JP5243748B2 - ブタノール生産能を有する形質転換体 - Google Patents
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Description
微生物によってブタノールが生成される現象は、1861年にパスツールによって初めて報告されたが、20世紀初頭、ハイム・ワイツマンが単離したClostridium acetobutylicumを用いて本格的な工業生産化が始まった。本微生物は、糖やデンプンを原料として、ブタノール:アセトン:エタノールを6:3:1の割合で生成する。この性質を利用したのが、“アセトン・ブタノール・エタノール発酵(以下「ABE発酵」と記す。)”であり、現在のバイオプロセスによるブタノール生産も基本は変わっていない。このABE発酵が大規模実利用されたのは、第一次世界大戦勃発時にも遡る。イギリスでは火薬原料に用いるためのアセトン需要が増加したが、Clostridium acetobutylicumを用いたABE発酵によって年間約3万トンが供給された。その後1917年には米国も参戦し、イギリスと同様、米国でも中西部コーンベルト地域にてABE発酵が行われ、生産されたアセトンが無煙火薬原料などに利用された。当時、ABE発酵にてアセトンと同時に得られるブタノールは、単なる副生成物であったが、その後、1920年以降の自動車産業の急速な成長によって、速乾塗料の材料として需要が拡大した。さらに、1936年にワイツマンのClostridium acetobutylicumによるABE発酵の特許切れを皮切りに、日本、インド、オーストラリア、南アフリカなどの世界各国にてABE発酵によるアセトン及びブタノールの生産が開始された。各国にて第二次世界大戦時頃まで生産が続けられたが、1950年代から1960年代にかけての石油化学工業の発達による安価な生産が可能となったことと、原料である糖蜜の動物飼料への利用増加を原因としてABE発酵法は衰退した。しかし近年、世界各国でのバイオ燃料生産利用の高まりの中で、ABE発酵を利用したバイオ燃料としてのブタノール生産研究開発が再び注目されている。
(1) Clostridium属細菌は、増殖、及びブタノールの生産において絶対嫌気性条件を必要とする。従って、嫌気条件下での培養、すなわち、培養装置内を窒素ガスなどの不活性ガスで置換するなどの煩雑な培養操作が必要である。また、増殖速度が極端に遅いために、増殖に伴うブタノール生産の速度が低い。これらの問題点を解決するには、高増殖速度の好気性微生物の利用が考えられるが、ブタノールを高効率に生産する好気条件下で増殖可能な微生物(好気性細菌または通気嫌気性細菌)は報告されていない。
(2) ABE発酵では、細胞増殖期において酢酸、酪酸が生成され、細胞増殖が停止した定常期にpHの酸性化が溶媒(アセトン、ブタノール)生成期への移行の引き金となり代謝系が大幅に変化して(以下、この現象を「代謝シフト」と記す)、アセトン、ブタノールが生成される。
(3) ABE発酵菌に最も用いられているClostridium acetobutylicumにおいて、親株より生育が早くABE発酵能を消失した変異株(退化株)が継代培養中に増大し、主要菌株となる。これはABE発酵に関わる遺伝子群が巨大プラスミドpSOL1上に存在し、このプラスミドが脱落することによりABE発酵機能が欠失することに要因する。これがABE発酵の不安定要因の一つとなっている。
Clostridium属細菌を用いたブタノール生産技術としては、以下のような技術が知られている。例えば、特許文献1は、胞子形成に関わる遺伝子を制御することにより、胞子形成期を遅らせ、結果としてブタノール生産を向上させる技術を開示している。また、特許文献2及び非特許文献1は、連続発酵法において、gas-stripping法により、連続的にブタノールを抽出する技術を開示している。また、非特許文献2および非特許文献3は、Clostridium属細菌を固定化してブタノールを生産する技術を開示している。また、非特許文献4は、連続発酵法においてClostridium属細菌の高濃度菌体を用い、菌体をリサイクルする技術を開示している。しかし、これらは、何れもClostridium属細菌を用いる嫌気条件下でのブタノール生産技術であり、上記の(1)〜(3)の課題を解決するものではない。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の微生物及びブタノールの製造方法を提供する。
(a)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(b)β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(c)3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(e)ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(f)ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
項2. (a)〜(f)の遺伝子が、クロストリジウム属細菌由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。
項3. (a) アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号1の塩基配列からなるDNA、又は配列番号1とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用い;
(b) β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、(c) 3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子、及び(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子として、配列番号2の塩基配列からなるDNA、又は配列番号2とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性、 3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性、及びブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用い;
(e)ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子、及び(f)ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子として、配列番号3の塩基配列からなるDNA、又は配列番号3とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、及びブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いる項1又は2に記載の形質転換体。
項4. さらに、以下の(g)及び(h)の遺伝子が導入された、項1〜3の何れかに記載の形質転換体。
(g) エレクトロントランスファーフラボプロテインαサブユニット遺伝子
(h) エレクトロントランスファーフラボプロテインβサブユニット遺伝子
項5. (a)アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子としてラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)由来のPhaA遺伝子を用い、(b)β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子としてラルストニア ユートロファ由来のPhaB遺伝子を用いる、項1に記載の形質転換体。
項6. (d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子として、ストレプトミセス アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトミセス コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス コリナス(Streptomyces collinus)、又はストレプトミセス シナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)由来のccr遺伝子を用いる項1に記載の形質転換体。
項7. 好気性細菌または通性嫌気性細菌が、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)又はコリネ型細菌である項1〜6の何れかに記載の形質転換体。
項8. 形質転換体がエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1(受託番号 FERM P-21323)である項1に記載の形質転換体。
項9. 項1〜8の何れかに記載の形質転換体を、糖類を含有する培地中で培養する工程と、培養物からブタノールを回収する工程とを含むブタノールの製造方法。
本形質転換体は、好気条件下で増殖可能な微生物(好気性細菌または通気嫌気性細菌)であることから、増殖速度が速く、その分、ブタノール生産速度が高くなる。このため、ブタノール生産プロセス設計及び運転が容易である。
本発明により、再生可能資源を原料とした効率的なブタノール生産が可能となり、工業生産における合理的プロセスを実現することが出来る。
(I)ブタノール生産能を有する形質転換体
本発明のブタノール生産能を有する形質転換体は、以下の(a)〜(f)の遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入した形質転換体である。
(a)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(b)β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(c)3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(e)ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(f)ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
本発明において形質転換の対象となる宿主は、ブタノール生産関連遺伝子群を含む組換えベクターにより形質転換され、これらの遺伝子がコードするブタノール生産に関与する酵素が発現し、結果としてブタノールを生産することができる好気性細菌または通性嫌気性細菌であれば特に限定されない。宿主としては、大腸菌、コリネ型細菌、ストレプトコッカス(Streptococcus)属細菌、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属細菌、エンテロコッカス(Enterococcus)属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌(例えば、枯草菌等)、ストレプトミセス(Streptomyces)属細菌などの細菌;アスペルギルス属菌などの真菌細胞;酵母、メタノール資化性酵母などの酵母細胞などが挙げられる。あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられる。
好ましくは大腸菌とコリネ型細菌である。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599(1974)〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌またはマイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、ブレビバクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)もしくはMJ-233AB-41(FERM BP-1498)、またはブレビバクテリウム アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6872等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス(Mycobacterium bovis)ATCC19210またはATCC27289等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ(Micrococcus freudenreichii)NO. 239(FERM P-13221)、マイクロコッカス ルテウス(Micrococcus leuteus)NO. 240(FERM P-13222)または、マイクロコッカス ウレアエ(Micrococcus ureae)IAM1010またはマイクロコッカス ロゼウス(Micrococcus roseus)IFO3764等が挙げられる。
上記(a)〜(f)のブタノール生産関連遺伝子としては、これらの遺伝子を含むDNA断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したDNA断片を使用することが出来る。DNA配列が不明の場合であっても、ブタノール生産関連酵素タンパク質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション法、PCR法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のブタノール生産関連遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートPCRによって断片を取得することが可能である。
上記(a)〜(f)のブタノール生産関連遺伝子はブタノール生産活性が保持されている限り、天然の塩基配列の一部が他の塩基(ヌクレオチド)と置換されていてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基(ヌクレオチド)が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これらの遺伝子誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で1乃至数個(1〜5個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)であってよい。
上記(a)〜(h)の遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は限定されない。
(b) β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、(c) 3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子、及び(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来遺伝子として、これらを含む配列番号2の塩基配列からなるDNA、又は配列番号2とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性、 3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性、及びブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用い;
配列番号1〜3の塩基配列のDNAは、クロストリジウム アセトブチリカムに由来する遺伝子であり、配列番号1はthiL遺伝子の塩基配列であり、配列番号2は、crt遺伝子、bcd遺伝子、及びhbd遺伝子を含むDNAの塩基配列であり、配列番号3はadhe1遺伝子の塩基配列である。クロストリジウム アセトブチリカムにおいて、etfB遺伝子及びetfA遺伝子は、crt-bcd-etfA-etfB-hbd遺伝子群として存在するため、配列番号2のDNAには、crt-bcd-etfA-etfB-hbd遺伝子群が含まれる。
種々の生物由来のTHL、HBD、CRT、BCD、ETFA、ETFB、BYDH、BDHをコードする外来性の遺伝子の配列をPCR(polymerase chain reaction)法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーとしては以下のものが挙げられる。このようなプライマーとしては、THLをコードする遺伝子を増幅するための配列番号4、5の各塩基配列で表されるプライマー;HBD、CRT、BCD、ETFA、及びETFBをコードする各遺伝子群を増幅するための、配列番号6、7の各塩基配列で表されるプライマー;BYDH、及びBDHをコードする各遺伝子群を増幅するための、配列番号8、9の各塩基配列で表されるプライマーなどが挙げられる。
PCR法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T easy vector system(Promega社製)、TOPO TA-cloning system(Invitrogen社製)、Mighty Cloning Kit(Takara社製)などの商業的に入手可能なPCRクローニングシステムなどを使用することもできる。また、方法の1つの例を実施例で詳記するが、該領域を含むDNA断片を、既知のTHL、HBD、CRT、BCD、ETFA、ETFB、BYDH、BDHをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて適切に設計された合成プライマーを鋳型として用いたハイブリダイゼーション法により取得することもできる。
次いで、PCR法で得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を、ベクター中のマーカー遺伝子に対応した適当な抗生物質(例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど)を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドDNAを抽出する。プラスミドDNAの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイックプラスミド精製キット(商品名:Qiaquick plasmid purification kit、キアゲン社製)などが挙げられる。この抽出されたプラスミドDNAの塩基配列を決定することにより、THL、HBD、CRT、BCD、ETFA、ETFB、BYDH、BDHをコードする遺伝子配列を確認することができる。DNAの塩基配列の決定は、公知の方法、例えばジオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、DNAシーケンサー、例えばABI PRISM 3730xl DNA Analyzer(アプライドバイオシステム社製)などを使用して決定することもできる。
広範囲の種類のプロモーターが本発明に使用するのに適している。そのようなプロモーターは、酵母、細菌及び他の細胞供給源を含む多くの公知の供給源から得られ、好気性細菌または通性嫌気性細菌において目的遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。例えば、大腸菌及びコリネ型細菌においてはlac、trc、tacプロモーター等を用いることができる。本発明に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節機構を変更することができる。また、目的遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、好気性細菌または通性嫌気性細菌においてその遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。
目的遺伝子を含むプラスミドベクターの好気性細菌または通性嫌気性細菌への導入方法としては、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。具体的には、例えば大腸菌の場合、塩化カルシウム法や電気穿孔法〔例えば、Sambrook, J. & Russel, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition)CSHL Press(2001)、またはAusubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)等〕などやエシェリヒア・コリ JM109のコンピテントセル(宝酒造株式会社製)を同社プロトコールに従い行うことができ、コリネ型細菌の場合、電気パルス法を、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 (1993)〕により行うことができる。
上記方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入法及び発現法は、多くの実験書に記載されているので(例えば、Sambrook、J.、Russel、D.W.、Molecular Cloning A Laboratory Manual、3rd Edition、CSHL Press、2001;HopwoodにD.A.、Bibb、M.J.、Chater、K.F.、Bruton、C.J.、Kieser、H.M.、Lydiate、D.J.、Smith、C.P.、Ward、J.M.、Schrempf、 H.Genetic manipulation of Streptomyces:A laboratory manual、The John lnnes institute、Norwich、UK、1985等)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
さらに、上述したのと同様の方法により、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属菌においてもブタノール生産能を有する形質転換体の創製が可能である。
また、形質転換体は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の目的とするブタノール生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質又は糖アルコール、酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。これら炭素源の培地における濃度は通常約0.1〜10%(wt)程度である。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約0.01〜1.0%(wt)程度である。
培地のpHは約5〜8が好ましい。
好ましい微生物培養培地としては、大腸菌用培地としては、LB(Luria−Bertani)培地、NZYM培地、TB(Terrific Broth)培地、SOB培地、2×YT培地、M9培地等が、コリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
ついで、形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。
回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
上記の如くして得られる培養物から回収分離された形質転換体の培養菌体またはその菌体処理物は、好気条件下または嫌気条件下の反応培地でのブタノール生成反応に供せられる。ブタノール生成方式は、回分式、流加式、連続式いずれの生成方式も可能である。
反応液には、ブタノールの原料となる有機炭素源(例えば、糖類等)が含まれていればよい。有機炭素源としては、本発明の形質転換体が生化学反応に利用できる物質であればよい。具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖もしくはラクトース、マルトースなどの二糖類、またはデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。特に、単糖類、及び二糖類が好ましく、単糖類がより好ましく、中でもグルコースがさらにより好ましい。なお、本発明においては、2種以上の糖の混合糖を用いることもできる。
培地のpHは、約6〜8が好ましい。
形質転換体またはその菌体処理物と糖類との反応は、本発明の形質転換体またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行なわれることが好ましく、形質転換体またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。通常、約25〜35℃とすればよい。
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1)クロストリジウム アセトブチリカム由来のブタノール生産遺伝子群のクローニング
クロストリジウム アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)ATCC824におけるブタノール生産遺伝子(アセチル-CoAからブタノールまでの代謝経路に関わる遺伝子)は、以下のような遺伝子群により構成されている。
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(別名チオーラゼ)遺伝子(thiL遺伝子)は、プラスミドpSOL1上にコードされている 〔Nolling, J. et al., Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 183:4823-4838〕。
一方、ブチリルアルデヒド デヒドロゲナーゼ及びブタノール デヒドロゲナーゼは、一つの酵素が両触媒活性を有するbifunctional 酵素であり、プラスミドpSOL1上のadhe1遺伝子によりコードされている 〔Nolling, J. et al., Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 183:4823-4838〕。
PCRに際して、thiL遺伝子、crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群、adhe1遺伝子をそれぞれクローン化するべく、クロストリジウム アセトブチリカムの配列(配列番号1; thiL遺伝子)、(配列番号2; crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群)、(配列番号3; adhe1遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-1); 5’- AT CCCGGG GAGGAGTAAAACATGAGAGA -3’(配列番号4)
(b-1); 5’- AT CCCGGG CTCGAG TTAGTCTCTTTCAACTACGA -3’(配列番号5)
尚、プライマー(a-1)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-1)には、SmaI及びXhoI制限酵素部位が付加されている。
crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子増幅用プライマー
(a-2); 5’- AT CCCGGG ATATTTTAGGAGGATTAGTC -3’(配列番号6)
(b-2); 5’- AT CCCGGG AGATCT CCATATTATAATCCCTCCTC-3’(配列番号7)
尚、プライマー(a-2)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-2)には、SmaI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
adhe1遺伝子増幅用プライマー
(a-3); 5’- AT CCCGGG ATATCTATCTCCAAATCTGC-3’(配列番号8)
(b-3); 5’- AT CCCGGG CTCGAG CCAATCATAATTGTCATCCC-3’(配列番号9)
尚、プライマー(a-3)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-3)には、SmaI及びXhoI制限酵素部位が付加されている。
PCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(宝酒造株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
<反応液>
TaKaRa LA TaqTM (5 units/μl) 0.5μl
10X LA PCRTM Buffer II (Mg2+ free) 5μl
25mM MgCl2 5μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 8μl
鋳型DNA 5μl(DNA含有量 1μg以下)
上記記載の2種プライマー 各々0.5μl(最終濃度 1μM)
滅菌蒸留水 25.5μl
<PCR条件>
PCRサイクル:
デナチュレーション過程 :94℃,60秒
アニーリング過程 :52℃,60秒
エクステンション過程 :72℃,thiL遺伝子では60秒、crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群では300秒、adhe1遺伝子では180秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記反応により生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルによる電気泳動に供したところ、thiL遺伝子の場合約1.2kb、crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群の場合約4.8kb、adhe1遺伝子の場合約2.8kbのDNA断片が検出できた。
上記(1)項のPCRにより増幅したクロストリジウム アセトブチリカム株由来thiL遺伝子を含む約1.2kbDNA断片10μl及びtacプロモーターを含有するプラスミドpKK223-3(ファルマシア社製)2μlを各々制限酵素SmaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (宝酒造株式会社製) 1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。
各々倍地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SmaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpKK223-3約4.6kbのDNA断片に加え、thiL遺伝子(ライゲーションA液)の場合、長さ約1.2kbの挿入断片が、crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群(ライゲーションB液)の場合、長さ約4.8kbの挿入断片が、adhe1遺伝子(ライゲーションC液)の場合、長さ約2.8kbの挿入断片が認められた。
thiL遺伝子を含むプラスミドをpTHI、crt-bcd-etfB-etfA-hbd遺伝子群を含むプラスミドをpBCS及びadhe1遺伝子を含むプラスミドをpADHとそれぞれ命名した。
この培地上で白色に呈する生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、大腸菌ベクターpCRB1 約4.1kbのDNA断片に加え、長さ約5.1kbの挿入DNA断片が認められた。
このプラスミドをpCRB1-PtacBCSと命名した。
得られたライゲーションE液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア・コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミド約9.1kbのDNA断片に加え、長さ約3.4kbの挿入DNA断片が認められた。
このプラスミドをpCRB1-PtacBCS-PtacADHと命名した。尚、このプラスミドは、制限酵素部位SalIが1箇所のみ存在する。
得られたライゲーションF液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア・コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1におけるブタノール生産関連酵素、THL、HBD、CRT、BCD、BYDH、BDHの活性を以下の方法により測定した。尚、コントロールとして、エシェリヒア コリJM109も同様の方法にて測定した。
エシェリヒアコリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、50μg/mlを含むLB寒天培地〔1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、および1.5%寒天〕により30℃で静置培養した。これを50μg/mlを含むLB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、および0.5% 塩化ナトリウム〕10mlに植菌し、13時間振盪培養(30℃、200rpm)した。エシェリヒア コリJM109は、LB培地にクロラムフェニコールを添加しないこと以外は同様の条件にて培養した。各培養菌体を遠心分離(4℃、5,000×g、10分)し、培地を取り除いた後、破砕液1(100mMトリス−塩酸緩衝液pH 7.5、2mMジチオスレイトール)により洗浄した。再び遠心分離し、回収した菌体を1mlの破砕液1で懸濁し、ガラスビーズ0.5gを加え、超音波破砕機(Biorupter、コスモバイオ製)により30分間ホモジナイズした。遠心分離(4℃、15,000×g、15分)により不溶性物質を取り除き、酵素液1を得た。タンパク質量はBio-Rad protein assay(Bio-Rad製)により決定した。得られた酵素液を用い、以下に記載の方法でTHL, HBD及びCRTの活性測定を行った。
さらに、反応の前後での基質減少と生成物増加を、高速液体クロマトグラフィー(高速液体クロマトグラフシステム8020、東ソー製)によって確認した。100mMトリス−塩酸緩衝液pH 8.0、10mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイトール、1mMアセトアセチル−CoA、1mM CoAを上記条件で反応させ、反応開始0, 3, 6, 9, 12, 15, 18分後に、各時間の反応液を60%過塩素酸を反応液の1/100量添加することによって反応を停止させた。得られた反応停止液を6N水酸化ナトリウム溶液で中和後、200mMリン酸緩衝液pH5.0で2倍希釈し、限外ろ過(Ultracel YM-30 3,000MWCO、ミリポア製)を行った。得られた溶液をODSカラム(TSK-GEL ODS-100Z、東ソー製)、溶離液1(0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液pH5.0、10%アセトニトリル)、流速1ml/1min、カラム温度30℃、検出UV254nmの条件で、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。この条件下において、各0.2mMのCoA、アセチル−CoA、アセトアセチル−CoAは、それぞれ9.8分、20分、22分に検出された。反応時間とともにCoA、アセトアセチル−CoAが減少し、アセチル−CoAが増加していることが確認された。
この結果、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1のHBD活性は、1.0 U/mg-protein(1Uは1分間に1μmolの基質を消費する酵素量を示す)であった。一方、コントロールであるエシェリヒア コリJM109は、0.047 U/mg-proteinであった。
また反応の前後での基質減少、生成物増加を、高速液体クロマトグラフィーによって確認した。50mM MOPS緩衝液pH 7.0、1mMジチオスレイトール、0.5mMアセトアセチル−CoA、0.5mM NADHを上記条件で反応させ、得られた反応停止液をTHLと同条件で分析した。この条件下において、各0.2mMのアセトアセチル−CoAとβ-ヒドロキシブチリル−CoAは、それぞれ22分と24分に検出された。反応時間とともにアセトアセチル−CoAが減少し、β-ヒドロキシブチリル−CoAが増加していることが確認された。
また反応の前後での基質減少と生成物増加を、高速液体クロマトグラフィーによって確認した。100mM トリス−塩酸緩衝液pH 7.5、0.5mMクロトニル−CoAを上記条件で反応させ、THLと同様の手順で得た反応停止液を、前述のODSカラムにより、溶離液2(0.2M リン酸ナトリウム、アセトニトリル12〜36%のグラジエント溶出(27分))、流速1ml / 1min、カラム温度30℃、検出UV254nmの条件で分析した。この条件下において、各0.2mMのβ-ヒドロキシブチリル−CoAとクロトニル−CoAは、それぞれ13.5分と22.5分に検出された。反応時間とともにクロトニル−CoAが減少し、β-ヒドロキシブチリル−CoAが増加していることが確認された。
エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕により30℃で静置培養した。これを50μg/mlを含むLB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、および0.5% 塩化ナトリウム〕100mlに植菌し、13時間振盪培養(30℃、200rpm)した。エシェリヒア コリJM109は、LB培地にクロラムフェニコールを添加しないこと以外は同様の条件にて培養した。以降の操作は全て95% N2、5% H2で置換されている嫌気チャンバー内で行った。各培養菌体を遠心分離(4℃、5,000×g、10分)し、培地を取り除いた後、破砕液2 (50mM MOPS緩衝液 pH 7.0) により洗浄した。再び遠心分離し回収した菌体を1mlの破砕液2で懸濁し、ガラスビーズ0.5gを加え、1分間のボルテックスミキサーによるホモジナイズと1分間の氷上静置を10回繰り返し、遠心分離(4℃、5,000×g、10分)することで酵素液2を得た。得られた酵素液2を用い、以下に記載の方法でBCDの活性測定を行った。
また反応の前後での基質減少、生成物増加を、高速液体クロマトグラフィーによって確認した。50mM MOPS緩衝液pH 7.0、0.2mMクロトニル−CoA、0.2mM フェリセニウム錯体を上記条件で反応させ、THLと同様の手順で得た反応停止液を、前述のODSカラムにより、溶離液3(0.2M リン酸ナトリウム、アセトニトリル0〜36%のグラジエント溶出(42分))、流速1ml / 1min、カラム温度30℃、検出UV254nmの条件で分析した。この条件下において、各0.2mMのクロトニル−CoAとブチリル−CoAは、それぞれ36.5分と39分に検出された。反応時間とともにクロトニル−CoAが減少し、ブチリル−CoAが形成されていることが確認された。
エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕により30℃で静置培養した。これを50μg/mlを含むLB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、および0.5% 塩化ナトリウム〕100mlに植菌し、13時間振盪培養(30℃、200rpm)した。エシェリヒア コリJM109は、LB培地にクロラムフェニコールを添加しないこと以外は同様の条件にて培養した。以降の操作は全て95% N2、5% H2で置換されている全て嫌気チャンバー内で行った。培養菌体を50mlメディゥム瓶に移し、培養嫌気チャンバー内で開放し3時間攪拌することで培地及び菌体を嫌気置換した。破砕液2で洗浄後、1mlの破砕液2で懸濁し、ガラスビーズ0.5gを加え、1分間のボルテックスミキサーによるホモジナイズと1分間の氷上静置を10回繰り返し、遠心分離(4℃、5000g、10分)することで酵素液3を得た。得られた酵素液3を用い、以下に記載の方法でBYDH、BDHの活性測定を行った。
この結果、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1のBYDH活性は、0.0038U/mg-protein(1Uは1分間に1μmolの基質を消費する酵素量を示す)であった。一方、コントロールであるエシェリヒアコリJM109は、0.0019 U/mg-proteinであった。
また高速液体クロマトグラフィーより、酵素反応前後の基質減少を確認した。50mM MES緩衝液(pH6.0)、100mM KCl、1mM NADH、0.5mM ブチリル-CoAを上記条件で反応させ、CRTと同条件で分析した。この条件下においてブチリル-CoAは25分に検出され、反応時間と共に減少していることが確認された。さらにガスクロマトグラフィー(GC-2014、島津製)により生成物増加を確認した。同じ反応停止液を、パックドカラム(Thermon-1000、島津製)により、キャリアガス流速60ml/min、昇温速度3℃ / min、カラム温度160〜196℃の条件で分析した。この条件下においてブタノールは9.5分に検出され、反応時間と共に増加していることが確認された。
この結果、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1のBDH活性は、0.24 U/mg-protein(1Uは1分間に1μmolの基質を消費する酵素量を示す)であった。一方、コントロールであるエシェリヒア コリJM109は、0.12 U/mg-proteinであった。
またガスクロマトグラフィー(島津製 GC-2014)により基質減少と生成物増加を確認した。50mM MES緩衝液(pH6.0)、0.5mM NADH、0.5mM ブチルアルデヒドを上記条件で反応させ、BYDHと同じ条件で反応停止液をパックドカラムにより分析した。この条件下においてブチルアルデヒドは6.7分、ブタノールは9.5分に検出され、反応時間と共にブチルアルデヒドが減少し、ブタノールが増加していることが確認された。
冷凍庫(-80℃)に保存してある実施例1で創製したエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、30℃、20時間暗所に静止した。
上記のプレートで生育したエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、10mlのクロラムフェニコール50μg/ml を含むLB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、および0.5% 塩化ナトリウム〕 の入った試験管に一白金耳植菌し、30℃にて20時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1を、500mlのクロラムフェニコール50μg/ml を含むLB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、および0.5% 塩化ナトリウム〕の入った容量1Lの三角フラスコに植菌し、30℃にて20時間、好気的に振盪培養を行った。
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、8,000×g, 20分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終濃度OD660=20となるようにM9液体培地(0.6% Na2HPO4、 0.3% KH2PO4、 0.05% NaCl、 0.1% NH4Cl, 0.0001% 塩酸チアミン, 1mM MgSO4、 0.1mM CaCl2)に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液80mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、グルコース3.2gを、クロラムフェニコール が50μg/mlになるように添加し、30℃に保った嫌気チャンバー内で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが6.5を下回らないように2.5Nの水酸化ナトリウム溶液を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式:DT-1023)でコントロールしながら反応した。
反応開始から22時間後の反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析したところ、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1ではブタノールを3.1mM生成していた。
実施例3で使用したエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1に代えて、エシェリヒア コリJM109を用い、LB培地もしくはM9培地にクロラムフェニコールを添加しないこと以外は、実施例3と同様の条件、方法にてブタノール生産実験を行った。
その結果、エシェリヒア コリJM109は、ブタノールを生成しなかった。
実施例3の結果との比較において、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1は、ブタノール生成能を有することが明らかとなった。
Claims (4)
- 以下の(a)〜(h)の遺伝子をエシェリヒア コリ(Escherichia coli)に導入したことを特徴とする、ブタノール生産能を有する形質転換体。
(a)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(b)β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(c)3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(e)ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(f)ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
(g) エレクトロントランスファーフラボプロテインαサブユニット遺伝子
(h) エレクトロントランスファーフラボプロテインβサブユニット遺伝子
但し、(a)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子は、配列番号1の塩基配列からなるDNAであり、
(b)β-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、(c) 3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、及び(d)ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子は、配列番号2の塩基配列に含まれるDNAであり、
(e)ブチリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、及び(f)ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子は、配列番号3の塩基配列からなるDNAである。 - (g)エレクトロントランスファーフラボプロテインαサブユニット遺伝子、及び(h)エレクトロントランスファーフラボプロテインβサブユニット遺伝子が、クロストリジウム アセトブチリカム由来の遺伝子である請求項1に記載の形質転換体。
- 形質転換体がエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109/pBUT1(受託番号 FERM P-21323)である請求項1又は2に記載の形質転換体。
- 請求項1〜3の何れかに記載の形質転換体を、糖類を含有する培地中で培養する工程と、培養物からブタノールを回収する工程とを含むブタノールの製造方法。
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