JP2760973B2 - アミノ基転移酵素遺伝子ｔｙｒＢのクローニングおよびその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】フェニルアラニンの新規（de
novo)合成における最終段階は、アミノ基転移酵素（ト
ランスアミナーゼ）によるフェニルピルビン酸（phenyl
pyruvate）のアミノ化である。いろいろの酵素がフェニ
ルピルビン酸をアミノ基転移によってフェニルアラニン
とすることができるが、この機能は、いわゆる芳香族ア
ミノ基転移酵素によって細胞内で営まれる。大腸菌（E.
coli）の芳香族アミノ基転移酵素に対する、遺伝学で用
いられる略号は、ｔｙｒＢである(Umbarger, Ann. Rev.
Biochemistry 47(1978), 533-606参照）。Ｅ． ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２の場合には、この遺伝子の染色体上の位置
は、正確に判明しており、この遺伝子産物も、酵素番号
が付与されている（酵素番号２．６．１．５）（Bachma
nn et al.,Microbiological Reviews 44 (1980),1-56参
照）。 【０００２】 【従来の技術】ヨーロッパ公開特許出願第０，１１６，
８６０号明細書には、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２からのｔｙｒ
Ｂ遺伝子の分離とこのアミノ基転移酵素のマルチコピー
（multicopy ）プラスミドへのクローニングについての
記載がある。このクローニングした遺伝子を、その遺伝
子を分離した元の細菌株にもどすと、この細菌株におけ
るＬ‐フェニルアラニンの生産量が１１％まで増加す
る。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかし、Ｌ‐フェニル
アラニンの収量をより一層高めることが求められてい
る。 【０００４】 【課題を解決するための手段】大腸菌ＡＴＣＣ１１３０
３に存在するｔｙｒＢ遺伝子を分離し、マルチコピープ
ラスミドでクローニングし、このプラスミドで微生物、
特に元の細菌株、を形質転換すると、驚くべきことに、
Ｌ‐フェニルアラニンの収量が１０倍増加することがわ
かった。 【０００５】かくして、本発明は以下のことに関連する
ものである。 【０００６】１． Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３
より分離したｔｙｒＢ遺伝子を含む増殖性染色体外因
子。 【０００７】２． 芳香族アミノ基転移酵素合成のため
の、第１項に規定した染色体外因子の使用。 【０００８】３． 以下の段階（ａ〜ｃ）からなる、第
１項に規定した染色体外因子の微生物におけるＬ‐フェ
ニルアラニンの過剰生産のための使用。 【０００９】ａ） 微生物への染色体外因子の導入、 ｂ） 当該微生物におけるｔｙｒＢ遺伝子の発現と活性
な芳香族アミノ基転移酵素の合成、 ｃ） アミノ基転移酵素によるフェニルピルビン酸(phe
nylpyruvate)のアミノ化惹起。 【００１０】 【発明の実施の形態】本発明は以下の詳細な説明の項及
び特許請求の範囲の項で詳述及び規定されている。 【００１１】野生型のＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０
３だけでなく、その変種や突然変異体も使用することが
できる。例えば既知の方法（E.Adelberg et al., Bioch
em.Biophys. Res. Comm.18,788(1965) ）で突然変異を
おこさせ、Ｌ‐フェニルアラニンの過剰生産について選
別した株を使用することもできる。ｔｙｒＢがコードす
るＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３の芳香族アミノ基
転移酵素は、とりわけ、グルタミン酸（グルタメート）
からアミノ基を転移させることによりフェニルピルビン
酸からＬ‐フェニルアラニンを合成する。さらにこのア
ミノ基転移酵素を用いて、チロシン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸（aspartate）およびロイシンも合成する
ことができる。アミノ酸のイソロイシン、バリン、ロイ
シン、フェニルアラニン及びグルタミン酸は、ｉｌｖＥ
遺伝子がコードするアミノ基転移酵素を用いてつくられ
る。一方、アミノ酸のアスパラギン酸、グルタミン酸、
アェニルアラニンおよびチロシンは、その発現にａｓｐ
Ｃ遺伝子が必要なアミノ基転移酵素によって合成され
る。しかしながら、該アミノ基転移酵素は、別の二つの
アミノ基転移酵素のうちの一つに特異的に限定されたア
ミノ酸合成においても又、弱い活性を示す。Ｌ‐フェニ
ルアラニンの合成をさらに増加させるために、芳香族ア
ミノ基転移酵素をコードするｔｙｒＢ遺伝子をクローニ
ングする。これは、Ｅ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０３か
らＤＮＡを分離することにより達成される。このＤＮＡ
を部分消化し、生じた２０〜３０ｋｂの範囲にある種々
の大きさのフラグメントを、広範囲の宿主領域をもつレ
プリコンを有するコスミドに連結し、λファージの頭殻
に包みこむ。用いられるコスミドは、ｐＩＭＳ ６０２
６が好ましい。コスミドｐＩＭＳ６０２６はコスミドｐ
ＬＡＦＲ１（ＡＴＣＣ ３７１６７）から次のようにし
て、すなわち市販のＥｃｏＲＩフラグメント（ファルマ
シア，ウプサラ，スエーデン；Pharmacia, Uppsala, Sw
eden）でそのフラグメント上にトランスポゾンＴｎ９０
３のカナマイシン耐性遺伝子を有するものをコスミドｐ
ＬＡＦＲ１の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位にクローニング
することによって、得られる。挿入部として短いＤＮＡ
片が残るように、ＢａｍＨＩで消化し、続いて再連結を
行うことによって、ＥｃｏＲＩフラグメントの大部分を
欠失させることもできる。この挿入部では、ＢａｍＨＩ
切断箇所は二つのＥｃｏＲＩ切断箇所に接することにな
る。このＢａｍＨＩ切断箇所は、コスミドｐＬＡＦＲ１
には存在せず、クローニングのために用いることができ
る。包み込みを行なったコスミドと適切に調製したＥ．
ｃｏｌｉ ＤＧ３０の浮游液とのインキュベーション
（incubation）によってこのコスミドを微生物に導入す
る。Ｅ． ｃｏｌｉＤＧ３０は、三種のアミノ基転移酵
素、すなわちａｓｐＣ、ｉｌｖＥおよびｔｙｒＢ、を欠
いている。したがって、この株は完全培地では問題なく
増殖するけれども、最少培地では種々のアミノ酸を合成
できないので、増殖のためには、これらを外から供給し
なければならない。この株を用い、適切な培地を選択す
ることにより、取り込まれたＤＮＡが特定のアミノ基転
移酵素についての染色体の欠陥を補完できるものである
かどうかをしらべることができる。ｔｙｒＢ遺伝子の導
入は、無チロシン最少培地でのＥ．ｃｏｌｉＤＧ３０の
増殖の有無によって検出できる。チロシン合成について
の染色体の欠陥を、ｔｙｒＢ又はｉｌｖＥ又はａｓｐＣ
を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３に由来する
ＤＮＡの取り込みによって補完することができるクロー
ンのみがこの最少培地で増殖することができる。ａｓｐ
Ｃ、ｔｙｒＢ、およびｉｌｖＥ遺伝子によってコードさ
れるこの三つのアミノ基転移酵素は、すべて、チロシン
を作るけれども、その基質特異性が異る。 【００１２】例えば、ｔｙｒＢ遺伝子によってコードさ
れる芳香族アミノ基転移酵素はケト前駆体からイソロイ
シンを作ることはできないが、対応するケト前駆体から
ロイシンを高収量で合成することができる。ａｓｐＣ遺
伝子によってコードされるアミノ基転移酵素は、イソロ
イシンを作ることもできず又ロイシンに効率よく変換す
ることもできない。 【００１３】従って、特定の遺伝子に特徴的なアミノ酸
をのぞいて、代謝に必要なアミノ酸を補充した最少培地
上での増殖によって、どのアミノ基転移酵素を含むかと
いう点に関して個々のクローンを区別することができ
る。この方法で、ｔｙｒＢ遺伝子を含むＤＧ３０株のク
ローンが選別される。 【００１４】ここで、当該クローンが真にｔｙｒＢ遺伝
子を持つかどうかをしらべることが必要である。これに
は、クローンからプラスミドＤＮＡを分離する必要があ
る。しかしながら、ＤＧ３０株からのプラスミドＤＮＡ
の分離は困難である。可能ではあっても、低収率であ
る。かくして、最少溶菌後、興味のあるクローンからの
コスミドＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換し、それか
ら形質転換菌から、導入ＤＮＡを高収量で再分離するこ
とができる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４
９）は、この目的に特に適切である。 【００１５】次の段階では、再分離したコスミドＤＮＡ
を高いコピー数のベクターと連結する。Ｅ．ｃｏｌｉＫ
１２株の染色体遺伝子地図から、ｔｙｒＢ遺伝子はＣｌ
ａＩフラグメント上に在ることがわかっている。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＴＡＣＣ１１３０３でもそうである可能性があ
る。そこで、好ましいベクターとしてＣｌａＩ切断箇所
をもつマルチコピー(multicopy）プラスミドｐＡＴ１５
３がもちいられる。ｐＡＴ１５３は塩基配列がわかって
おり、特に好ましい(Winnacker, E.L., Gene und Klon
e，VCH-Verlagsgesellschaft, Weinheim 参照）。 【００１６】コスミドＤＮＡとこのベクターとを、制限
酵素ＣｌａＩで完全に消化する。二種のＤＮＡを混合
し、連結し、この連結産物を、フェニルアラニン産生を
増加させたい宿主微生物の受容細胞を形質転換するため
に使用する。用いる細菌は腸内細菌、特にＥ．ｃｏｌ
ｉ、が好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３お
よびその突然変異体および変種がとりわけ好ましい。耐
性コロニーをアンピシリンで選別し、テトラサイクリン
平板でレプリカ法によって、マーカ抑制を基にして、挿
入の有無をしらべる。プラスミドＤＮＡを最少溶菌によ
って適切なコロニーから分離し、ベクター中の Ｃｌａ
Ｉフラグメントの有無を、制限酵素ＣｌａＩで完全消化
することによってしらべる。この制限酵素による分析
は、元のＤＮＡ断片に含まれるすべてのＣｌａＩフラグ
メントがこの方法でサブクローニングされているという
ことを確認するために行われる。これらの限定ＣｌａＩ
フラグメントのひとつを含む各クローンを、芳香族アミ
ノ基転移酵素、すなわちｔｙｒＢの遺伝子産物、活性に
関してアスパルテート−フェニルピルベートアミノトラ
ンスフェラーゼ分析（ＡＰＰＡＴ）を用いて最終的にし
らべる。この方法でｔｙｒＢ活性を５〜１０倍、増加さ
せることができる。アガロースゲル電気泳動で、宿主株
のベクターはおよそ２．７ＭＢの大きさのＣｌａＩフラ
グメントを含むことを示すことができる。 【００１７】 【実施例】本発明は以下の例に於て詳細に述べられてい
る。特に規定されない限り、百分率データは重量に関す
るものである。 【００１８】例１ Ｅ．ｃｏｌｉからのコスミドｐＩＭＳ６０２６の分離お
よび消化 Ｅ．ｃｏｌｉからコスミドｐＩＭＳ６０２６を分離する
ために用いられた方法は、ハンフリーらの方法（Biochi
m. Biophys. Acta 383, 457-63 (1975)参照）か又は１
０倍のスケールで行ったバーンボイム（Birnboim）とド
ーリー（Doly）の方法（Nucleic Acids Res. 7:151参
照）によるアルカリ溶菌のいずれかであった。いずれの
場合にも、プラスミドＤＮＡは、塩化セシウム／臭化エ
チジウム密度勾配遠心法で少くとも一回精製した。コス
ミドｐＩＭＳ６０２６は製造元であるニュー・イングラ
ンド・バイオラブ社（New England Biolabs ）の指定し
た方法でＢａｍＨＩで完全に消化された。消化が完全に
行われたかどうか、しらべるために制限酵素反応物の混
合液の一部をとって０．８％アガロースゲルで電気泳動
を行った。臭化エチジウムで染色した後、短波長紫外線
（２５４ｎｍ）照射による単一のバンドの出現で消化の
完全さが示された。フェノール処理で、消化したコスミ
ドＤＮＡから制限酵素をとりのぞき、 ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、真空中で
乾燥させ、ティーイー（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭトリ
ス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で適量とした。場
合により、製造元のベーリンガーマンハイム（Boehring
er Mannheim）の指示する方法でアルカリホスファター
ゼ処理をほどこした。１μｌアルカリホスファターゼ
（ＣＩＰ）を添加して３７℃、３０分間、反応混合液の
インキュベーションを行い、フェノール処理で酵素を取
除き、上に述べた方法でＤＮＡを精製した。ＤＮＡは最
終的に、ＴＥ緩衝液に再浮游させた。 【００１９】例２ Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３からのＤＮＡの部分
消化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３から、全 ＤＮＡを
マーマー（Marmur）の方法（J. Mol. Biol. 53, 155-
162, (1961) 参照）で分離した。分離した全ＤＮＡを、
生成フラグメントが主に ２０−３０ｋｂの範囲の大き
さとなるように、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化した。
この目的のために適切なＤＮＡと酵素の比率、及び最適
な酵素とＤＮＡの反応時間を確立するために予備試験を
行った。適切な方法はビー・アール・エル（ＢＲＬ）刊
行の「フォーカス（focus ）（page3, vol 7 No2, 198
5）に記載されている。最適であると判明した反応時間
の経過後、６５℃、１０分間加熱することにより酵素を
分解し、望ましい大きさのＤＮＡフラグメントが生じた
か否かは、適切なＤＮＡマーカー例えばＥｃｏＲＩで消
化したλファージＤＮＡを用いてアガロースゲル電気泳
動を行うことによりしらべた。 【００２０】例３ 制限酵素反応物の連結 部分的にＳａｕ３Ａで消化した、Ｅ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ
１１３０３からの全ＤＮＡとＢａｍＨＩで完全に切断
し、アルカリホスファターゼで処理したｐＩＭＳ６０２
６コスミドＤＮＡとをモル比１：５で混合した。この混
合物を、ニューイングランドバイオラブ社（New Englan
d Biolabs ）が記載したように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
とって最適なイオン強度となるように、数倍濃縮した緩
衝液に混合し、１μｌの酵素と１６℃で少くとも １４
時間、インキュベーションを行った。この混合物の全容
積は５０μｌで全ＤＮＡ濃度は２０μｇ／mlであった。 【００２１】例４ ファージλの包みこみ（Packaging ） リガーゼによる反応の後、例３のようにして得られたＤ
ＮＡはインビトロ（invitro）でファージλの頭殻に包
みこんだ。この目的のために必要な二種類の異った細菌
からの抽出物は、ホーン（Hohn）の方法（Wu, R.編；Re
combinant DNA,Methods in Enzymology, vol.68, Acade
mic Press ，New York, ２９９−３０９ページ（１９７
９）参照）で調製するか又はベーリンガーマンハイム
（Boehringer Mannheim ）かアマーシャム バックラー
（Amersham Buchler, Braunschweing ）から購入でき
る。例３のようにして得た混合物の３μｌとアマーシャ
ム（Amersham）から供給され、直前に融解させた細菌抽
出物とを氷で冷却しつつ、十分に混合した。この混合物
を２０℃で３０〜６０分間、インキュベーションし、そ
の後、２００μｌのエスエム（ＳＭ）緩衝液（１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４，５０ｍＭ ｔｒ
ｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０１％ゼラチン）を
加えた。この混合物を直接形質導入に用いるか又は、後
の使用に供するため、１０μｌのクロロホルムを添加し
て、４℃で保存した。 【００２２】例５ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＧ３０の形質導入 ０．４％のマルトースを、１％バクトトリプトン（Bact
o Tryptone），０．５％酵母抽出物及び０．５％の塩化
ナトリウムからなるＬブロス（L broth ）の５mlに添加
し、この混合物に、 ５０μｌの増殖静止期にあるＥ．
ｃｏｌｉ ＤＧ３０の液体培地を接種した。初期増殖静
止期に到達するまでこれを３７℃、１２時間培養した。
細菌を遠心沈殿させ、塩化マグネシウム１０ｍＭ水溶液
２．５mlに注意深く再浮游させた。例４の混合物１０
μｌと、濃縮細菌浮游液２０μｌとを混合し、この混合
物を室温で５０分間、インキュベーションした。 【００２３】その後、２００μｌのＬブロスを添加し、
混合物を時々、攪拌しながら１時間３７℃でインキュベ
ーションした。この５０μｌを２０μｇ／mlのテトラサ
イクリンを含むＬブロス寒天にうえた。この寒天平板を
少くとも１２時間３７℃でインキュベーションした。す
でに記述した方法で、１バッチ当り平均１０００コロニ
ー得ることができた。 【００２４】例６ ａｓｐＣ又はｉｌｖＥ又はｔｙｒＢ遺伝子を有するＥ．
ｃｏｌｉ ＤＧ３０の選別 先きに述べた方法で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＧ３０の形質導
入後、２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬブロス
寒天上で得られたおよそ８００コロニーを最少寒天培地
に釣り上げた。最少寒天培地は、イソロイシン、ロイシ
ン、バリン、アスパラギン酸、フェニルアラニンを添加
したグルコース入りＭ９培地から成る。しかしながら、
ＤＧ ３０株が同様に合成することができないアミノ
酸、チロシンは当該培地には添加しなかった。釣り上げ
た８００個のコロニーのうち、７個がこの最少培地で増
殖することができた。 【００２５】Ｅ．ｃｏｌｉに導入された想定されうる三
種の遺伝子ａｓｐＣ及びｉｌｖＥ及びｔｙｒＢを識別す
るために、これら７個のコロニーを上記の最少培地に再
び釣り上げた。この最少培地は下に挙げた表のアミノ酸
を添加されているが、各場合、一種類のアミノ酸を除い
てある。これら各々の場合について、各遺伝子がコード
するアミノ基転移酵素はそれぞれ基質特異性を有する。 【００２６】結果を下の表に示す。_{クローン アミノ酸添加培地に 想定され} 含まれないアミノ酸 る遺伝子_{アスパラ ロイシン イソロイ チロシン} ギン酸 シン １ ＋ ＋ − ＋ ｔｙｒＢ ２ ＋ ＋ − ＋ ｔｙｒＢ ３ − ＋− ＋ ＋− ｉｌｖＥ ４ − ＋− ＋ ＋− ｉｌｖＥ ５ ＋ ＋ − ＋ ｔｙｒＢ ６ ＋ ＋ − ＋ ｔｙｒＢ ７ − ＋− ＋ ＋− ｉｌｖＥ ＋ ＝増殖良好 ＋−＝増殖不良 − ＝増殖なし 【００２７】例７ ｔｙｒＢ遺伝子の位置決定 マニアーティスらの方法（Maniatis et al., Cold Spr
ing Harbor, ３６６ページ〜３７０ページ（１９８２）
参照）による最少溶菌で、例６で得られたクローン１〜
７からコスミドＤＮＡを得た。このコスミドＤＮＡをそ
れからＥ．ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）に
導入した。この菌から高収量でコスミドＤＮＡを再分離
することができた。 【００２８】このＤＮＡで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ１から本来Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＧ３０のクローン５
（例６参照）から得られたプラスミドＤＮＡが、分離さ
れた。このプラスミドＤＮＡを製造元のニューイングラ
ンドバイオラブ(New EnglandBiolabs ）の指示に従って
制限酵素ＣｌａＩで完全に消化した。ベクターｐＡＴ１
５３を同様に完全にＣｌａＩで消化し、その後アルカリ
ホスファターゼ処理を行なった。この二つのＤＮＡを混
合し例４ですでに述べた方法で連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＡＴＣＣ １１３０３の受容菌を、このリガーゼ混合物
の例えば１０μｌで形質転換した。５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含むＬブロス平板で選別した耐性コロニーを
レプリカ法で２０μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬ
ブロス平板でマーカーインアクチベーションについて、
すなわち挿入についてしらべた。アンピシリン耐性テト
ラサイクリン感受性の表現形質を示すコロニーから、最
少溶菌によってプラスミドＤＮＡを分離し、ベクターｐ
ＡＴ１５３中のＣｌａＩフラグメントの有無をＣｌａＩ
制限酵素による完全消化でしらべた。 【００２９】例８ アミノ基転移酵素活性の検査 ＡＰＰＡＴ分析（シグマ・テスト・キットＧＯ３９０。
このキットではα‐ケトグルタール酸（α‐ケトグルタ
レート）がフェニルピルビン酸におきかえられた。）を
用いて芳香族アミノ基転移酵素、すなわちｔｙｒＢの遺
伝子産物、の活性についてしらべた。未形質転換出発菌
株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １１３０３を比較のため
に用いた。この測定によって、１例に於て出発菌株Ｅ．
ｃｏｌｉＡＴＣＣ １１３０３と比較してｔｙｒＢ活性
の著明な増加、特に５〜１０倍増加、が判った。 【００３０】適切なマーカーを用いてアガロースゲル電
気泳動で、ｔｙｒＢ遺伝子活性の増加を示したこの株が
ｐＡＴ１５３ベクターを含んでいることを示すことがで
きた。このベクターはおよそ２．７ＭＢの大きさの編入
ＣｌａＩフラグメントを含んでいた。分離したプラスミ
ドＤＮＡを再びプラスミドをもたないＥ．ｃｏｌｉＡＴ
ＣＣ１１３０３の形質転換に用いたとき、各事例につき
ｔｙｒＢ活性の５〜１０倍増加をみとめることができ
た。このプラスミドをｐＩＭＳ６０５６と名づけた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ハンス‐マティアス、デーガー ドイツ連邦共和国ホーフハイム、アム、 タウヌス、アム、ラインガウアー、ウェ ーク、８ (72)発明者 ゲハルト、ウェーナー ドイツ連邦共和国フレールスハイム、ア ム、マイン、フレールスハイマー、シュ トラーセ、27 (72)発明者 マーティン、ロビンソン イギリス国バークシャー、メイドゥンヘ ッドプリンス、アンドルー、ロード、45 (72)発明者 アンドルー、ドハーティー イギリス国バッキンガムシャー、ボー ン、エンド、ゴディントン、ロード、５ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/22 C12N 15/54 C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３の微生
   物において、出発株と比較して増加した量でＬ−フェニ
   ルアラニンを生産する方法であって、出発株としての
   Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３から制限酵素Ｓａｕ
   ３Ａで消化した２０〜３０ｋｂのＤＮＡを、ＢａｍＨＩ
   で消化したコスミドｐＩＭＳ６０２６と共にファージλ
   に包み込み、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＧ３０を形質導入し、Ｌ
   −フェニルアラニンの合成能に基づいてスクリーニング
   を行い、次いでコスミドＤＮＡを単離し、得られたＤＮ
   ＡをＣｌａ１で消化することにより得られる、ｔｙｒＢ
   遺伝子を含有する約２．７ＭＢの大きさのＤＮＡ断片を
   有する増殖性染色体外因子を用いて該微生物を形質転換
   し、 活性な芳香族アミノ基転移酵素の合成により、該微生物
   中においてｔｙｒＢ遺伝子を発現させ、 上記アミノ基転移酵素によってフェニルピルビン酸（ｐ
   ｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ）をアミノ化する、工程を
   含むことを特徴とする、方法。 ２．該染色体外因子が、マルチコピープラスミドであ
   る、請求項１に記載の方法。 ３．該マルチコピープラスミドがｐＡＴ１５３である、
   請求項２に記載の方法。 ４．該微生物がＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ１１３０３であ
   る、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。