CN109477066B - 转化体及使用其的原儿茶酸或其盐的制造方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种以糖类为原料可以有效地制造原儿茶酸或其盐的微生物、及使用该微生物有效地制造原儿茶酸或其盐的方法。一种转化体，其被实施了下述(A)、(B)、及(C)的操作，具有原儿茶酸生产能力。(A)3‑脱氢莽草酸脱水酶活性的强化(B)分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化(C)4‑羟基苯甲酸羟化酶活性的强化。一种原儿茶酸或其盐的制造方法，其包含将该转化体在含有糖类的反应液中进行培养而生产原儿茶酸或其盐的工序。

Description

转化体及使用其的原儿茶酸或其盐的制造方法
技术领域
本发明涉及一种转化体、及使用该转化体的有效的原儿茶酸的制造方法，所述转化体通过实施特定的基因操作，可以以糖类为原料有效地生产原儿茶酸或其盐。
背景技术
以地球温暖化及化石资源的枯竭问题为背景、以可再生的资源为原料的化学品的制造，与生物燃料并列地作为新产业生物炼制被认为是面向实现低碳社会的重要对策，备受关注。
原儿茶酸除成为医药、农药、香料等原料之外，其自身是作为抗氧化剂被使用的有用化合物。
目前，原儿茶酸主要通过来自天然物(农产品)的提取法而制造。但是，在这种制造法中，存在天然物原料的生产量受限制、或来自天然物的提取效率低的问题，因此，处于难以大量生产的状況。
已知有在微生物中，存在具有通过将各种各样的芳香族化合物进行代谢分解而作为碳源利用的能力、将原儿茶酸作为代谢中间体生成的微生物。因此，提出了通过控制该代谢，利用以糖类为原料的发酵法经由原儿茶酸生产各种化合物的方法。特别是，人们期望开发，对环境负荷小，以源自可再生的非可食生物质资源的糖类为原料，可廉价且大量地制造原儿茶酸的方法。
专利文献1、2教导了一种方法，其使用在可以将碳源经由芳香族氨基酸生物合成共同途径而转换为3-脱氢莽草酸的埃希菌属细菌或克雷伯菌属细菌中导入了源自克雷伯菌属细菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因、及原儿茶酸脱羧酶基因的转化体，由糖类经由原儿茶酸而制造儿茶酚。专利文献2进一步教导，为了经由原儿茶酸生产儿茶酚，优选通过使莽草酸脱氢酶失活，抑制从3-脱氢莽草酸向分支酸的转换。
另外，专利文献3、4教导了一种方法，其使用在埃希菌属细菌或克雷伯菌属细菌中导入了3-脱氢莽草酸脱水酶基因、原儿茶酸脱羧酶基因、及儿茶酚1,2-双加氧酶基因的转化体，由糖类经由原儿茶酸制造顺,顺-粘康酸、或己二酸。在专利文献3、4中，优选抑制从3-脱氢莽草酸向分支酸的代谢途径上的任一个酶。
另外，专利文献5教导了一种方法，其使用在埃希菌属细菌或克雷伯菌属细菌中导入了3-脱氢莽草酸脱水酶基因、及变异型的4-羟基苯甲酸羟化酶基因的转化体，由糖类经由原儿茶酸制造没食子酸(Gallic acid)或邻苯三酚。
但是，这些专利文献1～5的问题在于，不打算制造原儿茶酸，生成的原儿茶酸会转换为儿茶酚、顺,顺-粘康酸、己二酸、或没食子酸。另外，也不能实用上充分且有效地制造这些物质。进而，这些专利文献中记载的微生物存在如下问题：以提高目标化合物的生产率为目的，芳香族氨基酸的生物合成途径被切断，因此，使用有该微生物的情况下，为了产生色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸及2,3-二羟基苯甲酸的要求性，有必要将这6种化合物添加于培养基。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5,629,181号
专利文献2：美国专利第5,272,073号
专利文献3：美国专利第5,487,987号
专利文献4：美国专利第5,616,496号
专利文献5：美国专利第6,472,190号
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的技术问题在于，提供一种以糖类为原料可以有效地制造原儿茶酸或其盐的微生物、及使用该微生物有效地制造原儿茶酸或其盐的方法。
用于解决问题的技术方案
为了解决上述技术问题，本发明者们反复进行了研究，得到以下的见解。
(i)已知原儿茶酸一般对微生物显示细胞毒性，考虑了由于所生产的原儿茶酸的毒性而限定生产率的可能性。因此，对迄今为止报道有芳香族化合物的生产的几种微生物，比较了原儿茶酸给它们的增殖带来的影响，结果显示：在谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、红平红球菌中，谷氨酸棒状杆菌对原儿茶酸的耐性最高。具体而言，谷氨酸棒状杆菌即使在其它微生物的增殖完全、或显著地被抑制的500mM的高浓度的原儿茶酸的存在下，也显示高的增殖能力及糖消耗能力。这样，由于谷氨酸棒状杆菌对原儿茶酸的耐性非常高，因此，特别适于原儿茶酸或其盐的生产。
(ii)通过在棒状型细菌中组合进行(a)将编码3-脱氢莽草酸脱水酶的基因导入宿主微生物而实现该酶活性的强化和(b)将编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因及编码4-羟基苯甲酸羟化酶的基因导入宿主微生物而实现该酶活性的强化，与仅进行(a)的情况、或仅进行(b)的情况相比，来自糖类的原儿茶酸或其盐的生产率显著地提高。
(iii)进而，实施了(a)和b)的两者的棒状型细菌转化体具有如下优点：原儿茶酸或其盐的生产率显著地提高，另一方面，芳香族氨基酸生物合成途径没有被切断，因此，不产生色氨酸、酪氨酸、及苯丙氨酸之类的芳香族氨基酸或对氨基苯甲酸的要求性，因此，为了使该转化体增殖，没必要将这些化合物添加于培养基。
(iv)该转化体在需氧且实质上不增殖的条件下进行反应时，原儿茶酸或其盐的生产效率特别高。
本发明是基于上述见解而完成的，提供以下的转化体、及原儿茶酸或其盐的制造方法。
项1.一种转化体，其被实施了下述(A)、(B)、及(C)的操作，具有原儿茶酸生产能力。
(A)3-脱氢莽草酸脱水酶活性的强化；
(B)分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化；
(C)4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化。
项2.根据项1所述的转化体，其中，3-脱氢莽草酸脱水酶活性的强化是向宿主导入编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因而实现的，所述基因源自属于棒状杆菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、交替单胞菌属、海杆菌属、甲基杆菌属、泛菌属、脉孢菌属、或曲霉属的微生物。
项3.根据项2所述的转化体，其中，编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、耐盐棒杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、乳酪棒杆菌(Corynebacterium casei)、Corynebacterium efficiens、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)的基因。
项4.根据项2或3所述的转化体，其中，编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因利用下述(a)或(b)的DNA被编码。
(a)由序列号7、134、135、145、147、或149的碱基序列构成的DNA；
(b)由与序列号7、134、135、145、147、或149的碱基序列具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的多肽的DNA。
项5.根据项1～4中任一项所述的转化体，其中，分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的酶的基因而实现的，所述基因源自普罗威登斯菌属细菌、或克洛诺菌属细菌。
项6.根据项5所述的转化体，其中，分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的酶的基因而实现的，所述基因源自拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、或阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
项7.根据项1～6中任一项所述的转化体，其中，分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入下述(c)或(d)的DNA而实现的。
(c)由序列号9、128、或129的碱基序列构成的DNA；
(d)由与序列号9、128、或129的碱基序列具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
项8.根据项1～7中任一项所述的转化体，其中，4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因而实现的。
项9.根据项1～8中任一项所述的转化体，其中，4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化是通过向宿主导入下述(e)或(f)的DNA而实现的。
(e)由序列号8的碱基序列构成的DNA；
(f)由与序列号8的碱基序列具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的DNA。
项10.根据项1～9中任一项所述的棒状型细菌转化体，其中，原儿茶酸3,4-双加氧酶活性消失、或被抑制、或减少。
项11.根据项1～10中任一项所述的转化体，其中，选自由3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸(EPSP)合酶、及分支酸合酶构成的组中的至少一个酶活性被强化。
项12.根据项11所述的转化体，其中，DAHP合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(g)或(h)的DNA而实现的，3-脱氢奎尼酸合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(i)或(j)的DNA而实现的，3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的强化是通过向宿主导入下述(k)或(l)的DNA而实现的，莽草酸脱氢酶活性的强化是通过向宿主导入下述(m)或(n)的DNA而实现的，莽草酸激酶活性的强化是通过向宿主导入下述(o)或(p)的DNA而实现的，EPSP合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(q)或(r)的DNA而实现的，分支酸合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(s)或(t)的DNA而实现的。
(g)由序列号2的碱基序列构成的DNA；
(h)由与序列号2具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有DAHP合酶活性的多肽的DNA；
(i)由序列号153的碱基序列构成的DNA；
(j)由与序列号153具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性的多肽的DNA；
(k)由序列号5的碱基序列构成的DNA；
(l)由与序列号5具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的多肽的DNA；
(m)由序列号6的碱基序列构成的DNA；
(n)由与序列号6具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有莽草酸脱氢酶活性的多肽的DNA；
(o)由序列号154的碱基序列构成的DNA；
(p)由与序列号154具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有莽草酸激酶活性的多肽的DNA；
(q)由序列号155的碱基序列构成的DNA；
(r)由与序列号155具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有EPSP合酶活性的多肽的DNA；
(s)由序列号156的碱基序列构成的DNA；
(t)由与序列号156具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有分支酸合酶活性的多肽的DNA。
项13.根据项1～12中任一项所述的转化体，其中，选自由转酮醇酶活性及转醛醇酶活性构成的组中的至少一个活性被强化。
项14.根据项13所述的转化体，其中，转酮醇酶活性的强化是通过导入下述(u)或(v)的DNA实现的，转醛醇酶活性的强化是通过导入下述(w)或(x)的DNA实现的。
(u)由序列号151的碱基序列构成的DNA；
(v)由与序列号151具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码转酮醇酶的DNA；
(w)由序列号152的碱基序列构成的DNA；
(x)由与序列号152具有90％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码转醛醇酶的DNA。
项15.根据项1～14中任一项转化体，其中，宿主为棒状型细菌。
项16.根据项15所述的转化体，其具有同时利用葡萄糖与选自由木糖、阿拉伯糖及纤维二糖构成的组中的至少1种糖的能力。
项17.根据项15或16所述的转化体，其中，作为宿主的棒状型细菌是棒状杆菌属细菌。
项18.根据项17所述的转化体，其中，作为宿主的棒状杆菌属细菌是谷氨酸棒状杆菌。
项19.根据项18所述的棒状型细菌转化体，其中，作为宿主的谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032、或ATCC13869。
项20.一种谷氨酸棒状杆菌PCA4(保藏号：NITE BP-02217)。
项21.一种原儿茶酸或其盐的制造方法，其包含将项1～20中任一项所述的转化体在含有糖类的反应液中进行培养而生产原儿茶酸或其盐的工序。
项22.根据项21所述的方法，其中，在需氧且转化体不增殖的条件下培养转化体。
发明效果
如图1所示，作为微生物中的原儿茶酸的生物合成途径，存在：(a)利用3-脱氢莽草酸脱水酶被催化的、3-脱氢莽草酸向原儿茶酸转换的原儿茶酸生成途径；(b)利用分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶进行催化的、分支酸(莽草酸途径的最终代谢产物)向原儿茶酸转换的原儿茶酸生成途径这2种途径。
根据本发明，通过将以3-脱氢莽草酸为基点进行分叉、共同直至原儿茶酸生成的竞争的上述(a)及(b)的二个代谢途径同时强化，出乎意料地，原儿茶酸的生产显著增大。即，在棒状型细菌中，通过同时实施(a)3-脱氢莽草酸脱水酶活性的强化和(b)分支酸丙酮酸裂解酶活性、及4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化，与仅实施(a)的情况、或仅实施(b)的情况相比，来自糖类的原儿茶酸或其盐的生产量显著地提高。
在利用3-脱氢莽草酸脱水酶活性的经由来自3-脱氢莽草酸生成原儿茶酸的儿茶酚的制造法中，如果考虑已知更优选抑制从3-脱氢莽草酸向分支酸的转换(专利文献1～5)，则难以预测本发明的效果。
这些酶活性的强化，例如可以通过将编码该酶的基因在适当的启动子的控制下导入棒状型细菌而进行。
另外，棒状型细菌在染色体上具有编码上述3种酶中的3-脱氢莽草酸脱水酶及4-羟基苯甲酸羟化酶的基因，但不具有编码分支酸丙酮酸裂解酶的基因。因此，在本发明的实施例中，我们发现通过将编码高活性的分支酸丙酮酸裂解酶的、源自拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)的基因导入宿主棒状型细菌，使(b)的原儿茶酸生物合成途径在棒状型细菌中起作用。
根据本发明，通过对环境负荷小的发酵法，可以廉价且大量地生产作为医药品、香料、聚合物等原料有用的原儿茶酸。
一般而言，微生物由于原儿茶酸之类的芳香族化合物的细胞毒性增殖被抑制，因此，使用微生物有效地制造原儿茶酸是困难的。但是，由于棒状型细菌相对于含有原儿茶酸的芳香族化合物的耐性非常高，因此，如果使用本发明的转化体，则可以有效地生产高浓度的原儿茶酸或其盐。另外，棒状型细菌与大肠杆菌不同，不生成内毒素，因此，没必要担心内毒素向产物的残留。另外，棒状型细菌以高细胞密度充填于培养槽，同时，即使在限制了增殖的条件下也不溶菌而进行原儿茶酸或其盐的生成反应，因此，原料的糖不因增殖而被消耗，原儿茶酸或其盐的收率升高。另外，在限制了增殖的条件下，没必要将微生物的增殖中一般所要求的芳香族氨基酸或4-羟基苯甲酸等添加于培养液，相应地，可以抑制生产成本。
另外，在专利文献1～4的方法中，抑制来自3-脱氢莽草酸生成分支酸的反应的结果，转化体显示芳香族氨基酸要求性，为了生长，有必要另行添加芳香族氨基酸或芳香族维生素。因此，利用转化体的物质生产变得成本高，另外也要考虑菌体的增殖能力降低的可能性。另一方面，在本发明的转化体中，不抑制分支酸的生成而是非营养要求性，因此，在为了制备反应用菌体而进行的菌体增殖(培养)中，也没必要添加芳香族氨基酸或芳香族维生素，另外，与显示营养要求性的菌株相比，菌体增殖更旺盛。
附图说明
图1是表示棒状型细菌中的原儿茶酸生成途径的图。点线表示外来基因产物引起的代谢反应。
图2表示原儿茶酸给各种微生物的增殖带来的影响的图。
图3是表示原儿茶酸给棒状型细菌的糖消耗带来的影响的图。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
为了使本发明的理解容易，图1示意性地图示棒状型细菌转化体中的原儿茶酸生物合成途径。
(1)具有原儿茶酸或其盐的生产能力的转化体
宿主
在本发明中，只要是具有生产原儿茶酸的能力的微生物，均可以用作宿主。
作为优选的宿主微生物，可举出：棒状杆菌属细菌、埃希菌属细菌(特别是大肠杆菌)、芽孢杆菌属细菌(特别是枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属细菌(特别是恶臭假单胞菌)、短杆菌属细菌、链球菌属细菌、乳酸杆菌属细菌、红球菌属细菌(特别是红平红球菌、浑浊红球菌)、链霉菌属细菌、酵母属酵母(特别是酿酒酵母)、克鲁维酵母属酵母、裂殖酵母属酵母、亚罗酵母属酵母、毛孢子菌属酵母、红冬孢酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、念珠菌属酵母、脉孢菌属霉菌、曲霉属霉菌、木霉属霉菌等。
其中，从原儿茶酸或其盐的生产效率的观点出发，优选使用棒状型细菌作为宿主。
棒状型细菌是伯杰氏鉴定细菌学手册[Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology、Vol.8、599(1974)]中所定义的一组微生物，只要是在通常的需氧的条件下增殖的微生物，就没有特别限定。如果列举具体例，则可举出：棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节细菌属菌、分枝杆菌属菌、微球菌属菌等。在棒状型细菌中，优选棒状杆菌属菌。
作为棒状杆菌属菌，可举出：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、Corynebacterium efficiens、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。
其中，从安全且原儿茶酸的生产率高的观点出发，优选谷氨酸棒状杆菌。作为优选的菌株，可举出：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株(FERM BP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。这些谷氨酸棒状杆菌株在布达佩斯条约下进行国际保藏，可以公开地利用。
其中，优选R株(FERM BP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。
另外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状型细菌也以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)统一菌名[Liebl,W.etal.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T,"Brevibacterium flavum"DSM 20411,"Brevibacteriumlactofermentum"DSM 20412and DSM 1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.Int J Syst Bacteriol.41：255-260.(1991)、驹形和男等,棒状杆菌的分类,发酵和工业,45：944-963(1987)]。
作为短杆菌属菌，可举出产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。
作为节细菌属菌，可举出：球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。
作为分枝杆菌属菌，可举出牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。
作为微球菌属菌，可举出：弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如No.239株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240株(FERM P-13222))、尿素小球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。
这些短杆菌属、节细菌属、分枝杆菌属、及微球菌属的菌株在布达佩斯条约下进行国际保藏，可以公开地利用。
另外，棒状型细菌除野生株之外，可以为其变异株或人为的基因重组体。可举出例如：乳酸(乳酸)脱氢酶(lactate dehydrogenase：LDH)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malatede hydrogenase)等的基因的破坏株。其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株，由于乳酸脱氢酶基因被破坏，由此切断从丙酮酸向乳酸的代谢途径。其中，优选谷氨酸棒状杆菌的特别是R(FERM BP-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。
这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法制作。例如，在WO2005/010182A1中记载有乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。
如图2所示，本发明者们发现：棒状型细菌与其它细菌相比，对于原儿茶酸的耐性非常高。另外，如图3所示，棒状型细菌即使在高浓度的原儿茶酸的存在下，也显示高的糖消耗能力。在这些方面，棒状型细菌适于利用本发明方法的原儿茶酸或其盐的制造。
导入基因
本发明的有效地生成原儿茶酸的转化体，可以通过在宿主菌株中，强化3-脱氢莽草酸脱水酶、分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶的各酶活性而得到。
3-脱氢莽草酸脱水酶催化由3-脱氢莽草酸生成原儿茶酸的反应。分支酸丙酮酸裂解酶催化由分支酸生成4-羟基苯甲酸的反应。另外，4-羟基苯甲酸羟化酶通过将4-羟基苯甲酸的芳香环的3位的碳原子氢氧化，催化生成原儿茶酸的反应。
这些酶的活性强化可以通过将编码这些酶的基因导入宿主微生物而进行。另外，这些酶的活性强化也可以通过向存在于宿主微生物的染色体上的该酶基因的控制序列、基因编码区域、或其两者导入变异、或进行碱基序列置换来实现。其中，通过向宿主微生物导入这些酶基因，增强该酶活性简便且效率好。
使用棒状型细菌作为宿主的情况下，本菌在染色体上具有3-脱氢莽草酸脱水酶基因及4-羟基苯甲酸羟化酶基因，但不具有分支酸丙酮酸裂解酶基因。另外，关于3-脱氢莽草酸脱水酶基因及4-羟基苯甲酸羟化酶基因，也要考虑这些基因仅在特定的培养条件下(原儿茶酸、或特定的芳香族化合物的存在下)诱导表达的可能性。因此，上述三种基因优选作为置于在使用的培养条件下引起高表达的适当的启动子的控制下的融合基因导入宿主棒状型细菌。
各基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，可举出例如下述的微生物的基因。
3-脱氢莽草酸脱水酶基因
作为3-脱氢莽草酸脱水酶基因，可举出：棒状杆菌属细菌(特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酪棒杆菌(Corynebacterium casei)、Corynebacterium efficiens、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans))、红球菌属细菌(特别是浑浊红球菌(Rhodococcus opacus))、分枝杆菌属细菌(特别是耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis))、芽孢杆菌属细菌(特别是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))、葡糖杆菌属细菌(特别是氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans))、红假单胞菌属细菌(特别是沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris))、交替单胞菌属细菌(特别是麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii))、海杆菌属细菌(特别是除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus))、甲基杆菌属细菌(特别是扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属细菌(特别是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、不动细菌属细菌(特别是不动杆菌(Acinetobacter baylyi))、泛菌属细菌(特别是菠萝多源菌(Pantoea ananatis))、脉孢菌属菌(特别是粗糙链孢霉(Neurospora crassa))、及曲霉属菌(特别是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger))的基因等。
其中，优选谷氨酸棒状杆菌、乳酪棒状杆菌、Corynebacterium efficiens、耐盐棒杆菌、浑浊红球菌、扭脱甲基杆菌、粗糙链孢霉、黑曲霉及米曲霉的基因，其中，更优选谷氨酸棒状杆菌及耐盐棒杆菌的基因。
作为谷氨酸棒状杆菌、乳酪棒杆菌、Corynebacterium efficiens、耐盐棒杆菌、浑浊红球菌、耻垢分枝杆菌、苏云金杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌、沼泽红假单胞菌、麦氏交替单胞菌、除烃海杆菌、扭脱甲基杆菌、恶臭假单胞菌、不动杆菌、菠萝多源菌、粗糙链孢霉、米曲霉、黑曲霉的3-脱氢莽草酸脱水酶基因，分别可举出由序列号7、及序列号134～150所示的碱基序列构成的基因。
序列号7的谷氨酸棒状杆菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因被称为qsuB。
另外，也可以使用与序列号7及序列号134～150的任一个碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA、且是编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的多肽的DNA。
在本发明中，“严格的条件”是指在6×SSC的盐浓度的杂交溶液中、在50～60℃的温度条件下进行16小时杂交、在0.1×SSC的盐浓度的溶液中进行清洗的条件。
另外，也可以使用由与序列号7、及序列号134～150的任一个碱基序列具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的多肽的DNA。
在本发明中，碱基序列的相同性是利用GENETYX ver.8(GENETYX株式会社ゼネティックス制)算出的值。
3-脱氢莽草酸脱水酶活性通过如下方法而进行测定：在33℃下，通过在由50mMtris-盐酸缓冲剂(pH7.5)、0.5mM 3-脱氢莽草酸、25mM MgCl2构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视显示原儿茶酸的生成的290nm的吸光(吸光系数＝3890/M·cm)的上升。将在33℃下、在1分钟内生成1μmol的原儿茶酸的活性设为1unit的3-脱氢莽草酸脱水酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性。
另外，在本发明中，转化体的3-脱氢莽草酸脱水酶活性被强化是通过测定该转化体的细胞提取液中的3-脱氢莽草酸脱水酶活性来确认的。
分支酸丙酮酸裂解酶基因
分支酸丙酮酸裂解酶基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，优选普罗威登斯菌属细菌、或克洛诺菌属细菌的基因，其中，更优选拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)的基因，进一步更优选拉氏普罗威登斯菌(Providenciarustigianii)的基因。
作为拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)及阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)的分支酸丙酮酸裂解酶基因，分别可举出由序列号9、128、及129所示的碱基序列构成的基因。
序列号9的拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)的分支酸丙酮酸裂解酶基因被称为ubiC。
另外，也可以使用与序列号9、128、及129的任一个碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA、且是编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
另外，也可以使用由与序列号9、128、及129的任一个碱基序列具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。
分支酸丙酮酸裂解酶活性使用“Journal of Bacteriology,174,5309-5316,1992"Material sand Methods"”中记载的方法改变后的方法进行测定。即，通过在33℃下、在由50mM tris-盐酸缓冲剂(pH7.5)、20mM NaCl、0.2mM NADH、0.5mM分支酸、5U/ml乳酸脱氢酶构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视起因于NADH的消耗的340nm的吸光度降低(吸光系数＝6220/M·cm)，NADH的消耗是伴随以利用该酶活性生成的丙酮酸为基质的乳酸脱氢酶的偶联反应产生的，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的NADH的活性设为1unit的分支酸丙酮酸裂解酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有分支酸丙酮酸裂解酶活性。
另外，在本发明中，转化体的分支酸丙酮酸裂解酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的分支酸丙酮酸裂解酶活性的上升来确认的。
4-羟基苯甲酸羟化酶基因
4-羟基苯甲酸羟化酶也被称为酚单加氧酶。4-羟基苯甲酸羟化酶基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，优选棒状杆菌属细菌的基因、其中的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因。
作为谷氨酸棒状杆菌的4-羟基苯甲酸羟化酶基因，可举出由序列号8所示的碱基序列构成的基因。谷氨酸棒状杆菌的4-羟基苯甲酸羟化酶基因被称为pobA。
另外，也可以使用与序列号8的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA、且是编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的DNA。
另外，也可以使用由与序列号8的碱基序列具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的DNA。
4-羟基苯甲酸羟化酶活性的测定如下进行。通过在33℃下、在由50mMtris-盐酸缓冲剂(pH8.0)、0.2mM NADPH、2mM 4-羟基苯甲酸构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视340nm的吸光(吸光系数＝6220/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的NADPH的活性设为1unit的4-羟基苯甲酸羟化酶活性，在检测出该活性的情况下，判定为具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性。
另外，在本发明中，转化体的4-羟基苯甲酸羟化酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的4-羟基苯甲酸羟化酶活性的上升来确认的。
3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶活性的强化
本发明的转化体进一步优选3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶活性被增强。DAHP合酶为由赤藓糖-4-磷酸及磷酸烯醇式丙酮酸生成作为芳香族化合物生物合成途径的初始代谢产物的DAHP的酶。
DAHP合酶活性的增强可以通过向宿主微生物导入DAHP合酶基因、或向宿主微生物的染色体上的DAHP合酶基因(控制序列或区域、基因编码区域、或其两者)导入变异或进行序列置换来实现。其中，通过向宿主微生物导入DAHP合酶基因，增强DAHP合酶活性简便且效率好。
导入的DAHP合酶基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，优选源自谷氨酸棒状杆菌、或大肠杆菌(Escherichia coli)的基因。其中，更优选源自大肠杆菌的基因。
作为源自大肠杆菌的DAHP合酶基因，进一步更优选由序列号2的碱基序列构成的DNA(aroGS180F)。本发明者们通过比较研究发现：该基因是在作为源自大肠杆菌的DAHP合酶基因之一的aroG基因中导入了使该基因所编码的氨基酸序列的第180号的丝氨酸变异为苯丙氨酸的变异(S180F)后的基因，其基因产物显示对含有芳香族氨基酸的芳香族化合物导致的反馈抑制的耐性、及高的DAHP合酶活性(未发表)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号2具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有DAHP合酶活性的多肽的DNA、或与序列号2互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA、且是编码具有DAHP合酶活性的多肽的DNA。
DAHP合酶活性的测定如下进行。通过在由20mM双三丙烷缓冲剂(pH6.8)、500μM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)钠、500μM赤藓糖-4-磷酸、1mM氯化锰构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视起因于PEP的232nm的吸光(吸光系数＝2800/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的PEP的活性设为1unit的DAHP合酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有DAHP合酶活性。另外，在本发明中，转化体的DAHP合酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的DAHP合酶活性值的上升来确认的。
转酮醇酶活性、转醛醇酶活性的强化
本发明的转化体进一步优选转酮醇酶活性、或转酮醇酶活性和转醛醇酶活性被增强。
在糖代谢中，转酮醇酶催化2种反应。第一个反应是在非氧化的戊糖磷酸途径中催化从D-己糖-5-磷酸向甘油醛-3-磷酸的转换、和从D-核糖-5-磷酸(R5P)向景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的转换的反应。这些反应是可逆地共轭反应。另外，第二个反应是催化从D-果糖-6-磷酸(F6P)向赤藓糖-4-磷酸(E4P)的转换、和从甘油醛-3-磷酸向D-己糖-5-磷酸的转换的反应。这些反应是可逆地共轭反应。
另外，在糖代谢中，转醛醇酶催化从甘油醛-3-磷酸向赤藓糖-4-磷酸的转换、和从景天庚酮糖-7-磷酸向D-果糖-6-磷酸的转换。这些反应是共轭的。
这样，转酮醇酶及转醛醇酶在作为芳香族化合物生物合成的前体之一的赤藓糖-4-磷酸的生成中发挥重要的作用。因此，通过强化这些酶活性，细胞内的赤藓糖-4-磷酸的供给增大，其结果，可认为向芳香族化合物生物合成途径的代谢通量提高，带来原儿茶酸的生产率提高。
转酮醇酶活性及转醛醇酶活性的强化可以通过向宿主微生物导入转酮醇酶基因及转醛醇酶基因、或向宿主微生物的染色体上的转酮醇酶基因、或转醛醇酶基因的控制序列、基因编码区域、或其两者导入变异或进行序列置换来实现。其中，通过向宿主微生物导入转酮醇酶基因及转醛醇酶基因可以简便且效率好地增强该酶活性。
导入的转酮醇酶基因及转醛醇酶基因的来源没有特别限定，单从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，优选为棒状杆菌属细菌、其中的谷氨酸棒状杆菌的转酮醇酶基因及转醛醇酶基因。
作为谷氨酸棒状杆菌的转酮醇酶基因，可举出由序列号151的碱基序列构成的DNA(tkt)，作为谷氨酸棒状杆菌的转醛醇酶基因，可举出由序列号152的碱基序列构成的DNA(tal)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号151或152具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是分别编码具有转酮醇酶活性、或转醛醇酶活性的多肽的DNA。
另外，在本发明中，也可以使用与序列号151或152互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交、且分别编码具有转酮醇酶活性、或转醛醇酶活性的多肽的DNA。
在本发明中，转酮醇酶活性按照公知的方法(Sugimoto and Shiio,Agric.Biol.Chem.53：2081-2087(1989))改变后的方法进行测定。即，通过在33℃下、在由50mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、0.5mM MgCl2、0.01mM硫胺素二磷酸、1mM NADH、3U甘油3-磷酸脱氢酶、10U磷酸丙糖异构酶、0.5mM D-核糖-5-磷酸、0.5mM D-己糖-5-磷酸构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer监视340nm的吸光的减少(吸光系数＝12000/M·cm)，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的NADH的活性设为1unit的转酮醇酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有转酮醇酶活性。
另外，在本发明中，转化体的转酮醇酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的转酮醇酶活性值的上升来确认的。
在本发明中，转醛醇酶活性按照公知的方法(Sprenger,GA.et al.,J.Bacteriol.177：5930-5936(1995))改变后的方法进行测定。即，通过在33℃下、在由100mM三乙醇胺·盐酸缓冲剂(pH7.6)、10mM EDTA、2.5mM果糖-6-磷酸、0.5mM赤藓糖-4-磷酸、0.5mM NADH、0.5U/ml甘油3-磷酸脱氢酶、5U/ml磷酸丙糖异构酶构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800spectrophotometer监视340nm的吸光的减少(吸光系数＝12000/M·cm)，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的NADH的活性设为1unit的转醛醇酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有转醛醇酶活性。
另外，在本发明中，转化体的转醛醇酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的转醛醇酶活性值的上升来确认的。
3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙 酮莽草酸3-磷酸(EPSP)合酶、及分支酸合酶的各酶活性的强化
本发明的转化体进一步优选DAHP合酶以后的莽草酸途径上的一系列酶组、即，3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸(EPSP)合酶、及分支酸合酶的各酶活性的任一个以上被强化，另外，更优选这些酶活性全部被强化。通过这些1种以上的酶活性的强化，促进从DAHP向分支酸的代谢转换。
3-脱氢奎尼酸合酶是催化从DAHP向3-脱氢奎尼酸的转换的酶，3-脱氢奎尼酸脱水酶是催化从3-脱氢奎尼酸向3-脱氢莽草酸的转换的酶，莽草酸脱氢酶是催化从3-脱氢莽草酸向莽草酸的转换的酶，莽草酸激酶是催化从莽草酸向莽草酸-3-磷酸的转换的酶，EPSP合酶是催化从莽草酸-3-磷酸向EPSP的转换的酶，另外，分支酸合酶是催化从EPSP向分支酸的转换的酶。
3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、EPSP合酶、及分支酸合酶的各酶活性的强化可以通过向宿主微生物导入编码这些各酶的基因、或向宿主微生物的染色体上的该酶基因的控制序列、基因编码区域、或其两者导入变异或进行碱基序列置换来实现。其中，通过向宿主微生物导入各酶基因，强化这些基因所编码的该酶活性简便且效率好。
编码导入的3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、EPSP合酶、及分支酸合酶的各基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸或其盐的生产效率好的观点出发，优选为棒状杆菌属细菌，特别优选为谷氨酸棒状杆菌的基因。
作为源自谷氨酸棒状杆菌的上述各酶基因，3-脱氢奎尼酸合酶基因可举出由序列号153构成的DNA(aroB)，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因可举出由序列号5构成的DNA(aroD)，莽草酸脱氢酶基因可举出由序列号6构成的DNA(aroE)，莽草酸激酶基因可举出由序列号154构成的DNA(aroK)，EPSP合酶基因可举出由序列号155构成的DNA(aroA)，分支酸合酶基因可举出由序列号156构成的DNA(aroC)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号153、5、6、154、155、或序列号156具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是分别编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性、3-脱氢奎尼酸脱水酶活性、莽草酸脱氢酶活性、莽草酸激酶活性、EPSP合酶活性、或分支酸合酶活性的多肽的DNA。
另外，在本发明中，也可以使用与序列号153、5、6、154、155、或序列号156互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA、且是分别编码具有3-脱氢奎尼酸合酶活性、3-脱氢奎尼酸脱水酶活性、莽草酸脱氢酶活性、莽草酸激酶活性、EPSP合酶活性、或分支酸合酶活性的多肽的DNA。
3-脱氢奎尼酸合酶活性按照公知的方法(Meudi,S.et al.,Dehydroquinatesynthase from Escherichia coli,and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate.Methods.Enzymol.142：306-314(1987))进行测定。即，通过在33℃下、在由50mM磷酸钾缓冲剂(pH7.0)、0.2mM DAHP、0.2mM NAD+、1mM氯化钴(II)·6H2O、3-脱氢奎尼酸脱水酶的粗酶液构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer监视起因于通过3-脱氢奎尼酸合酶活性和3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的偶联反应而生成的3-脱氢莽草酸的234nm的吸光的上升(吸光系数＝12000/M·cm)，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内1μmol的3-脱氢莽草酸生成的活性设为1unit的DHQ合酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有DHQ合酶活性。
另外，在本发明中，转化体的3-脱氢奎尼酸合酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的3-脱氢奎尼酸合酶活性的上升来确认的。
3-脱氢奎尼酸脱水酶活性按照公知的方法(Chaudhuri,S.et al.,3-Dehydroquinate dehydratase from Escherichia coli.Methods.Enzymol.142：320-324(1987))而进行。即，通过在33℃下、在由50mM磷酸钾缓冲剂(pH7.0)、及0.5mM 3-脱氢奎尼酸构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用BeckmanDU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视起因于生成的3-脱氢莽草酸的234nm的吸光(吸光系数＝12000/M·cm)的上升，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内生成1μmol的3-脱氢莽草酸的活性设为1unit的3-脱氢奎尼酸脱水酶活性，在检测出活性的情况下，判定为具有3-脱氢奎尼酸脱水酶活性。
另外，在本发明中，转化体的3-脱氢奎尼酸脱水酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的上升来确认的。
莽草酸脱氢酶活性按照公知的方法(Chaudhuri,S.et al.,Shikimatedehydrogenase from Escherichia coli.Methods.Enzymol.142：315-320(1987))进行测定。即，通过在33℃下、在由100mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、0.2mM NADPH、0.5mM 3-脱氢莽草酸构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用BeckmanDU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视伴随NADPH的消耗的340nm的吸光(＝6220/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的NADPH的活性设为1unit的莽草酸脱氢酶活性，在检测出该活性的情况下，判定为具有莽草酸脱氢酶活性。
另外，在本发明中，转化体的莽草酸脱氢酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的莽草酸脱氢酶活性的上升来确认的。
莽草酸激酶活性按照公知的方法(Cheng,WC.et al.,Structures ofHelicobacter pylori shikimate kinase reveal a selective inhibitor-induced-fitmechanism.PLos One.7：e33481(2012))进行测定。即，通过在33℃下、在由100mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2、1.6mM莽草酸、2.5mM ATP、1mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.1mM NADH、2.5U/ml丙酮酸激酶、2.7U/ml乳酸脱氢酶构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，使莽草酸激酶活性引起的ADP的生成与丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶引起的反应共轭，利用Beckman DU800 spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视伴随上述反应结果产生的NADH的氧化的340nm的吸光(ε＝6220/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内1μmol的NADH被氧化的活性设为1unit的莽草酸激酶活性，在检测出该活性的情况下，判定为具有莽草酸激酶活性。
另外，在本发明中，转化体的莽草酸激酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的莽草酸激酶活性的上升来确认的。
EPSP合酶活性如以下那样进行测定。即，通过在在33℃下、在由100mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、5mM MgCl2、0.5mM莽草酸-3-磷酸、0.5mM磷酸烯醇式丙酮酸钠构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800 spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视起因于PEP的232nm的吸光(吸光系数＝2800/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内消耗1μmol的磷酸烯醇式丙酮酸的活性设为1unit的EPSP合酶活性，在检测出该酶活性的情况下，判定为具有EPSP合酶活性。
另外，在本发明中，转化体的EPSP合酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的EPSP合酶活性的上升来确认的。
分支酸合酶活性按照公知的方法(Kitzing,K.et al.,Spectroscopic andKinetic Characterization of the Bifunctional Chorismate Synthase fromNeurospora crassa.J.Biol.Chem.276：42658-42666(2001))进行测定。即，通过在37℃下、在由100mM磷酸钾缓冲剂(pH7.6)、4mM MgSO4、10mM谷氨酰胺、30mM硫酸铵、1mMDTT、0.01mMFMN、0.08mM EPSP、氨茴酸合酶的粗酶液构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用F-2500Fluorescence Spectrophotometer(日立社制)监视显示氨茴酸的生成的390nm的荧光，所述氨茴酸是通过与氨茴酸合酶的偶联反应而生成的，由反应初速度算出酶活性。FMN的还原可以通过添加5mM的连二亚硫酸盐(dithionite)或1mM的NADPH而进行。将在37℃下、在1分钟内生成1μmol氨茴酸的活性设为1unit的分支酸合酶活性，在检测出该酶活性的情况下，判定为具有分支酸合酶活性。
另外，在本发明中，转化体的分支酸合酶活性被强化是通过该转化体的细胞提取液中的分支酸合酶活性的上升来确认的。
原儿茶酸3,4-双加氧酶活性的消失、抑制、减少
本发明的转化体优选原儿茶酸3,4-双加氧酶活性消失、抑制、或减少。
原儿茶酸3,4-双加氧酶是在原儿茶酸的异化代谢途径中催化原儿茶酸的开环而引起的向β-羧基-顺,顺粘康酸的转换的酶。原儿茶酸3,4-双加氧酶活性可以通过染色体上的原儿茶酸3,4-双加氧酶基因的破坏、缺失、或变异而使其消失、抑制、或减少。
作为谷氨酸棒状杆菌的原儿茶酸3,4-双加氧酶基因，可举出pcaHG。
在本发明中，转化体的原儿茶酸3,4-双加氧酶活性消失、抑制、或减少可以通过测定该转化体的细胞提取液中的原儿茶酸3,4-双加氧酶活性来确认该酶活性减少或消失。
原儿茶酸3,4-双加氧酶活性通过在33℃下、在由100mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、及1mM原儿茶酸构成的反应用混合液中添加被验酶液而开始反应，利用Beckman DU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视起因于原儿茶酸的290nm的吸光(吸光系数＝2800/M·cm)的减少，由反应初速度算出酶活性。将在33℃下、在1分钟内1μmol的原儿茶酸消失的活性设为1unit的原儿茶酸3,4-双加氧酶活性，在检测出该酶活性的情况下，判定为具有原儿茶酸3,4-双加氧酶活性。
向经由磷酸转移酶系统(PTS)的细胞内的糖的摄入的消失、抑制、减少
磷酸烯醇式丙酮酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)是以将葡萄糖等糖向细胞内的摄入和糖的磷酸化共轭进行为特征的、仅存在于原核生物的糖输送机构。在大肠杆菌或棒状型细菌中，在糖向细胞内的摄入中PTS发挥主要的作用。PTS是由作为共同组件的Enzyme I(酶I)(PEP蛋白激酶)、HPr(Histidine-phosphorylatable protein；组氨酸可磷酸化蛋白)、及作为与各种糖的特异性的输送有关的膜蛋白质的Enzyme II(酶II)构成，将源自糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)设为磷酸供给体，经由这些构成因子间的磷酸传递而将糖作为磷酸化体输送至细胞内的系统。另一方面，PTS伴随葡萄糖向细胞内的输送，将作为芳香族化合物的共同前体之一的PEP作为用于葡萄糖-6-磷酸生成的磷酸供给基消耗掉。PEP是在芳香族化合物生产中成为关键的前体化合物，为了高生产含有原儿茶酸的芳香族化合物，抑制PTS之类的竞争代谢途径导致的PEP的消耗，提高向芳香族化合物生产途径的PEP的利用能力变得重要。在本发明的转化体中，优选经由PTS的糖的摄入被钝化，同时，赋予伴随糖输送而不消耗PEP的、经由与PTS不同的糖输送系统(非PTS糖输送系统)的糖利用能力。
经由PTS向细胞内的糖的摄入可以通过编码棒状型细菌的染色体上的PTS的基因的破坏、缺失、或变异而使其消失、抑制、或减少。
作为编码PTS的基因，可举出：编码EnzymeI的ptsI、编码Hpr的ptsH、及编码EnzymeII的ptsG等。为了抑制PTS依赖的葡萄糖输送，这些的基因的1个以上被破坏、缺失、或变异即可，优选编码作为PTS的共同组件的Hpr蛋白质的ptsH基因被破坏、缺失、或变异。
制作以将基因的部分序列缺失、不产生正常起作用的蛋白质的方式改变的缺失型基因，在含有该基因的DNA中将细菌转化，在缺失型基因和染色体上的基因中引起相同重组，由此可以将染色体上的基因置换为缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因所编码的蛋白质即使生成，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。利用了这种相同重组的基因置换导致的基因缺失或破坏已经确立，有包含温度感受性复制起点的质粒、使用可接合传递的质粒的方法、利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。
在本发明中，经由棒状型细菌转化体的PTS的糖输送能力消失、抑制、或减少是通过在该转化体中、以由PTS输送的糖(葡萄糖、蔗糖、果糖等)为碳源的生长消失、抑制、或被抑制、及利用这样的表现型因正常的pts基因的导入而恢复来确认的。
经由非PTS糖输送系统的糖摄入活性的强化
在谷氨酸棒状杆菌中，存在为与PTS不同的糖输送体、且伴随糖在细胞内输送而不消耗PEP的非PTS葡萄糖输送体。通过pts基因的破坏等而抑制了经由PTS的糖的摄入的谷氨酸棒状杆菌，将葡萄糖作为单一碳源不能增殖，或增殖能力显著降低，但相对于该株使非PTS葡萄糖输送体及葡萄糖激酶同时高表达时，以葡萄糖为单一碳源的增殖恢复(Ikeda,M.,et al.,Identification and application of a different glucose uptake systemthat functions as an alternative to the phosphotransferase system inCorynebacterium glutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.90：1443-1451,Lindner,S.N.,et al.,Phosphotransferase system-independent glucose utilization inCorynebacterium glutamicum by inositol permeases and glucokinases.Appl.Environ.Microbiol.77：3571-3581)。
在本发明中，在切断了PTS引起的糖输送的谷氨酸棒状杆菌中，葡萄糖向细胞内的摄入、及以葡萄糖为碳源的菌的增殖期望通过非PTS葡萄糖输送体活性及葡萄糖激酶活性的强化而得以改善。由此，认为可以避免伴随葡萄糖的输送的PEP的消耗，将更多的PEP供给于莽草酸等芳香族化合物生物合成成为可能。
非PTS葡萄糖输送体引起葡萄糖向细胞内的摄入可以通过编码非PTS葡萄糖输送体的基因的导入、或棒状型细菌的染色体上的非PTS葡萄糖输送体基因(控制序列或编码区域)中导入变异、或碱基序列置换引起该基因表达量的增大、或该基因产物的活性的增大而强化。
其中，通过非PTS葡萄糖输送体基因的导入而强化葡萄糖的摄入活性简便且效率好。
导入的非PTS葡萄糖输送体基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选为棒状杆菌属细菌、其中的谷氨酸棒状杆菌的基因。
非PTS葡萄糖输送体只要在棒状型细菌内起作用即可，可举出：源自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体(IolT1,IolT2)、源自大肠杆菌的半乳糖透性酶(GalP)、源自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖转运蛋白(Glf)等。其中，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选经由源自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体的糖摄入活性被强化。
作为源自谷氨酸棒状杆菌的肌醇转运体基因，可举出由序列号157的碱基序列构成的DNA(iolT1)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号157具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有肌醇转运体活性的多肽的DNA。
另外，在本发明中，也可以使用与序列号159互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交、且编码具有肌醇转运体活性的多肽的DNA。
在本发明中，DNA所编码的蛋白质是非PTS葡萄糖输送体的情况是通过下述指标来确认的：对于通过ptsH基因破坏等而失去PTS依赖的葡萄糖输送能力，以葡萄糖为碳源的生长降低的宿主细胞，导入该DNA、使其表达的转化体的葡萄糖为碳源的生长、或葡萄糖消耗速度与转化前的细胞相比升高，另外，其效果不受pts基因破坏等导致的PTS依赖的糖输送的抑制引起的影响。
另外，在本发明中，转化体的非PTS葡萄糖输送体活性被强化的情况是通过下述指标来确认的：以缺损了PTS引起的糖输送的该转化体中的葡萄糖为碳源的生长、或葡萄糖消耗速度在该转化体中，与基因导入前相比升高。
葡萄糖激酶活性的强化
为了利用非PTS葡萄糖输送体将被摄入于细胞内的葡萄糖在中央代谢系统中进行代谢，有必要利用葡萄糖激酶转换为葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖激酶是催化从葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸的转换的酶。
在本发明中，优选与非PTS葡萄糖输送体依赖的葡萄糖输送的强化同时，强化葡萄糖激酶活性。由此，将促进葡萄糖向细胞内的摄入和与其连续的糖酵解途径或戊糖磷酸途径上的糖代谢作为特征。
葡萄糖激酶活性，可以通过葡萄糖激酶基因的导入引起的高表达、或对于染色体上的葡萄糖激酶基因(控制序列及基因编码区域)导入变异、或进行序列置换来引起该基因表达量的增大、或该基因产物的活性增大来进行强化。
在谷氨酸棒状杆菌R株的染色体上，作为葡萄糖激酶基因，存在cgR_2067(glk1)、cgR_2552(glk2)、及cgR_1739(ppgK)至少3种。其中，cgR_2067(glk1)及cgR_2552(glk2)与以ATP为良好的基质的葡萄糖激酶具有高的相同性，cgR_1739(ppgK)与以聚磷酸为良好的基质的葡萄糖激酶具有高的相同性。在本发明中，优选这些葡萄糖激酶基因中的1种以上被强化，更优选3种全部被强化。
葡萄糖激酶活性的强化通过葡萄糖激酶基因的导入来进行简便且效率好。
导入的葡萄糖激酶基因的来源没有特别限定，从莽草酸生产效率好的观点出发，优选为棒状杆菌属细菌、其中的谷氨酸棒状杆菌的基因。
作为源自谷氨酸棒状杆菌的葡萄糖激酶基因，可举出由序列号158、159及160的碱基序列构成的DNA(分别、glk1、glk2、及ppgK)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号158、159、或160具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且编码具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。
另外，在本发明中，也可以使用与序列号158、159、或160互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交、且编码具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。
在本发明中，DNA所编码的蛋白质为葡萄糖激酶，是通过测定该DNA所编码的蛋白质的葡萄糖激酶活性来确认的。葡萄糖激酶活性通过如下方法而进行测定：通过在33℃下、在由100mM tris盐酸缓冲剂(pH7.5)、4mM氯化镁、1mM ATP、0.2mM NADP+、20mM葡萄糖、1U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶构成的反应用混合液中添加酶液而开始反应，利用Beckman DU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视显示NADPH的生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。将在33℃下、在1分钟内生成1μmol的NADPH的活性设为1unit的葡萄糖激酶活性。
另外，在本发明中，转化体的葡萄糖激酶活性被强化是通过测定该转化体的细胞提取液中的葡萄糖激酶活性来确认的。
GAPDH活性的强化
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是将甘油醛3-磷酸转换为1,3-双磷酸甘油酸的酶。
在本发明的转化体中，优选GAPDH活性被强化。
在本发明中，pts基因被破坏，将经由非PTS葡萄糖输送体的糖摄入活性及葡萄糖激酶活性进行了强化的棒状型细菌转化体在培养及反应时显著地蓄积作为糖酵解途径代谢中间体的二羟基丙酮磷酸进行了脱磷酸化的代谢产物即二羟基丙酮(DHA)、或DHA进一步进行代谢而生成的甘油。另外，甘油醛-3-磷酸及其上游的糖酵解途径代谢中间体的细胞内浓度在该转化体中显著地增大。本发明人发现：这些现象在该转化体中，利用GAPDH进行催化的反应阶段显示成为糖酵解途径上的糖代谢的限速，通过该转化体中的GAPDH的高表达而促进糖消耗，也促进与其相伴的目标产物的生产。
因此，在本发明中，期望通过强化转化体的GAPDH活性，将糖代谢的限速解除而促进糖消耗，同时提高原儿茶酸生产能力。
GAPDH活性，可以通过GAPDH基因的导入引起的高表达、或在染色体上的GAPDH基因(控制序列及基因编码区域)中导入变异、或进行序列置换引起的该基因表达量的增大、或该基因产物的活性的增大来强化。
其中，GAPDH活性的强化通过GAPDH基因的导入而进行简便且效率好。
导入的GAPDH基因的来源没有特别限定，从原儿茶酸生产效率好的观点出发，优选为棒状杆菌属细菌、其中的谷氨酸棒状杆菌的基因。
作为源自谷氨酸棒状杆菌的GAPDH基因，可举出由序列号161的碱基序列构成的DNA(gapA)。
另外，在本发明中，也可以使用由与序列号161具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的相同性的碱基序列构成的DNA、且是编码具有GAPDH活性的多肽的DNA。
另外，在本发明中，也可以使用与序列号161互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交、且编码具有GAPDH活性的多肽的DNA。
在本发明中，DNA所编码的蛋白质为GAPDH通过测定该DNA所编码的多肽的GAPDH活性来确认。GAPDH活性的测定通过如下方法而进行：通过在33℃下、在由25mM磷酸缓冲剂(pH7.5)、25mM tris乙醇胺(pH7.5)、0.2mM EDTA、5mM NAD+、5mM甘油醛-3-磷酸构成的反应用混合液中添加酶液而开始反应，利用Beckman DU800spectrophotometer(ベックマン·コールター社制)监视显示NADH的生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。将在33℃下、在1分钟内生成1μmol的NADH的活性设为1unit的GAPDH活性。
另外，在本发明中，棒状型细菌转化体的GAPDH活性被强化是通过测定该棒状型细菌转化体的细胞提取液中的GAPDH活性来确认的。
二羟基丙酮磷酸(DHAP)脱磷酸化活性的消失、抑制、减少
DHAP脱磷酸化酶是催化DHAP的脱磷酸化引起的向二羟基丙酮(DHA)的转换的酶。
本发明的转化体优选DHAP脱磷酸化酶活性消失、抑制、或减少。如上所述，在进行了高表达的非PTS葡萄糖输送体及葡萄糖激酶中依赖地将糖摄入于细胞内并利用的棒状型细菌，作为副产物高生成DHA。因此，通过DHA生成途径的切断，可以将更多的碳供给于原儿茶酸等芳香族化合物生成。
谷氨酸棒状杆菌作为催化DHAP的脱磷酸化的酶，具有HAD(卤酸脱卤酶haloaciddehalogenase)超家族磷酸酶(HdpA)(Jojima,T.et.al.,Identification of a HADsuperfamily phosphatase,HdpA,involved in 1,3-dihydroxyacetone productionduring sugar catabolism in Corynebacterium glutamicum.FEBS.Lett.586：4228-4232(2012))。谷氨酸棒状杆菌的DHAP脱磷酸化酶活性可以通过染色体上的DHAP脱磷酸化酶基因(hdpA)的破坏、缺失、或变异而使其消失、抑制、或减少。
另外，在本发明中，转化体的DHAP脱磷酸化酶活性消失、抑制、或减少是通过测定该转化体的细胞提取液中的DHAP脱磷酸化酶活性来确认的。DHAP脱磷酸化酶活性通过如下方法而进行测定：通过在33℃下、在由100mM tris-苹果酸缓冲剂(pH7.5)、5mM硫酸镁、5mMDHAP构成的反应用混合液中添加酶液而开始反应，将从DHAP游离的无机磷酸离子按照公知的方法(Gawronski,J.D.,et.al.,Microtiter assay for glutamine synthetasebiosynthetic activity using inorganic phosphate detection.Anal.Biochem.327：114-118(2004))进行比色定量。在该定量值减少或消失的情况下，判定为二羟基丙酮磷酸脱磷酸化酶活性消失、抑制、或减少。
用于转化体的载体的构建
通过向宿主微生物导入基因，使其所编码的蛋白质或酶的活性强化时，编码各蛋白质或酶的DNA只要各自插入于宿主的染色体、或克隆成可以在宿主中扩增的适当的载体而导入宿主即可。
质粒载体只要是在棒状型细菌内含有担任自律复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可举出：源自乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256的pAM330[日本特开昭58-67699号公报]、[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids in glutamicacid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)]及[Yamaguchi,R.etal.,Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacteriumlactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16：265-267(1985)]、源自谷氨酸棒状杆菌ATCC3058的pHM1519[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)]及pCRY30[Kurusu,Y.et al.,Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.Appl.Environ.Microbiol.57：759-764(1991)]、源自谷氨酸棒状杆菌T250的pCG4[日本特开昭57-183799号公报]、[Katsumata,R.et al.,Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159：306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.et al.,Afamily of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors forcloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene,102：93-98(1991)]等。
作为优选的启动子，可举出：源自谷氨酸棒状杆菌R的甘油醛3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。
作为优选的终止子，可举出：大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB T1T2终止子。
转化
转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这种公知的方法，可举出例如：氯化钙·氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电脉冲法等。其中，就棒状型细菌而言，电脉冲法适合，电脉冲法可以通过公知的方法进行(Kurusu,Y.et al.,Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990))。
转化体只要使用微生物的培养中通常所使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类、及其它营养物质等的天然培养基、或合成培养基。
作为碳源，可举出：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨醇、甘油等糖质或糖醇；醋酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以单独使用1种，或也可以混合2种以上。培养基中的这些碳源的浓度通常设为约0.1～10(w/v％)即可。
作为氮源，可举出：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵等无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以利用玉米浆、肉精、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，另外也可以混合2种以上而使用。培养基中的氮源浓度也因使用的氮化合物而不同，但通常设为约0.1～10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可举出例如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用1种，另外也可以混合2种以上而使用。培养基中的无机盐类浓度也因使用的无机盐而不同，但通常设为约0.01～1(w/v％)即可。
作为营养物质，可举出例如：肉精、蛋白胨、聚蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、玉米浆、脱脂粉乳、脱脂大豆盐酸水解物、或动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等，但通常设为约0.1～10(w/v％)即可。进而，也可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可举出例如：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
培养基的pH优选约6～8。
作为优选的微生物培养培养基，可举出：A培养基[Inui,M.et al.,Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)]等。
培养温度设为约15～45℃即可，培养时间设为约1～7天即可。
(2)原儿茶酸或其盐的制造方法
可以通过包含使上述说明的本发明的转化体在含有糖类的反应液中进行培养或反应而生产原儿茶酸或其盐的工序的方法制造原儿茶酸或其盐。
作为糖类，优选葡萄糖，但还可以使用果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖，除此之外，也可以使用通过代谢可生成葡萄糖的糖类。在这种糖类中包含具有葡萄糖单元的低聚糖或多糖，可举出：纤维二糖、蔗糖(蔗糖)、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等二糖；糊精或可溶性淀粉等多糖等。
另外，例如作为含有这些原料化合物的原料，也可以使用糖蜜。另外，也可以使用将秸(稻秸、大麦秸、小麦秸、黑麦秸、燕麦秸等)、甘蔗渣、玉米秸秆等非可食农产废弃物、或柳枝稷、象草、芒草等能量作物、或木屑、旧纸等用糖化酶等进行了糖化的、含有葡萄糖等多个糖的糖化液。
微生物的增殖
优选含有糖类的培养基中的培养，即在反应之前，将转化体在需氧条件下、在温度约25～38℃下培养约12～48小时而使其增殖。
培养用培养基
用于反应之前的转化体的需氧培养的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其它营养物质等的天然培养基或合成培养基。
作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖之类的单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖之类的二糖；淀粉之类的多糖；糖蜜等)、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油之类的糖醇；醋酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸之类的有机酸；乙醇、丙醇之类的醇；正石蜡之类的烃等。
碳源可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。
作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵之类的无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉精、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。氮源的培养基中的浓度也因使用的氮化合物而不同，但通常设为约0.1～10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。无机盐类的培养基中的浓度也因使用的无机盐而不同，但通常设为约0.01～1(w/v％)即可。
作为营养物质，可举出：肉精、蛋白胨、聚蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、玉米浆、脱脂粉乳、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基中的浓度也因使用的营养物质而不同，但通常设为约0.1～10(w/v％)即可。
进而，也可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可举出：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
培养基的pH优选约6～8。
作为具体的优选的棒状型细菌用培养基，可举出：A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)]等。在这些培养基中，使糖类浓度为上述范围而使用即可。
培养液或反应液
作为培养液或反应液，可以使用含有碳源、氮源及无机盐类等的天然反应液或合成反应液。
作为碳源，使用上述说明的糖类或含有其的糖蜜或糖化液等即可。另外，作为碳源，除糖类之外，也可以使用：甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油之类的糖醇；醋酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸之类的有机酸；乙醇、丙醇之类的醇；正石蜡之类的烃等。
碳源可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。
作为反应液中的原料化合物的糖类的浓度优选约1～20(w/v％)，更优选约2～10(w/v％)，进一步更优选约2～5(w/v％)。
另外，含有原料的糖类的总碳源的浓度设为约2～5(w/v％)即可。
作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵之类的无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉精、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。氮源的反应液中的浓度也因使用的氮化合物而不同，但通常设为约0.1～10(w/v％)即可。
作为无机盐类，可举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用1种，或混合2种以上而使用。无机盐类的反应液中的浓度也因使用的无机盐而不同，但通常设为约0.01～1(w/v％)即可。
进而，也可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可举出：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
反应液的pH优选约6～8。
作为具体的优选的棒状型细菌用反应液，可举出前述的BT培养基等。在这些培养基中，使糖类浓度为上述范围而使用即可。
培养条件或反应条件
培养温度或反应温度、即转化体的生存温度优选约20～50℃，更优选约25～47℃。如果为上述温度范围，则可以有效地制造原儿茶酸。
另外，培养或反应时间优选约1～7天，更优选约1～3天。
培养可以为间歇式、流加式、连续式的任一种。其中，优选间歇式。
反应可以在需氧的条件下进行，也可以在还原条件下进行。需氧的条件下，本发明的转化体自身的原儿茶酸或其盐的生产能力高。但是，由于在需氧的条件下转化体增殖，因此，原料化合物因为增殖而被消耗，相应地，原儿茶酸或其盐的制造效率降低。
因此，优选在需氧且转化体不增殖的条件下进行反应。本发明中不增殖包含实质上不增殖、或几乎不增殖。例如，通过在微生物的增殖中使用使作为必须的化合物的生物素、硫胺素等维生素类、氮源、或营养要求性的转化体的增殖中必须的氨基酸等的1种以上缺乏、或被限制的反应液，可以避免或抑制转化体的增殖。
另外，在还原条件下，棒状型细菌实质上不增殖，因此，原料化合物不因增殖而被消耗，相应地，原儿茶酸或其盐的制造效率升高。
还原条件以反应液的氧化还原电位被规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～-500mV，更优选约-150mV～-500mV。
反应液的还原状态可以简便地用刃天青指示剂(如果为还原状态，则从蓝色向无色的脱色)推定，但可以准确地使用氧化还原电位差计(例如BROADLEY JAMES社制、ORPElectrodes)测定。
处于还原条件的培养液或反应液的调整方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，作为反应液的液体介质，可以使用反应液用水溶液取代蒸馏水等，就反应液用水溶液的调整方法而言，例如硫酸还原微生物等绝对嫌气性微生物用的培养液调整方法(Pfennig,N.et al.,(1981)：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria，In TheProkaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and Identification of Bacteria，Ed.by Starr，M.P.et al.,p926-940，Berlin，Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26刷、产业图书株式会社出版”等成为参考，可以得到所期望的还原条件下的水溶液。
具体而言，通过将蒸馏水等进行加热处理或减压处理而除去溶解气体，可以得到还原条件的反应液用水溶液。该情况下，通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压下将蒸馏水等进行处理约1～60分钟左右、优选约5～40分钟左右，可以除去溶解气体、特别是溶解氧而制作还原条件下的反应液用水溶液。
另外，也可以添加适当的还原剂(例如硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基醋酸、硫醇醋酸、谷胱甘肽、硫化钠等)而调整还原条件的反应液用水溶液。
适当组合这些方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的调整方法。
在还原条件下进行反应的情况下，反应中也优选将反应液维持在还原条件。为了维持反应中途的还原条件，优选尽可能防止来自反应体系外的氧的混入，具体而言，可举出将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等封入的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应中途使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能有效地起作用，也存在产生反应体系的pH维持调整液的添加或适当添加各种营养素溶解液的必要的情况，但在这种情况下，从添加溶液中预先除去氧是有效的。
通过如上述那样培养，在培养液或反应液中生产原儿茶酸或其盐。
原儿茶酸的盐也因培养基或反应液的成分而不同，但可举出碱金属盐(钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(镁盐、钙盐等)。
实施例
[实施例1]
PCA生产株的构建
(1)染色体DNA的调整
为了取得PCA生产关联酶基因，从下述菌株调整染色体DNA。
将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERMP-18976)、大肠杆菌(Escherichia coli K-12MG1655)、拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii JCM3953)、乳酪棒状杆菌(Corynebacterium casei JCM 12072)、Corynebacterium efficiensNBRC100395、菠萝多源菌(Pantoea ananatis LMG 20103)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans ATCC 621H)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida NBRC14164)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris ATCC BAA-98)、不动杆菌(Acinetobacter baylyi ATCC33305)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodiiNBRC102226)、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus JCM 20777)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens JCM 2802)、粗糙链孢霉(Neurospora crassaATCC36373)、黑曲霉(Aspergillus niger JCM22282)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis ATCC700084)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans JCM12676)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus ATCC51881)、米曲霉(Aspergillus oryzae JCM13832)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis NBRC3951)按照菌株获得机关的信息接着培养之后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：Genomic Prep Cells and Tissue DNA IsolationKit、アマシャム社制)进行调整。
(2)PCA生产关联基因表达质粒的构建
将用于分离目标酶基因的引物序列示于表1。PCR使用Veriti Thermal cycler(アプライド·バイオシステムズ社制)，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社制)作为反应试剂。
将得到的DNA片段导入含有PgapA启动子的克隆载体(pCRB207[Hasegawa S etal.,Improvement of the redox balance increases L-valine production byCorynebacterium glutamicum under oxygen deprivation conditions.Appl EnvironMicrobiol.78(3)：865-875(2012)]、pCRB209[国际公开WO2012/033112]、pCRB210[国际公开WO2012/033112]。
[表1]
PCA生产关联基因分离用引物及扩增基因序列
Figure GDA0001901621840000411
将导入的克隆载体和得到的质粒名称示于表2。另外，tkt和tal(tkt-tal基因；序列号1)、aroC和aroK和aroB(aroCKB；序列号3)在染色体上连续地配置在相同的方向，因此，统一进行克隆。
[表2]
PCA生产关联基因表达质粒
基因来源 酶基因 导入载体 质粒名称
Corynebacterium glutamicum tkt，tal pCRB209 PGppp25
Escherichia coil aroG pCRB210 pSKM1
Escherichia coli aroG(S180F) pCRB210 pCRB237
Corynebacterium glutamicum aroC，aroK，aroB pCRB209 pCRB270
Corynebacterium glutamicum aroA pCRB207 pCRB271
Corynebacterium glutamicum aroD pCRB209 pCRB272
Corynebacterium glutamicum aroE pCRB209 pCRB273
Corynebacterium glutamicum qsuB pCRB209 R493/Lgup10
Corynebacterium glutamicum pobA pCRB209 Pphe314
Providencia rustigianii ubiC pCRB209 Pphe292
Corynebacterium casei qsuB pCRB210 Padi31
Corynebucterium efficiens qsuB pCRB209 Padi25
Pantoea ananatis v11Y pCRB209 Padi26
Gluconobacter oxydans asbF pCRB209 Padi28
Pseudomonas putida quiC pCRB209 Padi29
Rhodopseudomonas palustris asbF pCRB209 Padi30
Acinetobacter baylyi quiC pCRB209 PGadi1
Alteromonas macleodii asbF pCRB209 Padi43
Marinobacter hydrocarbonoclasticus asbF pCRB209 Padi42
Methylobacterium extorquens asbF pCRB209 Padi37
Neurospora crassa qsuB pCRB209 Padi39
Asporgillus niger qutC pCRB209 Padi41
Mycobacterium smegmatis asbF pCRB209 Padi36
Corynebacterium halotolerans qsuB pCRB209 Padi35
Rhodococcus opacus qsuB pCRB209 Padi44
Aspergillus oryzae qutC pCRB209 Padi40
Bacillus thuringiensis asbF pCRB207 Padi34
(3)PCA生产关联基因染色体导入用质粒的构建
以被报道为在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的生长中非必须的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI区域)为基础决定为了将PCA生产关联基因以无标记导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的染色体而需要的DNA区域。该DNA区域通过PCR法进行扩增。将得到的DNA片段导入无标记基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]。予以说明，pCRB260、pCRB263、pCRB266、pCRB267、pCRB274及pCRB279通过反向PCR法在SSI区域中导入用于插入基因的限制酶部位(唯一限制性位点)。将用于SSI区域的分离及反向PCR的引物序列及得到的染色体导入用载体示于表3。
[表3]
用于将SSI区域分离的引物序列及得到的染色体导入用载体
Figure GDA0001901621840000451
*：反向PCR中使用的引物
在上述的染色体导入用质粒中，由上述表2中构建的PCA生产关联基因表达质粒取得PgapA启动子融合酶基因片段并导入。将得到的PCA生产关联基因染色体导入用质粒示于表4。
[表4]
PCA生产关联基因染色体导入用质粒
Figure GDA0001901621840000461
(4)谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株染色体基因破坏用质粒 的构建
将为了以无标记破坏谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的染色体基因而需要的DNA区域通过PCR法进行扩增。各PCR片段可利用重叠区域连结。将得到的DNA片段导入无标记基因破坏用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]。将得到的染色体基因破坏用质粒示于表5。
[表5]
Corynebacterium glutamicum R株染色体基因破坏用质粒
Figure GDA0001901621840000471
*：含有重叠区域的引物
(5)染色体基因重组引起的PCA生产株的构建无标记染色体基因导入用载体pCRA725是在谷氨酸棒状杆菌R内不能复制的质粒。与导入质粒pCRA725的染色体上的相同区域的一重交叉株的情况下，显示pCRA725上的卡纳霉素耐性基因的表达导致的卡纳霉素耐性和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达导致的含蔗糖的培养基中的致死性，与此相对，二重交叉株的情况下，显示pCRA725上的卡纳霉素耐性基因的脱落导致的卡纳霉素感受性和sacR-sacB基因的脱落导致的含蔗糖的培养基中的生长性。因此，无标记染色体基因导入株显示卡纳霉素感受性及含蔗糖的培养基生长性。
通过上述方法，使用上述的PCA生产关联基因染色体导入用质粒及染色体基因破坏用质粒构建PCA生产关联基因染色体导入株。使用木糖·纤维二糖同化性棒状型细菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)X5C1株[Appl Microbiol Biotechnol.81(4)：691-699(2008)]作为宿主菌株。另外，也使用ldhA基因破坏用质粒pCRA728[J MolMicrobiol Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]、阿拉伯糖同化基因染色体导入用质粒pCRD109[Appl Microbiol Biotechnol.85(1)：105-115(2009)]及阿拉伯糖转运体基因染色体导入用质粒pCRD108[Appl Microbiol Biotechnol.85(1)：105-115(2009)]。另外，本染色体基因重组的概要汇总示于表6。
[表6]
染色体基因重组引起的PCA生产关联基因导入株的构建
Figure GDA0001901621840000491
x2，x3，x4：表示导入染色体的基因个数
(6)PCA生产基因表达质粒导入株的构建
构建导入了源自上述的各种微生物的3-脱氢莽草酸脱水酶基因表达质粒的谷氨酸棒状杆菌转化体。另外，本质粒导入株的概要汇总示于表7。
[表7]
3-脱氢莽草酸脱水酶基因表达质粒导入株
构建菌株名称 宿主菌株名称 导入质粒 3-脱氢莽草酸脱水酶基因来源
DHS1/pCRB209 DHS1 pCRB209 -
PRO17 DHS1 R493/Lgap10 Corynebacterium glutamicum
PRO18 DHS1 Padi31 Corynebacterium casei
PRO19 DHS1 Padi25 Corynebacterium efficiens
PRO20 DHS1 Padi26 Pantoea ananatis
PRO21 DHS1 Padi28 Gluconobacter oxydans
PRO22 DHS1 Padi29 Pseudomonas putida
PRO23 DHS1 Padi30 Rhodopseudomonas palustris
PRO24 DHS1 PGadi1 Acinetobacter baylyi
PRO28 DHS1 Padi43 Alteromonas macleodii
PRO29 DHS1 Padi42 Marinobacter hydrocarbonoclasticus
PRO30 DHS1 Padi37 Methylobacterium extorquens
PRO31 DHS1 Padi39 Neurospora crassa
PR032 DHS1 Padi41 Aspergillus niger
PRO33 DHS1 Padi36 Mycobacterium smegmatis
PRO34 DHS1 Padi35 Corynebacterium halotolerans
PRO37 DHS1 Padi44 Rhodococcus opacus
PR038 DHS1 Padi40 Aspergillus oryzae
PRO39 DHS1 Padi34 Bacillus thuringiensis
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)PCA4在日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行国际保藏(基于布达佩斯条约的国际保藏的保藏日：2016年3月9日、保藏号：NITE BP-02217)。该株可以公开地利用。
[参考例1]
与其它微生物相比，棒状型细菌对原儿茶酸具有高的耐性的验证
使用微生物利用发酵法生产具有原儿茶酸之类的细胞毒性的产物的情况下，宿主微生物具有对该产物的耐性、即，不易受到产物导致的增殖抑制是重要的。因此，为了在与其它微生物的比较中验证对作为本发明中的宿主微生物优选的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的原儿茶酸的耐性度，关于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum),大肠杆菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtili),恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),红平红球菌(Rhodococcuserythropolis),及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，对需氧培养中的原儿茶酸引起的增殖抑制效果进行了研究。
将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株涂布于含有4％的葡萄糖的A琼脂培养基[将(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物(vitaminassay casamino acid)7g、琼脂20g溶解于蒸馏水1L]，在33℃下培养16小时。将在上述板上增殖的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株一白金耳植菌于放入有含有4％的葡萄糖的A液体培养基[将(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O 1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物(vitamin assay casamino acid)7g溶解于蒸馏水1L]10ml的试管，在33℃下需氧地进行振荡的培养16小时。将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株以成为初期菌体浓度OD610＝0.1的方式植菌于含有4％的葡萄糖的所述A液体培养基10ml，同时以原儿茶酸成为终浓度0、25、50、100、250、500mM的方式添加，在33℃下需氧地进行振荡的培养。菌体的增殖通过测定OD610而进行。
另外，将大肠杆菌(Escherichia coli)K12株,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)NBRC14144株,恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC700801株及红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC27854株各自涂布于LB琼脂培养基[1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、及1.5％琼脂]，大肠杆菌(Escherichia coli)K12株、及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)NBRC14144株在37℃下进行16小时培养，另外，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC700801株、及红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC27854株在30℃下进行16小时培养。将上述板上中增殖的各菌株植菌于LB液体培养基[1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、及0.5％氯化钠]10ml，大肠杆菌(Escherichia coli)K12株及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)NBRC14144株在37℃下需氧地进行振荡的培养16小时，另外，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC700801株及红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC27854株在30℃下需氧地进行振荡的培养16小时。将在上述条件下增殖的各菌株以成为初期菌体浓度OD610＝0.1的方式植菌于所述LB液体培养基10ml，同时以原儿茶酸浓度成为终浓度0、25、50、100、250、500mM的方式添加，大肠杆菌(Escherichiacoli)K12株及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)NBRC14144株在37℃下需氧地进行振荡的培养，另外，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC700801株及红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC27854株在30℃下需氧地进行振荡的培养。菌体的增殖通过测定OD610而进行。
另外，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2376株涂布于YPD琼脂培养基[2％聚蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖、及1.5％琼脂]，于30℃进行16小时培养。将上述板上增殖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2376株植菌于YPD液体培养基[2％聚蛋白胨、1％酵母提取物、及2％葡萄糖]，于30℃需氧地进行振荡的培养16小时。将在上述条件下增殖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2376株以成为初期菌体浓度OD610＝0.1的方式植菌于所述YPD液体培养基10ml，同时以原儿茶酸浓度成为终浓度0、25、50、100、250、500mM的方式添加，在30℃下需氧地进行振荡的培养。菌体的增殖通过测定OD610而进行。
将研究向培养基中添加原儿茶酸导致的对各菌株的需氧增殖的影响的结果示于图2。
大肠杆菌(Escherichia coli)K12株在100mM原儿茶酸存在下受到显著的增殖抑制，如果为250mM，则几乎完全抑制增殖。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)NBRC14144株在250mM原儿茶酸存在下受到显著的增殖抑制，如果为500mM，则几乎完全抑制增殖。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC700801株在100mM原儿茶酸存在下受到强的增殖抑制，如果为250mM，则几乎完全抑制增殖。
红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC27854株在250mM原儿茶酸存在下受到强的增殖抑制，如果为500mM，则几乎完全抑制增殖。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2376株在250mM原儿茶酸存在下受到增殖抑制，如果为500mM，则受到显著的增殖抑制。
与此相对，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株，在其它菌株的增殖显著，或即使在几乎完全被抑制的250～500mM的原儿茶酸存在下也可以进行旺盛的增殖。
这样，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)与作为原儿茶酸生产宿主有报道的其它微生物或代表的溶剂耐性菌相比，具有对原儿茶酸的高的耐性，因此，显示作为原儿茶酸生产宿主具有高的适性。
[参考例2]
棒状型细菌在高浓度的原儿茶酸存在下具有高的糖消耗能力的验证
如参考例1所示，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)在高浓度的原儿茶酸存在下也可以增殖。因此，进一步如下地研究了高浓度的原儿茶酸存在下的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的葡萄糖消耗能力。
将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株涂布于含有4％的葡萄糖的所述A琼脂培养基，在33℃下培养16小时。将在上述板上增殖的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株一白金耳植菌于放入有含有4％的葡萄糖的所述A液体培养基10ml的试管，在33℃下需氧地进行振荡的培养16小时。将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株以成为初期菌体浓度OD610＝0.2的方式植菌于含有4％的葡萄糖的所述A液体培养基10ml，同时以原儿茶酸成为终浓度0、50、250、500mM的方式添加，在33℃下需氧地进行振荡的培养。在培养24小时后回收培养液，将进行离心分离(4℃，15,000×g，5分钟)而得到的上清液中的葡萄糖浓度与后述的实施例2同样地利用葡萄糖传感器进行测定。将各浓度的原儿茶酸存在下的培养24小时后的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的葡萄糖消耗量示于图3。
如图3所示，可知：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)即使在高浓度的原儿茶酸存在下，糖消耗的降低也很少。
由参考例1和2的结果显示：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为原儿茶酸生产宿主非常优异。
[实施例2]
谷氨酸棒状杆菌转化体的小型发酵罐控制下的需氧静止菌体反应引起的原儿茶 酸生产试验
对作为以源自谷氨酸棒状杆菌R株的混合糖利用株为基础构建的原儿茶酸生产株的PCA1、PCA2、PCA3、PCA4、PCA5的各菌株(实施例1(表6))，按照以下叙述的方法确认小型发酵罐(エイブル株式会社制、型号：BMJ1L)控制下的需氧的静止菌体反应中的原儿茶酸生产能力。
PCA1株植菌于添加有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、莽草酸3.2mM、及葡萄糖4％(各终浓度)的10ml的所述A液体培养基(试管内)之后，另外，PCA2、PCA3、PCA4、及PCA5株植菌于添加有葡萄糖4％的10ml的所述A液体培养基(试管内)之后，在33℃下需氧地进行振荡培养12-16小时。
在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌PCA1株以成为初期OD＝0.05的方式植菌于添加有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、莽草酸3.2mM、及葡萄糖4％(各终浓度)的100ml的所述A液体培养基(500ml容量烧杯内)，另外，在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌PCA2、PCA3、PCA4、及PCA5株以成为初期OD＝0.05的方式植菌于含有4％葡萄糖的100ml的所述A液体培养基(500ml容量烧杯内)，在33℃下需氧地进行振荡培养16小时。
关于在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌PCA1株，以OD610成为0.3的方式植菌于添加有葡萄糖80g/l、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各100μg/ml、对氨基苯甲酸50μg/ml、莽草酸16mM、及消泡剂(ディスホームCB-442)3g/l(各终浓度)的600ml的所述A(-UB)液体培养基，另外，关于在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌PCA2、PCA3、PCA4、及PCA5株，以OD610成为0.3的方式植菌于添加有葡萄糖100g/l、及消泡剂(ディスホームCB-442)3g/l(各终浓度)的600ml的所述A(-UB)液体培养基，各自利用1000ml容量小型发酵罐(エイブル株式会社制、型号：BMJ1L)在33℃、pH7.0(通过5N氨水的添加而控制为一定)、通气量0.6L/min(air、1vvm)、溶存氧浓度(DO)10％(将33℃时的大气压下饱和溶存氧浓度设为100％)的条件下进行19-20小时通气搅拌培养。
将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌菌株通过离心分离(4℃，5000×g，10分钟)进行集菌，将菌体在BT(-UB)液体培养基[将(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、0.06％(w/v)(Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O)1ml、100μg/ml硫胺素溶液2ml溶解于蒸馏水1L]中清洗1次之后，相对于含有10％葡萄糖的所述BT(-UB)液体培养基，以成为25g湿菌体/250ml(作为湿菌体重量为10％的菌体存在于培养基中)的方式悬浮，使用所述1000ml容量小型发酵罐，在33℃、pH7.0(通过5N氨水的添加而控制)、通气量0.25L/min(air、1vvm)、溶存氧浓度(DO)5％(将33℃时的大气压下饱和溶存氧浓度设为100％)的条件下进行原儿茶酸生成反应。予以说明，使用葡萄糖传感器(王子计测机器、BF-5i)经时地测定反应液中的葡萄糖浓度，根据需要进行葡萄糖的追添加。菌体反应上清液中的芳香族代谢物质浓度利用高效液相色谱(Prominence HPLC装置(岛津制作所制)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、流动相使用[20％甲醇、0.07％过氯酸]分离)进行分析。
将使用有各菌株的需氧静止菌体反应引起的原儿茶酸生产实验的结果示于表8。
[表8]
小型发酵罐控制下的需氧静止菌体反应引起的原儿茶酸生产实验(反应24小时)
Figure GDA0001901621840000561
*1PCA：原儿茶酸，SA：莽草酸，DHS：3-脱氢莽草酸，Cho：分支酸
4HBA：4-羟基苯甲酸，Phe：苯丙氨酸 ND：未检出
*2PCA，SA，DHS，Cho，4HBA，和Phe的总生成量相对于消耗的葡萄糖的摩尔收率
就反应24小时后的各菌株的PCA生成量而言，PCA1株为273mM(42.1g/l)，PCA2株为153mM(23.6g/l)，PCA3株为515mM(79.4g/l)，PCA4株为536mM(82.5g/l)，PCA5株为408mM(62.8g/l)。另外，就各菌株中的PCA生产量的对糖摩尔收率而言，PCA1株为33.8％，PCA2株为10.0％，PCA3株为34.6％，PCA4株为39.3％，PCA5株为30.2％。
由以上的结果显示：将(a)利用3-脱氢莽草酸脱水酶进行催化的3-脱氢莽草酸向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成、和(b)利用分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶进行催化的分支酸(莽草酸途径的最终代谢产物)向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成这两者进行了强化的PCA3、PCA4、及PCA5株，在使用无机盐最少培养基的静止菌体反应工艺中，具有高的原儿茶酸生产能力。其中，导入了谷氨酸棒状杆菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因的PCA3株、及导入了耐盐棒杆菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因的PCA4株显示特别高的PCA生产率。另外显示：这些PCA3、PCA4、及PCA5株即使在营养培养基中的菌体培养时，即使添加含有芳香族氨基酸的辅助营养源，也旺盛地进行增殖。
另外，仅依赖于(a)利用3-脱氢莽草酸脱水酶进行催化的、3-脱氢莽草酸向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成的PCA1株也显示比较高的原儿茶酸生产能力，但与由(a)和(b)的两途径生成PCA的PCA3、PCA4、或PCA5株相比，其生产率差。另外，PCA1株因为芳香族氨基酸生物合成途径通过莽草酸脱氢酶基因(aroE)的破坏而被切断，因此，显示芳香族氨基酸及4-氨基苯甲酸的要求性，在营养培养基中使本菌株增殖的情况下，有必要在培养基中添加这些营养源。
另一方面显示：仅依赖于(b)利用分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶进行催化的、分支酸向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成而生成原儿茶酸的PCA2株的PCA生产率与上述的其它菌株相比大幅度低。
由以上的结果显示：将(a)利用3-脱氢莽草酸脱水酶进行催化的、3-脱氢莽草酸向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成、及(b)利用分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶进行催化的、分支酸向原儿茶酸的转换引起的原儿茶酸生成这两者同时进行强化与仅将它们的任一个途径进行了强化的情况相比，原儿茶酸生产能力显著地增大。
[实施例3]
原儿茶酸生产株中的3-脱氢莽草酸脱水酶、分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸 羟化酶的各酶活性的测定
对PCA1株、PCA2株、PCA3株、及作为这些菌株的亲株的CRZ22株(表6)，按照下述的方法测定3-脱氢莽草酸脱水酶、分支酸丙酮酸裂解酶及4-羟基苯甲酸羟化酶的各种酶活性。
用与实施例1同样的步骤进行使用有CRZ22株、PCA1株、PCA2株、及PCA3株的小型发酵罐的需氧的静止菌体反应，采取反应6小时后的各菌株培养液，通过离心分离回收菌体。将菌体用20mM Tris-HCl(pH7.5)清洗1次之后，悬浮于1ml的菌体破碎用缓冲剂(100mMTris-HCl(pH7.5)，20mM KCl，20mM MgCl2，0.1mM EDTA，和2mM DTT))，使用多珠烧杯(安井器械)及玻璃珠进行破碎。将菌体破碎液在15000rpm、10min、4℃的条件下进行离心分离，得到上清液组分作为粗酶提取液。就各粗酶提取液的蛋白质浓度而言，使用蛋白检测试剂盒(Bio-Rad，USA)，以BSA(Bovine serum albumin)为标准进行定量。各菌株的粗酶提取液中的各酶活性的测定按照上述的活性测定方法进行。
将结果示于表9。
[表9]
原儿茶酸生成反应时的各菌株细胞提取液中的各种酶活件
Figure GDA0001901621840000581
*1QsuB：3-脱氢莽草酸脱水酶，UbiC：分支酸内酮酸裂解酶，
PobA：4-羟基苯甲酸羟化酶，ND：未检出
-：未检测
就亲株的CRZ22株而言，进行了试验的3种酶活性均未检测出显著的活性。由此暗示：这些酶在该株中表达弱，或几乎不表达。
另一方面，在PCA1株中，伴随3-脱氢莽草酸脱水酶基因(qsuB)的导入，检测出3-脱氢莽草酸脱水酶(QsuB)活性。就PCA1株而言，编码莽草酸脱氢酶的aroE基因被破坏，因此，在该酶反应阶段莽草酸途径被切断。因此，PCA1株中的PCA生成仅依赖于(a)3-脱氢莽草酸脱水酶而发生。
在PCA2株中，与分支酸丙酮酸裂解酶(UbiC)及4-羟基苯甲酸羟化酶(PobA)基因的导入相对应而检测出这些酶活性，与此相对，未检测出3-脱氢莽草酸脱水酶(QsuB)活性。由此，在PCA2株中，不产生依赖(a)3-脱氢莽草酸脱水酶的原儿茶酸生成，支持通过经由(b)分支酸丙酮酸裂解酶(UbiC)及4-羟基苯甲酸羟化酶(PobA)的途径而生成原儿茶酸。
另外，在PCA3株中，检测出上述3种全部的酶活性，因此，在本菌株中，支持经由(a)和(b)的两者的途径而产生PCA生成。
以上的结果显示：在构建的各PCA生产菌株中，导入的酶基因功能性地表达。除该结果之外，实施例2的结果(表8)也暗示在各菌株中特定的PCA生成途径起作用。即，在破坏了莽草酸脱氢酶(aroE)基因的PCA1株的反应上清液中完全没有检测出分支酸或4-HBA，由此暗示：在本菌株中，利用(b)的PCA生成途径(分支酸丙酮酸裂解酶(UbiC)活性、及4-羟基苯甲酸羟化酶(PobA)活性进行催化的、从分支酸生成原儿茶酸的途径)不起作用。另一方面，在导入了直至分支酸生成的莽草酸途径上的全部酶基因的PCA2株及PCA3株的反应上清液中检测出分支酸或4-HBA的蓄积，由此暗示：在这些PCA生产菌株中，来自分支酸的(b)的PCA生成途径起作用。
[实施例4]
编码有能力的莽草酸脱水酶的不同种基因的探索
由实施例2及实施例3的结果显示：棒状型细菌转化体引起的原儿茶酸的生产率通过3-脱氢莽草酸脱水酶基因导入引起的该酶活性的强化而显著提高。另一方面，在棒状型细菌转化体PCA1株及PCA3株中，导入源自谷氨酸棒状杆菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因，但也考虑更有能力的3-脱氢莽草酸脱水酶存在于其它微生物的可能性。因此，进行了有能力的不同种3-脱氢莽草酸脱水酶基因的探索。
作为3-脱氢莽草酸脱水酶基因探索用的宿主，染色体上的3-脱氢莽草酸脱水酶基因(qsuB)、及莽草酸脱氢酶基因(aroE)被破坏，另外，使用导入了莽草酸途径基因aroGS180F、aroB、及aroD的、作为3-脱氢莽草酸生产菌株的DHS1株(表6)。相对于本菌株，使用多拷贝型表达载体(pCRB209、pCRB207、或pCRB210)构建导入了源自各种微生物的3-脱氢莽草酸脱水酶基因的各转化株(表7)，对这些菌株进行试管培养，研究了原儿茶酸生产能力。
各转化体的原儿茶酸生产能力如下地进行测定。首先，植菌于含有葡萄糖4％、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、莽草酸3.2mM、及卡纳霉素50μg/ml(各终浓度)的10ml的所述A液体培养基(试管内)之后，在33℃下需氧地进行振荡培养16-18小时。
将在上述条件下增殖的菌体以OD610成为0.2的方式植菌于含有葡萄糖4％、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、对氨基苯甲酸10μg/ml、莽草酸3.2mM、及卡纳霉素50μg/ml(各终浓度)的10ml的所述A液体培养基(试管内)，在33℃下需氧地进行振荡培养24小时。将培养24小时后的培养液进行离心分离(4℃,15,000×g、5分钟)，对得到的上清液进行HPLC分析，进行芳香族关联化合物的定量分析。将其结果示于表10。其结果显示：导入了源自耐盐棒杆菌的3-脱氢莽草酸脱水酶基因的PRO34株与导入了谷氨酸棒状杆菌的同基因的株PRO17株相比，生产高浓度的原儿茶酸。
[表10]
导入了来自各种微生物的3-脱氢莽草酸脱水酶基因的谷氨酸棒杆菌转化体在试管培养24小时后的原儿茶酸产量
Figure GDA0001901621840000611
*1DHS：3-脱氢莽草酸，*2ND：未检出
工业上的可利用性
根据本发明方法，可以使用微生物以实用的效率由葡萄糖等制造原儿茶酸或其盐。
序列表
<110> 公益财团法人地球环境产业技术研究机构
住友电木株式会社
<120> 转化体及使用其的原儿茶酸或其盐的制造方法
<130> FP181651JP
<150> JP2016-064516
<151> 2016-03-28
<160> 162
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3341
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 1
atgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60
gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120
tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180
cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240
ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300
cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360
gagtaccgcc acaccaaggg cgttgagatc accactggcc ctcttggcca gggtcttgca 420
tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480
gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540
caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacatc 600
atcgtgttct gggatgacaa ccgcatctcc atcgaagaca acactgagat cgctttcaac 660
gaggacgttg ttgctcgtta caaggcttac ggctggcaga ccattgaggt tgaggctggc 720
gaggacgttg cagcaatcga agctgcagtg gctgaggcta agaaggacac caagcgacct 780
accttcatcc gcgttcgcac catcatcggc ttcccagctc caaccatgat gaacaccggt 840
gctgtgcacg gtgctgctct tggcgcagct gaggttgcag caaccaagac tgagcttgga 900
ttcgatcctg aggctcactt cgcgatcgac gacgaggtca tcgctcacac ccgctccctc 960
gcagagcgcg ctgcagagaa gaaggctgca tggcaggtca agttcgatga gtgggcagct 1020
gccaaccctg agaacaaggc tctgttcgat cgcctgaact cccgtgagct tccagcgggc 1080
tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggcg 1140
tccgaggctg cacttcaggc actgggcaag acccttcctg agctgtgggg cggttccgct 1200
gacctcgcag gttccaacaa caccgtgatc aagggctccc cttccttcgg ccctgagtcc 1260
atctccaccg agacctggtc tgctgagcct tacggccgta acctgcactt cggtatccgt 1320
gagcacgcta tgggatccat cctcaacggc atttccctcc acggtggcac ccgcccatac 1380
ggcggaacct tcctcatctt ctccgactac atgcgtcctg cagttcgtct tgcagctctc 1440
atggagaccg acgcttacta cgtctggacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc 1500
ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560
ctgcgtcctg cagatgcgaa tgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaat 1620
gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680
gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740
accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800
aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860
ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920
gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980
gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040
ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaattgccc 2100
tgctgttttt agcttcaacc cggggcaata tgatcctccg gaattttatt gccccgggtt 2160
gttgttaatc ggtataaagg gtcttaagca catcccttac ttgcctgctc tccttgagcg 2220
cagttcaaga acaattcttt taaggaaaat ttagtttcat gtctcacatt gatgatctgg 2280
cacagctcgg cacttccact tggctcgacg acctctcccg cgagcgcatt acttccggca 2340
atctcagcca ggttattgag gaaaagtctg tagtcggtgt caccaccaac ccagctattt 2400
tcgcagcagc aatgtccaag ggcgattcct acgacgctca gatcgcagag ctcaaggccg 2460
ctggcgcatc tgttgaccag gctgtttacg ccatgagcat cgacgacgtt cgcaatgctt 2520
gtgatctgtt taccggcatc ttcgagtcct ccaacggcta cgacggccgc gtgtccatcg 2580
aggttgaccc acgtatctct gcggaccgcg acgcaaccct ggctcaggcc aaggagctgt 2640
gggcaaaggt tgatcgtcca aacgtcatga tcaagatccc tgctacccca ggttctttgc 2700
cagcaatcac cgacgctttg gctgagggca tcagtgttaa cgtcaccttg atcttctccg 2760
ttgctcgcta ccgcgaagtc atcgctgcgt tcatcgaggg catcaagcag gcagctgcaa 2820
acggccacga cgtatccaag atccactctg tggcttcctt cttcgtctcc cgcgtcgacg 2880
ttgagatcga caagcgcctc gaggcaatcg gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca 2940
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ccgagctgcc tgaaggcgcc aacactcagc gcccactgtg ggcatccacc ggcgtgaaga 3060
accctgcgta cgctgcaact ctttacgttt ccgagctggc tggtccaaac accgtcaaca 3120
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ggagcgaact gcttgagtcc atggaagctc gcctgaagta g 3341
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
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gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
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gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
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gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggcttttt 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
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ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 3
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acggttgaac acatgccagc aggcgtgccc gtgactaaag atgaggtctc gtatcaattg 120
gcgcgccgac gccttggata tggtcgcggc gctcgcatga agtttgagca agacgcgttg 180
accttcctga ccggcatccg ccacggcctc actttgggta gccccatctc aatcatgatc 240
ggcaacactg agtgggataa gtggaccacc atcatgtcct ctgacgcttt ggacatggaa 300
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tccttcctcc gtgaaacctt gggcgtggag gtgctctctc acgtaatttc cattggtgcg 540
tccgagcctt acgtcggcgc ggagccaacc tttgcagata ttcaagcaat cgatgattcc 600
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aagaaagccg gcgataccct cggtggcatc gtggaagtga ttgttgaagg cctacccatc 720
ggtttgggct cacacatttc tggcgaagat cgcctcgatg cgcagatcgc agctgcactc 780
atgggcattc aggccatcaa gggcgtggaa atcggtgacg gtttcgaaga agctcgtcga 840
cgtggctccg aagcccacga tgaagtgttc ctggatgaca acggcgtata ccgcaacacc 900
aaccgtgcag gtggcctcga aggcggcatg accaacggtg aaaccctgcg cgttcgtgct 960
ggcatgaagc caatttctac tgtgcctcgc gccctgaaaa ccattgatat ggaaaacggc 1020
aaggcagcaa ccggaatcca ccagcgttcc gacgtgtgcg ctgttccagc cgccggtgtc 1080
gttgcagaag caatggtcac cctggttctc gcccgcgcag tcctgcagaa attcggcggt 1140
gactccctga gtgaaaccaa gagcaacatt gacacctacc tcaaaaacat tgaggaacga 1200
atgaaattcg aaggtttaga ggatggagcg taatgaagtg aatgatcaaa ttcacttaga 1260
tcatcaatca gatgacacct ctgaatgctc ctgcccgatc gtggttcttg tgggtttgcc 1320
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cgactccgac gaactcattg agcgcgccac cggaaaagcc tgcggcgccg tgttcagcga 1440
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ctccggagtg gtgagcttgg gaggcggatc tgtgctgaca gaatccaccc gtgaactgct 1560
caaaggccac gacgtggtct ggatcgacgt gccagtagaa gaaggcatca ggcgcaccgc 1620
aaacgagcgt tcccgccccg tgctgcaagc cgccgacccc gccgagcact accgcaacct 1680
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gcggagcagg tagcgatttt gcaccagccc agcatggatg acattgcatc cgagttggat 2040
gcagcactag tcgctgctgg tttgaaggtc ctgcacctta atgttcccga tgcggaaaac 2100
ggcaagtcct tggaagtagc ggggcagtgc tgggatgaat tgggtggcgc agcattcggc 2160
cgccgcgata tcgtcatcgg acttggtggc ggtgctgcca cagatctcgc gggattcgtc 2220
gctgctgcgt ggatgcgtgg cgtgcgcgtc attcaggttc caaccacctt gttggccatg 2280
gtggacgctg cggtgggcgg caagactggc atcaataccg ccgcaggcaa gaaccttgtg 2340
ggcgcgttcc acgagcctga cgcagtattc attgacaccg aacgcctagc caccctgcct 2400
gacgcggaaa tcatcgcggg atccgccgaa atcatcaaaa ctggtttcat cgccgaccca 2460
gaaatcctgc gcctttacga aactgatccc gcagcctgcc tgaagaaaga agtcgaaggc 2520
tcccacctac ctgaactgat ttggcgctcc gtcaccgtca agggctccgt ggtcggccaa 2580
gacctcaaag aatctagcct gcgcgaaatc ctcaactacg gacacacctt tgcccacgcc 2640
gtcgaactcc gcgaaaactt ccgctggcgc cacggcaatg ccgttgcagt gggcatgatg 2700
ttcatcgcta acctctccca caagctcggg cttatcgacg cgcccctcct cgagcgccac 2760
cgctcaatcc tggcggccat cggtctgccc acttcctacg aaggcggagc cttcgacgag 2820
ctttacgacg gcatgacccg cgacaagaaa aaccgcgacg gcaacatccg cttcgtcgca 2880
ctgaccgccg tgggcgaggt tacccgcatt gaggggccct caaaacaaga tttacagagt 2940
gcttatgagg caatcagcca ctaa 2964
<210> 4
<211> 1293
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 4
atggtctttg tgtctgattc gtctatctct ttgcccattt gggatgctcc gcgcgctcgc 60
ggccccatag tctcggacct ggctatccct ggttccaagt cgatcaccaa ccgcgccctc 120
atcttggctg cgctcgcatc aactccatcc accatcattg atgtccttcg tagtcgtgat 180
accgatctca tgactgatgg tctacgcagc ctcggaatca ccattactga agaggcagtc 240
gatcgctacc gcgttgagcc cggacagttg tctgctggct ccgttgagtg tggtcttgct 300
ggtacggtca tgcgcttttt gcctcctgtt gctgctttcg ctgatggtcc tgttcatttt 360
gatggcgatc ctcaagctcg tgttcgtccg atgaccagca ttttggatgc gctgcgttcg 420
cttggtgtgg aggtggacaa caacaatctg cctttcactg ttaatgctgg tgaggtccct 480
gagggtggcg tggttgagat tgatgcttcc ggctcatctc agtttgtttc tggtcttttg 540
ctttcagcgc ctcgttttaa aaatggcgtc accgttaagc acgtcggtgg tcgtctgccg 600
agcatgccgc atattgagat gaccgtcgat atgcttcgtt ccgcaggcat tgagatcgaa 660
gagtcagaaa atcagtgggt tgttcatcct ggtgagatct tgggtcggac ctggcgcatt 720
gagccggatc tttctaatgc gactccgttc ctagctgccg ctgcggtcac tggtggaacc 780
atcaagatta atcactggcc aatcaaaact actcagcctg gcgatgctat tcgttcgatt 840
cttgagcgca tgggctgcga agttgagctg gttgctcagg gtgaaggtta cgatctgtcg 900
gtgactggtc cggttgctct caagggcatt gagatcgata tgtccgatat cggtgagttg 960
acccctaccg tggcggcgtt ggctgcgttg gcgtcgacag agtctcgttt gaccggtatt 1020
gctcatcttc gtggccatga gacggatcgt ttggctgcgt tgactgcgga gatcaacaaa 1080
cttggtggaa agtgcactga gcttaaggat ggtctgttga ttgagcctgc gtcgctgcac 1140
ggtggtgtgt ggcattcata tgctgatcat cgtatggcta ctgctggtgc gatcattggc 1200
ctcgcggttg atgacgttca ggttgaagac attaagacca cttccaagac tttccctggt 1260
tttgaaaatg tttgggagga gatggttggc tag 1293
<210> 5
<211> 438
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 5
atgcttggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60
cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120
gcgaagcacg gccttgaggt tgaggcgctg cagagcaatc acgaaggtga gctaatcgat 180
gcgctgcaca acgctcgcgg cacccacatc ggttgcgtga ttaaccccgg cggcctgact 240
cacacttcgg tggcgctttt ggatgcggtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300
cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360
gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420
gcaaatctca aaaagtag 438
<210> 6
<211> 831
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 6
atgggttctc acatcactca ccgggcggcc gtactcggct cacccatcga gcattccaaa 60
tccccagtcc tccacaacac cggctataaa gccctcggac tggaccaatg ggaatacgac 120
cgctttgagt gcaccggcga catgctcccc ggaatcgtct ccggcgctga tgaaacctac 180
cgcggattct ccgtcactat gccgtccaaa ttcgcagccc tcgaattcgc cgacgaagta 240
accgaacgcg cccgcgccat cggctccgca aacacacttc tgcgcaccga aaccggatgg 300
cgcgcagaca acaccgacgt cgacggcatc aggggagccc tcggtgaact cctcggcagc 360
gcatcactgg ccggcaaaca cgccatcgtc atcggctccg gcggcaccgc acgccccgcc 420
atctgggcac tcatcgaagc cggggtcgcg cggatcacgg tgctcaaccg ctccgatcga 480
accgccgaac tgcaaacgct tttcgacgaa acccccacca ccttggccta cgccccgctc 540
gaacatctcg acatcgaagc cgacgtcgta gtctctacag tgccctccgc agcaatcgca 600
ggcctcgaag acacactcgc aatcgcccca gtcctcgacg tcatctacga tccttggcca 660
acaccactcg tagaagtcgc acgagccaaa ggtctcaaag ctgtcggagg ccacgtcatg 720
ctggcacacc agtcctacgg acagtttgaa caattcaccg gaatggatgc accccgcgat 780
gctatgcgtg aggctttgga agaatcccta ggcatctcgg aagaacacta g 831
<210> 7
<211> 1857
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 7
atgcgtacat ccattgccac tgtttgtttg tccggaactc ttgctgaaaa gctgcgcgca 60
gctgcagatg ctggatttga tggtgtggaa atcttcgagc aggacttggt ggtttccccg 120
cattcggcag agcagattcg tcagcgggct caggatttgg gattaaccct ggatctgttc 180
cagccgtttc gagatttcga aggtgtggaa gaagagcagt ttctgaagaa tctgcaccgc 240
ttggaagaga agttcaagct gatgaacagg cttggcattg agatgatctt gttgtgttcc 300
aatgtgggca ccgcgaccat caatgatgat gaccttttcg tggagcagtt gcatcgtgca 360
gcagatttgg ctgagaagta caacgtcaag attgcttatg aagcgttggc gtggggcaag 420
tttgtcaatg attttgagca tgcgcatgca cttgtggaga aggtgaatca caaggcgctg 480
ggaacctgct tggatacgtt ccatattctt tcccgtggtt gggaaaccga cgaggtggaa 540
aacatcccgg cggagaagat cttctttgtt cagttggcgg atgcaccgaa gctgagcatg 600
gacattttgt cctggtcgcg tcaccaccgt gttttccctg gtgaaggcga tttcgatctg 660
gtgaaattca tggttcatct ggccaagacg ggttatgatg gcccgatttc tttggagatc 720
ttcaacgatt ccttccgcaa ggccgaggtt ggtcgcaccg cgattgatgg gttgcgttct 780
ttgcgttggt tggaagatca gacctggcat gcgctaaatg ctgaggatcg tccaagcgca 840
ctagagctgc gtgcacttcc tgaggtcgcg gaacctgaag gcgttgattt cattgagatc 900
gccactggac gtttgggtga gaccattcgg gttcttcatc aattgggttt ccgcttgggt 960
ggtcatcact gcagtaagca ggattaccag gtatggaccc agggcgatgt gcgcattgtg 1020
gtgtgtgatc gtggggccac cggggctcca accacgatct ctgcgatggg ctttgacacc 1080
cctgatccag aagccgcgca tgcccgtgcg gaattgctgc gggctcagac aattgatcgt 1140
ccccacatcg agggtgaagt tgaccttaaa ggtgtgtacg cgccggatgg ggtggagctg 1200
tttttcgcgg ggccgagccc cgatggaatg cccgagtggc tgccggaatt cggcgtcgaa 1260
aagcaagaag ctggtctcat tgaagccatc gaccacgtca atttcgccca gccatggcaa 1320
cattttgatg aggcagtgct gttttacacc gcgctgatgg cgttagagac tgtgcgtgag 1380
gatgagttcc cgagcccaat tggtttggtg cgcaatcagg tgatgcgttc gccgaatgat 1440
gcggtgcggt tgctgctcag cgtggcgccg gaggacggtg agcagggaga tttcctcaac 1500
gcggcctacc cggagcacat tgcgttggcc acggcggaca tcgtggcggt ggctgaacgt 1560
gcgcgcaaac gaggcctgga tttcttgccc gtcccagaga attactacga cgatgtgcag 1620
gcgcgttttg atttgccgca ggaattcttg gacacactca aggaaaacca cctgctttac 1680
gactgcgacg agaacggcga attcctccac ttttacaccc gcacgttggg cacgctgttc 1740
ttcgaagtgg tggaacgccg cggcggtttt gcaggttggg gcgaaacaaa cgctccggtg 1800
cggttagcgg cgcagtatcg tgaggtgcgg gacctcgagc ggggaatccc caactag 1857
<210> 8
<211> 1188
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 8
atgaaccacg taccagtggc aattattggc gcaggaccag caggactgac cctcgcccac 60
ctcctccacc ttcaaggtgt ggaatcaatc gtctttgaat cccgcacccg caaggacgtc 120
gaagaaaccg tccgagcagg cattctggaa caaggcaccc tgaatctgat gcgcgaaacc 180
ggagtcggcg cacgcatgga agcagaagcc gatcacgatg aagcaatcga catctccatc 240
aacaatgagc gcacccgcat tccgctgacc gaactcaccg gccacaaggt tgcgatctac 300
ccgcagcacg aatacctcaa agatttcatt gccaagcgca tcgaagacgg cggcgaactc 360
cttttcacca ccactgttga ttccgtagag aactacgaag gcgacctcgc caaggtgacc 420
tacaccgaag ccgatggttc ctccaccacc atcaccgccg actacgtcat cgcagctgac 480
ggctccaact ccccttaccg caagttgatc accgaagacg gcggcgtgcg cgcccgccat 540
gaataccctt acgcatggtt cggcattttg gtcgaagcac caaaaaccca aaaggaactc 600
atctacgcaa cccaccctga gggctttgcg ctgatctcca cccgcaccga tgaaatccag 660
cgctactacc tgcagtgcaa cccagacgac accccagaca tgtggtccga tgaccgcatt 720
tgggaacagc tgcatctgcg tgcggactcc cctggcatca ccgtgtctga agggcgcatc 780
tttgacaagg ccgtgctgcg tttccgctcc gcggtcaccg aaccaatgca aaagggacgc 840
ctcttccttg ctggcgatgc tgcacacacc gtgccgccaa ccggagctaa gggcctcaac 900
ttggctgttg ccgatgtcgc agtactcgcg ccagcactgg ttcgtgccct gaagaagaag 960
gacaccggct tgctcgatag ctacacctcc ctggcagtcc cccgcatctg gaaagcacag 1020
cacttctcct actggatgag ctccatgctc cacgcagtac ccggcgaaga tcactttgcc 1080
acccagcgcc gattcgctga attgcgctcc gtcctagaat cccaatccgg ccaacgctac 1140
ctcgcagagc agtacgttgg gcgcgaccta ccacgcttcg aggtataa 1188
<210> 9
<211> 504
<212> DNA
<213> 拉氏普罗威登斯菌（Providencia rustigianii）
<400> 9
atgcatgaaa caatttttac ccatcatccc attgattggc taaacgagga tgatgagtca 60
gttcctaaca gtgtactaga ttggctgcaa gagcgtggtt caatgactaa acggttcgag 120
cagcattgcc aaaaagtcac ggtaattccc tatttagagc gctatatcac tccagagatg 180
ctgagcgctg atgaagccga gcgtttaccc gaaagtcaac gttactggtt gcgagaagtc 240
attatgtatg gggataatat tccgtggttg ataggcagaa cattgatccc tgaagagacc 300
ctcaccaacg atgataaaaa gctggtggac attggtcgtg tgccattagg gcgttacctt 360
tttagtcatg atagtcttac ccgagattat attgatattg gcaccagtgc ggatcgttgg 420
gtgcgacgtt ctctgctgag attatctcaa aagcccttat tattaactga aatattttta 480
cctgaatcac ctgcatatag ataa 504
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 10
ctctcatatg acgctgtcac ctgaac 26
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 11
ctctcatatg ctacttcagg cgagcttc 28
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 12
ctctgatatc atgaattatc agaacgacga tttacgc 37
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 13
ctctgatatc gacttatcag gcctgtggtg 30
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 14
tttgtccggt cggcttcaaa aatg 24
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 15
aaagccctga tgccagttc 19
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 16
ctctcatatg ttacgctcca tcctctaaac c 31
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 17
ctctcatatg ttagtggctg attgcctcat aag 33
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 18
ctctccatgg tctttgtgtc tgattcgtc 29
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 19
ctctccatgg ctagccaacc atctcctc 28
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 20
ctctcatatg cttggaaaaa ttctcctcct c 31
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 21
ctctcatatg ctactttttg agatttgcca ggatatc 37
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 22
ctctcatatg ggttctcaca tcactcac 28
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 23
ctctcatatg ctagtgttct tccgagatgc 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 24
ctttgaccat atgcgtacat ccattgccac 30
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 25
ctagttccat atgctagttg gggattcccc gctc 34
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 26
ctctcatatg aaccacgtac cagtgg 26
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 27
ctctcatatg ttatacctcg aagcgtggta g 31
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 28
ctctcatatg catgaaacaa tttttaccca tcatcc 36
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 29
ctctcatatg gattatgtta gatagttatc tatatgcagg tg 42
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 30
ctctgtcgac cttattcgtc gtagtgccag 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 31
ctctgtcgac atcatcgcgg tgtcacagtt 30
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 32
ctctagatct catgggcaac tcctcg 26
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 33
ctctagatct atgcttgtca catgaggcg 29
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 34
ctctcctgca ggctgaccag gatttatctg tcc 33
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 35
ctctcctgca gggatcgtca ccttccaaac c 31
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 36
ctctagatct tctaggccag gaactaacg 29
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 37
ctctagatct gaagggtgct tcgcttc 27
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 38
ctctcctgca gggtggatac aaatgggatg tctg 34
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 39
ctctcctgca gggatgaagt tgctgaagca gg 32
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 40
ctctgtcgac cagatggcag ttgaggtg 28
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 41
ctctgtcgac cgatcagtgg agatcaacac 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 42
ctctgtcgac attcctgcgt ctggtggtct 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 43
ctctgtcgac ccgaccaatg atgtaactgc 30
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 44
ctctgtcgac ctgtggtgac tttattgtct agg 33
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 45
ctctgtcgac gccagcttct gtaagtaact c 31
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 46
ctctagatct gtgctgatct taatattgaa tcgttttatt c 41
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 47
ctctagatct gactactgtg agtggcttga 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 48
ctctgcatgc tcaacgagct gatggagctt 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 49
ctctgcatgc cgtggtgtat ctgtaactgc 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 50
ctcttctaga agacatcgga gcaatcggct 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 51
ctcttctaga gtccgcagag gaaccattca 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 52
ctctgagctc gtgaacatat cggcatcgag 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 53
ctctgtcgac ctatggcgtt ctatactgcg 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 54
ctcttctaga tatgcaagaa gcaagcaagt 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 55
ctctctcgag tctcataaaa gttctccgat 30
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 56
atgcatgcac gtactccgaa gatgtatg 28
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 57
atgcatgctt acatgcctat gcattcgg 28
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 58
ctcttctaga gatcggtaga acagcgtaac 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 59
ctctgagctc gccaagtcat gaaggttgtc 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 60
ctctagtact caacaggagt tggagatgtc 30
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 61
ctctagtact gatgatcctg atgccactat c 31
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 62
ctctcctgca ggtccagtgt ggatcgcaac 30
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 63
ctctcctgca gggaggatat ggtgactagc ttg 33
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 64
ctctgatatc cttcctaaac gatgagcgag 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 65
ctctgatatc ttggtcagtt cagtctggag 30
<210> 66
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 66
ctctcctgca ggtaatggtg tcgaccgaca tc 32
<210> 67
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 67
ctctcctgca ggaagttaga tgtggctccg ac 32
<210> 68
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 68
ctctcctgca ggaattcgca ggatccaagc tc 32
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 69
ctctcctgca gggaagcagg ttcttagcga tg 32
<210> 70
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 70
ctctgtcgac gatagaagaa gtaggcacct c 31
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 71
ctctgtcgac caatctgtat ggttgcctcg 30
<210> 72
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 72
ctctcctgca ggctcgaatg tttacctgcc tg 32
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 73
ctctcctgca ggggatgtat tcgatctggg ac 32
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 74
ctctgtcgac ctcagattgg tttcgcagtc 30
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 75
ctgattgcgc accaaaccaa gaacgtatcc aagcaggttc 40
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 76
ttggtttggt gcgcaatcag 20
<210> 77
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 77
ctctgtcgac tcaacggtag gaagctcag 29
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 78
ctctgtcgac gttcttcgaa gtggtggaac 30
<210> 79
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 79
gtgaggcagc tgacatcaaa cgttgaagcc aaggtagag 39
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 80
tttgatgtca gctgcctcac 20
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 81
ctctgtcgac tgatcacctt aaagggcgac 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 82
ctcttctaga gaaacgatca agtgcaccag 30
<210> 83
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 83
gacacgagcg tttatacctc taattgccac tggtacgtgg 40
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 84
gaggtataaa cgctcgtgtc 20
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 85
ctctgagctc gagaacacga accatacgag 30
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 86
ctcttctaga tacgtcctaa acacccgac 29
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 87
gaccaaccat tgctgacttg cgtatccata gtcaggcttc 40
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 88
caagtcagca atggttggtc 20
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 89
ctcttctaga tgatcagtac caagggtgag 30
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 90
ctctcctgca gggtcattga cctggatacg atc 33
<210> 91
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 91
gaacacacca accttgaagt gcatgtcgtt gtcgatgtct c 41
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 92
cacttcaagg ttggtgtgtt c 21
<210> 93
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 93
ctctcctgca gggtcatatt tccgctggca c 31
<210> 94
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 94
ctctagtact atgcgttctt caattgcgac tg 32
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 95
ctctagtact tgaccaatga gaccaagcag 30
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 96
ctctctcata tgcgcacgtc gatcgccac 29
<210> 97
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 97
ctctctcata tgcgttgagc agcagaatcc tg 32
<210> 98
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 98
ctctctcata tgaccgctta tcaggaggca ac 32
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 99
ctctctcata tgatcaacgt cttaccgcat gg 32
<210> 100
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 100
ctctctcata tgacgaaact ccccttcc 28
<210> 101
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 101
ctctctcata tgcttcgtca tcacgcagga c 31
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 102
ctctctcata tgcgtctgat gcctgcgctg 30
<210> 103
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 103
ctctctcata tgggaagcct taccgccgaa cc 32
<210> 104
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 104
ctctctcata tgaaactctc ggtctgcac 29
<210> 105
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 105
ctctctcata tgggatcaaa tacatgaggg tcc 33
<210> 106
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 106
ctctcatatg aaattaactt ctttacgcgt atctttattg 40
<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 107
ctctcatatg ttatctcatt ttcactgcag aacttaac 38
<210> 108
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 108
ggaattccat atgaatcttt cagtatgcac tatcactttt ag 42
<210> 109
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 109
ggaattccat atgttaaatg gcttgagcgg tagtc 35
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 110
ggaattccat atgattcgct tccacctgtg 30
<210> 111
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 111
ggaattccat atggatgagg ttcactggca gac 33
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 112
ggaattccat atgagaatcg cgctctgcac 30
<210> 113
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 113
ggaattccat atggtcatgt cggtctcctg aag 33
<210> 114
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 114
ggaattccat atgccgtcaa agctagccat tag 33
<210> 115
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 115
ggaattccat atgttacaat gaagcagaga ctcgg 35
<210> 116
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 116
ggaattccat atgcccaacc gtctcggcat c 31
<210> 117
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 117
ggaattccat atgctacaac cgatgctgca caac 34
<210> 118
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 118
ggaattccat atgagtgccg agaggcgact g 31
<210> 119
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 119
ggaattccat atggtgctgc tgatcagcct gc 32
<210> 120
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 120
ggaattccat atgcgtacct cgatcgccac 30
<210> 121
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 121
ggaattccat atgcagaatc cgttctgcca tgg 33
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 122
ggaattccat atgggacgac aggttcgtac 30
<210> 123
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 123
ggaattccat atgcttcgaa tcgaccgctc ag 32
<210> 124
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 124
ggaattccat atgcctaacc gtctcggaat tg 32
<210> 125
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 125
ggaattccat atgctaaagg cgatgctgca cag 33
<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 126
ctcttcatga aatattcgct atgtaccatt tcatttcgtc atc 43
<210> 127
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 127
ctcttcatga ctctaaacga gactctcaca tcatttcac 39
<210> 128
<211> 507
<212> DNA
<213> 斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii）
<400> 128
atggatgaaa cgctttttat ctctcacccg ataacatggc tatcagaaga tgatgacctt 60
gttcctgaaa atgttttaga ttggctacat gaactagggt cgatgacaaa acgcttagag 120
cagcattgcc aacgtgtcac ggttgttcct tatacgcaac gttatgtgac tcaagaggca 180
ttgagcgaag aagaagcggc gtgtttacct gtcagtgaat attattggtt acgtgaagtc 240
attatgtatg gtgataatat tccatggtta cttggacgaa cgttaattcc acaggagaca 300
ttgactggtg aagaccggaa acttattgat atcggtgctg taccgttagg gcgttatctc 360
tttagccatg ataatctttc ccgtgattat attcatatag ggcagcaaaa tttgcgatgg 420
atccgccgct ctctattaag attatctgaa aaacctttat tattaaccga actgttttta 480
cctgaatcac ctgcatataa aagataa 507
<210> 129
<211> 510
<212> DNA
<213> 阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）
<400> 129
atgtcccatc ccgcgctgag acaactgcgc gcgttgtcct tttttgacga tatcagcacg 60
cttgatagtt cgctgctcga ctggctgatg ctggaagatt ccatgacccg ccgtttcgaa 120
ggcttttgcg agcgcgtgac ggtcgacatg ctgtttgagg gctttgtcgg ccccgaggcg 180
ctggaggaag agggcgagtt tttgcctgat gagccgcgct actggctgcg cgaaatcctg 240
ctgtgcggcg acggcgtgcc gtggctggtt gggcgcacgc tggtgccgga gtctacactt 300
tgtgggccgg agctggcgtt gcagcagctc ggtaccacgc cgctgggccg ttatctgttt 360
acctcatcca ccctcacgcg tgattttatc cagccgggcc gcagcgacga actctgggga 420
cgccgctctc tgctgaggct ttccggcaaa ccgctgctgc tgactgaact gtttttacct 480
gcatcaccct tgtacggaga ggaaaaataa 510
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 130
ctctgtcgac cagacaacca ggttgatctc 30
<210> 131
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 131
gatgcctagg gattcttcca tttggaatgc tcgatgggtg 40
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 132
tggaagaatc cctaggcatc 20
<210> 133
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 133
ctctgagctc gttactcgtt aaggaagcac tc 32
<210> 134
<211> 1863
<212> DNA
<213> 乳酪棒杆菌（Corynebacterium casei）
<400> 134
atgcgttctt caattgcgac tgtttgtcta tcgggcactc tcgcggaaaa gctgcgggct 60
gctgccgatg ccggctttga cggagtagaa atctttgaac aagacttgat tgtctcgccg 120
cattcaccag aacaaattcg tgaacgtgct gcggaattgg gtctcacact ggacttgttc 180
cagccgttcc gtgacttgct gagcgtggaa gaagatatct tccgggataa tctgcgccgt 240
ctggaatcca agttccagct catgcagcgt cttggcatgg accagatttt ggtgtgctct 300
aacgtggcta ctgccactgt ggatgatgat gaagtccgcg tggatcagct gcgccgcgcc 360
ggtgagttgg ctgcacgcta tggctgcttc atctcttatg aggcattggc ttggggcaag 420
tatgttaata cttatcagca tgcttatgac cttgtggtta aggctgatca tccgaatgtg 480
ggcacgtgtt tggattcttt ccatattctt tcccgcggtg atgatccatc ggggattgcg 540
gatatggatc cggataaaat tttcttcttg cagctcgcgg acgctccgac tatggagatg 600
ggaatcttac cgtggtcacg ccaccaccgc gtattcccgg gcgagggtga tttcgacctg 660
aagaacttca tggagcaggt agccaaatca ggttataacg gtccagtgtc gttggagatt 720
ttcaatgatg aattccgcga ggctgaggtc ggccggaccg cgatcgatgg tctacgctcg 780
ctgatttggt tggcggacaa aactgcaaca cgggtgccgg actcaccgtt ggaattaccg 840
aagctggctg atgctcagtc accacggggc tttgactttg tggaactacg cacggggcgc 900
ctgggcgaag tcaccaaggc actgcaccaa ctgggattcc gtttgggtgg ctaccaccag 960
tccaaaccag actttcaagc gtgggtgcag ggggatgttc gcatcatcgt ggaggatgaa 1020
ggttccaccg gtggcgcaac ggagctgaca ggcttgggtg tcatcgtgga tgatgccact 1080
gctgcggcag agcgtgccac cgcgttgaaa gcaacaccag ttccacgcat gaccggggaa 1140
gatgaagaag acctacatcc agtctttacc ccagatggat ctgaactgta cttttgtgga 1200
ccaggacaaa ctggccgggg aagcacatgg ataccggagt tcggttttga acccgatgaa 1260
accagtagct cggagacttc tgacgtattg attaattctg ttcaccacat tgctttggcg 1320
cagccacggc atatggctgc ggaaacccgt ttattttact cttcggttct gggattggaa 1380
ccagctgtgc cggagttcat tccgtcgcca gcaggtctgg tgcacaagca ggcgattgaa 1440
ggcgagaatg tttgcatcac agtgtcggcc gctccggaag gctctgaaca gggtggtttc 1500
tttgctgagc actacccgga acacatcgct tttggcagtg atgacgtctt tgcagttgca 1560
caacgcgcgg tgaggcgtgg attgaagatg ttgcccattc cagagaatta ctatgatgac 1620
ctggcagcac gcttcggact ggaaccggga ttcatcacga agattaaagc actcaatatt 1680
tgctatgacc gcagcagcaa tggcgaatat ctgcactttt acaccgcgcc tttgggcaat 1740
accttctttg aggtagctga ggttcgaggg gactaccgcg gtttcggctg ggcagatgaa 1800
ccgattcgct tggccgcgca ataccgcgcg ctgcgcgatg atgtccgcgg aatcccgcgc 1860
taa 1863
<210> 135
<211> 1869
<212> DNA
<213> Corynebacterium efficiens
<400> 135
atgcgcacgt cgatcgccac cgtctgttta tcaggaaccc tcgccgagaa actccgcgcc 60
gccgccgacg ccggctttga cggcgtggaa atcttcgaac aggacctcac cgtctccccc 120
cactccccgg agcagatccg gcagcgggcc gccgacctgg ggctgaccct ggatctcttc 180
cagcccttcc gggatttcga gggggtggag gaggaacagt tcgtgaagaa tctccgccgc 240
atggaggcga agttcgcact gatgaaccgg ttggggatcg acaccatcct gctgtgctcc 300
aatgtcgcca ccgcgaccat caacgatgat gaactcttcg ccagccagct gcgccgcgcc 360
ggggacctgg cacagcgcta ccaggtccgc atcgcttatg aggcgctggc gtgggggcgg 420
ttcgtcaacg atttcgagca tgcccagcgc atcgtcgaca tggccgacca cccccaggtg 480
ggcacctgcc tggatacctt ccacatcctc tcccgcgggt ggtccaccga cgcggtggag 540
cagatccccg gcgagaagat cttcttcgtc cagcttgccg atgcccccaa gctcagcatg 600
gacatcctgt cctggtcccg ccaccaccgg gtcttccccg gggagggcga tttcgacctg 660
gtgaaattca tgacccacct cgcccgcacc ggatacgacg gacccatctc cctggagatc 720
ttcaatgatt ccttccgcaa ggccgatgtg gcccgcacgg ccgtcgatgg tctgcggtcc 780
ctgcgctggt tggaggacca gacgtggcac gccctggccg aggacgaacg cgatgtgacc 840
ctgcagctgt ccccgctgcc ggaggtcgca gaacccgccg gtgtggattt cctcgagatc 900
tccaccggac ggctggggga gaccatccgg gtgctccacc agctgggttt ccagctcggt 960
ggccaccacc gcagcaaatc cgacttccag gtctggaccc aggggccggt ccgcatcgtc 1020
atcggtgacc gcgggcccac cggcgccgcc accaccatca ccgggctcgg tttcgccacc 1080
ccggatccgg cctccgcgca gcagcgcgcc catctcctcc aggcgggcac catcgcccgg 1140
acccgcgagg acgatgaggc agatctgcgg ggcgcctacg cccccgacgg caccgaggtg 1200
ttcttcggtg aggtcagccc ggacggattc cccacctggc tcgatgagtt cggtgtggag 1260
aagaccgacc aggtgtccga cagcctcatc accgggatcg accacatcaa cctcgctcag 1320
ccctggcagc acttcgacga gtccatcctc ttctacacct ccctcatggc gctggaggcc 1380
cgcgaccgcg atgagttccc cagccccatc ggtctgatca gcaaccaggt gatgagctca 1440
cccaatgacg ccgtgcgtct gctgctcagc atcgccccgg aggacgggga acagggtgat 1500
ttcctggacg ccgcctaccc cgagcacatc gcgctcacca ccaccgatat cgtcgcggtg 1560
gcccgccgtg cacgcaagcg tggcctggcg ttcctccccg tcccggagaa ctacttcgag 1620
gacctgcagg cacgtttcga tctcgacccg gagttcctgg atctgctacg cgagaacaac 1680
ctgctctatg accgtgatga ccacggtggg gaattcctcc acttctacac ccgcaccctg 1740
ggcaccatgt tcatcgaggt cgtggaacgc cgcggtggtt tcaccggctg gggtgagacc 1800
aacgcaccgg ttcggctcgc cgcccagtac cgcacgatcc gcgacgccga gcgcggggtc 1860
ccgcgctaa 1869
<210> 136
<211> 1917
<212> DNA
<213> 菠萝多源菌（Pantoea ananatis）
<400> 136
atgaccgctt atcaggaggc aacaatgaaa cgttctgtcg ctacggtctc ggtatcgggc 60
acgctgccgg aaaaactgcg agcaattgcc gccgcaggct tcgatggcgt tgaaattttc 120
gataacgatc tggtctatta tcccggctca cccgtggaaa tccgccagct gtgtgaagcc 180
ctcgggctgg aaatcttgct gtttcaacct tttcgcgact tcgaaggcgg tccccgtgac 240
aggctggcgc aaaacctggc gcgcgcggcg cgcaagtttg aggtcatgca acagctgggc 300
tgtcagcgga tgctggtctg cagcaatgtc tcacccgact gcagtgacga cttcgccaca 360
caggtcagcg atctcaccgc tctggcagag ctggcggctg agcacggtat tactctcggt 420
tatgaggcgc tggcctgggg acgacacgtc agcctgtggc gcgacgcctg ggcccgcgtc 480
aaggccgtca accatcccgc gctggggatc gtgctcgaca gttttcatat tctgtcgcgc 540
ggcgacagcc tggacgggct ggaagcagtc ccgacggaga aaattgtgtt cgtacagctg 600
gcggatgcac cgctgctaaa aatggatgtg ctgtcgtgga gtcgccactt ccgctgtttt 660
cccggccagg gcgaattcaa tctgactcag tttatgacgc aactgtcggc gcatggctac 720
cgggatgcct ggtcgctgga aattttcaac gatggattcc gcgcctcgcc ggtggtgcct 780
accgcgcagg atggttatcg atcgctgctg tggctggagg agcaaacccg tgactggctg 840
gtcggacagc cgctgctgcc gagcgcgctg gcctccctgg ccggggaagg gctgttccac 900
tctgcgcccc agccgccgct gttgtcgctg gagttcattg agtttgccgt cagccacaat 960
gacgctttgg cactcggaca gtggctgacg cagcttggcc tggttcatgc gggcgatcat 1020
cgctccaagc aggtgtcgct gtatcgtaac ggcaaggtgc atgtgattct gaatgcgcag 1080
ccggagagcc aggccagcgg gtattatcat cagcacggta tttcgctgtg tgcggtggcc 1140
tggcgggttc gcggggtcga taagctgatc acgcgcgcgc aggattacgg ttacgccatc 1200
tggcaggggg aaaccggccc caacgaacgc cagatcccgg cgttatgtgc gcctgacggc 1260
agcctgattt atctggtgga agatgagcct gccggtcaag acggctacca cagcgacttc 1320
cacttaacgc accgcgccgc gccccagcct gcgatgcaga ccatcgacca tctggcgatt 1380
gccctgccgg atgatacgcg cgataactgg attatgttcc tgcgtagcgt gccgggtttt 1440
gtgcaggata ccgagtggga actgcccgat ccgctggggc tggtgcgtag ccgcgtgctg 1500
cgaagcccca acgatgcgat tcgcctgccg ctaaacatgt cggtcagtcg ggaaacccag 1560
atagcccgcg ctttaacgac ctatcagggc gcaggtttgc agcacgtcgc ctttggctgt 1620
gacgatctgt tcagtgcggt aaaggccgcg cgcgaacgtg ggctgaaaac cttgcacatt 1680
cccgataact attatcagga cctgatggcg cgtttcgatc tcgacgccga ttttctggcg 1740
cagctgcagc gttacgatgt gctgtacgat cgggacgaac agggcgggga gctgctgcac 1800
gtctatacgc ttccctatga aaagggccgc ttcttctttg agctgctgga acgacgtggc 1860
ggctatcgtg gctttggcgc ggccaatgct cccgtgcggc tgaccgccat gcggtaa 1917
<210> 137
<211> 852
<212> DNA
<213> 氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）
<400> 137
atgacgaaac tccccttccc tttcggcatg aacgaattca cgacccagcc ctggtcgttc 60
gaggaagacg tggcgcgtta ccgcgacctc ggcgtggatg cgatcgagat ctgtgaagcc 120
aagcttgatc cggcccgcat tgaggagcag atgtgcctcg tcagggagag cgggctgagc 180
gtcagtgcgg tccagccgct ggtccggacc ttcttcggaa gcgctatggt ccctgaacct 240
gaagcgactg aagcccgcgt caaacgcctt acccaaagcc tgaaaacgct cgcgcctcat 300
gtccccggca gcgtctttgt gaccaatacc ggcgcgccac ccaagggtaa catgcgccgt 360
accatggacg agacggtgcg ttacctgaag gagctctgtc cccttgccga ggatctgggt 420
gtttccctgt cgctggagcc gctcaacccg acctcggtga acaccgaaag cgccatctgg 480
accatcgagc aggccatgga catcattgag gacgtcggcc atccggcgat gggtctgtgt 540
ctggattact ggaacatctg gcagcagaag gatgtctgcg cggctatccg tgctgcggga 600
agcaaaatca acgtccttca ggtcagcgac tggcgcacgc cctattccgc cgccgaccgc 660
ctgatccccg gcgatggctg cattccgctt catgaaatgc tgcatgccac atgggatgcg 720
ggctttcgtg gcgcctgcac ggtcgagatc ttttcgtcag atgtgccgga cagcctttat 780
gaccgcgacc tgagcgatgt catccgcttc tgccgcgagg gactggatca ggcctggacc 840
ggcgaggcct ga 852
<210> 138
<211> 1473
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400> 138
atgcgtctga tgcctgcgct ggtggccttg ctgccactgc tccccctgcc cgccctggcc 60
gccgcaccgg ccaaccccga aaccctgcgt gtcgagcgct acgctgacga cgaccagctc 120
ggctcgctgc gctgggccat cgaaaccagt aaccagaacc ccggccacta cagcatcgac 180
attgccgccg tcggccagcc gccctacgtg atccgcccca gccgtgcgct gccggaaatc 240
aagggcccgg tgcgcatcac cggcctgcct tgggcccgcg atggccaata catcgccatc 300
gacggttcgg cctacatcaa ggaccagggc gtacgtacct gccccggcgc cctgcccggc 360
cagttcggca ctaacgtgcg caccaccacc aaccccgggc tggtgctgcg cgacacccag 420
ggcgtgcacc tgagcggcct ggaagtgcgc aacttctgca tcggcatcct ggtcaaccgc 480
gccagcggca acgtgatcga agacaaccgc atcgtcgcca acaaaggtgg cgcgggcatc 540
atgctgaccg gtgacgacgg cgcgggtaac cccaccgcca ccaccacgaa caacaacaag 600
gtgctgcgca accaactgat cgacaatggc gacggcctgg agctgacccg cggagcggca 660
ttcaacctgg tggccgacaa tctgttccgc tccacggcgg ccaaccccga accctcgcag 720
ggtatcgaga ttctgctggg caacgacaac agcgtggtgc gcaaccgctt cgagaactac 780
tccgacggcc tgcagatcaa ctggggcaag cgcaactacc tggcggccaa caccttcagc 840
ggcaactcga tcggcgtcag cgtcaccggc gagggcaaca tcctcgacgg caacctgatc 900
cacggcaacc gcatcggcgt tgcactgcgc ccggaaccgg atgctaccgc cacgcgcctg 960
agcggcaacc gcatctgggg taacagccag gatatccgcc gctgtgaagc gggcggttcg 1020
tgcgtgccgg gccaacgcac cggcgccatc gtgtttggcg tgcctgcgca ggcgcatgcg 1080
ctgtatgtag gttcgcgcgg ggtgggcgcc gacttgccga agaaagacca ggcgatcatc 1140
tgcgatgcca acggcgagcc caagccttgc cagccgctgc ccaaccataa ccagcaggcg 1200
ccaaggctga ttgcgctgga aggcaatgtg ttgcgcggtg aagtacaggg gccggaatcg 1260
agcctgctgc gggtggagtt ctttggcaat gccgaggcga atggcaccga ggcggagcag 1320
tacctcgggg aggtgctggt gaacagtgac agacaggggc aagcgcggtt tgcacaagtg 1380
ctggagaaca tcggtgggtt gcgcagcttt accgcgaccg taaccactgc cgatggggca 1440
acctccgagt tgagcctgcc ggttcggcgg taa 1473
<210> 139
<211> 918
<212> DNA
<213> 沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）
<400> 139
atgaaactct cggtctgcac catcacattc cgccatcacc tgctctgctt cagcgagatc 60
gtcgagtgga cgcaacgcaa cggcttcgac ggcgtcgaac tgtggggcgc tcatgcgcgc 120
ggcctgatgc ggacgcaccc ggaatacgat gcagattggc ttcgcagtta cggcctgtcg 180
gtgccgatgc tgagcgatta cctgccgacc gatggcgaca tcacggacac tcgccaccgt 240
gcaatcgagc tctgccggat tgcacagcat tggtcagcgc gaaagatccg cacattcgcc 300
ggtaacagac cgagcgccca gctgtcgcgc gagcagcgca gagcgctggc cggccggatc 360
ggtgagatcg ccggcatcgt ccatgatcac ggcatccggc tgttggtcga gacacacccg 420
aacacgctgg ccgacaacgt cgactcgaca cttggcctgt tggcggatgc caaccaccca 480
ggtctcggta ttaacttcga tgctctgcac gtctgggaag gcggcgacga tcccgttctg 540
gctcgccgca cgctcgcgga cttcatcggg cactatcatc tcaagaacgt ccgatcacgc 600
gacgagctcg gtgtgttcgc ccctgagaac gtctattctg ccgccggctc ccgtgacggc 660
atggtgccgc tgtttgacgg cgcgatggat tacgaaggtt tcctcgcatc cttggcggac 720
gagaccgatg cggaagcgtc gctcgaatgg ttcggtcacg attgcttcga aaccctggcc 780
cgagatcggc tagccatatt cgcacgctcg atatcgacga gaggtcgccg cggctcggcg 840
ggcacgcagc aagcgcggct ggcagagtcg cgtgccgccg gccgcgccgc ctcctccaaa 900
ggaccctcat gtatttga 918
<210> 140
<211> 1461
<212> DNA
<213> 不动杆菌（Acinetobacter baylyi）
<400> 140
atgaaattaa cttctttacg cgtatcttta ttggcgctgg gcttggtaac atcaggtttt 60
gctgcggcag aaacttatac tgtagatcgt tatcaggatg atagtgaaaa aggctctttg 120
cgttgggcaa ttgaacaatc taatgcaaat agcgcacaag agaatcagat tctgattcag 180
gctgttggta aggcacctta tgtgatcaag gtggataaac cgttaccacc gattaaatca 240
tctgtaaaaa ttattggtac agaatgggat aaaacgggcg aatttattgc gattgatggt 300
tcaaactata tcaagggcga aggcgaaaaa gcatgtccag gtgcaaatcc aggacaatat 360
ggtaccaatg ttcgtaccat gactttacca ggtttggttc tacaagatgt caatggtgtg 420
accctgaaag gtcttgatgt tcatcgcttc tgtattggtg tactggtaaa tcgttcaagc 480
aataatttga ttcagcataa ccgtatttca aataattacg gtggcgctgg tgtcatgatc 540
acgggtgatg atggtaaagg taacccaacg tctaccacca ccaataacaa caaagtattg 600
gataatgtgt ttattgacaa tggcgatggt cttgaactga cgcgtggagc agcattcaac 660
ctgattgcta acaatctgtt tacatcgacc aaagccaatc cagagccgtc tcaaggcatt 720
gaaattcttt gggggaatga caatgcagtg gtgggtaaca aatttgaaaa ctattcagat 780
ggtctacaaa tcaactgggg taaacgtaat tacatcgctt ataacgaatt gaccaataac 840
tctttgggtt tcaatcttac aggtgatgga aacatcttcg atagtaacaa agtgcatggc 900
aatcgtattg gtatcgcaat tcgttctgaa aaagatgcaa atgcacgtat cacacttacc 960
aaaaatcaga tttgggataa tggtaaagat atcaaacgct gtgaggctgg tggttcatgt 1020
gttccaaacc aacgtttagg tgcaattgta tttggtgttc ctgcgcttga gcatgaaggt 1080
tttgtaggct ctcgtggtgg cggtgtagtc attgaacctg caaaattaca aaaaacatgt 1140
acacagccaa atcaacaaaa ctgtaatgcc attccgaacc aaggtattca ggcacctaaa 1200
ctgactgtca gtaaaaaaca acttacagtt gaagttaaag gaacaccaaa ccagcgttac 1260
aacgtagaat tttttggaaa tcgtaatgca tcttcttccg aagctgagca atatttaggt 1320
tcaattgttg tagtgacaga tcatcaaggt cttgcaaaag caaactgggc accaaaagtc 1380
agcatgccat ctgttactgc gaatgtaact gatcacttgg gcgccacttc agagttaagt 1440
tctgcagtga aaatgagata a 1461
<210> 141
<211> 846
<212> DNA
<213> 麦氏交替单胞菌（Alteromonas macleodii）
<400> 141
atgaatcttt cagtatgcac tatcactttt aggcaccaac ttatctcaat cgctgaaatt 60
gcaaaatggt ctgtggcaaa tggttttcag gggatcgaat tatggggtgc acatgctacg 120
aatttagaag accaacccga gtatgggaaa gagtggctct caagctacgc gttgaaaaca 180
tccatgctaa gcgattatct gccacttttt gaagggaacg acgctttgta ttttaaggtt 240
catcgccttt gtcgtttggc taaacactgg ggggcaacca agattcgcac atttgctggc 300
aacgaaggca gcgcagccat acctgaagac cgaaaaaccc tgcttttcga gcggttacaa 360
cttgtttgtg attggcttag cgactatggg cttaacttag ttatcgaaac acaccctaat 420
acttacgctg actcggtggg ttctaccatt gaattgtttg aaaaagttaa caaagacaat 480
ttgcaactaa attacgatgt gttgcatgta tgggaatctg gcgctgacat tatttcctct 540
tgtgaacaac tcgcgccata tataaatcat tttcacttta aaaacataag tagcagtaaa 600
cacttaagtg tgtttgctcc agacaatgtg tatgccgcag caggctcgcg agaaggcatg 660
gtccccattt tcgacggtgc tgtagattat caaaggttta ttgaatacct gtactcgaaa 720
acaactctgc gaaatattga ctcttcactc gagtggtttg ggaacaattg caagaatatc 780
ctcagtcagg acagatataa attacagaaa atgagccagg ccgcgactac cgctcaagcc 840
atttaa 846
<210> 142
<211> 876
<212> DNA
<213> 除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）
<400> 142
atgattcgct tccacctgtg caccatctcg ttccgccacc agttggtgtc gttaccggaa 60
ctcgctacct gggctggcgc caccggcttt gacggtattg aactctgggg cgtgcatgcc 120
tggcacctgt tacagcagcc cggactggat ggccgctggc tgcaaagcca gggactggcc 180
attcccatgg tcagcgacta cctgccgcta gacggtagcg agcaggaggc tatccactac 240
acccgcgaac tctgccggct ggcccgacac tggcaggccc ccaaactgcg aacgtttgcc 300
ggccatcagg gcagcgccga gctcgaccag agacagcgcc aggcccagac ccgacgtctg 360
cagacgctga cccgttgcgt cgcagatgaa ggcctgaccc tggtggtgga aacacacccc 420
ggcaccctgg ccgatacggt cgactccacg ctgacgttgc taaccgacgt ggatcacccg 480
gccctgggta tcaacttcga cgtcttgcat gtctgggaag ccggagcaga cccaaagctg 540
gcgctgcaac aaatggcgcc ctgggtcaga cattttcact tcaagaatat ccgtcatcgg 600
gatcagctcg gcgtatttgc tccggctaat gtctactcac cggccggttc ccggcaggga 660
atggtgcctg tgctggacgg tgcctgtgac taccggccgc tactggacac cctggccggc 720
tggcaacagt cgcaaaccca tccggcccca ctggacattt ccctggagtg gttcggcccg 780
gacagctacc gggtgctatg cagcgatctt caccagttgc ggcaaaacgt tcgccagaac 840
cacgcgcaat ctcaggcgct ggccgtctgc cagtga 876
<210> 143
<211> 837
<212> DNA
<213> 扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）
<400> 143
atgagaatcg cgctctgcac catcagcttt cgccaccatc tcgtgtcgat cggcgaactc 60
gcccgcttcg cccgcggcca cggcttcgac ggcatcgaat tgtggggcgt gcatgcccgc 120
aatctcggcc ccggcgacca cgctgaatgg ctcgccgcct acggcctgcg cgtgccgatg 180
ctgagcgact acctgccgct cgacgcgccg ctggaaatcc tgaccgagcg gacggccgaa 240
ctcgcccggc tcgccgggag ctggggggcg ccgcggctgc gcaccttcgc cgggaccaag 300
ggcagtgcgg ccgcctcgct cgacgagcgc gcccatgtcg cccagcgcct gcggatggcg 360
gcgggccaac tcgccgacca gggcctgcgc ctcgtggtgg agacgcatcc cggcacgctc 420
gccgacacca ccgcctcgct cctcgacctg ctggatgcgg tcgatcaccc gaacctccgg 480
gtcaatttcg acacgctcca cgtctgggaa ggcggcgacg acccgctcgc ggcccacgcc 540
cggctctccc cgcatatcga ctactatcac ctcaagaacg tgcgcagccg cgccgacctg 600
tcggtgttcg agccggccaa cgtctatgcc gcggccggac ggcgcgaggg catgaccggc 660
ctgttcgagg gcgcgctgga ttacgccgct ttcctgaaga cgctgccgcc gcaggcggaa 720
ggctcgctcg aatggttcgg cgaggccagc ttctcggtcc tgcccaccga ccttttccgc 780
ctgcgcagtg ccactgccgg ccgccgcggg gcgggagccc tccacgccgc gcgctga 837
<210> 144
<211> 1080
<212> DNA
<213> 粗糙链孢霉（Neurospora crassa）
<400> 144
atgccgtcaa agctagccat tagttccatg tccctagggc gctgctttgc cggccactct 60
ctggacagca agcttgatgc cgctcaacga tacggctatc ttggtatcga gcttttttat 120
gaggatctgg tcgacgttgc agagcatttg tcgaacgagc gtccctctcc cgaaggccct 180
tttgtcgaag ctcagatagc cgccgctcgt catattctcc agatgtgtca agccagggcg 240
cttgaggtcg tctgcctcca gcctttcatg cactacgacg gccttaacga cagggcagaa 300
catgagcgtc gtctggagaa gctagcacta tggattgagc tcgctcatga gcttcacacc 360
gacatcattc agatcccagc caacttcctc cctgccaacc aagtcagtga caacctcgac 420
ctgattgtct cagatctttg caaggtggcc gatattggag ctcaagcttt gccccctatc 480
cgctttgcct acgagagtct ttgctggagc acccgtgtcg acctctggga gcgctgctgg 540
gacatcgtac aacgcgttga ccgccccaac tttggcattt gccttgacac cttcaacatc 600
ctcggccgca tctatgccga ccctacatct cctagcggta ggacatccaa cgcaaaagag 660
gcagtcagga agtccatcgc caacttggtc tcgcgcgtgg atgtctccaa agtcttctac 720
gtccaggtgg ttgacgccga gaggctgagc aagccactac tgcccggtca cccgtattac 780
aatccagagc agccggcgag gatgagctgg tcgcgcaatt gtagactgtt ctacggcgaa 840
acagaatatg gtgcgtatct tcccgtgaag gaggttgctc gagccctttt tcacggcatt 900
ggtttcgagg gctgggtcag tttggagctt ttcaaccgca gaatgtctga ggagggacct 960
gaagtgccgg aggaacttgc catgagaggc gctatctcgt gggccaagtt ggtgcaagac 1020
ctgaggatac cggtggaggg gccattggtg acgatgcccc gagtctctgc ttcattgtaa 1080
<210> 145
<211> 1116
<212> DNA
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<400> 145
atgcccaacc gtctcggcat cgcctccatg tcccttggac gcccaggcat ccactccctc 60
ccctggaagc tccacgaagc cgcccgccac ggctacagcg ggatcgagct cttcttcgac 120
gacctggacc actacgcaac cacccacttc aatggcagcc acatcgcggc tgctcacgcc 180
gtgcacgctc tctgcacgac cctcaacctc accatcatct gcctgcaacc cttctccttc 240
tacgaggggc tcgtcgaccg caagcaaacc gagtatctat tgaccgtgaa gctgcccaca 300
tggttccagc tcgctcgcat cctcgacacc gacatgatcc aggtgccctc gaacttcgcg 360
cccgcccagc aaaccacggg tgaccgggac gtgatcgtcg gcgacctcca gcgcctcgca 420
gacatcggcc tggcacagtc cccgcccttc cgcttcgtat acgaagcact ggcctggggc 480
acgcgggtga acctgtggga cgaggcgtac gagatcgtcg aggccgtgga ccgtcccaac 540
ttcggtatct gtcttgatac gtttaacctt gcgggtcggg tgtatgcgca ccctggtcgg 600
caggacggga agacggtcaa cgcggaggcg gatctggctg cgtcgttgaa gaagttgcgc 660
gagacggtgg atgtcaagaa ggtgttctac gtgcaggttg tggatggaga gaggctggag 720
aggccgttgg atgagaccca tccgtttcat gtggaggggc agccggtgcg gatgaactgg 780
agtcgcaatg cgaggttgtt tgcgtttgag gaggatcgcg gcgggtattt gcccattgag 840
gagaccgcga gggcgttctt tgatacgggg ttcgagggct gggtgtcgtt ggagttgttt 900
agtcgcacgt tggcggagaa gggcacgggg gtggtcacgg agcatgcgag acgcgggttg 960
gagtcgtgga aggagttgtg taggaggttg gagtttaagg gggcggagcc gggactggat 1020
tttgttcctg gggaggtgaa ggtgcagtcg gttgctgtgg ggagtgggaa gggggtggaa 1080
caggaggaga tgggggttgt gcagcatcgg ttgtag 1116
<210> 146
<211> 834
<212> DNA
<213> 耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）
<400> 146
atgagtgccg agaggcgact gtcgctgaac accatgacca ccaagcgcct cacgctgcgc 60
gaggccgtcg aggcaaccgc cgcggccggg ctggagtcca tcggcctgtg gcgtgaccgc 120
gtagccgaag cgggtgtgga caccgccgcg aaactgatgc acgacaacgg tcttcgcgtg 180
tccagtctgt gccggggcgg tttcctgacc gggttcgagg aagaccatgc gctcgccgac 240
aaccggcgcg ccatcgagga ggcggtcacg ctcgggacgc gagagctcgt catggtcgtg 300
ggcggcatcc cggaccgtga cctcgccgcc gcgaggggac gtgtggctca gcggctcgag 360
acgctcgtgc cctacgccgt cgaccacggt gtccggctgg cgctggaacc gctgcacccg 420
gtgttctgcg ccgaccgcgc ggtgatctcc acactggggc aggcgctggc actcgcggcg 480
ccgtacccgg ccgaggccgt cggcgtcgtc gtcgacacct tccacgtgtg gtgggatccc 540
gagttggcgg acggcatcgc cgcggcgggc gctcagcacc ggatcagctc gtaccaggtg 600
tgcgactggc tggtcccgat ggccgccgac ccgctggtgt cgcgcggcat gatgggtgac 660
ggcgtcatcg acttcggtgc ggtcaccgcg atggtgcggg ccgcgggata cgacggcgac 720
gtcgaggtcg agatcttcaa cgaggacatc tgggccaccg acgcggccgt cgtcatcgac 780
accatgaaac agcgctaccg cgatctggtg gcgcctgctc tcacggcagg ctga 834
<210> 147
<211> 1875
<212> DNA
<213> 耐盐棒杆菌（Corynebacterium halotolerans）
<400> 147
atgcgtacct cgatcgccac cgtctgcttg tccggcaccc tcgcggagaa gctccgggcg 60
gcggccgacg ccggattcga cggcgtggag atcttcgagc aggatctcac cgtctccccg 120
cactctccgg agcagatccg gcggcgcgcc gccgacctgg gcctcaccct cgatctcttc 180
cagcccttcc gtgacttcga gggggtggag gaagcgcagt tcgaggcgaa cctgcgccgc 240
atggaggcga agttcgcgtt gatgaaccgc ctgggcatcg acaccatcct gctgtgctcg 300
aacgtcgcca ccgccaccat cgacgacgac gggctcttcg ccgcccagct gcgccgcgcc 360
ggtgaactgg ccgagcgtta cgacgtgcgc atcgcctatg aggcgctggc ctggggccgc 420
ttcgtcaacg acttcgagca cgcccgacgc atcgtcgacc tggccggcca cccgcgggtg 480
ggcacctgcc tggacacctt ccacatcctc tcccgcggct ggtccaccga cgcggtggag 540
gagatcgcgg gcgagaagat cttcttcgtc cagctcgccg acgccccgca gctgagcatg 600
gacatcctgt cctggtcgcg ccaccaccgc gtcttccccg gcgaggggga cttcgacctg 660
gtgaagttca tgcgccacct cgcgcgcacc ggctacgacg gtccggtctc gctggagatc 720
ttcaacgact ccttccgcaa ggccgaggtc ggacgcaccg ccgtcgacgg cctgcgttcc 780
ctgcggtggc tggaggacca gacctggcgc gccctgcacg ccgcggggga gggcaaggcc 840
gctgaagccc tggagctgtc cccgctgccc gaggtcgccg accccgaggg cgtggacttc 900
gtggagatct ccaccggccg actgggggag accatcaagg tgctccacca gctcggcttc 960
cgcctcggcg ggtaccaccg cagcaagccc cagttccagg tgtggaccca ggggccggtg 1020
cgcgtcgtca tcggcgaccg cgggccgacc ggggccccca ccggcatcac ctccctgggc 1080
gtgcggaccc cggacccggc cgccgcgcag gcccgtgccc acctgctcca ggcccgtccg 1140
gtcccccgcg aacgggccgc gggcgaggtc gagctgcacg gggtgtacgc acccgacggc 1200
accgaagtgt tcttcagcgg tctggccccc gagaccgccc cggcgtggct ggcggaattc 1260
ggcgtcacgg acaacgacct ggagcccgcc ccgctgatca ccggcatcga ccacgtcaat 1320
ctggcccagc cctggcagca ctatgacgag accgtgctgt tctacacctc cctcatggcg 1380
ctggagaccc acagccgcga ggagttcccc agccccatcg ggctgatcag caataaggtc 1440
atgcgttcgg ccaacgacac cgtgcggtta ctgctcagcg tcgcccccga ggacggtgag 1500
cagggtgact tcctggccgc cgcctacccg gagcacatcg ccatcaccac caccgacatc 1560
gtcgcagtgg cgcgtcgtgc gcgacagcgg ggactggcgt tcctgccggt ccccgagaac 1620
tactacgacg acctgcaggc gagattcgac ctgaccccgg ccttcctcgc cgaactgcgc 1680
gagaacgacc tgctctacga ccgcgacgcc gacggcgaat tcctgcactt ctacaccggc 1740
accctgggca cgatgttcat cgaggtcgtc gagcgccgcg gcggtttctc cggctggggc 1800
gagaacaacg ccccggtccg actcgccgcc cagtaccgca acgtgcgcga cgccgaacgc 1860
ggcattccgc agtag 1875
<210> 148
<211> 1935
<212> DNA
<213> 浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）
<400> 148
atgggacgac aggttcgtac gagcgttgcc acggtatccc tgagcggatc gctggaggag 60
aaggttaccg cgatcgcggc ggccgggttc gacggattcg aggtgttcga acccgatttc 120
gtgagctcgc cgtggtcgcc gcgtgagctg gcttcccgcg cagcggatct cggactcaca 180
ctcgatctgt atcagccgtt ccgcgatctg gactccgtgg acgacacgac gttcgcgcgc 240
aacctgatcc gagccgagcg caagttcgac atcatggagc agctcggctg cgacaccctg 300
ctggtgtgct cgtcgccgtt gcccgaggcg gtgcgggacg acgctcgcct gaccgagcaa 360
ctccacactc tcgccgagcg cgcacacagc cggggtctcc gcatcgccta cgaggcgctg 420
gcctggggca cgcacgtcaa cacgtaccgg cacgcgtgga agatcgtgca ggacgcggac 480
catcctgccc tcggtacctg cctcgacagc ttccacatcc tctcccgcgg cgacgacccg 540
tccggcatcc gcgacatccc gggggagaag atcttcttcc tccaactcgc cgacgcgccc 600
cgcatgtcga tggacatcct gcagtggagc cggcaccacc ggaacttccc ggggcagggc 660
aacttcgatc tcgcgacgtt cggcgcgcac gtccaggccg ctggatacac cggaccgtgg 720
tcgctcgaga tcttcaacga cacgttccgg cagtcgtcca cggggcgcac ggccgccgac 780
gcgcaccgct cgctgctgta cctccaggag gaggtcgcac gcgtgcaggc cgagcgcggt 840
gaggacaccg gtcgcggcct gacgctgttc gagccgccgc cgcgcgcacc cctcgaaggc 900
atcgtgtcgc tccggctcgc ggccggtccg ggcaaggatt ccgaccttcg gcaggcgctg 960
cagcacatcg gattccgtct ggtgggccgg caccgcagcc acgacctcca gttgtggcgg 1020
cacggccgga tgaccatcgt ggtcgatgcg accgcgggca cggtgtggac cgctccgggt 1080
ctgcctgcgc acctgccggt gctcacccag atcggtatcc ggtcgagcga tcccgacgcg 1140
tggggtgagc gcgccgcggc gctcgaggtc ccggtgcacg aggtcctgtt gcccggtgtc 1200
gacaccgcac ccgaatcgga tgtggtgcgt ctcaagatca ccgacgcgac gtcgctggat 1260
ctgcgcggcc cgggcagcgc cgcgtcgtgg cagtcggcgt tcgatctgta tccgacggag 1320
tcgcgctggc aggatgaggt gcccgtcttc accggtgtcg atcacgtggc gctcgccgtg 1380
ccgtccgaca actgggacgg catcatgctg ctgctccgtt cggtgttcgc gatggcgccg 1440
cacgagggcc tcgatgtcac cgacgcggtc ggaatgatgc gcagtcaggc gctgacgatg 1500
gatcagacgg gtgcggacgg cgtcgaccgt ccgctgcgca tctccctgaa catggttccg 1560
ggtgcggtgt cgggcaactc ccacatcgcc gcggctcggc gcggcggcat cagtcacgtc 1620
gcgttctcgt gcacggacat tttcaccgcc gccgcgacca tgcagtccaa cgggttcgag 1680
ccccttgtga tttcgccgaa ctactacgac gacctcgagg cccgcttcgg gctctcccgc 1740
gaactcctgg accggatgag cgggtcgggc atcatgtacg accgtgatgc gcacggcgag 1800
ttcttccatc tgttcaccca gacggtgggc gccgacctgt tcttcgaggt ggtgcaacgc 1860
gtcggcggtt acgagggata cggggacgcg aactccgcga tgcgtttggc ggcccagttg 1920
cgggcggctg gctga 1935
<210> 149
<211> 1101
<212> DNA
<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae）
<400> 149
atgcctaacc gtctcggaat tggttccatg tccctggggc gcccgggaat ccacgatctg 60
ccaaccaagc tgcaccaggc ctctcagttc ggctacaagg gcatcgagct attctttgac 120
gaccttgacc acttggccaa gttgctcttt gatggagatc atattttagc tgctcatcat 180
gtacgccagc tttgtgtttc gctgggcctc tctatcatct gtctgcagcc cttttggcac 240
tacgaggggc ttctggatcg cactgagcac gagcgtcttc tcactgaaaa gcttcccaag 300
tggtttgagc ttgcacgcat tctggataca gatctcatcc agatcccatc taactttctc 360
cccgccgatg ctcagacagg ccagccccgc accacaggtg acatgtctgt cattgtctca 420
gatcttcaga agatcgccga tcttggcctt cagcagtctc ccccctttcg ttttgtctac 480
gaagccctag catggggtaa ccacatcaac aaatgggaag actcctggga agttgtagag 540
cgggtcaacc gtccaaactt tggaatttgt cttgacacct tcaatatcgc tggacgggtg 600
tatgccgatc ccacatctcc cacaggaaag acgcctaatg cggaagccga cctccaggca 660
tctatcgccc gcctgcgaac tcgcatcgac ctctcaaagg ttttctatgt tcaaatcgtg 720
gatggcgaac gcctgagtac ccctctggac gaatctcacc cattctatgt caagggtcag 780
ccctcccgca tgaactggtc gcgtaacgca cgcctgtttg cctttgaaga ggaccgtggt 840
ggatacttac ccgtcttgga cgtcgctaaa gccttcttcg atattggctt cgagggctgg 900
gtttccctgg aattgttcaa cagaagcttg gctgatcctg acccatctac gcctcgcaat 960
catgccaaaa gagggtttga gtcttggaag aaactggtcg ctgccttgaa gctcaatacc 1020
ggtgatgctt ctatggtgca tggtcttgac ggtacaattt caccatcgac ttctgctttg 1080
cctgtgcagc atcgccttta g 1101
<210> 150
<211> 843
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）
<400> 150
atgaaatatt cgctatgtac catttcattt cgtcatcaat taatttcatt tactgatatt 60
gttcaatttg catatgaaaa cggttttgaa ggaattgaat tgtgggggac tcatgcacaa 120
aatttgtata tacaagaacg cgaaacgaca gaacgagaat tgacttttct aaaggataaa 180
aacttagaaa ttacgatgat aagtgattac ttagatatat cattatcagc agattttgaa 240
aaaacgatag agaaaagtga acaacttgta gtactagcta attggtttaa tacgaataaa 300
attcgcacgt ttgctgggca aaaagggagc aaggacttct cggaacaaga gagaaaagag 360
tatgtaaagc gaatacgtaa gatttgtgat gtgtttgctc agcacaatat gtatgtgctg 420
ttagaaacac atcccaatac actaacagac acattgcctt ctactataga actattagaa 480
gaagtaaatc atccgaattt aaaaataaat cttgattttc tccatatatg ggagtctggc 540
gcagatccaa tagacagttt ccatcgatta aagccgtgga cactacatta ccattttaag 600
aatatatctt cagcggatta tttgcatgtg tttgaaccta ataatgtata tgctgcagca 660
ggaagtcgta ttggtatggt tccgttattt gaaggtattg taaattatga tgagattatt 720
caggaagtga gaggtacgga tctttttgct tccttagaat ggtttggaca taatgcaaaa 780
gagatattaa aagaagaaat gaaagtatta ataaatagaa aattagaagt agtaacttcg 840
taa 843
<210> 151
<211> 2094
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 151
ttgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60
gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120
tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180
cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240
ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300
cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360
gagtaccgcc acaccaaggg cgttgagatc accactggcc ctcttggcca gggtcttgca 420
tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480
gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540
caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacatc 600
atcgtgttct gggatgacaa ccgcatctcc atcgaagaca acactgagat cgctttcaac 660
gaggacgttg ttgctcgtta caaggcttac ggctggcaga ccattgaggt tgaggctggc 720
gaggacgttg cagcaatcga agctgcagtg gctgaggcta agaaggacac caagcgacct 780
accttcatcc gcgttcgcac catcatcggc ttcccagctc caaccatgat gaacaccggt 840
gctgtgcacg gtgctgctct tggcgcagct gaggttgcag caaccaagac tgagcttgga 900
ttcgatcctg aggctcactt cgcgatcgac gacgaggtca tcgctcacac ccgctccctc 960
gcagagcgcg ctgcagagaa gaaggctgca tggcaggtca agttcgatga gtgggcagct 1020
gccaaccctg agaacaaggc tctgttcgat cgcctgaact cccgtgagct tccagcgggc 1080
tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggcg 1140
tccgaggctg cacttcaggc actgggcaag acccttcctg agctgtgggg cggttccgct 1200
gacctcgcag gttccaacaa caccgtgatc aagggctccc cttccttcgg ccctgagtcc 1260
atctccaccg agacctggtc tgctgagcct tacggccgta acctgcactt cggtatccgt 1320
gagcacgcta tgggatccat cctcaacggc atttccctcc acggtggcac ccgcccatac 1380
ggcggaacct tcctcatctt ctccgactac atgcgtcctg cagttcgtct tgcagctctc 1440
atggagaccg acgcttacta cgtctggacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc 1500
ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560
ctgcgtcctg cagatgcgaa tgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaat 1620
gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680
gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740
accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800
aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860
ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920
gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980
gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040
ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaa 2094
<210> 152
<211> 1083
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 152
atgtctcaca ttgatgatct ggcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60
cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120
gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180
cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240
atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg tttaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300
tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgcggaccg cgacgcaacc 360
ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420
cctgctaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagtgtt 480
aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgaag tcatcgctgc gttcatcgag 540
ggcatcaagc aggcagctgc aaacggccac gacgtatcca agatccactc tgtggcttcc 600
ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggatccgat 660
gaggctttgg ctctgcgtgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720
tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggcg ccaacactca gcgcccactg 780
tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840
gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgctgt tctggaactg 900
ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc tgtgttctcc 960
cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga gaccgagggc 1020
gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc tcgcctgaag 1080
tag 1083
<210> 153
<211> 1098
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 153
atgagcgcag cgcagatttt caacaccgtc cacgtcaatg gatcttcccc ctatgatgtc 60
cacattggtt ccggcctcaa cgagctcatt gttcagcgcg cagcggaatc aggcgcggag 120
caggtagcga ttttgcacca gcccagcatg gatgacattg catccgagtt ggatgcagca 180
ctagtcgctg ctggtttgaa ggtcctgcac cttaatgttc ccgatgcgga aaacggcaag 240
tccttggaag tagcggggca gtgctgggat gaattgggtg gcgcagcatt cggccgccgc 300
gatatcgtca tcggacttgg tggcggtgct gccacagatc tcgcgggatt cgtcgctgct 360
gcgtggatgc gtggcgtgcg cgtcattcag gttccaacca ccttgttggc catggtggac 420
gctgcggtgg gcggcaagac tggcatcaat accgccgcag gcaagaacct tgtgggcgcg 480
ttccacgagc ctgacgcagt attcattgac accgaacgcc tagccaccct gcctgacgcg 540
gaaatcatcg cgggatccgc cgaaatcatc aaaactggtt tcatcgccga cccagaaatc 600
ctgcgccttt acgaaactga tcccgcagcc tgcctgaaga aagaagtcga aggctcccac 660
ctacctgaac tgatttggcg ctccgtcacc gtcaagggct ccgtggtcgg ccaagacctc 720
aaagaatcta gcctgcgcga aatcctcaac tacggacaca cctttgccca cgccgtcgaa 780
ctccgcgaaa acttccgctg gcgccacggc aatgccgttg cagtgggcat gatgttcatc 840
gctaacctct cccacaagct cgggcttatc gacgcgcccc tcctcgagcg ccaccgctca 900
atcctggcgg ccatcggtct gcccacttcc tacgaaggcg gagccttcga cgagctttac 960
gacggcatga cccgcgacaa gaaaaaccgc gacggcaaca tccgcttcgt cgcactgacc 1020
gccgtgggcg aggttacccg cattgagggg ccctcaaaac aagatttaca gagtgcttat 1080
gaggcaatca gccactaa 1098
<210> 154
<211> 573
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 154
atggagcgta atgaagtgaa tgatcaaatt cacttagatc atcaatcaga tgacacctct 60
gaatgctcct gcccgatcgt ggttcttgtg ggtttgccag gagctggaaa atccaccatt 120
ggacgtcgat tagcgcgcgc cttaaacact gaactcgtcg actccgacga actcattgag 180
cgcgccaccg gaaaagcctg cggcgccgtg ttcagcgagc tcggcgagcc agccttccgc 240
gagctcgagg ccatccacgt ggccgaagca ctgaaatcct ccggagtggt gagcttggga 300
ggcggatctg tgctgacaga atccacccgt gaactgctca aaggccacga cgtggtctgg 360
atcgacgtgc cagtagaaga aggcatcagg cgcaccgcaa acgagcgttc ccgccccgtg 420
ctgcaagccg ccgaccccgc cgagcactac cgcaacctgg tgaaagtgcg caccccgttg 480
tacgaagagg tggcaaccta ccgacttcgc accaacaacc gcagccccca gcaagtggtg 540
gcagcagtgt tgcatcatct agaaatcgat taa 573
<210> 155
<211> 1293
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 155
atggtctttg tgtctgattc gtctatctct ttgcccattt gggatgctcc gcgcgctcgc 60
ggccccatag tctcggacct ggctatccct ggttccaagt cgatcaccaa ccgcgccctc 120
atcttggctg cgctcgcatc aactccatcc accatcattg atgtccttcg tagtcgtgat 180
accgatctca tgactgatgg tctacgcagc ctcggaatca ccattactga agaggcagtc 240
gatcgctacc gcgttgagcc cggacagttg tctgctggct ccgttgagtg tggtcttgct 300
ggtacggtca tgcgcttttt gcctcctgtt gctgctttcg ctgatggtcc tgttcatttt 360
gatggcgatc ctcaagctcg tgttcgtccg atgaccagca ttttggatgc gctgcgttcg 420
cttggtgtgg aggtggacaa caacaatctg cctttcactg ttaatgctgg tgaggtccct 480
gagggtggcg tggttgagat tgatgcttcc ggctcatctc agtttgtttc tggtcttttg 540
ctttcagcgc ctcgttttaa aaatggcgtc accgttaagc acgtcggtgg tcgtctgccg 600
agcatgccgc atattgagat gaccgtcgat atgcttcgtt ccgcaggcat tgagatcgaa 660
gagtcagaaa atcagtgggt tgttcatcct ggtgagatct tgggtcggac ctggcgcatt 720
gagccggatc tttctaatgc gactccgttc ctagctgccg ctgcggtcac tggtggaacc 780
atcaagatta atcactggcc aatcaaaact actcagcctg gcgatgctat tcgttcgatt 840
cttgagcgca tgggctgcga agttgagctg gttgctcagg gtgaaggtta cgatctgtcg 900
gtgactggtc cggttgctct caagggcatt gagatcgata tgtccgatat cggtgagttg 960
acccctaccg tggcggcgtt ggctgcgttg gcgtcgacag agtctcgttt gaccggtatt 1020
gctcatcttc gtggccatga gacggatcgt ttggctgcgt tgactgcgga gatcaacaaa 1080
cttggtggaa agtgcactga gcttaaggat ggtctgttga ttgagcctgc gtcgctgcac 1140
ggtggtgtgt ggcattcata tgctgatcat cgtatggcta ctgctggtgc gatcattggc 1200
ctcgcggttg atgacgttca ggttgaagac attaagacca cttccaagac tttccctggt 1260
tttgaaaatg tttgggagga gatggttggc tag 1293
<210> 156
<211> 1233
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 156
atgctaggca tgcttcgatg gactacagca ggtgaatccc acggccaggc gcttatcgcc 60
acggttgaac acatgccagc aggcgtgccc gtgactaaag atgaggtctc gtatcaattg 120
gcgcgccgac gccttggata tggtcgcggc gctcgcatga agtttgagca agacgcgttg 180
accttcctga ccggcatccg ccacggcctc actttgggta gccccatctc aatcatgatc 240
ggcaacactg agtgggataa gtggaccacc atcatgtcct ctgacgcttt ggacatggaa 300
gacccagaca acgttgcggc gatgtcttcg ggtcgcggtg caaaactgac tcgtccgcgt 360
ccaggccacg cagattacgc aggcatgctc aagtacggat tcgatgatgc ccgcaacgtg 420
ctggagcgtt cttcagcccg tgagacggca gctcgcgtgg cagcagcaac cgttgcgcgt 480
tccttcctcc gtgaaacctt gggcgtggag gtgctctctc acgtaatttc cattggtgcg 540
tccgagcctt acgtcggcgc ggagccaacc tttgcagata ttcaagcaat cgatgattcc 600
ccagttcgtg cattcggtaa agacgctgaa aaatccatga tcgcggaaat cgaggccgca 660
aagaaagccg gcgataccct cggtggcatc gtggaagtga ttgttgaagg cctacccatc 720
ggtttgggct cacacatttc tggcgaagat cgcctcgatg cgcagatcgc agctgcactc 780
atgggcattc aggccatcaa gggcgtggaa atcggtgacg gtttcgaaga agctcgtcga 840
cgtggctccg aagcccacga tgaagtgttc ctggatgaca acggcgtata ccgcaacacc 900
aaccgtgcag gtggcctcga aggcggcatg accaacggtg aaaccctgcg cgttcgtgct 960
ggcatgaagc caatttctac tgtgcctcgc gccctgaaaa ccattgatat ggaaaacggc 1020
aaggcagcaa ccggaatcca ccagcgttcc gacgtgtgcg ctgttccagc cgccggtgtc 1080
gttgcagaag caatggtcac cctggttctc gcccgcgcag tcctgcagaa attcggcggt 1140
gactccctga gtgaaaccaa gagcaacatt gacacctacc tcaaaaacat tgaggaacga 1200
atgaaattcg aaggtttaga ggatggagcg taa 1233
<210> 157
<211> 1476
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 157
atggctagta ccttcattca ggccgacagc cctgaaaaaa gtaagaagct acccccactc 60
acagaaggtc cgtatagaaa gcggctgttc tacgttgcac tagttgcgac gtttggtggg 120
ctgctcttcg gatatgacac cggagtaatc aacggtgcac tcaacccaat gacacgtgag 180
ctcggactaa ccgcgttcac cgagggtgtt gtaacttctt ccctgctgtt tggtgcagca 240
gctggtgcga tgtttttcgg tcgcatttcc gacaactggg gtcgccggaa aacaatcatc 300
tcacttgcag tagctttctt tgtcggcacc atgatctgcg tgtttgctcc atcttttgca 360
gtaatggttg tcggacgtgt gcttcttgga ctcgcagttg gtggcgcttc cactgttgtc 420
cctgtctacc tggctgaact tgctcctttt gaaatccgtg gctcactggc tggccgtaat 480
gagttgatga ttgttgttgg tcagctcgca gctttcgtca tcaatgcgat tattggaaat 540
gtttttggac accacgatgg tgtgtggcgc tacatgctgg caattgccgc aatcccagca 600
attgccctct tctttggaat gctccgagtt ccagaatccc cacgctggct tgttgagcga 660
ggacgcattg atgaggctcg cgcagttctt gaaaccattc gccctctaga acgtgcccat 720
gcagaagttg ctgatgttga gcacctagca aaagaagagc acgccatttc cgagaagtcc 780
atgggcttaa gggaaatttt gtccagcaag tggcttgtgc gcatcctcct ggtaggtatc 840
ggattgggtg tcgcacagca gctgactggc atcaactcca tcatgtacta cggccaggtt 900
gttctcattg aggctggttt ctccgaaaat gcagctctga tcgccaacgt ggcgccagga 960
gtgatcgcag ttgtcggtgc atttatcgca ctgtggatga tggatcgcat caaccgccgt 1020
accaccctca ttaccggcta ctctctcact accattagcc acgtgttgat cggcatcgca 1080
tccgtagcat tctcagtcgg cgatccactt cgcccatacg ttattttgac cctagttgtg 1140
atcttcgtag gatccatgca gaccttcctc aacgtagcca cctgggtcat gctctccgag 1200
ctcttcccgc tggcaatgcg aggtttcgca atcggtatct cagtgttctt cctctggatc 1260
gcaaacgcgt tcctcggatt gttcttcccc accatcatgg aagcagtagg actaaccgga 1320
accttcttca tgttcgccgg aatcggtgtg gttgccttga tcttcatcta cacccaggtt 1380
cctgaaactc gtggacgtac cttggaggag attgatgagg atgttacttc cggtgtcatt 1440
ttcaacaagg acatccgaaa aggaaaggtg cactaa 1476
<210> 158
<211> 972
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 158
atgccacaaa aaccggccag tttcgcggtg ggctttgaca tcggcggcac caacatgcga 60
gctgggcttg tcgacgaatc cgggcgcatc gtgaccagtt tgtcggcgcc gtcgccgcgc 120
acgacgcagg caatggaaca ggggattttt gatctagtcg aacagctcaa ggccgaatac 180
ccggttggtg ctgtgggact tgccgtcgcg ggatttttgg atcctgagtg cgaggttgtt 240
cgatttgccc cgcaccttcc ttggcgcgat gagccagtgc gtgaaaagtt ggaaaacctt 300
ttgggcctgc ctgttcgttt ggaacatgat gccaactcag cagcgtgggg tgagcatcgt 360
tttggtgcag ctcaaggcgc tgacaactgg gttttgttgg cactcggcac tggaattggt 420
gcagcgctga ttgaaaaagg cgaaatttac cgtggtgcat atggcacggc accagaattt 480
ggtcatttgc gtgttgttcg tggcggacgc gcatgtgcgt gtggcaaaga aggctgcctg 540
gagcgttact gttccggtac tgccttggtt tacactgcgc gtgaattggc ttcgcatggc 600
tcattccgca acagcgggct gtttgacaag atcaaagccg atccgaattc catcaatgga 660
aaaacgatca ctgcggcagc gcgccaagaa gacccacttg ctctcgccgt tctggaagat 720
ttcagcgagt ggctgggcga aactttggcg atcattgctg atgtccttga cccaggtatg 780
atcatcattg gtggcggact gtccaatgct gccgaccttt atttggatcg ctcggttaac 840
cactattcca cccgcatcgt cggcgcagga tatcgccctt tggcacgcgt tgccacagct 900
cagttgggtg cggatgctgg catgatcggt gtcgctgatc tggctcgacg ttccgtgttg 960
gaagccaact ag 972
<210> 159
<211> 912
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 159
atgactgatc ccacttgcac ccttgccctt gatattggtg ccacaaagat tgcctacgca 60
ctagtccccg ataacgcccc gacgacaaca ttgtccacgg gacgcttggg aacaaaagaa 120
ggcgacagcc ctatcgagca gatccggctg gttcttctgg caggcttaaa agctgccgag 180
gaacacggtc tcagtgtcgc ccgcatcggc atgggcgctc ctggtgtaat tctgggacca 240
gagggaacca tcgtgtacaa cggtgaaacc ctcacagagt gggcaggcac tgacctgcga 300
ggattatccc gagaagtcct caacgttcca ttcgcggcac acaatgatgt ccgcgtatgg 360
gcctacggtg agcaccactt aggcaccggc aaagacctca ccggcagggt tctctacgtg 420
tccctcggca ctggagtcgg cggagcaatc atcgaagacg gaatcatgat gagtagcccc 480
actggaactg cgggagaatt cgcagaagtt gtgtgctctg accatgcagg attagccgtt 540
cggtgcgaaa atgtagcaag tggcaccggc ctaaccaggt actacaacga ggccgccgca 600
actcaacttg accttcccgc catcatggag cgcttccacc aaggtgacgg cctggcacag 660
caaatcatta ctggaaatct ccgaggcttt ggccaagcgc taggcgcatt agtcacagtg 720
ctggaccttt ccgcagtagt agttggaggc ggagtcgcag gcatcggcgc acccgtcatg 780
gatcccatca ccgcagggat tttcgatcga atgttagccc ccaacaaatc cgtacaagtt 840
ttaagcacgt cccttggtgc ccaagcagcc gtcatcgcag cagcaaaata tgcccgcgat 900
aacgcctttt aa 912
<210> 160
<211> 1233
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 160
gtggcgcgcg gcggtgtaca gcaccccggt gaccacattg atcacagcac ctgctacgac 60
ctcgccgtcg atcgccgcag cgatcgagac ggcgtattgg ggcaggccat aaaggaagtt 120
gacggtgccg tcaatggggt cgacgatcca ggtaactccg cttatcgacg ccgtccccgt 180
cccttcctcg cctatcagcc cgtctttagg ccgaagttcc tgcaacctat tggcgataaa 240
atcttcagcc aaagtatcta ctatcgtcac cggatcgact gtcgaacttt tggtgttggt 300
gtagtcccac aaattggtga gttcagcacg tttatccctg atacgtgtag cggtaagcgt 360
ggcagtttcc gcggcgatgg cacgcaactc attaaacgat tgttgttcca taagaccatc 420
atcgttgttt ttttagaaaa ttgcctgcca aaagccgaag taatttgtac acttgggcgc 480
atgactgaga ctggatttgg aattgatatc ggtggctccg gcatcaaagg cgcccgcgtt 540
aaccttaaga ccggtgagtt tattgatgaa cgcataaaaa tcgccacccc taagccagca 600
accccagagg ctgtcgccga agtagtcgca gagattattt ctcaagccga atgggagggt 660
ccggtcggaa ttaccctgcc gtctgtcgtt cgcgggcaga tcgcgctatc cgcagccaac 720
attgacaagt cctggatcgg caccgatgtg cacgaacttt ttgaccgcca cctaaatggc 780
cgagagatca ccgttctcaa tgacgcagac gccgccggca tcgccgaagc aacctttggc 840
aacgctgccg cacgcgaagg cgcagtcatc ctgctgaccc ttggtacagg tattggatcc 900
gcattccttg tggatggcca actgttcccc aacacagaac tcggtcacat gatcgttgac 960
ggcgaggaag cagaacacct tgcagcagca gccgtcaaag aaaacgaaga tctgtcatgg 1020
aagaaatggg cgaagcgcct gaacaaggtg ctgagcgaat acgagaaact tttctcccca 1080
tccgtcttca tcatcggtgg cggaatttcc agaaagcacg aaaagtggct tccattgctg 1140
gagctagaca ctgacattgt cccagctgag ctgcgcaatc gagccggaat cgtaggagct 1200
gccatggcag taaaccaaca cctcacccca taa 1233
<210> 161
<211> 1005
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 161
atgaccattc gtgttggtat taacggattt ggccgtatcg gacgtaactt cttccgcgca 60
gttctggagc gcagcgacga tctcgaggta gttgcagtca acgacctcac cgacaacaag 120
accctttcca cccttctcaa gttcgactcc atcatgggcc gccttggcca ggaagttgaa 180
tacgacgatg actccatcac cgttggtggc aagcgcatcg ctgtttacgc agagcgcgat 240
ccaaagaacc tggactgggc tgcacacaac gttgacatcg tgatcgagtc caccggcttc 300
ttcaccgatg caaacgcggc taaggctcac atcgaagcag gtgccaagaa ggtcatcatc 360
tccgcaccag caagcaacga agacgcaacc ttcgtttacg gtgtgaacca cgagtcctac 420
gatcctgaga accacaacgt gatctccggc gcatcttgca ccaccaactg cctcgcacca 480
atggcaaagg tcctgaacga caagttcggc atcgagaacg gcctcatgac caccgttcac 540
gcatacaccg gcgaccagcg cctgcacgat gcacctcacg gcgacctgcg tcgtgcacgt 600
gcagcagcag tcaacatcgt tcctacctcc accggtgcag ctaaggctgt tgctctggtt 660
ctcccagagc tcaagggcaa gcttgacggc tacgcacttc gcgttccagt tatcaccggt 720
tccgcaaccg acctgacctt caacaccaag tctgaggtca ccgttgagtc catcaacgct 780
gcaatcaagg aagctgcagt cggcgagttc ggcgagaccc tggcttactc cgaagagcca 840
ctggtttcca ccgacatcgt ccacgattcc cacggctcca tcttcgacgc tggcctgacc 900
aaggtctccg gcaacaccgt caaggttgtt tcctggtacg acaacgagtg gggctacacc 960
tgccagctcc tgcgtctgac cgagctcgta gcttccaagc tctaa 1005
<210> 162
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 162
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

Claims (20)

1.一种棒状型细菌转化体，其被实施了下述(A)、(B)、(C)及(D)的操作，所述棒状型细菌转化体具有原儿茶酸生产能力，且其中分支酸的生成未被抑制，
(A)3-脱氢莽草酸脱水酶活性的强化；
(B)分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化；
(C)4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化；
(D)使原儿茶酸3,4-双加氧酶基因活性消失或减少。
2.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
3-脱氢莽草酸脱水酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因而实现的，
所述基因源自属于棒状杆菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、红假单胞菌属、交替单胞菌属、海杆菌属、甲基杆菌属、泛菌属、脉孢菌属或曲霉属的微生物。
3.根据权利要求2所述的棒状型细菌转化体，其中，
编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、乳酪棒杆菌(Corynebacterium casei)、Corynebacterium efficiens、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的基因。
4.根据权利要求2所述的棒状型细菌转化体，其中，
编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的酶的基因由下述的(a)的DNA编码：
(a)由序列号7、134、135、145、147或149的碱基序列构成的DNA。
5.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的酶的基因而实现的，
所述基因源自普罗威登斯菌属细菌或克洛诺菌属细菌。
6.根据权利要求5所述的棒状型细菌转化体，其中，
分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有分支酸丙酮酸裂解酶活性的酶的基因而实现的，
所述基因源自拉氏普罗威登斯菌(Providencia rustigianii)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)或阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
7.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
分支酸丙酮酸裂解酶活性的强化是通过向宿主导入下述(c)的DNA而实现的：
(c)由序列号9、128或129的碱基序列构成的DNA。
8.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化是通过向宿主导入编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因而实现的。
9.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
4-羟基苯甲酸羟化酶活性的强化是通过向宿主导入下述(e)的DNA而实现的：
(e)由序列号8的碱基序列构成的DNA。
10.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
选自由3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸(EPSP)合酶和分支酸合酶构成的酶组中的至少一个酶活性被强化。
11.根据权利要求10所述的棒状型细菌转化体，其中，
DAHP合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(g)的DNA而实现的，3-脱氢奎尼酸合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(i)的DNA而实现的，3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的强化是通过向宿主导入下述(k)的DNA而实现的，莽草酸脱氢酶活性的强化是通过向宿主导入下述(m)的DNA而实现的，莽草酸激酶活性的强化是通过向宿主导入下述(o)的DNA而实现的，EPSP合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(q)的DNA而实现的，分支酸合酶活性的强化是通过向宿主导入下述(s)的DNA而实现的，
(g)由序列号2的碱基序列构成的DNA；
(i)由序列号153的碱基序列构成的DNA；
(k)由序列号5的碱基序列构成的DNA；
(m)由序列号6的碱基序列构成的DNA；
(o)由序列号154的碱基序列构成的DNA；
(q)由序列号155的碱基序列构成的DNA；
(s)由序列号156的碱基序列构成的DNA。
12.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其中，
选自由转酮醇酶活性及转醛醇酶活性构成的组中的至少一个活性被强化。
13.根据权利要求12所述的棒状型细菌转化体，其中，
转酮醇酶活性的强化是通过导入下述(u)的DNA实现的，转醛醇酶活性的强化是通过导入下述(w)的DNA实现的，
(u)由序列号151的碱基序列构成的DNA；
(w)由序列号152的碱基序列构成的DNA。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的棒状型细菌转化体，其具有同时利用选自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及纤维二糖构成的组中的至少1种糖的能力。
15.根据权利要求14所述的棒状型细菌转化体，其中，
作为宿主的棒状型细菌为棒状杆菌属细菌。
16.根据权利要求15所述的棒状型细菌转化体，其中，
作为宿主的棒状杆菌属细菌是谷氨酸棒状杆菌。
17.根据权利要求16所述的棒状型细菌转化体，其中，
作为宿主的谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌R、ATCC13032或ATCC13869，其中谷氨酸棒状杆菌R株的保藏号为FERM BP-18976。
18.根据权利要求1所述的棒状型细菌转化体，其为谷氨酸棒状杆菌PCA4，其保藏号为NITE BP-02217。
19.一种原儿茶酸或其盐的制造方法，其包含将权利要求1～18中任一项所述的棒状型细菌转化体在含有糖类的反应液中进行培养而生产原儿茶酸或其盐的工序。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，
在需氧且转化体不增殖的条件下培养所述棒状型细菌转化体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112074599A (zh) * 2018-05-01 2020-12-11 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 棒状细菌的转化体和使用其的有用化合物的制造方法
JPWO2020040017A1 (ja) * 2018-08-23 2021-08-10 住友ベークライト株式会社 医薬品、抗がん剤、医薬中間体および環式カルボン酸化合物またはその誘導体の製造方法
US20220025412A1 (en) * 2018-12-20 2022-01-27 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Coryneform Bacterium Transformant and Method for Producing 2-Phenylethanol Using Same
JP7217294B2 (ja) * 2018-12-20 2023-02-02 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 カルボニル化合物の製造法
CN110184288A (zh) * 2019-05-28 2019-08-30 南京趣酶生物科技有限公司 没食子酸和原儿茶酸的制备方法及其反应催化剂的制备方法
US20220411831A1 (en) * 2019-11-08 2022-12-29 Kao Corporation Polypeptide Having 4-Aminobenzoic Acid Hydroxylation Activity and Use Thereof
CN114761025B (zh) * 2019-12-02 2024-03-12 施明哲 PDIA4抑制剂及其用于抑制β细胞病变及治疗糖尿病的用途
JP2021185830A (ja) * 2020-05-29 2021-12-13 花王株式会社 没食子酸合成酵素
JP2021185831A (ja) * 2020-05-29 2021-12-13 花王株式会社 没食子酸生産能を有する形質転換体
CN111471630B (zh) * 2020-06-11 2021-11-02 鲁东大学 一株棒杆菌Ytld-phe09及其应用
DE102021000394A1 (de) 2021-01-27 2022-07-28 Forschungszentrum Jülich GmbH Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoat aus D-Xylose mit coryneformen Bakterien
CN113981014A (zh) * 2021-08-30 2022-01-28 黄山科宏生物香料股份有限公司 生产原儿茶酸的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103987840A (zh) * 2011-08-08 2014-08-13 国际香料香精公司 用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法
CN104379729A (zh) * 2012-07-03 2015-02-25 株式会社吉那里斯 有用微生物和目标物质的制备方法
WO2015156271A1 (ja) * 2014-04-08 2015-10-15 グリーンフェノール開発株式会社 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
EP2957635A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Rhodia Opérations Improved selectivity of the production of vanilloids in a recombinant unicellular host
WO2016027870A1 (ja) * 2014-08-21 2016-02-25 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法
WO2016036915A1 (en) * 2014-09-03 2016-03-10 Coffa Gianguido Genetically modified microbes for the biological conversion of carbonaceous materials to protocatechuic acid

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS5867699A (ja) 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
JPS62166890A (ja) 1986-01-20 1987-07-23 Asahi Chem Ind Co Ltd イソクエン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
US5272073A (en) 1992-06-30 1993-12-21 Purdue Research Foundation Biocatalytic synthesis of catechol from glucose
US5629181A (en) 1993-09-16 1997-05-13 Purdue Research Foundation Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
US6472190B1 (en) 2000-03-16 2002-10-29 Board Of Trustees Operating Michigan State Univerisity Biocatalytic synthesis of galloid organics
WO2005010182A1 (ja) 2003-07-29 2005-02-03 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法
JP3860189B2 (ja) 2004-10-27 2006-12-20 株式会社興人 非結晶性ポリエステル樹脂の製造方法
JP5140848B2 (ja) * 2007-09-10 2013-02-13 株式会社ジナリス 没食子酸の製造法
JP2009082064A (ja) * 2007-09-28 2009-04-23 Toyota Industries Corp 組換えプラスミド、形質転換体及び２ｈ−ピラン−２−オン−４，６−ジカルボン酸の製造法
JP2010207094A (ja) 2009-03-06 2010-09-24 Genaris Inc プロトカテク酸の製造法
JP5932649B2 (ja) 2010-09-08 2016-06-08 グリーンフェノール開発株式会社 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
BR112013023848A2 (pt) 2011-03-18 2018-07-03 Mitsubishi Chem Corp método para produzir polímero, método para produzir ácido orgânico, e microrganismo produtor de ácido orgânico.
TW201546275A (zh) * 2014-02-20 2015-12-16 拜耳材料科學股份有限公司 生產鄰－胺基苯甲酸鹽之重組菌株及來自經由２－胺基苯甲酸之再生資源發酵生產苯胺
CN106459958B (zh) 2014-05-14 2020-08-04 绿色化学品株式会社 使高活性突变型酶高表达的棒状细菌转化体及使用它的4-羟基苯甲酸或其盐的制造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103987840A (zh) * 2011-08-08 2014-08-13 国际香料香精公司 用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法
CN104379729A (zh) * 2012-07-03 2015-02-25 株式会社吉那里斯 有用微生物和目标物质的制备方法
WO2015156271A1 (ja) * 2014-04-08 2015-10-15 グリーンフェノール開発株式会社 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
EP2957635A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Rhodia Opérations Improved selectivity of the production of vanilloids in a recombinant unicellular host
WO2016027870A1 (ja) * 2014-08-21 2016-02-25 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法
WO2016036915A1 (en) * 2014-09-03 2016-03-10 Coffa Gianguido Genetically modified microbes for the biological conversion of carbonaceous materials to protocatechuic acid

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production of protocatechuic acid by Corynebacterium glutamicum expressing chorismate-pyruvate lyase from Escherichia coli;Naoko Okai等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20150921;第100卷(第1期);摘要，第138页右栏最后1段，图6及图示 *
Regulation of Expression of Genes Involved in Quinate and Shikimate Utilization in Corynebacterium glutamicum;Haruhiko Teramoto等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20090630;第75卷(第11期);全文 *

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