JPH028714B2 - - Google Patents

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JPH028714B2
JPH028714B2 JP56058186A JP5818681A JPH028714B2 JP H028714 B2 JPH028714 B2 JP H028714B2 JP 56058186 A JP56058186 A JP 56058186A JP 5818681 A JP5818681 A JP 5818681A JP H028714 B2 JPH028714 B2 JP H028714B2
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plasmid
pcg4
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corynebacterium
dna
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Ryoichi Katsumata
Tetsuo Oka
Akira Furuya
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Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規プラスミドに関する。さらに詳し
くは、本発明はコリネバクテリウム属またはプレ
ビバクテリウム属に属する微生物中で自律複製で
き、かつストレプトマイシンおよび／またはスペ
クチノマイシン耐性に関与する遺伝子を有する新
規プラスミドに関する。 遺伝子工学におけるプラスミドベクターの有用
性は、遺伝子工学技法の開発された大腸菌の宿
主・ベクター系でよく知られている。遺伝子工学
におけるベクターの役割は、レコンビナント・モ
レキユルス：インパクト・オン・サイエンス・ア
ンド・ソサイエテイ、マイルス・インターナシヨ
ナル・シンポジウム・シリーズNo.10
（Recombinant Molecules：Impact on Scince
and Society、Miles International Symposium
SeriesNo.10、edited by R.F.Beers and E.G.
Basset Raven Press、New York、1977）に明
解に概説されている。 一方、大腸菌以外の工業的に有用な微生物、例
えば、アミラーゼなどの生産菌である枯草菌、抗
生物質などの生産菌である放線菌および醸造用ア
ルコールの生産菌である酵母などでも組換え
DNA技法を確立しようとの試みがなされている。
組換えDNA技法の導入には、ベクターの取得が
必須であるため、これらの菌種ではプラスミドや
フアージの検策が行われてきた。 本発明者らは、グルタミン酸、リジンなど多く
の有用物質の工業生産に用いられるコリネバクテ
リウム・グルタミクムならびにそれに類縁の菌種
で組換えDNA技法を確立せんがために、これら
の菌種のベクターとなり得るプラスミドの検策を
行なつてきた。その結果、コリネバクテリウム属
に属する微生物中にベクターとして有用性を有す
る新規なプラスミドが存在することを見出し、本
発明を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物中で自律複製で
き、かつストレプトマイシンおよび／またはスペ
クチノマイシン耐性に関与する遺伝子を有する新
規プラスミドを提供するものである。 本発明のプラスミドは、そのDNA上にストレ
プトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン
に対する耐性遺伝子を所有しており、宿主菌に両
薬剤に対する耐性形質を付与することができる。
このことは、所望の遺伝子を組み込んた組換えプ
ラスミド保有株の取得にあたり、その選択を効率
的に行うことを可能ならしめ、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、およびその近縁菌
種におけるクローン化ベクターとして、極めて有
用であるとともに、組換えDNA研究用の試薬と
しても有用であることを示している。 本発明のプラスミドはコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌の菌体から得られ、
具体的に好適な一例としては、プラスミドpCG4
と名付けたプラスミドがあげられる。 以下プラスミドpCG4について詳細に説明する。 プラスミドpCG4の特徴 (1) プラスミドpCG4は、分子量約19メガダルト
ンのデオキシリボ核酸（DNA）である。 (2) プラスミドpCG4は下記制限酵素に対し、次
の切断感受性を有する。 酵素※ 切断部位数 EcoR ４ BamH ７ Hind ９ Pst ６ Sal ６ ※制限酵素の名称は次の菌種から得られる制
限酵素の略称である。 EcoR： エシエリヒア・コリ BamH：
バチルス・アミロリクエフアシエンス Pst： プロピデンシア・スチユアーテイー Hind： ヘモフイラス・インフルエンザ Sal： ストレプトマイセス・アルブス 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素
存在下でプラスミドpCG4を完全消化し、それら
の消化物を0.8％のアガロースゲル電気泳動にか
け、分解可能な断片の数から決定される。分子量
は、大腸菌のラムダフアージのDNAをHindで
消化して得られる分子量既知の断片〔Ｊ・Mol.
Biol.、98、551−564（1975）〕の同一アガロース
ゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
消化プラスミドpCG4の各断片の分子量を算出し、
それらを加算して求められる。 プラスミドpCG4は土壌から分離された菌株225
−250から得られる。225−250株の菌学的性状は
下記の通りである。菌学的性質の検討は
“Manual of Microbiological Methods”by the
Society of American Bacteriologist
Committee on Bacteriological Technique
（1957）に記載された方法で行つた。 細胞形態 通常0.7〜1.0×1.0〜3.0ミクロンの楕円ある
いは短桿状であるが、培養条件により、複数の
細胞が直鎖状あるいはＶ字型に連鎖したような
多形性を示す。グラム陽性、非運動性で胞子を
つくらない。 富栄養培地での生育特性 寒天培地上での単集落は円状で表面は光択を
おび、色は淡黄色である。スラント上での生育
は同じく淡黄色で不透明である。寒天培地上の
穿刺培養では最上部で良く生育し、深部ではわ
ずかに生育する。液体培養ではわずかに生育し
若干綿状に沈降する。 生理的性質 (1) 温度：至適温度は25〜37℃だが、42℃でか
すかに生育する。 (2) PH：至適PH７〜８だが、PH６〜９でも生育
可能である。 (3) 非熱耐性 (4) 好気性 (5) ゼラチンを液化しない (6) カゼインを分解代謝しない (7) インドール生産性 (8) カタラーゼ陽性 (9) 殿粉非同化性 (10) グルコース、フラクトース、マンノース、
マルトースから酸を生成するが、キシロー
ス、ガラクトース、ラクトースおよびグリセ
ロールからは酸を生成しない。 (11) ビオチン要求性 (12) ビオチン量制限培地では多量のグルタミン
酸を産生する。 (13) 高濃度ビオチン含有培地では乳酸および
α−ケトグルタール酸を産生する。 以上の結果は、J.Gen.Appl.Microbiol.、73、
279−301（1967）に記載された細菌群と比較する
と、コリネバクテリウム・グルタミクムに極めて
よく一致している。それ故、225−250株をコリネ
バクテリウム・グルタミクムと同定した。 コリネバクテリウム・グルタミクム225−250は
上記の如く分類学的特性においては、通常のコリ
ネバクテリウム・グルタミクムと相違点が認めら
れないが、唯一の相違点としてストレプトマイシ
ンおよびスペクチノマイシンに対する耐性変質を
保持することが特徴的である。本菌株にプラスミ
ドの一般的除去操作を施すことによつて、ストレ
プトマイシンおよびスペクチノマイシン耐性形質
を同時に喪失した誘導株が分離される。これらの
薬剤感受性株にはpCG4の存在が認められないこ
とから、ストレプトマイシンおよびスペクチノマ
イシン耐性遺伝子はpCG4上に担われていること
が明白である。 なお、コリネバクテリウム・グルタミクム225
−250およびそのpCG4消失株の一株であるコリネ
バクテリウム・グルタミクム250−１株は微生物
工業技術研究所に寄託され、それらの受託番号は
各々、微工研菌寄第5939、5940号である。さら
に、米国アメリカンタイプ・カルチヤー・コレク
シヨンに各々、ATCC31830、ATCC31831として
寄託されている。 コリネバクテリウム・グルタミクム225−250の
菌体中からプラスミドpCG4を抽出するためには、
まず培養細胞を溶菌しなければならないが、一般
にコリネバクテリウム属菌種およびその類縁菌種
の単に培養した細胞は、細菌細胞壁溶解酵素卵白
リゾチームに非感受性であるので培養細胞は卵白
リゾチームに感受性にしてから用いるとよい。コ
リネバクテリウム・グルタミクム225−250をリゾ
チーム感受性にするには、コリネバクテリウム・
グルタミクムと同様にグラム陽性でもともと卵白
リゾチーム非感受性のストレプトコツカス・フエ
カリス〔Can.J.Microbiol.、７、363−373
（1961）〕に施される公知の方法を適用することが
できる。すなわち、細胞培養の対数増殖期の中途
で、生育を抑制しないか、あるいは半抑制する濃
度（通常培養液中0.1〜10U／mlとなる濃度）の
ペニシリンを添加し、さらに数世代増殖させるこ
とによつて目的が達せられる。その際用いる培地
および培養方法は一般にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムおよびその近縁菌種の培養に用いられ
る液体培地およびその培養方法が適用できる。こ
のようにペニシリン処理したコリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−250の培養細胞は、リゾチ
ームにより容易に細胞壁が溶解される。溶菌物か
らは、例えばBiochim.Biophys.Acta.383、457−
463（1975）に記載されたような通常用いられる方
法により、プラスミドpCG4を容易に濃縮分離で
きる。 即ち、溶菌物にラウリル硫酸ナトリウムと
Naclとを加えて処理し、溶離したプラスミドを
遠心分離により上澄液として回収後、これにポリ
エチレングリコールを添加してDNAを沈殿濃縮
し、再溶解した沈殿物をエチジウムブロマイド−
塩化セシウム密度勾配遠心にかけ、プラスミド
pCG4を単離する。 コリネバクテリウム・グルタミクムおよびその
近縁菌種において選択可能な遺伝形質を有した自
律複製可能なプラスミドの存在は今まで知られて
おらず、本発明者らにより初めて見出されたもの
である。 プラスミドpCG4は、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムだけでなく、コリネバクテリウム属の
他の菌種あるいはブレビバクテリウム属の菌種で
も自律複製できると同時にその上に存在するスト
レプトマイシンおよびスペクチノマイシン耐性遺
伝子に由来する耐性形質をそれらの宿主菌に付与
することができる。プラスミドpCG4をこれらの
菌種に形質転換する方法は、本出願と同日に提出
するる特許出願〔発明の名称：微生物の形質転換
法〕に開示したが、具体的方法を実施例２として
後述する。この形質転換法により取得された菌株
は第１表に示した。
【表】
【表】 これらpCG4保有株、すなわちコリネバクテリ
ウム・ハーキユリスATCC138681pCG4、ブレビ
バクテリウム・フラブムATCC140671pCG4、ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC136551pCG4は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託され、各々受託番号 微工研菌寄第
5941、5942、5943号がつけられている。また米国
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
に各々ATCC31837、31838および31839として寄
託されている。 プラスミドpCG4が分離された元株コリネバク
テリウム・グルタミクム225−250株、それから誘
導されたプラスミドpCG4喪失株250−１株および
プラスミドpCG4で形質転換された他菌種の菌株
のストレプトマイシンとスペクチノマイシンに対
する感受性度を両薬剤の最小生育阻止濃度で測定
した結果を第１表に示した。最小生育阻止濃度
は、NB寒天培地（粉末ブイヨン20ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、寒天18ｇを純水１に含み、PH7.2に調
整した培地）上に約104細胞を塗布接種して30℃
で２日間培養後、生育の全く認められない濃度で
ある。 本発明のプラスミドの有用性は、アミノ酸、核
酸などの有用物質の生産に用いられる工業上重要
なコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種中で自律複製でき、それを保有する菌の
検出を可能にするストレプトマイシンおよびまた
はスペクチノマイシン耐性遺伝子を保有し、さら
には種々の制限酵素の切断点を有する特性にあ
る。 これらの特性により、本発明のプラスミドはコ
リネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
の菌種を宿主菌にして周知のDNA組換え技法で
任意の遺伝子をクローン化するのに必要なベクタ
ーとしての条件を備えている。従つて、本発明の
プラスミドは、これらの細菌種または他の微生物
からアミノ酸などの有用物質の生合成あるいはそ
の調節に関与する遺伝子をクローン化し、その遺
伝情報の増巾に基づく生合成系の強化により有用
物質の生産量を増大せしめたり、さらには動植物
の遺伝子をクローン化し、その遺伝情報の発現に
より有用な蛋白質を生産せしめるための手段を提
供することができる。クローン化は、試験管内で
作成されたベクタープラスミドとの組換えDNA
混成物を宿主菌に導入後、目的の遺伝子を組み込
んだプラスミドを保有する株を選択することによ
つて行われるが、本発明プラスミド上に存在する
ストレプトマイシンあるいはスペクチノマイシン
耐性遺伝子は目的のクローン化株の選択を容易な
らしめることができる。すなわち、目的のクロー
ン化すべき遺伝子がそれに由来する形質で選択で
きるときはストレプトマイシンあるいはスペクチ
ノマイシン耐性形質の同時獲得性により目的のク
ローン化株の把握を確実に行い得るし、また、目
的のクローン化すべき遺伝子がその形質で選択で
きないときもその取得に先立つて一旦ストレプト
マイシンあるいはスペクチノマイシン耐性形質で
プラスミド保有株を選抜することにより目的のク
ローン化株の取得を効率化し得る。 本発明プラスミドの自律複製能および宿主にス
トレプトマイシンあるいはスペクチノマイシン耐
性形質を付与する遺伝子は、一般のプラスミドと
同様にプラスミドDNAの一部分に担われている
ことが容易に類推されるので、例えばプラスミド
の一領域を欠失したり、あるいは別のDNAを挿
入付加したようなプラスミド誘導体も同様な機能
を有すると考えられる。 また、本発明プラスミドのストレプトマイシン
あるいはスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む
DNA断片は、周知のDNA組換え技法で識別可能
な特徴的遺伝子をもたない他のプラスミドへ連結
することができ、そのような組換え体も、ベクタ
ーとして同様な有用性を有することになる。 それゆえ、本発明プラスミドは、例示した
pCG4に限定されるものではなく、それより修飾
して得られる誘導体プラスミドや他のプラスミド
との組換え体プラスミドも含まれる。 以下に実施例を示す。 実施例 １ (1) コリネバクテリウム・グルタミクム225−250
の培養細胞からのプラスミドpCG4の分離 コリネバクテリウム・グルタミクム225−250
をNB培地（粉末ブイヨン20ｇ、酵母エキキス
５ｇを純水１に含みPH7.2に調整した培地）
で、30℃、18時間振盪培養し、その種培養５ml
を400ml半合成培地SSM〔グルコース20ｇ、
（NH4）2SO410ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、
KH2PO41ｇ、MgCl2・6H2O0.4ｇ、FeSO4・
7H2O10mg、MnSO4・４〜6H2O0.2mg、
ZnSO4・7H2O0.9mg、CuSO4・5H2O0.4mg、
Na2B4O7・10H2O0.09mg、（NH4）6MO7O24・
4H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミンン塩
酸塩１mgを純水１に含み、PH7.2に調整した
培地〕に接種して30℃で振盪培養する。東京光
電比色計で660nｍにおける吸光度（OD）を測
定し、OD0.2になつた時点で、培養液中0.5単
位／mlの濃度になるようにペニシリンＧを添加
する。さらに30℃で培養を継続し、OD約0.6に
なるまで生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液
〔0.03Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（トリス）、0.005M EDTA、0.05M
NaCl：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液（25％
シヨ糖、0.1M NaCl、0.05Mトリス、0.8mg／
mlリゾチーム：PH8.0）で10mlに懸濁し、37℃
で４時間反応させる。反応液に、5M NaCl24
ml、0.5M EDTA（PH8.5）0.6ml、４％ラウリル
硫酸ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4
mlを順次添加し、緩やかに混和してから氷水中
に15時間置く。溶菌物全量を遠心管に移し、４
℃で60分間、69400×ｇの遠心分離にかけ上澄
液をとる。これに重量百分率10％相当のポリエ
チレングリコール6000を加え、静かに混和して
溶解後氷水中に置く。16時間後、1500×ｇで10
分間遠心分離してペレツトを回収する。TES
緩衝液５mlを加えて、ペレツトを静かに再溶解
してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド20ml
を添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに
溶解し、密度を1580に合わせる。この溶液を
105000×ｇ、18℃で48時間遠心分離する。この
密度勾配遠心により、共有結合で閉じられた環
状のDNAは、紫外線ランプを照射することに
よつて遠心チユーブ中下方の密度の高いバンド
として見出される。このバンドを注射器で遠心
チユーブの側面から抜きとることによつて、プ
ラスミドpCG4が分離される。次いで分画液を
等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百分
率90％イソプロピルアルコール、10％TES緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウム
を含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイ
ドを抽出除去し、しかる後に、TES緩衝液に
対して透析する。 このようにして得られるプラスミドpCG4を
含む透析液１mlに２mlのエタノールを加え、−
20℃に12時間おいた後、10000×ｇで30分遠心
分離してDNAを沈降させ、さらに真空乾燥を
行つて20μｇのプラスミドpCG4が得られる。 (2) プラスミドpCG4の各種制限酵素による切断
特異性および分子量。 前記で調製したプラスミドpCG40.5μｇを10μ
のTES緩衝液（PH8.0）に溶かし、２倍過剰
量の制限酵素（EcoR、BamH、Hind、
PstおよびSalは宝酒造社製のものを使つ
た）を各々の制限酵素の適正条件にて反応させ
た。消化した試料は常法に従い、エチジウムブ
ロマイド0.6μｇ／mlを含有する水平型0.8％ア
ガロースゲルに供し、巾１cm当り7Vの一定付
加電圧で３〜４時間泳動を行つた。紫外線ラン
プをゲル平板上に照射して生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から各々の分子量を算出
し、それらを加算してプラスミドpCG4の分子
量を求めた。なお、分子量は同一アガロースゲ
ル上で同時に泳動したラムダフアージDNAの
Hind消化で生成する分子量既知の各断片の
泳動距離で描かれる標準線に基づいて算定し
た。結果を第２表に示す。
【表】 実施例 ２ コリネバクテリウム・ハーキユリス
ATCC13868、ブレビバクテリウム・フラブム
ATCC14067およびブレビバクテリウム・ラク
トフアーメンタムATCC13655のpCG4保有株の
調製 NB培地で培養した種培養の0.075mlを7.5ml
SSM培地に植菌し、30℃で振盪培養する。東京
光電比色計で660nｍにおける吸光度（OD）を測
定し、OD0.15になつた時点で0.5単位／mlになる
ようにペニシリンＧを添加する。さらにOD約0.5
になるまで培養する。培養液から細胞を集菌し、
該細胞をSSMで洗浄し、最終濃度0.5mg／mlのリ
ゾチームを含むPFM培地（SSM2倍希釈液中に
シヨ糖0.4M、MgCl2・6H2O0.01Mを含み、PH7.6
に調整した培地）２mlに懸濁する。30℃で12時間
反応して細胞をプロトプラスト化する。 プロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、
2500×ｇで５分間遠心分離し、沈降した細胞を
TSMC緩衝液〔10ｍＭ MgCl2・6H2O、30ｍＭ
CaCl・2H2O、500ｍＭコハク酸二ナトリウム、
50ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（トリス）；PH7.5〕１mlに懸濁して遠心洗浄する。
0.1mlのTSMC緩衝液を加えゆるやかに振つてプ
ロトプラストを再懸濁する。これに上記の２倍高
濃度のTSMC緩衝液と１対１に混合した
pCG4DNA液0.1ml（0.2μｇDNA含有）を加えて
混和し、次いでTSMC緩衝液中に20％ポリエチ
レングリコール6000を含む液0.8mlを添加してゆ
るやかに混和する。３分後、RCG倍地（グルコ
ース５ｇ、カゼインハイドロライゼート５ｇ、酵
母エキス2.5ｇ、K2HPO43.5ｇ、KH2PO41.5ｇ、
MgCl2・6H2O0.41ｇ、FeSO4・7H2O10mg、
MnSO4・４〜6H2O2mg、ZnSO4・7H2O0.9mg、
（NH4）6Mo7O24・4H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、
サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナトリウム
135ｇを純水１に含み、PH7.2に調整した培地）
２mlを添加し、2500×ｇで５分間遠心にかけて上
澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ml
のRCG培地に懸濁し、直ちにRCG倍地で希釈し、
一定量をRCGP寒天培地〔RCG培地に３％ポリ
ビニールピロリドン（重合度500）と1.4％寒天を
含む培地〕に塗布して30℃で10日間培養する。 RCGP寒天培地上に再生増殖した菌を白金耳で
かき集め、NB培地２mlに懸濁した菌液を希釈
し、一定量を12.5μｇ／mlのストレプトマイシン
を含むNB寒天培地に塗布する。30℃で２日間培
養して出現したコロニーをスペクチノマイシン
100μｇ／mlを含有するNB寒天培地にレプリカ塗
布し、30℃で２日間培養して生育した株をpCG4
の形質転換侯補株として取得した。 コリネバクテリウム・ハーキユリス
ATCC13868／pCG4、ブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067／pCG4およびブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムATCC13655／pCG4は
こうして得られた株である。これらの株の培養菌
体から実施例１と同じ方法でプラスミドを単離
し、各種制限酵素によるプラスミドDNAの切断
様式を調べた結果、pCG4と全く同一の切断片を
生成した。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ コリネバクテリウム・グルタミクム225−250
    （微工研菌寄第5939号）株から得ることができ、
    約19メガダルトンの分子量を有し、制限酵素に対
    する感受性部位数がEcoR ４、BamH
    ７、Hind ９、Pst ６およびSal ６で
    あり、かつストレプトマイシンおよび／またはス
    ペクチノマイシン耐性に関与する遺伝子を有する
    ことを特徴とする新規プラスミドpCG4。
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