JP5698655B2 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるイソブタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
遺伝子組換え菌によるイソブタノールの生産技術としては以下のような技術が知られている。例えば、特許文献1は、クレブジーラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)又はバチルス サブチリス(Bacillus subtilis)由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼ遺伝子、バチルス サブチリス、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)又はサッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のアセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ遺伝子、エシェリヒア コリ又はサッカロマイセス セレビシエ由来のジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ遺伝子、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)由来の2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子、エシェリヒア コリ又はクロストリジウム アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子を、宿主としてエシェリヒア コリ、サッカロマイセス セレビシエ、バチルス サブチリス、ラクトコッカス プランタラム(Lactococcus plantarum)又はエンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)等を使用して発現させイソブタノールを生産する技術を開示している。
コリネバクテリウム グルタミカム中で機能する(1)アセトヒドロキシ酸 シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、(2)アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、(3) ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、(4) 2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び(5)アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を有するコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)であって、(1)〜(5)の1以上がコリネバクテリウム グルタミカムの内在性の遺伝子であり、(1)〜(5)の1以上が外来性の遺伝子である形質転換体は、イソブタノールを効率よく生産する。
項1. 下記の(1)〜(5)の遺伝子を有するコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)であって、(1)〜(5)の1以上がコリネバクテリウム グルタミカムの内在性の遺伝子であり、(1)〜(5)の1以上が外来性の遺伝子であることを特徴とする、イソブタノール生産能を有する形質転換体。
(1)アセトヒドロキシ酸 シンターゼ(acetohydroxy acid synthase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(2)アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(3)ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ(dihydroxy acid dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(4)2-ケト酸 デカルボキシラーゼ(2-keto acid decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(5)アルコール デヒドロゲナーゼ(alcohol dehydrogenase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
項2. 内在性の遺伝子が高発現されていることを特徴とする項1に記載の形質転換体。
項3. 内在性の遺伝子が(1)アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、(2)アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、および(3)ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子から選ばれる遺伝子を含むことを特徴とする項1又は2に記載の形質転換体。
アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号61の塩基配列からなるDNA、又は配列番号61の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号62の塩基配列からなるDNA、又は配列番号62の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号43の塩基配列からなるDNA、配列番号52の塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号43又は52の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号40の塩基配列からなるDNA、配列番号46の塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号40、又は46の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとスコリネバクテリウム グルタミカムトリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAから選ばれる遺伝子であることを特徴とする項1〜4のいずれかに記載の形質転換体。
項7. Corynebacterium glutamicumIBU1(受託番号 NITE BP−718)、Corynebacterium glutamicumIBU2(受託番号 NITE BP−719)、Corynebacterium glutamicumIBU3(受託番号 NITE BP−720)、又は、Corynebacterium glutamicumIBU4(受託番号 NITE BP−721)である形質転換体。
項9. 反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項8に記載のイソブタノールの製造方法。
項10. 還元条件下の反応培地の酸化還元電位が−100〜−500ミリボルトであることを特徴とする項8又は9に記載のイソブタノールの製造方法。
本発明により、再生可能資源を原料とした効率的なイソブタノール生産が可能となり、工業生産における合理的プロセスを実現することが出来る。
(I)イソブタノール生産能を有する形質転換体
本発明のイソブタノール生産能を有する形質転換体は、コリネバクテリウム グルタミカム中で機能する、前述した(1)〜(5)の遺伝子を有するコリネバクテリウム グルタミカムであって、(1)〜(5)の少なくとも1が内在性の遺伝子であり、かつ、(1)〜(5)の少なくとも1が外来性の遺伝子である、イソブタノール生産能を有する形質転換体である。内在性の遺伝子は高発現していることが好ましい。即ち、宿主であるコリネバクテリウム グルタミカムが本来有する内在性の遺伝子は、さらにプラスミド等として導入されていることにより高発現していることが好ましい。
「コリネバクテリウム グルタミカム中で機能する」とは、DNAがコードする酵素がコリネバクテリウム グルタミカム中で発現し、触媒作用を呈することを意味する。
本発明において形質転換の対象となる宿主は、イソブタノール生産関連遺伝子群を含む組換えベクターにより形質転換され、これらの遺伝子がコードするイソブタノール生産に関与する酵素が発現し、結果としてイソブタノールを生産することができるコリネバクテリウム グルタミカムであれば特に限定されない。
宿主として用いられるコリネバクテリウム グルタミカムとは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599(1974)〕に定義されている一群の微生物である。
具体的には、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、 MJ-233(FERM BP-1497)又はMJ-233AB-41(FERM BP-1498)等が挙げられる。
また、これらコリネバクテリウム グルタミカムは、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼ(lactate dehydrogenase)、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ(phosphoenolpyrvate carboxylase)、マレートデヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)などの遺伝子の1又は2以上を破壊した遺伝子破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、イソブタノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
本明細書中、下記の(1)〜(5)の遺伝子をイソブタノール生産関連遺伝子ともいう。
本遺伝子として、好ましいのは、配列番号34で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号58で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号34又は58で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸 シンターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも1種のDNAである。
本遺伝子として、好ましいのは、配列番号61で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号61で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも1種のDNAである。
本遺伝子として、好ましいのは、配列番号62で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号62で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも1種のDNAである。
本遺伝子として、好ましいのは、配列番号43で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号52で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号43又は52で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも1種のDNAである。
本遺伝子として、好ましいのは、配列番号40で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号46で表わされる塩基配列からなるDNA、及び配列番号49で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号40、46又は49で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも1種のDNAである。
イソブタノールは、酵母によるアルコール発酵時のfusel alcoholと呼ばれる副生物の一つとして見出される〔Hazelwood, L.A. et al., The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl. Environ. Microbiol. 74:2259-2266 (2008)〕。このfusel alcoholとは、イソブタノールの他、イソアミルアルコール、活性アミルアルコール等の高級アルコールの呼称であり、アミノ酸代謝系に由来することが1世紀前Enrlichにより初めて見出された。この代謝系はEnrlich経路と呼ばれ、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニールアラニンなどの生合成代謝中間体である2−ケト酸から、広い基質特異性を有する2-ケト酸 デカルボキシラーゼによりアルデヒドに変換し、さらにアルコール デヒドロゲナーゼによりアルコールに変換される。イソブタノールは、バリンへの生合成代謝中間体である2-ketoisovalerateに由来する〔Dickinson, J.R. et al., An investigation of the metabolism of valine to isobutyl alcohol in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273:25751-25756 (1998)〕。
さらに、これらの遺伝子は、イソブタノール生産能を有さない菌から取得してもよい。
中でも、(1)〜(3)のステップに関する遺伝子としては、宿主であるコリネバクテリウム グルタミカム由来の遺伝子を用いると好ましい場合もある。
その他の代謝ステップ(4)、 (5)に関する具体的例として、以下があげられる。
従って、上記(1)〜(5)の遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等に関しては、これらの各種の遺伝子の内、少なくとも一つが宿主であるコリネバクテリウム グルタミカム由来のものを含む点を除いては、特段の限定があるものではない。
上記(4)においては、配列番号43で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラクトコッカス ラクティス由来の遺伝子(kivD)であり、配列番号52で表わされる塩基配列からなるDNAが、スタフィロコッカス エピデルミディス由来の遺伝子(ipd)であることが好ましい。
本発明ではまた、上記記載の遺伝子(1)〜(5)について、それぞれが相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしたものであっても良い。
次いで、PCR法で得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を、ベクター中のマーカー遺伝子に対応した適当な抗生物質(例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど)を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドDNAを抽出する。プラスミドDNAの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイックプラスミド精製キット(商品名:Qiaquick plasmid purification kit、キアゲン社製)などが挙げられる。この抽出されたプラスミドDNAの塩基配列を決定することにより、AHAS、AHAIR、DHAD、KDC、ADHをコードする遺伝子配列を確認することができる。DNAの塩基配列の決定は、公知の方法、例えばジオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、DNAシーケンサー、例えばABI PRISM 3730xl DNA Analyzer(アプライドバイオシステム社製)などを使用して決定することもできる。
目的遺伝子を含むプラスミドベクターのコリネバクテリウム グルタミカムへの導入方法としては、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば電気穿孔法、コンジュゲーション法などの公知の方法で行うことができる。具体的には、電気パルス法を、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 (1993)〕により行うことができる。
また、形質転換体は、紫外線、エックス線又は薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の目的とするイソブタノール生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。
かくして創製された本発明のコリネバクテリウム グルタミカムの形質転換体(以下、単に「形質転換体」という)は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。
培地のpHは約5〜8が好ましい。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日間とすればよい。
回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
上記の如くして得られる培養物から回収分離された形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物は、還元条件下の反応培地でのイソブタノール生成反応に供せられる。菌体処理物としては、菌体を例えばアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体などが挙げられる。上記形質転換体、又は菌体処理物により、還元条件下で、糖類を含有する培地(反応培地)中でイソブタノール生成を行なわせる工程と、生成したイソブタノールを回収する工程とを含むイソブタノールの製造方法も本発明の1つである。
イソブタノール生成方式は、回分式、流加式、連続式のいずれの生成方式も可能である。
形質転換体又はその菌体処理物と糖類との反応は、本発明の形質転換体又はその菌体処理物が活動できる温度条件下で行なわれることが好ましく、形質転換体又はその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。通常、約25〜35℃とすればよい。
本発明のイソブタノール製造方法の特徴の一つは、還元条件下の糖類を含有する反応培地で使用される形質転換体の増殖を実質的に伴わないことである。反応培地中の形質転換体の増殖を伴わないでイソブタノールが生成されることは、経時的に適宜反応液を採取し、そのイソブタノール濃度と菌体濃度(例えば、菌体の光学濃度)を測定することにより知ることができる。
また、培養時間は、例えば約2〜72時間とすればよい。
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
バチルス サブチリス168 NBRC14144からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [Polypepton 10g、Yeast extract 2g、MnSO4.7H2O 1gを蒸留水1Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名:GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点(以降、pCASE1-oriと記す)配列、及びクローニングベクターpHSG298(タカラバイオ株式会社製)をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1(pCASE1-ori配列)、配列番号2(クローニングベクター−pHSG298)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-1); 5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’ (配列番号3)
(b-1); 5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’ (配列番号4)
尚、プライマー(a-1)及び(b-1)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
(a-2); 5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3 (配列番号5)
(b-2); 5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’ (配列番号6)
尚、プライマー(a-2)及び(b-2)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー(a-1)と(b-1)の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー(a-2)と(b-2)の組み合わせで行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃
pCASE1-ori配列:150秒
クローニングベクターpHSG298:180秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。
コリネバクテリウム グルタミカム内で複製可能なプラスミドpCG1 [(特開昭57−134500)] 由来のDNA複製起点(以降、pCG1-oriと記す)配列、及びクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ株式会社製)をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCG1-ori配列、クローニングベクターpHSG398をそれぞれクローン化するべく、配列番号7(pCG1-ori配列)、配列番号8(クローニングベクターpHSG398)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-3); 5’- AT AGATCT AGCATGGTCGTCACAGAG -3’ (配列番号9)
(b-3); 5’- AT AGATCT GGAACCGTTATCTGCCTATG -3’ (配列番号10)
尚、プライマー(a-3)及び(b-3)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
(a-4); 5’- AT AGATCT GTCGAACGGAAGATCACTTC -3’ (配列番号11)
(b-4); 5’- AT AGATCT AGTTCCACTGAGCGTCAG -3’ (配列番号12)
尚、プライマー(a-4)及び(b-4)には、BglII制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pCG1-ori配列を増幅する場合はプライマー(a-3)と(b-3)の組み合わせ、クローニングベクターpHSG398を増幅する場合はプライマー(a-4) と (b-4) の組み合わせで行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃
pCG1-ori配列:120秒
クローニングベクターpHSG398:150秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
pCG1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB11と命名した。
クローニングベクターpCRB11を含むDNA断片及びpSELECT-zeo-mcs(インビトロジェン株式会社製)由来のゼオシン耐性遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、クローニングベクターpCRB11及びゼオシン耐性遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号13(pCRB11)及び配列番号14(ゼオシン耐性遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-5); 5’- AT GATATC CGAAGTGATCTTCCGTTCGA -3’ (配列番号15)
(b-5); 5’- AT GATATC AAGGCAGTTATTGGTGCCCT -3’ (配列番号16)
尚、プライマー(a-5)及び(b-5)には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。
(a-6); 5’- AT GATATC TAGCTTATCCTCAGTCCTGC -3’ (配列番号17)
(b-6); 5’- AT GATATC CCATCCACGCTGTTTTGACA -3’ (配列番号18)
尚、プライマー(a-6)及び(b-6)には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) クローニングベクターpCRB11配列を増幅する場合はプライマー(a-5)と(b-5)の組み合わせ、ゼオシン耐性遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組み合わせで行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃
pCRB11配列:200秒
ゼオシン耐性遺伝子:45秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、ゼオシン25μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
ゼオシン耐性遺伝子を含むクローニングベクターをpCRB15と命名した。
クローニングベクターpCRC200〔Yasuda, K. et al., Analyses of the acetate-producing pathways in Corynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions. Applied Microbiology and Biotechnology. 77:853-860 (2007)〕を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCRC200をクローン化するべく、配列番号19(pCRC200)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-7); 5’- CTCT ACTAGT GTCGAC GGATCC TTGTGTGGAATTGTGAGCGG -3’
(配列番号20)
(b-7); 5’- CTCT ACTAGT CATACGAGCCGGAAGCATAA -3’
(配列番号21)
尚、プライマー(a-7)には、SpeI、SalI及びBamHI制限酵素部位が、プライマー(b-7)には、SpeI制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃、300秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記のPCRにより増幅したpCRC200由来遺伝子を含む約5.0-kb DNA断片10μlを制限酵素SpeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法 〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
クローニングベクターpCRC200に制限酵素部位SpeI、SalI及びBamHIサイトを付加したクローニングベクターをpCRB205と命名した。
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列(以降、PgapAと記す)を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3(ファルマシア社製)由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列(以降、ターミネーター配列と記す)を含むDNA断片をを以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号22(PgapA配列)、配列番号23(ターミネーター配列)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-9); 5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
(配列番号26)
(b-9); 5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3
(配列番号27)
尚、プライマー(a-9)には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー(b-9)には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) PgapA配列を増幅する場合はプライマー(a-8)と(b-8)の組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-9) と (b-9) の組み合わせで行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃
PgapA配列:45秒
ターミネーター配列:30秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。
得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のL-乳酸デヒドロゲナーゼ(L-lactate dehydrogenase)をコードするldhA遺伝子のプロモーター配列(以降、PldhAと記す)を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PldhA配列をクローン化するべく、配列番号28(PldhA配列)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-10); 5’- CTCT GTCGAC CGGAACTAGCTCTGCAATGA -3’
(配列番号29)
(b-10); 5’- CTCT GTCGAC GGATCC CATATG CGATCCCACTTCCTGATTTC -3’
(配列番号30)
尚、プライマー(a-10)には、SalI制限酵素部位が、プライマー(b-10)には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃、30秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションG液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
PldhA配列を含むクローニングベクターをpCRB208と命名した。
バチルス サブチリス由来のイソブタノール生産遺伝子のクローニング
バチルス サブチリス由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼをコードするalsS遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、alsS遺伝子をクローン化するべく、配列番号31(バチルス サブチリスalsS遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-11); 5’- CTCT CCATGG TGACAAAAGCAACAAAAGAACAAAAATCC -3’
(配列番号32)
(b-11); 5’- CTCT CCATGG AGATCT CTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAG -3’
(配列番号33)
尚、プライマー(a-11)には、NcoI制限酵素部位が、プライマー(b-11)には、NcoI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼをコードするilvB-ilvN遺伝子、アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子、ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
(a-12); 5’- GA CCCGGG AGTAAAGGAGCCAGAAAGTCGTGAA -3’
(配列番号36)
(b-12); 5’- GA CCCGGG CCTGCAGG TGCCTTATGTACAAAGTGCACAGCA -3’
(配列番号37)
尚、プライマー(a-12)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-12)には、SmaI及びSse8387I制限酵素部位が付加されている。
(a-13); 5’- CTCT TCATGA TCCCACTTCGTTCAAAAGTC -3’
(配列番号38)
(b-13); 5’- CTCT TCATGA TTAGTCGACCTGACGGAC -3’
(配列番号39)
尚、プライマー(a-13)及び(b-13)には、BspHI制限酵素部位が付加されている。
エシェリヒア コリ由来のアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、adhP遺伝子をクローン化するべく、配列番号40(エシェリヒア コリadhP遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-14); 5’- CTCT CCATGG AGGCTGCAGTTGTTACGAAG -3’
(配列番号41)
(b-14); 5’- CTCT CCATGG AGATCT TTAGTGACGGAAATCAATCACCAT -3’
(配列番号42)
尚、プライマー(a-14)には、NcoI制限酵素部位が、プライマー(b-14)には、NcoI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
ラクトコッカス ラクティス由来の2-ケト酸 デカルボキシラーゼをコードするkivD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、kivD遺伝子をクローン化するべく、配列番号43(ラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
シュードモナス プチダ由来のアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadh遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してadh遺伝子をクローン化するべく、配列番号46(シュードモナス プチダadh遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーをアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems) 社製「394 DNA/RNA シンセサイザー (synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-16); 5’- CTCT TCATGA AAGCTGCTGTCGTTGC -3’ (配列番号47)
(b-16); 5’- CTCT TCATGA CTCGAG TCAGCCTTCGAACTGTATCAC -3’
(配列番号48)
尚、プライマー(a-16)には、BspHI制限酵素部位が、プライマー(b-16)には、BspHI及びXhoI制限酵素部位が付加されている。
サッカロマイセス セレビシエ由来のアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadh2遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してadh2遺伝子をクローン化するべく、配列番号49(サッカロマイセス セレビシエadh2遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
スタフィロコッカス エピデルミディス由来の2-ケト酸 デカルボキシラーゼ(別名;インドール-3-ピルベート デカルボキシラーゼ)をコードするipd遺伝子(locus tag; NP_765765)を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してipd遺伝子をクローン化するべく、配列番号52(スタフィロコッカス エピデルミディスipd遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
イソブタノール生産遺伝子のpKK223-3へのクローニング
上記(3)のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含む約3.7-kb DNA断片10μl及びtacプロモーターを含有するクローニングベクターpKK223-3(ファルマシア社製)2μlを各々制限酵素SmaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液とした。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含むプラスミドをpKK223-3-ilvB-ilvN-ilvC/CGと命名した。
上述のプラスミドpKK223-3-ilvB-ilvN-ilvC/CGから、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカムR由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカムR由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子(配列番号55;Ptac-ilvB-ilvN-ilvC配列)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-19); 5’- AT GCAAGC TTCGGCTGTGCAGGTCGTAAAT -3’ (配列番号56)
(b-19); 5’- AC GCAAGC TTCGCTTATGTACAAAGTGCAC -3’ (配列番号57)
尚、プライマー(a-19)及び(b-19)には、HindIII制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃、240秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションI液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-ilvB-ilvN-ilvC/CG(図1)と命名した。
上記項(3)に示したPCRにより増幅したバチルス サブチリス株由来alsS遺伝子を含む約1.8-kb DNA断片、エシェリヒア コリ株由来adhP遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片、ラクトコッカス ラクティス株由来kivD遺伝子を含む約1.7-kb DNA断片、サッカロマイセス セレビシエ株由来adh2遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片及びスタフィロコッカス エピデルミディス株由来ipd遺伝子を含む約1.7-kb DNA断片 10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207 2μlを各々制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションJ液、K液、L液、M液及びN液とした。
上述のプラスミド1種類pCRB1-ilvB-ilvN-ilvC/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol.54、443-447(1990) 及び Res. Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)] を形質転換し、クロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
実施例1において構築したイソイソブタノール生産遺伝子をそれぞれ単独で導入したコリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant(以降、コリネバクテリウム グルタミカム単一遺伝子導入株と記す)(ただし、例外としてilvB-ilvN-ilvCは同一のプラスミド上に連結されている)におけるイソイソブタノール生産関連酵素、すなわちアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(AHAIR)、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)、2-ケト酸デカルボキシラーゼ(KDC)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)の活性を以下の方法により測定した。尚、コントロールとして、宿主として用いたコリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutantも同様の方法にて測定した。
コリネバクテリウム グルタミカム単一遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
コリネバクテリウム グルタミカム単一遺伝子導入株を、カナマイシン 50μg/ml含むA寒天培地 [(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
(1) ブタノール生産遺伝子のクローニング
バチルス サブチリス由来のイソブタノール生産遺伝子のクローニング
バチルス サブチリス由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼをコードするalsS遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、alsS遺伝子をクローン化するべく、バチルス サブチリスの配列(配列番号58;alsS遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-20);5’-CTCT CCCGGG AAACTTTTTAGAAAGGTGTGTTTCACCCGTGTTGACAAAAGCAACAAAAGAAC -3’
(配列番号59)
(b-20);5’-CTCT CCCGGG AGATCT CTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGA -3’
(配列番号60)
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼをコードするilvB-ilvN遺伝子、アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子、ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
(a-12); 5’- GA CCCGGG AGTAAAGGAGCCAGAAAGTCGTGAA -3’
(配列番号36)
(b-12); 5’- GA CCCGGG CCTGCAGG TGCCTTATGTACAAAGTGCACAGCA -3’
(配列番号37)
尚、プライマー(a-12)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-12)には、SmaI及びSse8387I制限酵素部位が付加されている。
(a-21); 5’- CTCT CCATGG CTATTGAACTGCTTTATGATG -3’
(配列番号63)
(b-21); 5’- CTCT CCATGG AGATCT TTAAGCGGTTTCTGCGCGA -3’
(配列番号64)
尚、プライマー(a-21)には、NcoI制限酵素部位が、プライマー(b-21)には、NcoI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
(a-22); 5’- GA CCCGGG GAGCAGATTTGAAAAGCGCATCATG -3’
(配列番号65)
(b-22); 5’- GA CCCGGG GGTACC GTATTTGCAACGGGGAGCTCCACCA -3’
(配列番号66)
尚、プライマー(a-22)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-22)には、SmaI及びKpnI制限酵素部位が付加されている。
エシェリヒア コリ由来のアセトヒドロキシ酸 シンターゼをコードするilvB-ilvN遺伝子、アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子、ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子及びアルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
(a-23); 5’- CTCT CCCGGG ATGGCAAGTTCGGGCACAA -3’
(配列番号70)
(b-23); 5’- CTCT CCCGGG AGATCT TTACTGAAAAAACACCGCGATCTT-3’
(配列番号71)
尚、プライマー(a-23)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-23)には、SmaI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
(a-24); 5’- CTCT CCCGGG ATGGCTAACTACTTCAATACACTG -3’
(配列番号72)
(b-24); 5’- CTCT CCCGGG AGATCT TTAACCCGCAACAGCAATACG-3’
(配列番号73)
尚、プライマー(a-24)には、SmaI制限酵素部位が、プライマー(b-24)には、SmaI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
(a-25); 5’- CTCT TTTAAA ATGCCTAAGTACCGTTCCG -3’
(配列番号74)
(b-25); 5’- CTCT TTTAAA AGATCT TTAACCCCCCAGTTTCGATTTAT-3’
(配列番号75)
尚、プライマー(a-25)には、DraI制限酵素部位が、プライマー(b-25)には、DraI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
(a-14); 5’- CTCT CCATGG AGGCTGCAGTTGTTACGAAG -3’
(配列番号41)
(b-14); 5’- CTCT CCATGG AGATCT TTAGTGACGGAAATCAATCACCAT -3’
(配列番号42)
尚、プライマー(a-14)には、NcoI制限酵素部位が、プライマー(b-14)には、NcoI及びBglII制限酵素部位が付加されている。
ラクトコッカス ラクティス由来の2-ケト酸 デカルボキシラーゼをコードするkivD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、kivD遺伝子をクローン化するべく、ラクトコッカス ラクティスの配列(配列番号43;kivD遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
シュードモナス プチダ由来のアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadh遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してadh遺伝子をクローン化するべく、シュードモナス プチダの配列(配列番号46;adh遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーをアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems) 社製「394 DNA/RNA シンセサイザー (synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
(a-16); 5’- CTCT TCATGA AAGCTGCTGTCGTTGC -3’ (配列番号47)
(b-16); 5’- CTCT TCATGA CTCGAG TCAGCCTTCGAACTGTATCAC -3’
(配列番号48)
尚、プライマー(a-16)には、BspHI制限酵素部位が、プライマー(b-16)には、BspHI及びXhoI制限酵素部位が付加されている。
サッカロマイセス セレビシエ由来のアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadh2遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してadh2遺伝子をクローン化するべく、サッカロマイセス セレビシエの配列(配列番号49;adh2遺伝子)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイザー(synthesizer)」を用いて合成し、使用した。
イソブタノール生産遺伝子のpKK223-3へのクローニング
上記(1)のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含む約3.7-kb DNA断片、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子を含む約2.0-kb DNA断片、エシェリヒア コリ株由来ilvB-ilvN遺伝子を含む約2.0-kb DNA断片及びエシェリヒア コリ株由来ilvC遺伝子を含む約1.5-kb DNA断片10μl及びtacプロモーターを含有するクローニングベクターpKK223-3(ファルマシア社製)2μlを各々制限酵素SmaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションQ液、R液、S液及びT液とした。
得られた5種のライゲーションQ液、R液、S液、T液及びU液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
上述のプラスミドpKK223-3-ilvB-ilbN-ilvC/CG及びpKK223-3-ilvD/CGから、tacプロモーターを含むコリネバクテリウム グルタミカムR由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子及びilvD遺伝子のDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカムR由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子(配列番号55;Ptac-ilvB-ilvN-ilvC配列)、ilvD遺伝子(配列番号76;Ptac-ilvD配列)を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
(a-19); 5’- AT GCAAGC TTCGGCTGTGCAGGTCGTAAAT -3’(配列番号56)
(b-19); 5’- AC GCAAGC TTCGCTTATGTACAAAGTGCAC -3’(配列番号57)
尚、プライマー(a-19)及び(b-19)には、HindIII制限酵素部位が付加されている。
(a-26); 5’- ATAT CCTGCAGG CTAGCGCTGTGCAGGTCGTAAATCAACT -3’
(配列番号77)
(b-26); 5’- ATATGCTAGCT CCTGCAGG TATTTGCAACGGGGAGCTC -3’
(配列番号78)
尚、プライマー(a-26)及び(b-26)には、Sse8387I制限酵素部位が付加されている。
実際のPCRは、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて下記の条件で行った。
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) Ptac-ilvB-ilvN-ilvC配列を増幅する場合はプライマー(a-19)と(b-19)の組み合わせ、Ptac-ilvD配列を増幅する場合はプライマー(a-26)と(b-26)の組み合わせで行った。
デナチュレーション過程 :94℃、60秒
アニーリング過程 :52℃、60秒
エクステンション過程 :72℃
Ptac-ilvB-ilvN-ilvC配列:240秒
Ptac-ilvD配列:150秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
得られたライゲーションV液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvB-ilvN-ilvC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-ilvB-ilvN-ilvC/CGと命名した。
エシェリヒア コリ株由来ilvB-ilvN遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-ilvB-ilvN/ECと命名した。
尚、このプラスミドは、制限酵素部位BamHIが1箇所のみ存在する。
得られたライゲーションY液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
エシェリヒア コリ株由来ilvB-ilvN遺伝子及びエシェリヒア コリ株由来ilvC遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-ilvB-ilvN/EC-ilvC/ECと命名した。
尚、このプラスミドは、制限酵素部位BamHIが1箇所のみ存在する。
得られたライゲーションZ液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
エシェリヒア コリ株由来ilvB-ilvN遺伝子、エシェリヒア コリ株由来ilvC遺伝子及びエシェリヒア コリ株由来ilvD遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-ilvB-ilvN/EC-ilvC/EC-ilvD/ECと命名した。
尚、このプラスミドは、制限酵素部位BamHIが1箇所のみ存在する。
上記項(1)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvC遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片、エシェリヒア コリ株由来adhP遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片、ラクトコッカス ラクティス株由来kivD遺伝子を含む約1.7-kb DNA断片、サッカロマイセス セレビシエ株由来adh2遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207 2μlを各々制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションAA液、AB液、AC液及びAD液とした。
上記項(1)に示したPCRにより増幅したバチルス サブチリス株由来alsS遺伝子を含む約1.8-kb DNA断片10μl及びtacプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB205 2μlを各々制限酵素SmaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションAG液とした。
得られたライゲーションAG液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
バチルス サブチリス株由来alsS遺伝子を含むプラスミドをpCRB205-alsS/BSと命名した。
得られたライゲーションAH液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール 50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
バチルス サブチリス株由来alsS遺伝子及びコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvC遺伝子を含むプラスミドをpCRB205-alsS/BS-ilvC/CGと命名した(図2)。
上記項(1)に示したPCRにより増幅したラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子を含む約1.7-kb DNA断片10μl及びldhAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB208 2μlを各々制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションAI液とした。
得られたライゲーションAI液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
ラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子を含むプラスミドをpCRB208-kivD/LLと命名した(図2)。
上述のプラスミドpCRB207-adhP/EC、pCRB207-adh/PP及びpCRB207-adh2/SCを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(株式会社キアゲン社製)によって回収したgapAプロモーターとエシェリヒア コリ株由来adhP遺伝子及びターミネーター配列を連結した約2.0-kbのDNA断片と、gapAプロモーターとシュードモナス プチダ株由来adh遺伝子及びターミネーター配列を連結した約2.0-kbのDNA断片と、gapAプロモーターとサッカロマイセス セレビシエ株由来adh2遺伝子及びターミネーター配列を連結した約2.1-kbのDNA断片とBamHIで切断した上述のプラスミドpCRB15約3.8-kbを70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl 、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製) 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションAJ液、AK液及びAL液とした。
得られたライゲーションAM液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、ゼオシン 25μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
エシェリヒア コリ株由来adhP遺伝子及びコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子を含むプラスミドをpCRB15-adhP/EC-ilvD/CGと命名した(図2)。
上述のプラスミドpCRB1-ilvB-ilvN-ilvC/CG-ilvD/CG、pCRB208-kivD/LL及びpCRB15-adh2/SCを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)] 株を形質転換し、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/ml、ゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドである。
<遺伝子起源略語>
BS; バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)
CG; コリネバクテリウム グルタミカム R(Corynebacterium glutamicum)
EC; エシェリヒア コリ(Escherichia coli)
LL; ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)
PP; シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)
SC; サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
上述のプラスミドpCRB1-ilvB-ilvN/EC-ilvC/EC-ilvD/EC、pCRB208-kivD/LL及びpCRB15-adh2/SCを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)] 株を形質転換し、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/ml、ゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドである。
実施例3で創製したコリネバクテリウム グルタミカムIBU1、IBU2及びIBU3を、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/mlおよびゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカム IBU1、IBU2及びIBU3を、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/mlおよびゼオシン25μg/mlを含むA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムIBU1、IBU2及びIBU3を、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/mlおよびゼオシン25μg/mlを含むA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
コリネバクテリウム グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) IBU4を用いた還元条件下におけるイソブタノール生産実験
コリネバクテリウム グルタミカム IBU4を用いた以外は、実施例4と同様の方法でイソブタノール生産を評価した。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムIBU4は、還元条件下でのイソブタノール生成反応の開始から22時間後に97 mM、36時間後に146 mMのイソブタノールを反応液中にそれぞれ生産していた。
本実施例は、AHASをコードする遺伝子に関して、コリネバクテリウム グルタミカム内在性のilvBN遺伝子を導入した場合の方が、外来性(バチルス サブチリス由来)のalsS遺伝子を導入した場合よりも、高い生産性を与えることを示す実験例である。
コリネバクテリウム グルタミカム IBU5を用いた以外は、実施例4と同様の方法でイソブタノール生産を評価した。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムIBU5は、還元条件下でのイソブタノール生成反応の開始から22時間後に72 mM、36時間後に97 mMのイソブタノールを反応液中にそれぞれ生産していた。
コリネバクテリウム グルタミカムIBU5は、IBU2と比較して、KDC、ADHをコードする同じ遺伝子が導入されていることは共通であり、異なる点は、AHAS、AHAIR、DHADをコードする遺伝子として、IBU5がエシェリヒア コリ由来のilvBN、ilvC、ilvD遺伝子が導入されているのに対して、IBU2はコリネバクテリウム グルタミカム由来のilvBN、ilvC、ilvD遺伝子を導入させている点である。すなわち、IBU5はすべて外来性遺伝子が導入されているのに対して、IBU2は、内在性のilvBN、ilvC、ilvD遺伝子が導入されている。従って、コリネバクテリウム グルタミカム内在性のilvBN、ilvC、ilvD遺伝子を導入したIBU2の方が、外来性エシェリヒア コリ由来のilvBN、ilvC、ilvD遺伝子を導入したIBU5に比べて高い生産性を示した。
実施例3で創製したコリネバクテリウム グルタミカムIBU2を、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/mlおよびゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムIBU2を、クロラムフェニコール 5μg/ml、カナマイシン 50μg/mlおよびゼオシン25μg/mlを含むA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムIBU2は、図3に示すように増殖した。この時、好気培養開始から4時間後に0 mM、10時間後に0 mM、16時間後に0.3 mMのイソブタノールを生産した。そして、16時間以降では、イソブタノールの生成濃度の増大は殆ど認められなっかた。コリネバクテリウム グルタミカムIBU2は、増殖を伴う好気条件下ではほとんどイソブタノールを生産しなかったのに対して、増殖を伴わない還元条件下(実施例4参照)では、著量のイソブタノールを生産することが分かった。
イソブタノールを生産する宿主としてコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に代わりに、コリネバクテリウム キャピトビス(Corynebacterium capitovis)、コリネバクテリウム カゼイ(Corynebacterium casei)、コリネバクテリウム ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)及びコリネバクテリウム テルペノタビディウム(Corynebacterium terpenotabidum)を用いる以外は、実施例4と同様の方法でイソブタノール生産を評価した。尚、導入プラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム IBU2と同様のpCRB1-ilvB-ilvN-ilvC/CG-ilvD/CG、pCRB208-kivD/LL及びpCRB15-adhP/ECを用いた。
このイソブタノールを生産する場合の宿主として、コリネバクテリウム属の中で、コリネバクテリウム グルタミカムがもっとも優れていることが明らかになった。
Corynebacterium glutamicum IBU2 NITE BP−719
Corynebacterium glutamicum IBU3 NITE BP−720
Corynebacterium glutamicum IBU4 NITE BP−721
Claims (10)
- 下記の(1)〜(5)の全ての遺伝子で形質転換されたコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)形質転換体であって、(1)〜(5)の1以上がコリネバクテリウム グルタミカムの内在性の遺伝子であり、(1)〜(5)の1以上が外来性の遺伝子であり、内在性の遺伝子が導入されていることにより高発現していることを特徴とする、イソブタノール生産能を有する形質転換体。
(1)アセトヒドロキシ酸 シンターゼ(acetohydroxy acid synthase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(2)アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(3)ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ(dihydroxy acid dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(4)2-ケト酸 デカルボキシラーゼ(2-keto acid decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(5)アルコール デヒドロゲナーゼ(alcohol dehydrogenase)活性を有する酵素をコードする遺伝子 - 内在性の遺伝子が(1)アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、(2)アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、および(3)ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子から選ばれる遺伝子を含むことを特徴とする請求項1に記載の形質転換体。
- アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)由来の遺伝子、または、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)由来の遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の形質転換体。
- 2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)由来の遺伝子、または、スタフィロコッカス エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)由来の遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の形質転換体。
- アセトヒドロキシ酸 シンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号34の塩基配列からなるDNA、配列番号58の塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号34又は58の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸 シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
アセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号61の塩基配列からなるDNA、又は配列番号61の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号62の塩基配列からなるDNA、又は配列番号62の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号43の塩基配列からなるDNA、配列番号52の塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号43又は52の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAのいずれかの遺伝子から選ばれる遺伝子であり、そして、
アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、配列番号40の塩基配列からなるDNA、配列番号46の塩基配列からなるDNA、配列番号49の塩基配列からなるDNA、あるいは、配列番号40、46、又は49の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAから選ばれる遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の形質転換体。 - 宿主として用いられるコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルタミカムR(FERM P−18976)、ATCC13032、又はATCC13869である請求項1に記載の形質転換体。
- Corynebacterium glutamicumIBU1(受託番号 NITE BP−718)、Corynebacterium glutamicumIBU2(受託番号 NITE BP−719)、Corynebacterium glutamicumIBU3(受託番号 NITE BP−720)、又は、Corynebacterium glutamicumIBU4(受託番号 NITE BP−721)である形質転換体。
- 請求項1又は7に記載の形質転換体、又はその処理物を、還元条件下の、糖類を含有する反応培地で反応させる工程と、生産されたイソブタノールを回収する工程とを含むことを特徴とするイソブタノールの製造方法。
- 反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項8に記載のイソブタノールの製造方法。
- 還元条件下の反応培地の酸化還元電位が−100〜−500ミリボルトであることを特徴とする請求項8に記載のイソブタノールの製造方法。
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