
０株の染色体Ｄ　Ｎ　Ａから遺伝子ライブラリーを作製
し、抗つサギ抗ウリカーゼ抗体を用いて該ライブラリー
をスクリーニングし、本発明のウリカーゼ遺伝子を含む
ファージＤＮＡより、ウリカーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片を単離し、プラスミドと連結することにより得ること
ができる。

よく知られているように、多くのアミノ酸についてはそ
れをコードする遺伝子ＤＮＡ配列は複数存在する。その
塩基配列は一義的には決らず多数の可能性があり得る。

本発明者等により明らかにされたバチルス・エスピー　
ＴＯ−９０株のウリカーゼのアミノ酸配列をコードする
遺伝子の場合も、そのＤＮＡ塩基配列は、天然の遺伝子
の塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮ
Ａ配列は、天然のＤＮＡ塩基配列のみに限定されるもの
ではなく、本発明により明らかにされたウリカーゼのア
ミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も含むものであ
る。

また、遺伝子組換え技術によれば、基本となるＤＮＡの
特定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように、人為的に変異を起こすことができる。本発明に
より提供される、天然の塩基配列を有するＤＮＡあるい
は天然のものとは異なる塩基配列を有するＤＮＡに関し
ても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことによ
り天然の遺伝子を同等あるいは改善された特性とするこ
とが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも含
むものである。

本発明のバチルス・エスピー　ＴＢ　−９０株のウリカ
ーゼ遺伝子を大腸菌の適当な発現、ベクター、例えばＩ
ａｃプロモーターを保持する発現ベクターｐＵＣ１８（
東洋紡）、大腸菌の強力なプロモーターであるｔａｃプ
ロモーターとｒｒｎＢリポソームＲＮＡのターミネータ
−を保持する発現ベクターｐ■２２３−３　（ファルマ
シア社）　、ｔｒｐプロモーターを保持する発現ベクタ
ーｐＤＲ７２０（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベ
クターｐＰＬ−Ｌａｍｂｄａ　（ファルマシア社）等に
連結することにより大腸菌の微生物菌体内でバチルス・
エスピー　ＴＢ　−９０株のウリカーゼを生産させる発
現ベクターを構築することができる。さらに、例えは枯
草菌と大腸菌とのシャトル・ベクターｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ（東洋紡）やプラスミドベクターｐＵＢ１１０（Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４．３１８−３２９．
１９７８）等に連結することにより枯草菌の微生物菌体
内及び培養液中でバチルス・エスピー　ＴＢ−９０株の
ウリカーゼを生産させる組換えプラスミドを構築するこ
とができる。

本発明のウリカーゼ遺伝子を保持する組換えプラスミド
を大腸菌や枯草菌等の宿主微生物へ導入することにより
菌体内及び菌体外でウリカーゼを生産する形質転換体を
得ることができる。

このようにして製造された形質転換微生物を適当な培地
、条件で培養することによりウリカーゼを大量生産する
ことが可能である。この場合、例えば培養初期に誘導剤
イソプロピルチオガラクトシド等を添加することにより
ウリカーゼの生産を有利に行うことができる。

培養後のうりカーゼの単離は、例えば菌体をリゾチーム
で処理、あるいは超音波等の手段を用いて破砕したり、
または培養液より抽出・分離・精製することにより行う
ことができる。

また、大腸菌や枯草菌の宿主−ベクター系のみならず、
酵母、シュードモナス菌あるいは放線菌等の宿主−ベク
ター系も利用可能であり、各々の宿主−ベクター系の特
徴を活かしたウリカーゼの大量生産が行える。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げ、さらに本発明の詳細な説明する。

本発明は以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。

実施例１ つ１カーゼ　　　のクローニング 入±ニブｌ　抗つサギ抗ウリカーゼ抗体の調製バチルス
・エスピー　ＴＢ　−９０株の培養液より抽出・精製し
たウリカーゼをウサギに投与し、免疫することにより、
抗つサギ抗ウリカーゼ抗血清を得ることができる。この
抗血清の抗体価は、ＥＬＩＳＡ法では１０２〜１０３、
オフタロニー法では１６倍であった。次に、抗血清の精
製を行い、抗血清１０ｍ１からプロティンＡセファロー
スカラムクロマトグラフィー（４ｍｊりにより、抗ウリ
カーゼ抗体１ｇＧ　８．９ｍｌが得られた。

ステップ２　バチルス・エスピー　ＴＢ　−９０株のフ
ァージＤＮＡライブラリーの作製 ブイヨン培地（肉エキス　５ｇ、ペプトン１０ｇ。

Ｎａ（／！５ｇを加えてＩＬとして作製した液体培地、
ｐＨ７，２）で培養したバチルス・エスピー　ＴＢ−９
０株の菌体的２．５ｇより、Ｄｏｉ　Ｒ，Ｈ，の方法（
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋　
　ｅｄ、　　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　　ｅｔ　　ａｌ、。

ｐ１６２＋　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　１９８３）あるいは
Ｋｏｉｚｕｍ！　Ｊ、　らの方法（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　
Ｂｉｏｅｎｇ、。

２７、７２１−７２８．１９８５）ニ従ッテ染色体ＤＮ
Ａを調製した。

この結果、０Ｄｚｂ。１００２８゜＝１．８程度のかな
り純粋な染色体ＤＮＡを約９００μｇｍ製することがで
きた。

次に制限酵素５ａｕ３ＡＩを用いて、常法により前記Ｄ
ＮＡを部分分解し、５％〜２０％シａ’ＪＲ密度匂配遠
心分離を行って２〜２０ｋｂ画分のＤＮＡを調製した。

ラムダファージ・クローニングベクターＥＭＢＬ３ａｒ
ｍｓ　（東洋紡）ｌａｇに前記の染色体ＤＮＡの５ａｕ
３Ａ１部分分解物０．４μｇを混合し、Ｔ４ＤＮ＾リガ
ーゼ（東洋紡）１ユニツトで連結させ、ラムダＤＮＡ　
１ｎｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｇｉｇ
ａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　、東洋紡）でパッケージングを
行い、Ｅ、ｃｏｌｉ　１３５９株に感染させ、プレート
当り約２０００個のプラークができるように撒いた。

Ｘ＝ヱプ３　プラークハイブリダイゼーションによるウ
リカーゼ遺伝子クローンの単離 上記の精製１ｇＧに西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲ
ＰＯ）を加え、ＩｇＧ−１（ＲＰＯコンジュゲートを作
製した。このコンジュゲートを用−いて、Ｇｅｎｅ　Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（ベーリンガー・マンハイム
社）によりウリカブラリ−をスクリーニングしたところ
、青みがかった緑色に発色したポジティブクローンが得
られ、特に発色の強いクローンを選択し、プラークがす
べて発色するまでファージの純化を行った。その結果、
ファージ１と３を選択し、ＩＩ！、ｃｏｌｉ口３５９株
に感染させ、その培養上清についてウリカーゼ活性を測
定したところ、各々７　ｍｕ／＋ｗ　ｌ及び９　ｍｕ／
ｍ　１であった。

単離したポジティブファージクローン１と３のファージ
ＤＮＡを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
　ｅｄ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｐ８５＋　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　１９８２）に従って調製し、制
限酵素ＢａＩＷＨＩと５ａ１１を用いて切断し、０．８
％アガロースゲル電気泳動で分析したところ、ファージ
１と３ともに５ａｉｌで１断片として切り出すことがで
きる各々１８ｋｂと１５ｋｂのＤＮＡが挿入されていた
。

さらに、制限酵素ＢａｍＨＩＳＳｐｈＩ、　ＫｐｎＩを
用いて挿入ＤＮＡの制限酵素切断地図を作製したところ
、ファージ１は、ファージ３を含み、両者は共通部分を
有することが判った。次に、ファージ１のファージＤＮ
Ａを制限酵素５ａｌＩで切断し、アガロースゲルから１
８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を抽出しく方法はベク・ターＤ
ＮＡ、榊佳之著、講談社、ｐ６７に従った。）、これを
プローブとするサザーン・ハイブリダイゼーション（Ｊ
、　Ｍｏｌ、　　Ｂｉｏｌ、、　ｉａ、　５０３−５１
７．１９７５）を行ったところ、ファージ１の１８ｋｂ
　ＤＮＡ断片は、ファージ３の１５ｋｂ　ＤＮＡ断片の
みならず、ＴＢ−９０株の染色体ＤＮＡともハイブリダ
イズした。このことから、ウリカーゼ活性を示すファー
ジ１と３のＤＮＡは共通部分を含み、バチルス・エスピ
ー　ＴＢ　−９０株の染色体ＤＮＡに由来する挿入ＤＮ
Ａ断片を有していることが判った。

次に、ファージ３のファージＤＮＡより１５ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片を前述と同様の方法で単離し、５ａｌＩで切断し
たプラスミド・ベクターｐＵＣ１８に連結後、さらにサ
ブクローニングし、挿入ＤＮＡ断片中のウリカーゼ遺伝
子領域を特定し、ウリカーゼ遺伝子を含む４、８　ｋｂ
　ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を持つｐＵＯＤ３１と名付
けた組換えプラスミドを得た。このプラスミドの制限酵
素切断地図を図２の上部中央に示す。

続いて、各種制限酵素で切断したＤＮＡ断片をベクター
ｐＵｃ　１ｇと１９にサブクローニングした後、Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
ｔｄｓ　Ｒｅｓ、＋ヱ。

１５１３−１５２３．１９７９）によりＤＮＡ断片を含
むプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮ八を１８
μｌのＴＥ（１０ｍＭ　ｌ−リス−塩酸（ｐＨ７，４）
、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、２μ２の２Ｎ　Ｎ
ａＯＨを加え、室温で５分間放置し、８μｌの５Ｍ酢酸
アンモニウムを加え、１００μｌの冷エタノールを加え
、エタノール沈澱を行った。これらのプラスミドＤＮＡ
について、Ｍ１３Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（東
洋紡）と［α−”Ｐ　］　ｄＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ、アマジャム・ジャパン）を用イテ、塩基配列の決
定を行った。

決定した塩基配列を図１に示す。バチルス・エスピー　
ＴＢ　−９０株のウリカーゼ遺伝子は開始コドン＾ＴＧ
から始まり、ストップコドンＴＧＡで終わる９９９塩基
のコーディング領域をもち、図１に示すように３３２個
のアミノ酸をコードしていた。

バチルス・エスピー　ＴＢ　−９０のつ１カーゼ゛ウリ
カーゼ遺伝子を含む約１０μｇの組換えプラスミドｐＵ
ＯＤ３１にＥｃｏＲＩと旧ｎｃｌＩを加え、３０ｕｌの
門バッファ　　（１０ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７，
５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ２　ｚ　、１ｍＭジチオスレ
イトール、５０ｍＭ　Ｎ４Ｃｆ）中で３７’Ｃ２時間反
応後、反応液を０．１μｇａｍｅの臭化エチジウムを含
む０．８％のアガロースゲル電気泳動を行い、前述の方
法で１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ旧ｎｃｌｌ　ＤＮＡ断片を
単離した。

次に、１μｇの発現ベクターｐＵｃ１８　（東洋紡）と
ｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア社）を各々ＥｃｏＲ
Ｉと旧ｎｃｌＩ及びＥｃｏＲＩとＳｍａ　Ｉで切断し、
前述と同様の方法で各々２．７ｋｂ及び４．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を単離した。

次に、最初に調製した１、　４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｃｌｌＤＮＡ断片１慢を発現ベクターｐＵｃ１Ｂと
ｐＫＫ２２３−３各々１′ｕｇずつに混合し、５ユニツ
トの７４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡）を加え、４５μ！の
りガーゼ反応液（６６ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７，６
）　、６．６ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ、１０ｍＭジチオスレ
イトール、１　、　ＯｍＭ　ＡＴＰ）中で１６°Ｃ１６
時間反応した。

その後、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、、瓜。

５５７、１９８３）に従い、リガーゼ反応を行った反応
液で大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造）を形質転換した。５
０ｇｇ／ｌａｎのアンピシリンを含むＬプロス平板固体
培地（トリプトン（デイフコ社）１０ｇ、イーストエキ
ストラクト（デイフコ社）　５　ｇ、　ＮＡＣ１５ｇ、
粉末寒天１５ｇをＬＬの蒸留水に溶解させた培地（ｐＨ
７，２））に出現したアンピシリン耐性コロニーを培養
し、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法によりプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各種の制限酵素で切断後、アガロー
スゲル電気泳動で分析して１．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩＨ
ｉｎｃｌｌ　ＤＮＡ断片が各々の発現ベクターに正しく
挿入されていることを確認した。ｐＵｃ１８と連結した
ものをｐＵＯＤ３１６．　ｐＫＫ２２３−３と連結した
ものをｐＫＵｌと各々名付けた。組換えプラスミドｐＵ
ＯＤ３１からの発現プラスミドｐＵＯＤ３１６とｐＫ旧
の構築方法を図２に示す。

でのつ１カーゼの 構築した各発現プラスミドｐＵＯＤ３１６．　ｐＫ旧を
Ｈａｎａｈａｎの方法に従い、大腸菌ＪＭ１０９株へ導
入し、得られた大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＬＩＯＤ
３１６とＪＭ１０９／ｐＫ旧が生産するウリカーゼの同
定・分析を以下のように行った。

各大腸菌をＬプロス液体培地中で３７°Ｃ１−晩培養し
た。０．１ｍｆｆ１の培養液を、Ｉｏｎ　１のＬブロス
液体培地に移し、３７°Ｃで培養し、０Ｄ６６゜の値が
０．２に達した時、最終濃度１１ＩＩＭのイソプロピル
チオガラクトシドを添加した。さらに、３７°Ｃで培養
を継続し、１６時間後、培養液１．０ｍｆを分取し、０
．５ｍｌの抽出バッファー（５０ｍＭホウ酸バッファー
（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　ＥＤＴ＾・３Ｎａ、０．
３％Ｔｒｉｔｏｎｘ　−ｔｏｏ、０．３％　リゾチーム
）を加え、３７°Ｃテ１０分間インキュベートした後、
遠心操作（１２，ＯＯＯｒｐｍ。

１０分）により溶菌液の上清を得た。この上清２０μｌ
を同量のサンプル処理液（６２，５ｍＭ　）リス−塩酸
（ｐＨ６，８）、　２％ＳＯ３，１０％　グリセロール
、５％　２−メルカプトエタノール、０．００１％ＢＰ
Ｂ）に懸濁後、１００°Ｃで５分間熱処理し、Ｌａｅｍ
ｍｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６
８５．１９７０）に従ってＳＯＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルをクーマシーブリリ
アントブルーで染色し、脱色、乾燥後、濾紙に固定した
。その結果、発現プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９株
では、分子！約３５にのウリカーゼのバンドが検出され
、この蛋白バンドは抗ウリカーゼ抗体（ＩｇＧ）と特異
的な交叉反応を示した。ゲル上の各蛋白バンドをデンシ
トメーターで測定したところ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵ
ＯＤ３１６及びＪｌ’１１０９／ｐＫＵｌは、各々全菌
体蛋白光り各々１％、３％のウリカーゼを生産した。従
って、これらの大腸菌組換え体は、効率よくバチルス・
エスピ−ＴＢ−９０株のウリカーゼを生産していること
が確認された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＯＤ３１６はＦ
ＥＲＭＢＰ　−＋４’Ｃ’ｌ　　、大腸菌ＪＭ１０９／
ｐＫＵｌはＦＥＲＭ　ＢＰ−Ｉｆ８０　　としてそれぞ
れ微工研に寄託されている。

実施例２ 実施例１と同様の方法で得られた大腸菌の組換えプラス
ミドｐＵＯＤ３１よりウリカーゼ遺伝子を含む３、０　
ｋｂ　Ｂａｌｌ１旧−Ｂｇｌｌｌ断片を単離、抽出した
。次に、大腸菌・枯草菌シャトル・ベクターｐｌ（Ｙ　
３００ＰＬＫ　（東洋紡）２μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ２ユニツトでウリカー
ゼ遺伝子を含む３．０　ｋｂ　Ｂａｍ［−ＢｇｌｌＩ断
片２ｕｇと連結し、大腸菌Ｃ６００株を１（ａｎａｈａ
ｎの方法で形質転換し、５０μｇ／ｍＩ！、のアシピシ
リンを含むＬブロス平板固体培地でアンピシリン耐性株
を選択した。このようにして得た形質転換株の中のウリ
カーゼ活性を示す０６００株よりＢｉｒｎｂｏｉｍらの
方法によりプラスミドＤＮＡを調製し、この組換えプラ
スミドをｐＥ８２と名付けた。このプラスミドの構築方
法を図３に示す。

次に、このプラスミドを用いてＲｏｄｒｉｇｕｅｚらの
方法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、　ｅｄ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　６＋ａ１．
＋　ｐ１８４−１８６．Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ
　ＰｕｂｕｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、　１９８３
）に従い、コンピテントセルを作成し、枯草菌ＩＳＷ　
１２１４株（東洋紡）を形質転換した。

次に、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと０．２％の
グルコースを含むしブロス平板固体培地にまき、３７°
Ｃで一晩培養した。その結果、テトラサイクリン耐性株
を選択することにより、ａ換えプラスミドｐＥＢ２で形
質転換された枯草菌を得ることができた。この形質転換
体を１５μｇ７ｍｌのテトラサイクリンと０．２％のグ
ルコースを含むしブロス液体培地中で３７°Ｃで一晩培
養した後、前述のＲｏｄｒｉｇｕｅｚらの方法（Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋　
ｅｄ。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ５１−ａｌ、＋　　ｐ、１６４−１
６５＋　　八ｄｄｉｓｏｎ−ＷｅｓｌｅｙＰｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　１９８３＞に従ってプラ
スミドを単離・抽出した。この形質転換体のプラスミド
を各種の制限酵素で切断して、アガロースゲル電気泳動
にかけることによって、このプラスミドはベクターｐ）
ｌＹ３００ＰＬににウリカーゼ遺伝子を含む３．０ｋｂ
のＢａｍ旧−Ｂｇｌｌｌ断片が挿入された組換えプラス
ミドｐＥ８２を保持していることが１１１１認された。

でのウリカーゼの ウリカーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＥ８２を枯
草菌ｌ５Ｗ１２１４株へ導入して得られた枯草菌組換え
体ＩＳ旧２１４／ｐＥＢ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ　−ｌヲｇ
ｔ　　）が生産するウリカーゼの同定・分析を以下のよ
うに行った。

枯草菌組換え体を１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと
０．２％のグルコースを含むしブロス液体培地中で３７
°Ｃ１−晩培養した。培養後、培養液１．０ｍｌを分取
し、８．　ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心にかけ、培養上清
と菌体に分けた。菌体は前述の１．０ｍｆの抽出バッフ
ァーに懸濁し、３７°Ｃで１０分間インキユソベートし
た後、遠心操作（１２，００Ｏｒｐｍ、　１０分）によ
り溶菌液の上清を得た。次に、培養上清と菌体の溶菌液
の上滑との各々２０μ２を同量の前述のサンプル処理液
に懸濁後、１００°Ｃで５分間熱処理し、Ｌａｅｍｎ＋
１ｉらの方法に従ってＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。泳動後、ゲルをクーマシーブリリア
ントブルーで染色し、脱色、乾燥後、濾紙に固定した。

その結果、組換えプラスミドｐＥ８２を含む枯草菌ｌ５
Ｗ１２１４株では、培養上清及び菌体の溶菌液の上清の
いずれの場合でも、分子置駒３５にのウリカーゼのバン
ドが検出され、この蛋白バンドは抗ウリカーゼ抗体（Ｉ
ｇＧ）　と特異的な交叉反応を示した。ゲル上の各蛋白
バンドをデンシトメーターで測定したところ、枯草菌ｌ
５Ｗ１２１４／ｐＥＢ２は、菌体内に全菌体蛋白当り０
．６％のウリカーゼを生産した。また、培養上清、つま
り菌体外には、菌体内の４０％に当たる量のウリカーゼ
が生産されていた。従って、枯草菌組換え体ｒｓｔ＋１
２１４／ｐＥ８２は、菌体内及び菌体外にウリカーゼを
生産することが判った。

〔発明の効果］ 以上詳述したように、本発明によりウリカーゼをコード
するＤＮＡ配列及びプラスミドを得ることができて、遺
伝子工学的にウリカーゼの生産等が可能になった。例え
ば、従来のウリカーゼに比較して安定性のよいウリカー
ゼをコードするＤＮＡ配列、かかるＤＮＡ配列を有する
プラスミド、かかるプラスミドを含む形質転換体の利用
による遺伝子工学的ウリカーゼの生産が可能になったも
のであり、産業の発達に寄与するものである。

【図面の簡単な説明】 図１（そのｌ、その２）は、バチルス・エスピＴＢ−９
０株のウリカーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列及び
対応するアミノ酸配列を示す図面である。 図２は、バチルス・エスピー　ＴＢ−９０株のウリカー
ゼをコードするＤＮＡ配列を有する大腸菌の組換えプラ
スミドｐＵＯＤ３１からの発現プラスミドｐＵＯＤ３１
６及びｐＫＬｌｌの構築方法を示す図面である。黒色及
び白色のボックスは、各々ウリカーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片及びｌａｃまたはｔａｃプロモータ一部分を示し
ている。ｌｉｇａｔｉｏｎとは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
よるＤＮＡ断片の連結反応を示す。 図３は、バチルス・エスピー　ＴＢ−９０株のウリカー
ゼをコードするＤＮＡ配列を有する枯草菌の組換えプラ
スミドｐＥ８２の構築方法を示す図面である。 黒色及び白色のボックスとｌｉｇａｔｉｏｎは、図２と
同様のものを示す。 Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ＾Ｓｎ
　Ｐｒｏ　１ｊｌｕ　ＡＳｎ　１ｙｒ　Ｗｉｋ１図２ 図１（その２） Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｌｌｅ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｉ
ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒ
ｇ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ＰｈｅＣＣＴ　
ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＡＣＴＴ
ＣＧＡＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＴ　ＡＣＡ　
ＴＧＧ　ＧＡＴ　Ａ＾＾ＡＴ＾Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａ
ｓｐ　Ｌｙｓ　１ｌｅ２９０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３０ＧＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ
　ｌ　ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ＾
ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。 １Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配
   列。 ２、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配
   列を有するプラスミド。 ３、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配
   列を有するプラスミドを含む形質転換体。 ４、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配
   列を有するプラスミドを含む形質転換体を培地に培養し
   てウリカーゼを蓄積せしめ、該ウリカーゼを採取するこ
   とを特徴とするウリカーゼの製造法。