JPS6251980A - 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法Info
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- JPS6251980A JPS6251980A JP60191523A JP19152385A JPS6251980A JP S6251980 A JPS6251980 A JP S6251980A JP 60191523 A JP60191523 A JP 60191523A JP 19152385 A JP19152385 A JP 19152385A JP S6251980 A JPS6251980 A JP S6251980A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、３−デオキシ−〇−アラビノーへグチェロ
ン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「ＤＳ」と記す）が
組込まれている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌及び
それを用いるＬ−ト！Ｊグトファンの製造法に関する。
ン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「ＤＳ」と記す）が
組込まれている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌及び
それを用いるＬ−ト！Ｊグトファンの製造法に関する。
従来の技術
ＤＳは、ホスホエノールピルビン酸とエリスロース４−
リン酸よシの３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へグチェロ
ン酸−７−リン酸（以下［ＤＡＨＰ Ｊと記す〕の合成
を触媒する酵素であ、！ｌ） 、ＤＡＨＰは、コリスミ
酸を経由してフェニルアラニン、チロシン又”はトリプ
トファンに変換される。コリネ型細菌では、ＤＳ活性は
、最終生産物であるフェニルアラニンとチロシンによる
相乗的な阻害を受けることが知られてお夛、Ｌ−）リプ
ドアアン生産菌を育種する場合、この阻害の解除した強
力なりＳ活性を保持する株を選択することが重要である
。
リン酸よシの３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へグチェロ
ン酸−７−リン酸（以下［ＤＡＨＰ Ｊと記す〕の合成
を触媒する酵素であ、！ｌ） 、ＤＡＨＰは、コリスミ
酸を経由してフェニルアラニン、チロシン又”はトリプ
トファンに変換される。コリネ型細菌では、ＤＳ活性は
、最終生産物であるフェニルアラニンとチロシンによる
相乗的な阻害を受けることが知られてお夛、Ｌ−）リプ
ドアアン生産菌を育種する場合、この阻害の解除した強
力なりＳ活性を保持する株を選択することが重要である
。
一方、組換えＤＮＡ法を用いて、コリネ型細菌における
Ｌ−）リプドアアン生産菌を育種することは、特開昭５
９−１５６２９２で報告されているが、ＤＳをコードす
る遺伝子が組込まれたものではない。また、ＤＳをコー
ドする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを有するコリネ型
細菌において、Ｌ−フェニルアラニンあるいはＬ−チロ
シン生産菌を育種した例は、特願昭５９−２４５７００
で報告されているがＬ−）リプドアアン生産菌を育種し
た例は無い。
Ｌ−）リプドアアン生産菌を育種することは、特開昭５
９−１５６２９２で報告されているが、ＤＳをコードす
る遺伝子が組込まれたものではない。また、ＤＳをコー
ドする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを有するコリネ型
細菌において、Ｌ−フェニルアラニンあるいはＬ−チロ
シン生産菌を育種した例は、特願昭５９−２４５７００
で報告されているがＬ−）リプドアアン生産菌を育種し
た例は無い。
発明が解決しようとする問題点
この発明は、Ｌ−）！Ｊグト７アンの生産性がよシ高い
微生物を得ること、及びそれによってＬ−トリプトファ
ンのよ）効率のよい製造法を見い出すことにある。
微生物を得ること、及びそれによってＬ−トリプトファ
ンのよ）効率のよい製造法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段
本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研究の結果
、コリネ型細菌細胞内で発現しＤＳをコードする遺伝子
がコリネ型細菌細胞内で増殖しうるグラスミドベクター
に接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を
分離することに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−）
リプドアアンの高い生産性を有することを見い出した。
、コリネ型細菌細胞内で発現しＤＳをコードする遺伝子
がコリネ型細菌細胞内で増殖しうるグラスミドベクター
に接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を
分離することに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−）
リプドアアンの高い生産性を有することを見い出した。
本発明にいうコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂ
ａｃｔｅｒｉｍ）は、バーシース・マニュアル・オプ・
デターミネイティプ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇ＠ｙ
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔ＠ｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４
）に定義されている一群の微生物であり、好気性、ダラ
ム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である。
ａｃｔｅｒｉｍ）は、バーシース・マニュアル・オプ・
デターミネイティプ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇ＠ｙ
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔ＠ｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４
）に定義されている一群の微生物であり、好気性、ダラ
ム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である。
このよりなコリネ型細菌のうち特に以下に述べるような
コリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明においては、
最も好ましいものである。
コリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明においては、
最も好ましいものである。
コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性味の例としては
次のようなものがあげられる。
次のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディパリカタム ＡＴ
ＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・す、カロリティク
ム ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・イ
ンマリオフイルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３
８６９プレビパクテリクム・ロゼラム
ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウ
ム・チオグエタリス ＡＴＣＣ１９２４０コ
リネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣ
Ｃ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリウム・カル
ナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリネバク
テリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，１
３０６０コリネパクテリクム・リリウム Ａ
ＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ
ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモ
ニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４本発明のコリネ型グ
ルタミン酸生産性細菌には上記のようなグルタミン酸生
産性を有する野性味のほかにグルタミン酸生産性を有す
るまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含まれる
。
ＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・す、カロリティク
ム ＡＴＣＣ１４０６６プレビパクテリウム・イ
ンマリオフイルム ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３
８６９プレビパクテリクム・ロゼラム
ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリウ
ム・チオグエタリス ＡＴＣＣ１９２４０コ
リネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣ
Ｃ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ＡＴＣＣ１５８０６コリネパクテリウム・カル
ナエ ＡＴＣＣ１５９９１コリネバク
テリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２，１
３０６０コリネパクテリクム・リリウム Ａ
ＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ
ＡＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモ
ニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４本発明のコリネ型グ
ルタミン酸生産性細菌には上記のようなグルタミン酸生
産性を有する野性味のほかにグルタミン酸生産性を有す
るまたはグルタミン酸生産性を失った変異株も含まれる
。
ＤＳ遺伝子を単離する方法は、コリネ型１）Ｒ菌のＤＳ
遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し
く例えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ Ｂ
ｉｏａｈｅｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２．６
１９． （１９６３）の方法が使用できる。〕、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌細胞
内で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた
組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌のＤＳ欠損変異株を
形質転換せしめ、ＤＳ生成活性を保有するにいたった菌
株を単離し、これよりＤＳ遺伝子を分離できる。
遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し
く例えばＨ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ Ｂ
ｉｏａｈｅｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２．６
１９． （１９６３）の方法が使用できる。〕、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌細胞
内で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた
組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌のＤＳ欠損変異株を
形質転換せしめ、ＤＳ生成活性を保有するにいたった菌
株を単離し、これよりＤＳ遺伝子を分離できる。
また、同様の組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌の野生
株を形質転換せしめ、ＤＳ活性に阻害効果を有する芳香
族アミノ酸のアンタゴニストなどに耐性を保持するにい
たった菌株を単離し、これよ“すＤＳ遺伝子を分離する
ことも可能である。
株を形質転換せしめ、ＤＳ活性に阻害効果を有する芳香
族アミノ酸のアンタゴニストなどに耐性を保持するにい
たった菌株を単離し、これよ“すＤＳ遺伝子を分離する
ことも可能である。
芳香族アミノ酸のアンタゴニストの例としては、ｏ−フ
ルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニ
ン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニン、β−３−チェニルアラニン、３−アミノチ
ロシン、チロシンヒドロキサメート、５−メチルトリッ
ト７アン等がある。
ルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニ
ン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニン、β−３−チェニルアラニン、３−アミノチ
ロシン、チロシンヒドロキサメート、５−メチルトリッ
ト７アン等がある。
ＤＮＡ供与菌としては、前記の芳香族アミノ酸アンタゴ
ニスト耐性などの変異を付与することにより、芳香族ア
ミノ酸またはその前駆体の生合成活性が高まったような
変異株を用いれば更によい。
ニスト耐性などの変異を付与することにより、芳香族ア
ミノ酸またはその前駆体の生合成活性が高まったような
変異株を用いれば更によい。
ここにいう芳香族アミノ酸の前駆体とはＤＡＨＰ３−デ
ヒドロキナ酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキ
ミ酸−３−リン酸、５−エノールビルビルシキミ酸−３
−リン酸、コリズミン酸、プレ７エン酸、フェニルピル
ビン酸、アントラニル酸、インドール３−グリセロール
リン酸などをいう。
ヒドロキナ酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキ
ミ酸−３−リン酸、５−エノールビルビルシキミ酸−３
−リン酸、コリズミン酸、プレ７エン酸、フェニルピル
ビン酸、アントラニル酸、インドール３−グリセロール
リン酸などをいう。
このような変異株の例としては外檜梼≠央米国特許３，
６６０．２３５、米国特許３，７５９，９７０、特開昭
５６−６４７９３等に記載されている。
６６０．２３５、米国特許３，７５９，９７０、特開昭
５６−６４７９３等に記載されている。
ＤＳ遺伝子として、野性型のものを用いることができる
し、更に変異株の遺伝子を用いることもできる。変異株
遺伝子として、フェニルアラニンとチロシンによる相乗
阻害の程度が軽減されたＤＳをコードするように変異さ
れたものが特に好ましい。
し、更に変異株の遺伝子を用いることもできる。変異株
遺伝子として、フェニルアラニンとチロシンによる相乗
阻害の程度が軽減されたＤＳをコードするように変異さ
れたものが特に好ましい。
変異型の遺伝子を得るには、ＤＮＡ供与菌を変異処理し
てもよいし、ＤＳ遺伝子をベクタープラスミドに挿入後
、得られた組換えＤＮＡ ｙｋＤＮＡ受容菌に導入し得
られた形質転換株を変異処理しても良い。更に、上記組
換えＤＮＡ自体を生体外で変異処理しても、変異型遺伝
子を得ることもできる。
てもよいし、ＤＳ遺伝子をベクタープラスミドに挿入後
、得られた組換えＤＮＡ ｙｋＤＮＡ受容菌に導入し得
られた形質転換株を変異処理しても良い。更に、上記組
換えＤＮＡ自体を生体外で変異処理しても、変異型遺伝
子を得ることもできる。
染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度′ｔ−調節すれば、巾広い種類の制限酵
素が使用できる。
して切断の程度′ｔ−調節すれば、巾広い種類の制限酵
素が使用できる。
本発明にて使用されるグラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
（１） ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９
参照（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７
８９５参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−
１９２９００参照（４） ｐＡＪ ６１１
同 上（５） ｐＡＪ １８４４
同 上（６） ＰＣＧ １
特開昭５７−１３４５００参照（７） ｐＣＧ ２
特開昭５８−３５１９７参照（８） ｐＣＧ
４ 特開昭５７−１８３７９９参照（９） ｐ
ＣＧ １１ 同 上グラスミド
ベクターＤＮＡの開裂は、描該ＤＮＡを一箇所で切断す
る制限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制
限酵素を用いて部分的に切断することにより行う。
参照（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７
８９５参照（３） ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−
１９２９００参照（４） ｐＡＪ ６１１
同 上（５） ｐＡＪ １８４４
同 上（６） ＰＣＧ １
特開昭５７−１３４５００参照（７） ｐＣＧ ２
特開昭５８−３５１９７参照（８） ｐＣＧ
４ 特開昭５７−１８３７９９参照（９） ｐ
ＣＧ １１ 同 上グラスミド
ベクターＤＮＡの開裂は、描該ＤＮＡを一箇所で切断す
る制限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制
限酵素を用いて部分的に切断することにより行う。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素によシ切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリｗｅヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
ＤＮＡ ７ラグメントとのライダージョン反応に付され
る。
れた制限酵素によシ切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリｗｅヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
ＤＮＡ ７ラグメントとのライダージョン反応に付され
る。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクターグラ
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄａ ｌ 、Ｍ、 ａｎｄ
Ｈｉｇａ、 Ａ、、Ｊ、Ｍｏ１．、 Ｂｉｏｌ、、 ５
３．１５９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様（Ｄｕｎｃａｎ、
Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌａｏｎ、 Ｇ、Ａ、 ａｎｄ Ｙｏ
ｕｎｇ。
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌
へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１２について
報告されている様な（Ｍａｎｄａ ｌ 、Ｍ、 ａｎｄ
Ｈｉｇａ、 Ａ、、Ｊ、Ｍｏ１．、 Ｂｉｏｌ、、 ５
３．１５９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様（Ｄｕｎｃａｎ、
Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌａｏｎ、 Ｇ、Ａ、 ａｎｄ Ｙｏ
ｕｎｇ。
Ｆ、Ｅ、、Ｇｏｎｅ、 １．１５３ （１９７７））細
胞がＤＮＡを取シ込み得る様になる増殖段階（いわゆる
コンピテントセル）に導入する方法によシ可能である。
胞がＤＮＡを取シ込み得る様になる増殖段階（いわゆる
コンピテントセル）に導入する方法によシ可能である。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、 ａｎｄ
Ｃｈｏｅｎ。
について知られている様に（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、 ａｎｄ
Ｃｈｏｅｎ。
５−Ｎｒ ｅ Ｍｏ １ ｅｅ −Ｇｅｎ −ｓ Ｇｅ
ｎｅ ｔ −ｔ １６８ ＊ １１１ （１９７９）
：Ｂｉｂｂ ｐＭ、Ｊ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、Ｌ ａｎ
ｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ、 Ｏ，Ａ、 、 Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７４３９８（１９７８） ：Ｈｌｎｎｅｎ、Ａ、
、 Ｈｌｃｋｓ、 Ｊ、Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ。
ｎｅ ｔ −ｔ １６８ ＊ １１１ （１９７９）
：Ｂｉｂｂ ｐＭ、Ｊ、、 Ｗａｒｄ、 Ｊ、Ｌ ａｎ
ｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ、 Ｏ，Ａ、 、 Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７４３９８（１９７８） ：Ｈｌｎｎｅｎ、Ａ、
、 Ｈｌｃｋｓ、 Ｊ、Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ。
Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｅａｄ、Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ、 ７５１９２９（１９７８））、ＤＮＡ受
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスオドをＤＮＡ
受容菌に導入することも可能である。
、 ＵＳＡ、 ７５１９２９（１９７８））、ＤＮＡ受
容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロトプラ
ストまたはスフェロプラストにしてプラスオドをＤＮＡ
受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高ｌＡ頻度を得ること
ができるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロ
トプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニル
アルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとシ
込ませる方法も当然利用できる。４？リエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールの代９に、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、フィコール、ツルロ
ニックＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡの
とシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高ｌＡ頻度を得ること
ができるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロ
トプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニル
アルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとシ
込ませる方法も当然利用できる。４？リエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールの代９に、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、フィコール、ツルロ
ニックＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡの
とシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
Ｌ−トリプトファン生産菌として、野生株あるいはＤＳ
欠損株を宿主として形質転換した株を用いることができ
るが、ｍ下に示すような宿主を用いればよりＬ −）
１）ブトファンの生産性が高い菌株が得られることがあ
る。
欠損株を宿主として形質転換した株を用いることができ
るが、ｍ下に示すような宿主を用いればよりＬ −）
１）ブトファンの生産性が高い菌株が得られることがあ
る。
即ち、ブレビバクテリウム属のフェニルアラニン、チロ
シンを要求し、５−メチルトリプトファンに耐性を有す
る変異株（１，５ｈｉｉｏ 、 Ｈ，５ａｔｏ 、 Ｍ
。
シンを要求し、５−メチルトリプトファンに耐性を有す
る変異株（１，５ｈｉｉｏ 、 Ｈ，５ａｔｏ 、 Ｍ
。
Ｎａｋａｇａｗａ 、 Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、旦、 ２３１５（１９７２））、ブレビバク
テリウム属の７エニルアラニンを要求し、ｍ−フルオロ
フェニルアラニン、５−フルオロトリプトファンに耐性
を有する変異株（１，５ｈｉｉｏ。
ｈｅｍ、旦、 ２３１５（１９７２））、ブレビバク
テリウム属の７エニルアラニンを要求し、ｍ−フルオロ
フェニルアラニン、５−フルオロトリプトファンに耐性
を有する変異株（１，５ｈｉｉｏ。
Ｓ、 Ｓｕｇｉｍｏｔｏ 、 Ｍ、 Ｎａｋａｇａｗａ
、、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３９
。
、、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３９
。
６２７（１９７５））、 ブレビバクテリウム属のチ
ロシンを要求し、５−フルオロトリプトファン、アゾセ
リンに耐性を有する変異株、コリネパクテリクム属の７
エニルアラニン、チロシンを要求し、５−メチルトリブ
トファン、４−メチルトリブトファン、６−フルオロト
リプトファン、トリシト７アンヒトロキテメート、ｐ−
フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメート
、フェニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する変
異株（Ｈ，Ｈａｇｉｎｏ、 Ｋ、 Ｎａｋａｙａｍａ、
、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３９
。
ロシンを要求し、５−フルオロトリプトファン、アゾセ
リンに耐性を有する変異株、コリネパクテリクム属の７
エニルアラニン、チロシンを要求し、５−メチルトリブ
トファン、４−メチルトリブトファン、６−フルオロト
リプトファン、トリシト７アンヒトロキテメート、ｐ−
フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメート
、フェニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する変
異株（Ｈ，Ｈａｇｉｎｏ、 Ｋ、 Ｎａｋａｙａｍａ、
、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ３９
。
３４５（１９７５））等がある。
このようにして得られたＬ−）リグドアアン生産能を有
するコリネ型細菌を培養してＬ−）リグドアアンを生成
蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌によるＬ−）リ
グドアアンの製造のために使用されていた方法と特に大
きく違う点はない。
するコリネ型細菌を培養してＬ−）リグドアアンを生成
蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌によるＬ−）リ
グドアアンの製造のために使用されていた方法と特に大
きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更
に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源トンては、グルコー
ス、シェフロース、ラクトース等及びこれらを含有する
殿粉加水分解液、ホエイ、゛糖蜜等が用、いられる。窒
素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。
に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を
含有する通常のものである。炭素源トンては、グルコー
ス、シェフロース、ラクトース等及びこれらを含有する
殿粉加水分解液、ホエイ、゛糖蜜等が用、いられる。窒
素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地の−及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ −ト１）ブト７アンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
つ、実質的にＬ −ト１）ブト７アンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。
実施例
（１）ＤＳ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製染色体ＤＮ
Ａの調製源としては、フェニルアラニンによるＤＳの阻
害が解除したことによって、フェニルアラニンアナログ
であるｍ−フルオロフェニルアラニンに対して抵抗性を
有するに到ったフェニルアラニン生産菌ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムＡＪ １１９５７ （ＦＥ
ＲＭ−Ｐ６６７３）を用いた。
Ａの調製源としては、フェニルアラニンによるＤＳの阻
害が解除したことによって、フェニルアラニンアナログ
であるｍ−フルオロフェニルアラニンに対して抵抗性を
有するに到ったフェニルアラニン生産菌ブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタムＡＪ １１９５７ （ＦＥ
ＲＭ−Ｐ６６７３）を用いた。
この菌を１１のＣＭＧ培地（ベグトン１９７ｄｉ、酵母
エキス１ｆ／Ｕ、 グルコース０．５ Ｐ／ｄｌ 、
及びＮａＣ）０、５／Ｊを含み、ｐＨ７，２に調整した
もの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、
対数増殖期の菌体を集めた。
エキス１ｆ／Ｕ、 グルコース０．５ Ｐ／ｄｌ 、
及びＮａＣ）０、５／Ｊを含み、ｐＨ７，２に調整した
もの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、
対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
の７エノール処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３．５■のＤＮＡを得た。
の７エノール処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３．５■のＤＮＡを得た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ １８４４ （分子量５．４メガ
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した
。
まｆ ｐＡＪ １８４４ をグラスミドとして保有す
るプＬ’ ｋ’ バクテリクムーラクト７エルメンタム
ＡＪ１２０３７（Ｆ母圓ＢＰ−５７７）を１００ｍ１の
ＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養
したのち、リゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌させ、３０
．０００Ｘｊｌ。
るプＬ’ ｋ’ バクテリクムーラクト７エルメンタム
ＡＪ１２０３７（Ｆ母圓ＢＰ−５７７）を１００ｍ１の
ＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養
したのち、リゾチームＳＤＳ処理によシ溶菌させ、３０
．０００Ｘｊｌ。
３０分の超遠心により上清を得た。フェノール処理のの
ち、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収した。
ち、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収した。
これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ ト＋）ス塩酸塩
、２０ ｍＭ ＮａＣノ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ
８，０） ）に溶解後、アブロースグル電気泳動にかけ
分離後、切シ出してｐＡＪ １８４４ ｆラスミドＤＮ
Ａ約１５μ２を得た。
、２０ ｍＭ ＮａＣノ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ
８，０） ）に溶解後、アブロースグル電気泳動にかけ
分離後、切シ出してｐＡＪ １８４４ ｆラスミドＤＮ
Ａ約１５μ２を得た。
（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡｌ０μ２と（２）で得たグラスミドＤＮ
Ａ ５μノとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉでそ
れぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。
た染色体ＤＮＡｌ０μ２と（２）で得たグラスミドＤＮ
Ａ ５μノとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉでそ
れぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。
６５℃に１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４７アーソ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ
鎖を連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５分間
加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結され
たＤＮＡの沈澱を採取した。
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４７アーソ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ
鎖を連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５分間
加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結され
たＤＮＡの沈澱を採取した。
（４） ＤＳ遺伝子のクローニング
ＤＮＡ受容菌としては、ｍ−フルオロフェニルアラニン
感受性のブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡ
Ｊ １２０３６ （ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９）を用いた。
感受性のブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡ
Ｊ １２０３６ （ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９）を用いた。
形質転換の方法としては、グロトゾラス））ランス７オ
ーメーシ目ン法を用いた。まず、菌株を５１ｎｌのＣＭ
Ｇ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリン
Ｇを０．６ユニツ）７ｍ７添加後、さらに１．５時間根
強培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍ
シー−クロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ｍＭ塩化マ
グネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｒｅｏ）
からなるＳＭＭＰ培地（ｐｉ−１６，５）０．５−で洗
浄した。次いで１０ ｍｐＡ／のりゾチームを含むＳＭ
ＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトゲラスト化を
図った。６０００Ｘノ、１０分間遠心分離後、プロトプ
ラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５１１！ｊのＳＭＭＰに
再度懸濁した。この様にして得られたプロトゲラストと
（３）で調製したＤＮＡｌ０μＦを５ｍＭＥＤＴＡ存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終密度が３０
％になる様に添加した後、ＤＮＡをプロトゲラストに取
シ込ませるために室温に２分間放置した。このプロトシ
ラスト’ｉ ＳＭＭＰ培地１ｄで洗浄後、ＳＭＭＰ培地
１ｒＬｔに再懸、濁し、形質発現のため、３０℃で２時
間培養した。この培養液をｐ）ｉ ７． Ｏのグロトグ
ラスト再生培地上に塗布した。
ーメーシ目ン法を用いた。まず、菌株を５１ｎｌのＣＭ
Ｇ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリン
Ｇを０．６ユニツ）７ｍ７添加後、さらに１．５時間根
強培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍ
シー−クロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ｍＭ塩化マ
グネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｒｅｏ）
からなるＳＭＭＰ培地（ｐｉ−１６，５）０．５−で洗
浄した。次いで１０ ｍｐＡ／のりゾチームを含むＳＭ
ＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトゲラスト化を
図った。６０００Ｘノ、１０分間遠心分離後、プロトプ
ラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５１１！ｊのＳＭＭＰに
再度懸濁した。この様にして得られたプロトゲラストと
（３）で調製したＤＮＡｌ０μＦを５ｍＭＥＤＴＡ存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終密度が３０
％になる様に添加した後、ＤＮＡをプロトゲラストに取
シ込ませるために室温に２分間放置した。このプロトシ
ラスト’ｉ ＳＭＭＰ培地１ｄで洗浄後、ＳＭＭＰ培地
１ｒＬｔに再懸、濁し、形質発現のため、３０℃で２時
間培養した。この培養液をｐ）ｉ ７． Ｏのグロトグ
ラスト再生培地上に塗布した。
プロトグラスト再生培地は蒸留水１！あたシトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン１２Ｐ１ＫＣｊ Ｏ，５
ｊ’ 、グルコース１０ Ｐ ％ ＭｇＣ’２・６Ｈ２
０８，１ノ、ＣａＣノ２・２Ｈ２０２，２ｐ、ペグトン
４Ｆ、粉末酵母エキス４Ｐｓ カブミノ酸（Ｄｌｆｃｏ
社） Ｉ Ｅｌｓ Ｋ２ＨＰＯ４０−２ＰＳ”ハク酸ナ
トリウム１３５Ｐ、寒天８Ｆ及びクロラムフェニコール
３μｍｐ７ｆｄを含む。
ドロキシメチル）アミノメタン１２Ｐ１ＫＣｊ Ｏ，５
ｊ’ 、グルコース１０ Ｐ ％ ＭｇＣ’２・６Ｈ２
０８，１ノ、ＣａＣノ２・２Ｈ２０２，２ｐ、ペグトン
４Ｆ、粉末酵母エキス４Ｐｓ カブミノ酸（Ｄｌｆｃｏ
社） Ｉ Ｅｌｓ Ｋ２ＨＰＯ４０−２ＰＳ”ハク酸ナ
トリウム１３５Ｐ、寒天８Ｆ及びクロラムフェニコール
３μｍｐ７ｆｄを含む。
３０℃で２週間培養後、約２５０００個のクロラム“フ
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのｆこｔＬｔｍ
−フルオロフェニルアラニン５００μμを含む最少培地
（２チグルコース、１ｔｌｂ硫酸アンモニウム、０．３
％尿素、ｏ、ｉＧりん酸二水素カリ。ラム、０．０４％
硫酸マグネシウム７水塩、２ ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐ
ｍマンガンイオン、２００μＰ／ｌサイア建ン塩酸塩、
５０μＶ！ビオチン、クロラムフ、 ＝ コーｋ １０
ｆｉＰＡＬｌ、ｐＨ７，０、寒天１．８％）Ｉｃレプ
リカし、クロラムフェニコール耐性でかつｍ−フルオロ
フェニルアラニン耐性の菌株５株を得た。
ェニコール耐性コロニーが出現してきたのｆこｔＬｔｍ
−フルオロフェニルアラニン５００μμを含む最少培地
（２チグルコース、１ｔｌｂ硫酸アンモニウム、０．３
％尿素、ｏ、ｉＧりん酸二水素カリ。ラム、０．０４％
硫酸マグネシウム７水塩、２ ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐ
ｍマンガンイオン、２００μＰ／ｌサイア建ン塩酸塩、
５０μＶ！ビオチン、クロラムフ、 ＝ コーｋ １０
ｆｉＰＡＬｌ、ｐＨ７，０、寒天１．８％）Ｉｃレプ
リカし、クロラムフェニコール耐性でかつｍ−フルオロ
フェニルアラニン耐性の菌株５株を得た。
（５）形質転換株のグラスミド解析
これらの株よシ（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アがロースグル電気泳動法によシ、グラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、全ての株でベクターのｐＡＪ
１８４４よシも明らかに大きなグラスミドが検出された
。
製し、アがロースグル電気泳動法によシ、グラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、全ての株でベクターのｐＡＪ
１８４４よシも明らかに大きなグラスミドが検出された
。
５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制限酵素Ｐ
ｓｔ ｌで切断するとその内の４株には共通な６．７
ｋｂのＤＮＡ挿入断片が認められた。
ｓｔ ｌで切断するとその内の４株には共通な６．７
ｋｂのＤＮＡ挿入断片が認められた。
また、他の１株には、３．７ ｋｂ ％ ３．０ ｋｂ
−、１，７ｋｂ Ｎ１．６ｋｂ 、 １．４ｋｂ
、 １．３ｋｂ １０．８ｋｂ、 ０．７ｋｂ、 ０
．４ｋｂの９個のＤＮＡ挿入断片が認められた。ベクタ
ーｐＡＪ １８４４のＰｓｔ ｌ切断点に、前者の６．
７ｋｂのＰａｔ１断片を有する組換えグラスミドをｐＡ
Ｒ−２と名付け、後者の９個のＰｉｔ ］ ＤＮＡ断片
を有する組換えグラスミドをｐＡＲ−１と名付け、ｐＡ
Ｒ−１を保持する株をＡＪ １２１８１ （Ｆ酵Ｗ−Ｐ
７９４８）、ｐＡＲ−２を保持する株をＡＪ １２１８
２ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７９４７）と名付けた。尚ｐＡＲ
−２は第１図に示す制限酵素地図を有する。
−、１，７ｋｂ Ｎ１．６ｋｂ 、 １．４ｋｂ
、 １．３ｋｂ １０．８ｋｂ、 ０．７ｋｂ、 ０
．４ｋｂの９個のＤＮＡ挿入断片が認められた。ベクタ
ーｐＡＪ １８４４のＰｓｔ ｌ切断点に、前者の６．
７ｋｂのＰａｔ１断片を有する組換えグラスミドをｐＡ
Ｒ−２と名付け、後者の９個のＰｉｔ ］ ＤＮＡ断片
を有する組換えグラスミドをｐＡＲ−１と名付け、ｐＡ
Ｒ−１を保持する株をＡＪ １２１８１ （Ｆ酵Ｗ−Ｐ
７９４８）、ｐＡＲ−２を保持する株をＡＪ １２１８
２ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７９４７）と名付けた。尚ｐＡＲ
−２は第１図に示す制限酵素地図を有する。
（６）再トランスホーメーシ１ン
（５）で検出されたＤＮＡ断片を含む組換えプラグミド
上にｍ−フルオロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺
伝子が存在することを確認するためこのグラスミドＤＮ
Ａ ｐＡＲ−１とｐＡＲ−２を用い、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンタムＡＪ １２０３６を再度、形
質転換した。
上にｍ−フルオロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺
伝子が存在することを確認するためこのグラスミドＤＮ
Ａ ｐＡＲ−１とｐＡＲ−２を用い、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンタムＡＪ １２０３６を再度、形
質転換した。
生シタクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ５０個を釣り上げｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する感受性をテストしたところ、これらのいずれも耐性
が付与されており、上記の！う〜スミド上に、ｍ−フル
オロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝子が存在す
ることが明らかとなった。
れ５０個を釣り上げｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する感受性をテストしたところ、これらのいずれも耐性
が付与されており、上記の！う〜スミド上に、ｍ−フル
オロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝子が存在す
ることが明らかとなった。
（７）形質転換株のＤＳ活性
被検体をフェニルアラニン生産培地（グルコース１３０
Ｆ、 （ＮＨ４）２８０４１０ｊｌｓ ｉＧ（２ＰＯ
４１ＰｓＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１Ｐ、フマル酸１２Ｐ１
酢酸３ｍ／、大豆蛋白酸加水分解液「味液」５０ゴ、Ｆ
＠ＳＯ４・７Ｈ２０１０Ｔｎ９、ＭｎＳＯ４”４Ｈ２０
１０１１９、ビオチン５０μ２、サイアミン塩酸塩２０
００１ＵＰ及びＣａＣＯ３５０Ｐを水１１に含む、ｐＨ
７，０）２０１１Ｉｌで３０℃にて１５時間培養した菌
体よシ、超音波処理により、溶菌液をｖ４Ｍし、これを
３２０００Ｘｊｌ、２０分間遠心分離して上清を得た。
Ｆ、 （ＮＨ４）２８０４１０ｊｌｓ ｉＧ（２ＰＯ
４１ＰｓＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１Ｐ、フマル酸１２Ｐ１
酢酸３ｍ／、大豆蛋白酸加水分解液「味液」５０ゴ、Ｆ
＠ＳＯ４・７Ｈ２０１０Ｔｎ９、ＭｎＳＯ４”４Ｈ２０
１０１１９、ビオチン５０μ２、サイアミン塩酸塩２０
００１ＵＰ及びＣａＣＯ３５０Ｐを水１１に含む、ｐＨ
７，０）２０１１Ｉｌで３０℃にて１５時間培養した菌
体よシ、超音波処理により、溶菌液をｖ４Ｍし、これを
３２０００Ｘｊｌ、２０分間遠心分離して上清を得た。
この上清を粗酵素液として用い、５０ｍＭ）リヌー塩酸
緩衝液（ＰＨ７，５）、０．５ｍＭホヌホエノールピル
ピン酸、 ０．５ｍＭエリスロースー４−リン酸から
成る１、０コの反応液中で３０℃、１０分間反応させ、
反応終了後０．２ ｍのトリクロロ酢酸を加え酵素を失
活させる。変性蛋白を遠心除去後、得られた上清０．２
５ゴに０．２５′Ｒ１の０．０２５Ｍ過ヨウ素酸を加え
、３７℃で３０分間インキエペートする。これに０．５
、ｍ／の２チ亜砒酸ナトリウムを加え酸化反応を停止
後、２．０Ｒ１ｃＤＯ，３％２−チオパルビクール酸を
加え１００Ｃで８分間加熱する。反応液の５４９ ｎｍ
の吸光度を測定し、ＤＡＨＰの分子吸光係数４．５ Ｘ
１０ （Ｊ＠ｎ５ｅｎ、 Ｒ，Ａ、 ａｎｄ Ｎ＠ｓ
ｔ＠ｒ、 Ｅ、Ｗ、 、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｗｎ止
幻２，３３６５（１９６６））を使用して酵素活性を求
めた。
緩衝液（ＰＨ７，５）、０．５ｍＭホヌホエノールピル
ピン酸、 ０．５ｍＭエリスロースー４−リン酸から
成る１、０コの反応液中で３０℃、１０分間反応させ、
反応終了後０．２ ｍのトリクロロ酢酸を加え酵素を失
活させる。変性蛋白を遠心除去後、得られた上清０．２
５ゴに０．２５′Ｒ１の０．０２５Ｍ過ヨウ素酸を加え
、３７℃で３０分間インキエペートする。これに０．５
、ｍ／の２チ亜砒酸ナトリウムを加え酸化反応を停止
後、２．０Ｒ１ｃＤＯ，３％２−チオパルビクール酸を
加え１００Ｃで８分間加熱する。反応液の５４９ ｎｍ
の吸光度を測定し、ＤＡＨＰの分子吸光係数４．５ Ｘ
１０ （Ｊ＠ｎ５ｅｎ、 Ｒ，Ａ、 ａｎｄ Ｎ＠ｓ
ｔ＠ｒ、 Ｅ、Ｗ、 、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｗｎ止
幻２，３３６５（１９６６））を使用して酵素活性を求
めた。
また、反応液中にフェニルアラニン、チロシンのいずれ
か、或いはその両者を１ｍＭづつ添加した時の活性も測
定し、無添加時を１００％として表示した。第１表に測
定結果を示す。
か、或いはその両者を１ｍＭづつ添加した時の活性も測
定し、無添加時を１００％として表示した。第１表に測
定結果を示す。
得られ九組換デラヌミドが導入されることによ、ｊ５、
ＤＳ活性は２．６〜１４倍に増大し、各アミノ酸による
活性阻害パターンも、野性株型から変異株型に変化して
おり、ｐＡＲ−１、ｐＡＲ−２にコードされたｍ−フル
オロフェニルアラニン耐性遺伝子は、ＤＳ遺伝子である
ことは明らかである。また、ｐＡＲ−１とｐＡＲ−２の
有するＰａｔ ｌ断片が全く異なることにより、ＤＳ活
性を有する蛋白質をコードする遺伝子は２糧類以上存在
すると考えられる。
ＤＳ活性は２．６〜１４倍に増大し、各アミノ酸による
活性阻害パターンも、野性株型から変異株型に変化して
おり、ｐＡＲ−１、ｐＡＲ−２にコードされたｍ−フル
オロフェニルアラニン耐性遺伝子は、ＤＳ遺伝子である
ことは明らかである。また、ｐＡＲ−１とｐＡＲ−２の
有するＰａｔ ｌ断片が全く異なることにより、ＤＳ活
性を有する蛋白質をコードする遺伝子は２糧類以上存在
すると考えられる。
（８）ＤＳ遺伝子のサックロー二ンダ
ｐＡＲ−１を制限酵素Ｐａｔ １で切断し、６５℃、１
０分間加熱した後、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在
下でＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって４℃に
一晩放置しＤＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反応液を６
５℃罠で１０分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたＤＮＡの沈澱を採取した。これに少
盆のＴＥＮ緩衝液を加え形質転換に用すた。
０分間加熱した後、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在
下でＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって４℃に
一晩放置しＤＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反応液を６
５℃罠で１０分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたＤＮＡの沈澱を採取した。これに少
盆のＴＥＮ緩衝液を加え形質転換に用すた。
（４）で示した形質転換方法を用いてブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンタムＡＪ １２０３６を形質転換
した。３０℃で２週間クロラムフェニコール３μｍ７ｋ
ｌを含む再生培地で再生させた後、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニン５００μに包を含む最少培地にレプリカし、
クロラムフェニコール耐性でかつｍ−フルオロフェニル
アラニン耐性となった株を多数得た。これらの株のいく
つかが、ｐＡＲ−１より小屋の！ラヌミド群を有してい
た。このうちの最も小屋化したグラスミドをｐＡＲ−１
１２と名付け、ｐＡＲ−１１２を有する株をＡＪ １２
１８３ （Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ ７９４６）と名゛付けた。
ム・ラクトフェルメンタムＡＪ １２０３６を形質転換
した。３０℃で２週間クロラムフェニコール３μｍ７ｋ
ｌを含む再生培地で再生させた後、ｍ−フルオロフェニ
ルアラニン５００μに包を含む最少培地にレプリカし、
クロラムフェニコール耐性でかつｍ−フルオロフェニル
アラニン耐性となった株を多数得た。これらの株のいく
つかが、ｐＡＲ−１より小屋の！ラヌミド群を有してい
た。このうちの最も小屋化したグラスミドをｐＡＲ−１
１２と名付け、ｐＡＲ−１１２を有する株をＡＪ １２
１８３ （Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ ７９４６）と名゛付けた。
尚ｐＡＲ−１１２は、第２図に示す制限酵素地図を有す
る。
る。
（９） 形質転換株のトリブトファン生産能上記のｐ
ＡＲ−１１２を用い、ｍ−フルオロフェニルアラニン及
び５−フルオロトリブトファン耐性株ブレビバクテリウ
ラ−ラクト７エルメンタムＭ２４７を（４）で述べた方
法により形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標
として形質転換株を選択した。かくして得られたＦＩＲ
Ｍ Ｐ−８４１４、ＡＪ １２２５１を培養し、トリブ
トファン生産能を調べたところ第２表に示す結果を得た
。
ＡＲ−１１２を用い、ｍ−フルオロフェニルアラニン及
び５−フルオロトリブトファン耐性株ブレビバクテリウ
ラ−ラクト７エルメンタムＭ２４７を（４）で述べた方
法により形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標
として形質転換株を選択した。かくして得られたＦＩＲ
Ｍ Ｐ−８４１４、ＡＪ １２２５１を培養し、トリブ
トファン生産能を調べたところ第２表に示す結果を得た
。
培養はトリブトファン生産培地（グルコース１３ｏＰ１
（ＮＨ４）２Ｓ０４２５７、フマル酸１２Ｐ１酢酸３
ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ノ、ＭｎＳＯ４” ７Ｈ２０１
０Ｗ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０１ノ、ｄ−ビオチン５０μ
ノ、サイアミン塩酸塩２−０００μノ、メチオニン４０
０〜、チロシン６５０〜、大豆蛋白酸加水分解液「味液
Ｊ ５０ Ｒ１１ＣａＣＣ）３５０りを水１１に含む、
ｐ）！ ６．５゜）２０ゴを５００ゴの坂ロフラスコに
入れたものに被検菌株を植えつけ、３０℃にて７２時間
、振盪下に行なった。
（ＮＨ４）２Ｓ０４２５７、フマル酸１２Ｐ１酢酸３
ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ノ、ＭｎＳＯ４” ７Ｈ２０１
０Ｗ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０１ノ、ｄ−ビオチン５０μ
ノ、サイアミン塩酸塩２−０００μノ、メチオニン４０
０〜、チロシン６５０〜、大豆蛋白酸加水分解液「味液
Ｊ ５０ Ｒ１１ＣａＣＣ）３５０りを水１１に含む、
ｐ）！ ６．５゜）２０ゴを５００ゴの坂ロフラスコに
入れたものに被検菌株を植えつけ、３０℃にて７２時間
、振盪下に行なった。
培養後、遠心上溝中のＬ −ト１，１ブト７アンをロイ
コノストック自メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｇｔ
ｏｅｍｅａｓｎｔ）ｒｏｉｄｅａ） ＡＴＣＣ８０４２
を定量菌株として用いるパイオア、セイ法によって求め
た。
コノストック自メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｇｔ
ｏｅｍｅａｓｎｔ）ｒｏｉｄｅａ） ＡＴＣＣ８０４２
を定量菌株として用いるパイオア、セイ法によって求め
た。
尚、Ｍ２４７を得るためＫは寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−
８４１４ＡＪ １２２５１ より宿主細胞を損うこと
なく宿主細胞中の複合グラスミドを除去することが可能
である。
８４１４ＡＪ １２２５１ より宿主細胞を損うこと
なく宿主細胞中の複合グラスミドを除去することが可能
である。
即ち、グラスミドは宿主より自然に失なわれることもあ
るし、「除去」操作によって除くこともできる（Ｂａｅ
ｔ、 Ｒｅｖ、、 ３６． ｐ３６１−４０５（１９７
２））。他の除去操作の例は以下の通シである。ＡＪ
１２１９５ をＣＭＧ液体培地に接種し、３７℃で一
晩培養（高温処理）後、培養液を適当に希釈し、クロラ
ムフェニコ′−ルを含有し又は含有しないＣＭＧ寒天培
地に塗布し、３０℃で１〜３日間培養する。かくしてク
ロラムフェニコール感受性株として分離される株がＭ２
４７である。
るし、「除去」操作によって除くこともできる（Ｂａｅ
ｔ、 Ｒｅｖ、、 ３６． ｐ３６１−４０５（１９７
２））。他の除去操作の例は以下の通シである。ＡＪ
１２１９５ をＣＭＧ液体培地に接種し、３７℃で一
晩培養（高温処理）後、培養液を適当に希釈し、クロラ
ムフェニコ′−ルを含有し又は含有しないＣＭＧ寒天培
地に塗布し、３０℃で１〜３日間培養する。かくしてク
ロラムフェニコール感受性株として分離される株がＭ２
４７である。
４、図ｆ７の簡単な添刈
１２ ＠ １） ＰＡＺ−１１２Ｍ ＄＋ＪＦ＋ｔｆＪ
＃ｔｅｆ’Ｊ ４ｆｆｉ？。
＃ｔｅｆ’Ｊ ４ｆｆｉ？。
Claims (2)
- （１）コリネ型細菌細胞内で発現し３−デオキシ−Ｄ−
アラビノ−ヘプチュロン酸−７−リン酸シンターゼをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラ
スミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有する
コリネ型細菌。 - （２）コリネ型細菌細胞内で発現し３−デオキシ−Ｄ−
アラビノ−ヘプチュロン酸−７−リン酸シンターゼをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラ
スミドベクネーに接続されている組換えＤＮＡを有する
コリネ型細菌を培養することを特徴とするＬ−トリプト
ファンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191523A JPS6251980A (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
| DE8585114713T DE3576523D1 (de) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Rekombinante dna enthaltende coryneformbakterien und verfahren zur herstellung von aromatischen aminosaeuren unter verwendung dieser bakterien. |
| EP85114713A EP0183175B1 (en) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Coryneform bacteria carrying recombinant dna and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
| US07/316,961 US4968609A (en) | 1984-11-20 | 1989-02-28 | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191523A JPS6251980A (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251980A true JPS6251980A (ja) | 1987-03-06 |
| JPH055480B2 JPH055480B2 (ja) | 1993-01-22 |
Family
ID=16276078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60191523A Granted JPS6251980A (ja) | 1984-11-20 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6251980A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| EP0401735A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing -L-tryptophan |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58103398A (ja) * | 1981-10-09 | 1983-06-20 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 微生物遺伝子、プラスミド、および芳香族アミノ酸の微生物による製造法 |
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
-
1985
- 1985-08-30 JP JP60191523A patent/JPS6251980A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58103398A (ja) * | 1981-10-09 | 1983-06-20 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 微生物遺伝子、プラスミド、および芳香族アミノ酸の微生物による製造法 |
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| EP0401735A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing -L-tryptophan |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH055480B2 (ja) | 1993-01-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |