JPS5867699A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
- Publication number
- JPS5867699A JPS5867699A JP56165511A JP16551181A JPS5867699A JP S5867699 A JPS5867699 A JP S5867699A JP 56165511 A JP56165511 A JP 56165511A JP 16551181 A JP16551181 A JP 16551181A JP S5867699 A JPS5867699 A JP S5867699A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- coryneform bacteria
- molecular weight
- producing coryneform
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテ
リアより分離されるプラスミド？こ関する。
リアより分離されるプラスミド？こ関する。
・グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリアは大量
のし一グルタミン酸を生産することがするものが知られ
ていて、工業的ｔこ有用な微生物である。一方、最近Ｄ
ＮＡ組換え技術による工業微生物の育種、改良がエシェ
リヒア・コリ等により試みられているが、グルタミン酸
生産性コリネホルム・バクテリア−については、これら
の微生物を宿主とするに適したベクターが開発されてお
らず、ＤＮＡ組換えｔこよるグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリアの育種、改良の妨げとなっていた。
のし一グルタミン酸を生産することがするものが知られ
ていて、工業的ｔこ有用な微生物である。一方、最近Ｄ
ＮＡ組換え技術による工業微生物の育種、改良がエシェ
リヒア・コリ等により試みられているが、グルタミン酸
生産性コリネホルム・バクテリア−については、これら
の微生物を宿主とするに適したベクターが開発されてお
らず、ＤＮＡ組換えｔこよるグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリアの育種、改良の妨げとなっていた。
本発明者らはこのような背景ｔこおいて、コリネホルム
・バクテリアｔこ適したベクターを開発スヘく鋭意研究
し、つい１こグルタミス酸生産性コリネホルム・バクテ
リアより、ベクターとして用いるのｔこ適した、あるい
はベクターとして加工するｔこ適したプラスミドである
分子量３．０±０．１メガダルトンであって、第１図に
示す制限酵・素切断地図を有するプラスミドを見い出し
た。
・バクテリアｔこ適したベクターを開発スヘく鋭意研究
し、つい１こグルタミス酸生産性コリネホルム・バクテ
リアより、ベクターとして用いるのｔこ適した、あるい
はベクターとして加工するｔこ適したプラスミドである
分子量３．０±０．１メガダルトンであって、第１図に
示す制限酵・素切断地図を有するプラスミドを見い出し
た。
本発明のプラスミドの具体例として、グルターミン酸生
産性コリネホルム・バクテリアであるブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９より分離
されたｐＡＭ３３０、コリネバクテリウム９グルタミカ
ムＡＪ１１５６Ｑ。
産性コリネホルム・バクテリアであるブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９より分離
されたｐＡＭ３３０、コリネバクテリウム９グルタミカ
ムＡＪ１１５６Ｑ。
ＦＥＲＭ−Ｐ５４８５より分離されたｐＡＭ２Ｂ６があ
り、これらのプラスミドは以下の点で共通の性質を有し
ている。
り、これらのプラスミドは以下の点で共通の性質を有し
ている。
分子量は３．０メガダルトン（アガロースゲル電気泳動
法、及び電子顕微鏡観察による）であり、各種制限酵素
會こ対する感受性は第１表に示すとおりであり、制限酵
素切断地図は第１図に示すとおりである。第１図の制限
酵素切断地図は全長を１００とし、）ｌｉｎｄｍ 切断
位置を００位置に定めて表わした。
法、及び電子顕微鏡観察による）であり、各種制限酵素
會こ対する感受性は第１表に示すとおりであり、制限酵
素切断地図は第１図に示すとおりである。第１図の制限
酵素切断地図は全長を１００とし、）ｌｉｎｄｍ 切断
位置を００位置に定めて表わした。
プラスミドｐＡＭ３３０及びｐＡＭ２８６は、それぞれ
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９及びコリネバクテリウムのグルタミクムＡＪ１
１５６０．’ＦＥＲＭ−Ｐ５４８５より、実施例１及び
実施例２に記載さえ【た方法により、容易ｔこ分離、精
製できる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９及びコリネバクテリウムのグルタミクムＡＪ１
１５６０．’ＦＥＲＭ−Ｐ５４８５より、実施例１及び
実施例２に記載さえ【た方法により、容易ｔこ分離、精
製できる。
制限酵素 由 来 切断
数Ａｌｕ ｌ （：アースロバフタ−・ルテウス
≧−４（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ １ｕｔｅ
ｕｓ ） ）ＢｓｔＥｌ （バチルスφステアロサ
ーそフィールスＥＴ ≧４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｕｇ ） ）ＨｇｉＡｌ
（ヘルベトシフオン・ギガンテウス ≧４（Ｈｅ
ｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｇｊｇａｎｔｅｕｓ ））Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ （同 上 〕
ＩＨｐａ ＩＩ （へモフィルス・パライ
ンフルエンゼ ≧４（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕａ ｐａ
ｒａｉｎＮｕｅｎｚａｅ ） ）制限酵素
由 来 切断数グルタミン酸生産性
コリネホルム・バクテリアは、好気性、無胞尤非抗酸性
、グラム陽性、不定性の桿菌である、所謂コリネホルム
・バクテリアの内のグルタミン酸を多量ｔこ生産するも
のであり、以下にその−・部を具体的に例示する。
数Ａｌｕ ｌ （：アースロバフタ−・ルテウス
≧−４（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ １ｕｔｅ
ｕｓ ） ）ＢｓｔＥｌ （バチルスφステアロサ
ーそフィールスＥＴ ≧４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｕｇ ） ）ＨｇｉＡｌ
（ヘルベトシフオン・ギガンテウス ≧４（Ｈｅ
ｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｇｊｇａｎｔｅｕｓ ））Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ （同 上 〕
ＩＨｐａ ＩＩ （へモフィルス・パライ
ンフルエンゼ ≧４（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕａ ｐａ
ｒａｉｎＮｕｅｎｚａｅ ） ）制限酵素
由 来 切断数グルタミン酸生産性
コリネホルム・バクテリアは、好気性、無胞尤非抗酸性
、グラム陽性、不定性の桿菌である、所謂コリネホルム
・バクテリアの内のグルタミン酸を多量ｔこ生産するも
のであり、以下にその−・部を具体的に例示する。
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ１３７
４５ ブレビバクテリウム・デイバリヵタム ＡＴＣ’Ｃ］４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム ・ＡＴＣＣ１３８２６ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ケトグルタミクムＡＴＣＣ１５８
８７ ブレビバクテリウム−ラクトファーメンタムＡＴＣＣ］
３８６９ ブレビバクテリウム・−ゼウム ＡＴＣＣ１３８２６ ブレビバクテリウム鴫すツ力ロリティカムＡＴＣＣ］４
０６６ ブレビバクテリウム魯チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム・アルカノリテカムＡＴＣＣ２１５
１１ コリネバクテリウムｅカルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム串ハイドロカーポクラスタスＡＴＣ
Ｃ１５５９２ コリネバクテリウム−リリウム ＡＴＣＣ１５９９１１ コリネバクテリウム・メラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフイラムＡＴＣＣ１５
３５４ アＩレスロバクター働シトレウス ＡＴＣＣ１７７７，５ アルスロバクタ−・パラフイネウス 、 ＡＴＣＣ１９０６４ アルスロバクタ−・シンプレックス 、ＡＴＣＣ１５７９９ これらのグルタミン酸生産性コリネホルム・バ主となる
ことができる。
４５ ブレビバクテリウム・デイバリヵタム ＡＴＣ’Ｃ］４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム ・ＡＴＣＣ１３８２６ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ケトグルタミクムＡＴＣＣ１５８
８７ ブレビバクテリウム−ラクトファーメンタムＡＴＣＣ］
３８６９ ブレビバクテリウム・−ゼウム ＡＴＣＣ１３８２６ ブレビバクテリウム鴫すツ力ロリティカムＡＴＣＣ］４
０６６ ブレビバクテリウム魯チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム・アルカノリテカムＡＴＣＣ２１５
１１ コリネバクテリウムｅカルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム串ハイドロカーポクラスタスＡＴＣ
Ｃ１５５９２ コリネバクテリウム−リリウム ＡＴＣＣ１５９９１１ コリネバクテリウム・メラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフイラムＡＴＣＣ１５
３５４ アＩレスロバクター働シトレウス ＡＴＣＣ１７７７，５ アルスロバクタ−・パラフイネウス 、 ＡＴＣＣ１９０６４ アルスロバクタ−・シンプレックス 、ＡＴＣＣ１５７９９ これらのグルタミン酸生産性コリネホルム・バ主となる
ことができる。
本発明のプラスミドは上記のような宿主微生物内にて、
よく増殖することができるので、このプラスミドのいず
れかの位置ｒこ外来遺伝子が挿入されれば、その外来遺
伝子の遺伝情報を宿主であるグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリア細胞内で発現せしめることかでき、
これら宿主微生物の遺伝形質を変換せしめることができ
る。
よく増殖することができるので、このプラスミドのいず
れかの位置ｒこ外来遺伝子が挿入されれば、その外来遺
伝子の遺伝情報を宿主であるグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリア細胞内で発現せしめることかでき、
これら宿主微生物の遺伝形質を変換せしめることができ
る。
本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入するには
、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ −１２で報告されているように
低温のもとて菌を塩化カルシウムで処理して菌膜の透過
性を増大せしめ、プラスミドを移入する方法（Ｍａｎｄ
ｅｌ、 Ｍ ａｎｄ Ｈｉｇａ、 Ａ、＋ Ｊ、 Ｍｏ
＋。
、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ −１２で報告されているように
低温のもとて菌を塩化カルシウムで処理して菌膜の透過
性を増大せしめ、プラスミドを移入する方法（Ｍａｎｄ
ｅｌ、 Ｍ ａｎｄ Ｈｉｇａ、 Ａ、＋ Ｊ、 Ｍｏ
＋。
Ｂｉｏｌ、、 ５工、 １５９（１９７０））、枯
草菌で報告されているよう１こ増殖のある段階で自然に
プラスミドを取り込みやすくなること（いわゆるコンヒ
ーテントな状態）を利用して、プラスミドを移入する方
法（Ｄｕｎｃａｎ、 Ｃ，、Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｇ
、 Ａ。
草菌で報告されているよう１こ増殖のある段階で自然に
プラスミドを取り込みやすくなること（いわゆるコンヒ
ーテントな状態）を利用して、プラスミドを移入する方
法（Ｄｕｎｃａｎ、 Ｃ，、Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｇ
、 Ａ。
ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ＋ Ｆ、 Ｅ、＋ Ｇｅｎｅ＋上、
１５３（１９７７））、更には枯草菌、放線菌、酵
母の報告ｅこあるように細胞をプロトプラスト又はスフ
ェロプラストにしてプラスミドを移入する方法（Ｃｈａ
ｎｇ、 Ｓ ａｎｄＣｏｈｅｎ＋Ｓ、 Ｎ、＋ Ｍｏ１
ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １６８ 。
１５３（１９７７））、更には枯草菌、放線菌、酵
母の報告ｅこあるように細胞をプロトプラスト又はスフ
ェロプラストにしてプラスミドを移入する方法（Ｃｈａ
ｎｇ、 Ｓ ａｎｄＣｏｈｅｎ＋Ｓ、 Ｎ、＋ Ｍｏ１
ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、＋ １６８ 。
１１１ （１９７９） ； Ｂｉｂｂ、Ｍ、Ｊ、、
Ｖｌ／１ａｒｄ、Ｊ、Ｍ。
Ｖｌ／１ａｒｄ、Ｊ、Ｍ。
ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ、 Ｄ、 Ａ、Ｉ Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ｉユ４． ３９８（１９７８） ； Ｈｉｎｎ
ｅｎ、Ａ−ｒ Ｈ１ｃｋ＠、Ｊ、Ｂ、ａｎｄＦｉｎｋ、
Ｇ、ＬＩ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｅｔ、
ＵＳＡ＋７５、ｔ９２９（１９７８））等が知られ
ている。
ｅ、 ｉユ４． ３９８（１９７８） ； Ｈｉｎｎ
ｅｎ、Ａ−ｒ Ｈ１ｃｋ＠、Ｊ、Ｂ、ａｎｄＦｉｎｋ、
Ｇ、ＬＩ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｅｔ、
ＵＳＡ＋７５、ｔ９２９（１９７８））等が知られ
ている。
本発明のプラスミドに外来遺伝子を挿入するには、第１
表？こ示すような制限酵素により切断さ矛する個所ｔこ
挿入するのが便利であるが、その内、特に同じ制限酵素
による被切断個所が１カ所であるような個所に挿入する
のが望ましい。外来遺伝子を挿入するには、プラスミド
及び外来遺伝子源となるゲノムＤＮＡをそれぞれ同じ制
限酵素で、部分時又は完全に分解し、これを適当な条件
下に接続せしめればよい。
表？こ示すような制限酵素により切断さ矛する個所ｔこ
挿入するのが便利であるが、その内、特に同じ制限酵素
による被切断個所が１カ所であるような個所に挿入する
のが望ましい。外来遺伝子を挿入するには、プラスミド
及び外来遺伝子源となるゲノムＤＮＡをそれぞれ同じ制
限酵素で、部分時又は完全に分解し、これを適当な条件
下に接続せしめればよい。
外来遺伝子としてグルタミン酸生産性コリネホルム・バ
クテリアのゲノムＤＮＡが最も効率よく、その遺伝情報
が発現される。
クテリアのゲノムＤＮＡが最も効率よく、その遺伝情報
が発現される。
本発明のプラスミドは更に、そのドライブユニット以外
の部分の全部又はその一部を取り除いても当然、上記の
ような宿主微生物内で増殖することができ、しかもより
分子量は小さくなるので、より好ましいベクターとして
使用することかでｉる。
の部分の全部又はその一部を取り除いても当然、上記の
ような宿主微生物内で増殖することができ、しかもより
分子量は小さくなるので、より好ましいベクターとして
使用することかでｉる。
本発明のプラスミドは、細胞内でのフビー数が多く、従
って外来遺伝子を組み換えた時に、多量の遺伝子増１１
が期待できる。
って外来遺伝子を組み換えた時に、多量の遺伝子増１１
が期待できる。
実施例１
ＡＭ３３０ＤＮＡの
ｐ’ＡＭ３３０のＤＮＡを次のようｔこして調製した。
まず、ｐＡＭ３３０をプラスミドとして保有するブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡ Ｔ ＣＣ１３
８６’９をｌｔのＣＭＧ培地（ペプトン１ ｔ ／ｄｉ
、 ｎｌ母エキス！ ｆ／ｄｅ、 ｆルコ−ｙ。
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡ Ｔ ＣＣ１３
８６’９をｌｔのＣＭＧ培地（ペプトン１ ｔ ／ｄｉ
、 ｎｌ母エキス！ ｆ／ｄｅ、 ｆルコ−ｙ。
ｏ、５ｙ／ｄｅ及ヒＮａＣ１Ｏ，５ｆ ／ ｄｅを含む
ｐＨ７，２に調製したもの）ｅこ接種し、３０Ｃで対数
後期まで培養したのち、リゾチーム・ＳＤＳ処理処理上
って溶菌させ、３０．０００Ｘｆ、３０分の超遠心Ｖこ
後、沈澱物をトリス・ＥＤＴＡＩＩＮａＣｌノくノファ
（ＰＨ８，０）の少量に溶解後７カ゛四−スゲル電気泳
動法（電圧ゲル１ｃｒｎ当り５■、ｔｓａ存間）ｔこよ
って最終７４μ２のｐＡＭ３３０プラスミドｐＡＭ３３
０の分子量の決定はアガロ−スゲＩし電気泳動及び電子
顕微鏡観察１こよった。
ｐＨ７，２に調製したもの）ｅこ接種し、３０Ｃで対数
後期まで培養したのち、リゾチーム・ＳＤＳ処理処理上
って溶菌させ、３０．０００Ｘｆ、３０分の超遠心Ｖこ
後、沈澱物をトリス・ＥＤＴＡＩＩＮａＣｌノくノファ
（ＰＨ８，０）の少量に溶解後７カ゛四−スゲル電気泳
動法（電圧ゲル１ｃｒｎ当り５■、ｔｓａ存間）ｔこよ
って最終７４μ２のｐＡＭ３３０プラスミドｐＡＭ３３
０の分子量の決定はアガロ−スゲＩし電気泳動及び電子
顕微鏡観察１こよった。
−アガロースゲル電気泳動はシャープ（Ｐ、’Ａ。
５ｈａｒｐ ）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋
＋（１９７３）’ ） ｖこより、０．７〜０．８％ゲ
ルをバー（１、ゲル長さ−当り、５ｖで１５時間、定電
圧で泳動した。分子量は分子量既知のプラスミドｐＢＲ
３２２〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ、 Ｆ ’）らｇｅ
＠ｅ２＋９５（ｉ９’７７））ｐＵＢ １．１ （１（
グリクザン？ （’ｊｒ／ｅＺａＴ１ ’ｒ、 Ｊ、 ）らＪ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １３４ ＋３ １ ８ （’１
９ ７ ８ ） ＋ Ｃｏ１Ｅ１””” （
／’ ザ ラ − ル（Ｂａｚａｒａｌ Ｍ、）らＪ
、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ ３６ １８５（１９６Ｂ）等と
の移動度の比較１こよって１ｔＨｔ。
＋（１９７３）’ ） ｖこより、０．７〜０．８％ゲ
ルをバー（１、ゲル長さ−当り、５ｖで１５時間、定電
圧で泳動した。分子量は分子量既知のプラスミドｐＢＲ
３２２〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖｅｒ、 Ｆ ’）らｇｅ
＠ｅ２＋９５（ｉ９’７７））ｐＵＢ １．１ （１（
グリクザン？ （’ｊｒ／ｅＺａＴ１ ’ｒ、 Ｊ、 ）らＪ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １３４ ＋３ １ ８ （’１
９ ７ ８ ） ＋ Ｃｏ１Ｅ１””” （
／’ ザ ラ − ル（Ｂａｚａｒａｌ Ｍ、）らＪ
、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ ３６ １８５（１９６Ｂ）等と
の移動度の比較１こよって１ｔＨｔ。
た。
電子Ｉ微鏡観察はクライン・ンユミントら１’４ｂ、７
７０（１９５９））のチトクローム−単分子膜展開法に
よった１、 剪 制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラドリース、ヘー
リンガー・マンノ１イム社、二ニー〇イングランド・バ
イオラブ社、ワーシントンｅノくイオケミカル社の市販
品を使用した。制限酵素ｔこよる消化は、少なくとも３
倍過剰以上の酵素を使用して、各酵素毎ｅこ指定された
条件で行なった。プラスミドＤＮＡを１種以上の制限酵
素で切断する場合Ｖこけ、第１の制限酵素切断断片を分
離用アガロースゲルよりタナ力らの方法（Ｔ、 Ｔａｎ
ａｋａ ａｎｄＢ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、 Ｊ、 ｍ”
ａｃｔｅｒｉｏｌ、、 エヱユ、 ３５４（１９７５）
’］ Ｋより皐離後、エタノ−７し沈澱【こより濃縮
し第２の制限酵素で消化した。
７０（１９５９））のチトクローム−単分子膜展開法に
よった１、 剪 制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラドリース、ヘー
リンガー・マンノ１イム社、二ニー〇イングランド・バ
イオラブ社、ワーシントンｅノくイオケミカル社の市販
品を使用した。制限酵素ｔこよる消化は、少なくとも３
倍過剰以上の酵素を使用して、各酵素毎ｅこ指定された
条件で行なった。プラスミドＤＮＡを１種以上の制限酵
素で切断する場合Ｖこけ、第１の制限酵素切断断片を分
離用アガロースゲルよりタナ力らの方法（Ｔ、 Ｔａｎ
ａｋａ ａｎｄＢ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、 Ｊ、 ｍ”
ａｃｔｅｒｉｏｌ、、 エヱユ、 ３５４（１９７５）
’］ Ｋより皐離後、エタノ−７し沈澱【こより濃縮
し第２の制限酵素で消化した。
切断断片をシャープらの方法（Ｐ、 Ａ、 ’５ｈｅｒ
ｐｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ＋工２．
−３０５５（１９７３））（こよりアガロース電気泳動
にかけた。０．７〜１％のアガロースゲルを用い、ゲル
長さα当たり５〜２０Ｖで１〜数時間、定電圧で泳動し
た。分子量はＤＮＡ分子量標準試料（ペセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ製ΦＸ’１７４ ＲＦ−Ｈａｅ
［１断片及λ びｌＤＮＡ−Ｈ１ｎｄｌｌ断片）との移動度の比較に１
′１より算出した。
ｐｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ＋工２．
−３０５５（１９７３））（こよりアガロース電気泳動
にかけた。０．７〜１％のアガロースゲルを用い、ゲル
長さα当たり５〜２０Ｖで１〜数時間、定電圧で泳動し
た。分子量はＤＮＡ分子量標準試料（ペセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ製ΦＸ’１７４ ＲＦ−Ｈａｅ
［１断片及λ びｌＤＮＡ−Ｈ１ｎｄｌｌ断片）との移動度の比較に１
′１より算出した。
ｐＡＭ３３０を含むブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＴＣＣ１３８６’９を３Ｈ−チミジン１００
μＣｉを含む最少培地（グルコース２０グ、硫安１０ｔ
１尿素２．５９、Ｋｌ（、Ｐｏ、 １ ｆ、ＭｇＳＯ
４・７Ｈ，Ｏ（１，４９、ビオチン５０１ｔｆ、チ７ミ
７ＨＣＩ ２ ０ ０ １ｒｔ 、 Ｆ
ｅＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，０１？及びＭｎＳＯ４’４Ｈ，
，００，０１ｔを１ｔの純水１こ溶解し、ｐＨ７，０に
調製したもの）５−中で３０Ｃ−夜振盪培養し、得られ
た菌体な９ソザイムＳＯ８を用いて溶解後、ＣｓＣ１−
ｇｔＢｒ平衡密度勾配遠心により、閉環状プラスミド区
分を線状と閉環状ＤＮＡとに分離させ、放射能を計測し
た。閉環状プラスミド画分の放射能は０．８〜１．０％
、と求められ、ｐＡＭ３：う（）の分子量を３Ｘ１０６
、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ
＋ ３８６９染色体ＤＮＡ分子量を３ Ｘ １０”とす
る］ と閉環状プラスミドのコピー数は８〜１０コト
計算された（尚、このコピー数測定法は閉環状プラスミ
ドについてのみ計測されるので、菌体内であるいは抽出
操作中に開環状となったものは無視しており、実際のコ
ピー数はこの値以−にとなると考えられる。（換張健二
「分子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則編、講談
社、ｐ１７２（１９７９））−０ ５１１６（ＮＲａＬＢ−１２４０５）（特開昭５２−６
６６８７）より常法により得た染色体ＤＮＡｌ０μノを
とり、制限エンドヌクレアーゼＨｉ＋ｖｄ ［［を与え
、３７Ｃで１０分、３０分、又は６０分反応させ、ＤＮ
Ａ鎖を種々の程度に切断した。プラスミドｐＡＭ３３０
ＤＮＡの場合す５μ？をとり、６０分反応させ、完全に
切断せしめた。
メンタムＡＴＣＣ１３８６’９を３Ｈ−チミジン１００
μＣｉを含む最少培地（グルコース２０グ、硫安１０ｔ
１尿素２．５９、Ｋｌ（、Ｐｏ、 １ ｆ、ＭｇＳＯ
４・７Ｈ，Ｏ（１，４９、ビオチン５０１ｔｆ、チ７ミ
７ＨＣＩ ２ ０ ０ １ｒｔ 、 Ｆ
ｅＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，０１？及びＭｎＳＯ４’４Ｈ，
，００，０１ｔを１ｔの純水１こ溶解し、ｐＨ７，０に
調製したもの）５−中で３０Ｃ−夜振盪培養し、得られ
た菌体な９ソザイムＳＯ８を用いて溶解後、ＣｓＣ１−
ｇｔＢｒ平衡密度勾配遠心により、閉環状プラスミド区
分を線状と閉環状ＤＮＡとに分離させ、放射能を計測し
た。閉環状プラスミド画分の放射能は０．８〜１．０％
、と求められ、ｐＡＭ３：う（）の分子量を３Ｘ１０６
、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ
＋ ３８６９染色体ＤＮＡ分子量を３ Ｘ １０”とす
る］ と閉環状プラスミドのコピー数は８〜１０コト
計算された（尚、このコピー数測定法は閉環状プラスミ
ドについてのみ計測されるので、菌体内であるいは抽出
操作中に開環状となったものは無視しており、実際のコ
ピー数はこの値以−にとなると考えられる。（換張健二
「分子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則編、講談
社、ｐ１７２（１９７９））−０ ５１１６（ＮＲａＬＢ−１２４０５）（特開昭５２−６
６６８７）より常法により得た染色体ＤＮＡｌ０μノを
とり、制限エンドヌクレアーゼＨｉ＋ｖｄ ［［を与え
、３７Ｃで１０分、３０分、又は６０分反応させ、ＤＮ
Ａ鎖を種々の程度に切断した。プラスミドｐＡＭ３３０
ＤＮＡの場合す５μ？をとり、６０分反応させ、完全に
切断せしめた。
６５Ｃ，５分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及
びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮ
Ａ ！Ｉガーゼｔこよって１０ｒ、２４時間ＤＤＮＡ鎖
連結反応を行った。
びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮ
Ａ ！Ｉガーゼｔこよって１０ｒ、２４時間ＤＤＮＡ鎖
連結反応を行った。
６’５Ｃ，５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノー
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
ルを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム扉５１１６
よりＬ−グルタミン酸要求性変異株を誘導し、扁３株（
ＮＲＲＬＢ−１２４ｏ ａ ）を得た。
よりＬ−グルタミン酸要求性変異株を誘導し、扁３株（
ＮＲＲＬＢ−１２４ｏ ａ ）を得た。
この株をＣＭＧ培地２０ｗｊｔこ接種し、３０ｔ？で振
盪培養を行ない、対数増殖期中期まで生育させた後集菌
し、塩化カルシウム法により、コンピテントな（ＤＮＡ
取り込み能を有する）細胞を得た。
盪培養を行ない、対数増殖期中期まで生育させた後集菌
し、塩化カルシウム法により、コンピテントな（ＤＮＡ
取り込み能を有する）細胞を得た。
この細胞懸濁液に上記のＤＮＡの溶解液を加え、ＤＮＡ
を細胞内に取り込ませた。この反応液を適宜希釈して最
少培地プレート（グルコース２０ｖ１硫安１０Ｆ、尿素
２．５ ｆ、 ＫＨｉＰｏ、 １ Ｆ、ＭｇＳＯ４＠
７Ｈ２００，４り、ビオチン５０μ？、チアーミン塩酸
塩２００ ｌｔｔ 、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０１
？。
を細胞内に取り込ませた。この反応液を適宜希釈して最
少培地プレート（グルコース２０ｖ１硫安１０Ｆ、尿素
２．５ ｆ、 ＫＨｉＰｏ、 １ Ｆ、ＭｇＳＯ４＠
７Ｈ２００，４り、ビオチン５０μ？、チアーミン塩酸
塩２００ ｌｔｔ 、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０１
？。
及びＭｎＳＯ４・４ＨｖＯＯ，０１ｔを１ｔの純水に溶
解しｐＨ７，０に調整したものを基本最少培地とし、こ
れに寒天２％を加えて殺菌した固形培地）１こ塗抹し、
３７Ｃで４日間培養した。
解しｐＨ７，０に調整したものを基本最少培地とし、こ
れに寒天２％を加えて殺菌した固形培地）１こ塗抹し、
３７Ｃで４日間培養した。
このようにして形質転換株Ａ Ｊ Ｉ’ １５６’ １
（ＦＥＲＭ’−Ｐ ５４６９ ）を得た。
（ＦＥＲＭ’−Ｐ ５４６９ ）を得た。
ＡＪ１１５６＋を、ＤＮＡ供与菌及びＤＮＡ受容菌と比
較してＬ−グルタミン酸の発酵生産を検定した。
較してＬ−グルタミン酸の発酵生産を検定した。
結果を第１表に示した。培養はグルコース３．６？／ｄ
ｅ、尿素ｏ、ｓｖ／ｄｌ、ＫＨ，ＰＯ４０，１ｆ／ｄｌ
。
ｅ、尿素ｏ、ｓｖ／ｄｌ、ＫＨ，ＰＯ４０，１ｆ／ｄｌ
。
ＭｇＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，１ｔ／ｄｅ、、 ＦｅＳＯ４
−７Ｔ（、Ｏｌａｇ／ｄｅ １Ｍｎ ＳＯ４・４ ）１
． ＯＩ １ｇ／ ｄｌ、チアミン塩酸塩ｏ、ｌ寓ｇ／
１１ビオチン３μＶｔ１大豆蛋白加水分解液（「味液Ｊ
） ａ 、ｎｔ／ｌｕ、及び炭酸カルシウム２．５ｙ
／ｄｉ（別殺菌添加）を含みｐＨ７，０の液体培地を用
い、５００ｇ／容フラスコｔこ培地２０ｗｅを入れ、こ
れ１こ第１表に示す微生物を七矛１ぞれ１白金耳植えつ
け、３１Ｃで４８時間培養した。培養後、遠心上清液中
のＬ−グルタミン酸を酵素法により定植した。
−７Ｔ（、Ｏｌａｇ／ｄｅ １Ｍｎ ＳＯ４・４ ）１
． ＯＩ １ｇ／ ｄｌ、チアミン塩酸塩ｏ、ｌ寓ｇ／
１１ビオチン３μＶｔ１大豆蛋白加水分解液（「味液Ｊ
） ａ 、ｎｔ／ｌｕ、及び炭酸カルシウム２．５ｙ
／ｄｉ（別殺菌添加）を含みｐＨ７，０の液体培地を用
い、５００ｇ／容フラスコｔこ培地２０ｗｅを入れ、こ
れ１こ第１表に示す微生物を七矛１ぞれ１白金耳植えつ
け、３１Ｃで４８時間培養した。培養後、遠心上清液中
のＬ−グルタミン酸を酵素法により定植した。
第 １ 表
扁 ５１１６ ５り
ＯＡ ３
０ＡＪ１１５’６１
９８０実施例２ ｐＡＭ２８６のＤＮＡを次のようｔこして調製した。ま
ず、ｐＡＭ２８６をプラスミドとして保有するコリネバ
クテリウム・グルタミクムＡＪ１１５６０を１１のＣＭ
Ｇ培地（ペプトン１ｆンｄ７！、酵母ｚキス１ ｙ／ｄ
ｅ、 ｆルーｒ−ｙ、ｏ、ｓ ｔ／ｄｉ及ｐ’ＮａｃＩ
＋１．５ ｆ ／ ｄｅを含むｐ Ｈ’ ７．２
ｔ：調製したもの）に接種し、３０Ｃで対数後期まで培
養したのち、リゾチーム・ＳＤＳ処理処理上って溶菌さ
せ、３０．０００Ｘｆ’、３０分の超遠心により上清を
得た。これよりポリエチレングリコールを用いてＤＮＡ
画分を沈澱させ、沈澱区分を１／１０容のＴＥＮバッフ
ァー（２０ｍＭ）リス、２０ ｍ、ＭＮａＣｌ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）に溶解後、ＣｓＣ
１−ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心１こより閉環状プラスミ
ド画分を得、ＥｔＢｒの抽出除去、透析ｔこよる精製を
行ない、最終８２μ２のｐＡＭ２８６ＤＮＡを得た。こ
れらの方法は松原の方法（山川民夫編、生化学実験講座
、２巻１．ｐ７３、東京化学同人（１９７５）ｋこ準じ
た。
ＯＡ ３
０ＡＪ１１５’６１
９８０実施例２ ｐＡＭ２８６のＤＮＡを次のようｔこして調製した。ま
ず、ｐＡＭ２８６をプラスミドとして保有するコリネバ
クテリウム・グルタミクムＡＪ１１５６０を１１のＣＭ
Ｇ培地（ペプトン１ｆンｄ７！、酵母ｚキス１ ｙ／ｄ
ｅ、 ｆルーｒ−ｙ、ｏ、ｓ ｔ／ｄｉ及ｐ’ＮａｃＩ
＋１．５ ｆ ／ ｄｅを含むｐ Ｈ’ ７．２
ｔ：調製したもの）に接種し、３０Ｃで対数後期まで培
養したのち、リゾチーム・ＳＤＳ処理処理上って溶菌さ
せ、３０．０００Ｘｆ’、３０分の超遠心により上清を
得た。これよりポリエチレングリコールを用いてＤＮＡ
画分を沈澱させ、沈澱区分を１／１０容のＴＥＮバッフ
ァー（２０ｍＭ）リス、２０ ｍ、ＭＮａＣｌ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）に溶解後、ＣｓＣ
１−ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心１こより閉環状プラスミ
ド画分を得、ＥｔＢｒの抽出除去、透析ｔこよる精製を
行ない、最終８２μ２のｐＡＭ２８６ＤＮＡを得た。こ
れらの方法は松原の方法（山川民夫編、生化学実験講座
、２巻１．ｐ７３、東京化学同人（１９７５）ｋこ準じ
た。
制限酵素による切断及びアガロースゲル電気泳動ｉ１ｈ
Ｊ施例１に示した方法ｔこ準じて行った。
Ｊ施例１に示した方法ｔこ準じて行った。
ｐＡＭ２８６のコピー数測定
コリネバクテリウム嗜グルターミクムＡＪ１１５６１１
を用い、実施例１に示した方法に準じて行ったところ、
閉環状プラスミドのコピー数は８〜１０コと計算された
（尚、このコピー数決定法は閉環状プラスミドについて
のみ計測されるので、菌体内であるいは抽出操作中Ｖこ
開環状となったもの１ｉ無視しており；実際のコピー数
はこの１１１以上となると考えられる。（長張健二「分
子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則編、講談社、
ｐ！？２（１９７（１））、、）。
を用い、実施例１に示した方法に準じて行ったところ、
閉環状プラスミドのコピー数は８〜１０コと計算された
（尚、このコピー数決定法は閉環状プラスミドについて
のみ計測されるので、菌体内であるいは抽出操作中Ｖこ
開環状となったもの１ｉ無視しており；実際のコピー数
はこの１１１以上となると考えられる。（長張健二「分
子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則編、講談社、
ｐ！？２（１９７（１））、、）。
ｐＡＭ２８６の分子量の決定
ｐＡＭ２８６の分子量の決定は実施例１ｔこ示した方法
によりアガロースゲル電気泳動及び電子顕微鏡観察によ
った。
によりアガロースゲル電気泳動及び電子顕微鏡観察によ
った。
ｐＡＭ２８６を用いたＤＮＡ組換え体の作製プリネバク
テリウム台グルクミクムＡＪ１１５６Ｑより誘導した５
−（２−７ミノエチル）−システィン（ＡＥＣ）耐性変
異株扁２２（ＮＲＲＬ’Ｂ−１２’４１６）を１ｔのＣ
ＭＧ培地（ペプトン１ｆ／ｄｅ、酵母エキスｌ ｆ ／
ｄｅ ｓ グ４ コ−７，０，５ｆ／ｄｅ及びＮａＣ
ｌ Ｏ，５ｆ ／ｄｌを含み、ｐＨ７，２ンこ調整し
たもの）を用い、３０Ｃで約３時間振盪培養を行い、対
数増殖期の菌体を集めた。この菌体よりフェノール法Ｖ
こよる通常のＤＮＡ抽出法Ｖこよって一′染色体ＤＮ’
Ａを抽出精製し、最終４．０ｍ９のＤＮＡを得た。
テリウム台グルクミクムＡＪ１１５６Ｑより誘導した５
−（２−７ミノエチル）−システィン（ＡＥＣ）耐性変
異株扁２２（ＮＲＲＬ’Ｂ−１２’４１６）を１ｔのＣ
ＭＧ培地（ペプトン１ｆ／ｄｅ、酵母エキスｌ ｆ ／
ｄｅ ｓ グ４ コ−７，０，５ｆ／ｄｅ及びＮａＣ
ｌ Ｏ，５ｆ ／ｄｌを含み、ｐＨ７，２ンこ調整し
たもの）を用い、３０Ｃで約３時間振盪培養を行い、対
数増殖期の菌体を集めた。この菌体よりフェノール法Ｖ
こよる通常のＤＮＡ抽出法Ｖこよって一′染色体ＤＮ’
Ａを抽出精製し、最終４．０ｍ９のＤＮＡを得た。
得られた染色体ＤＮＡｌ０μ２をとり、制限エンドヌク
レアーゼＸｂａ ｌを与え、３７Ｃで１０分、３０分、
又は６０分反応させ、ＤＮＡ鎖を種々の程度に切断した
。又、ｐＡＭ２８６ＤＮＡの場合は５７ｔｆをとり、６
０分反応させ、完全に切断せしめた。６５Ｃ，５分の熱
処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによっ
て１０Ｃ１２４時叩ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
レアーゼＸｂａ ｌを与え、３７Ｃで１０分、３０分、
又は６０分反応させ、ＤＮＡ鎖を種々の程度に切断した
。又、ｐＡＭ２８６ＤＮＡの場合は５７ｔｆをとり、６
０分反応させ、完全に切断せしめた。６５Ｃ，５分の熱
処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによっ
て１０Ｃ１２４時叩ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。
６５’Ｃ１５分の熱処理後、反応液Ｖこ２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱コリネバク
テリウム拳グルタミクム扁２２よりＬ−リジン要求性変
異株を誘導し、扁９７（ＮＲＲＬＢ−１２４１７）を得
た。この菌株なＣＭＧ培地培地２０ト／種し、３０Ｃで
振盪培養を行ない、対数増殖期中期まで生育させた後集
菌し、塩化カルシウム法により、コンピテントな（ＤＮ
Ａ胞内に取り込ませた。この反応液を最少培地ブレニド
（グルコース２０ｆ１硫安ｔ’ｏｔｉ尿素２，５２、Ｋ
Ｈ，ＰＯ４１ｔ、ＭｇＳＯ４−７ｍ（、Ｏｎ、４ Ｆ
、ビオチン５０μ？、チアミン塩ｒｌ！塩２００μ？、
Ｆｅ５０．−７Ｈ，００，０１？ 、及びＭｎＳＯ４＠
４Ｈｇ ００．０１ ｔを１ ｔ、の純水に溶解しｐ
Ｈ７，０に調整したものを基本最少培地とし、これに寒
天２％を加えて殺菌した固邪培地）ｔこ塗抹し、３７Ｃ
で４［１間培養した。生じたコロニーな釣菌、純化後ｐ
ＡＭ２８６ｔこＬ−リジン生合成ｔこ関与する遺伝子が
組み入れられているようなプラスミドを保有するコロニ
ーを、目的とする形質転換株として保存した。
ールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱コリネバク
テリウム拳グルタミクム扁２２よりＬ−リジン要求性変
異株を誘導し、扁９７（ＮＲＲＬＢ−１２４１７）を得
た。この菌株なＣＭＧ培地培地２０ト／種し、３０Ｃで
振盪培養を行ない、対数増殖期中期まで生育させた後集
菌し、塩化カルシウム法により、コンピテントな（ＤＮ
Ａ胞内に取り込ませた。この反応液を最少培地ブレニド
（グルコース２０ｆ１硫安ｔ’ｏｔｉ尿素２，５２、Ｋ
Ｈ，ＰＯ４１ｔ、ＭｇＳＯ４−７ｍ（、Ｏｎ、４ Ｆ
、ビオチン５０μ？、チアミン塩ｒｌ！塩２００μ？、
Ｆｅ５０．−７Ｈ，００，０１？ 、及びＭｎＳＯ４＠
４Ｈｇ ００．０１ ｔを１ ｔ、の純水に溶解しｐ
Ｈ７，０に調整したものを基本最少培地とし、これに寒
天２％を加えて殺菌した固邪培地）ｔこ塗抹し、３７Ｃ
で４［１間培養した。生じたコロニーな釣菌、純化後ｐ
ＡＭ２８６ｔこＬ−リジン生合成ｔこ関与する遺伝子が
組み入れられているようなプラスミドを保有するコロニ
ーを、目的とする形質転換株として保存した。
以上のようにして、ＡＪ １ ｊ５７５ （、ＦＥＲＭ
−Ｐ５５０１）を得た。
−Ｐ５５０１）を得た。
得られたリジン生産菌株を、’ＤＮＡＤＮＡ受容菌ＮＡ
受容菌と比較してＬ−リジンの発酵生産を検定した。
受容菌と比較してＬ−リジンの発酵生産を検定した。
結果を第１表に示した。培養はグルコース１０ｆ ／
ｄｉ 、尿素０．５り／ｄ７！、（ＮＨ４）、５ｏ４４
．５ ｔ ／ｄｉ、 ＫＨ，ＰＯ４０，１ｔ ／ｄｌ、
Ｍｇ８０４・７Ｔ（、ＯＯ，０４ｔ／ｄｅ、 ＦｅＳ
Ｏ４−７Ｔ（，０１８９／ｄｌ、 ＭｎＳＯ４−４）１
．Ｏｏ、ｏ ｓ ｑ ／ｄｉｓ−Ｊ−７ミン塩酸塩ｏ、
ｉｍｇ／ｌ、ビオチン０．ｓ ｅＩｇ／ｌ 、アデニン
１ｏｍｇ／ｄｅｓ グルタミン酸ナトリウムｌＯ■／
ｄｉ 、及び炭酸カルシウム５ｙ／ｄｌ（別殺菌添加）
を含みｐＨ８，０に調節した液体培地を用い、５０（Ｉ
ｔ／容フラスコに培地２０ｍ１を入れ、これに第２表ｅ
こ示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ、３１Ｃで７
０時間培養した。培養後、遠心上清液中のし一リジンを
ミクロバイオアンセイ法により定量した。
ｄｉ 、尿素０．５り／ｄ７！、（ＮＨ４）、５ｏ４４
．５ ｔ ／ｄｉ、 ＫＨ，ＰＯ４０，１ｔ ／ｄｌ、
Ｍｇ８０４・７Ｔ（、ＯＯ，０４ｔ／ｄｅ、 ＦｅＳ
Ｏ４−７Ｔ（，０１８９／ｄｌ、 ＭｎＳＯ４−４）１
．Ｏｏ、ｏ ｓ ｑ ／ｄｉｓ−Ｊ−７ミン塩酸塩ｏ、
ｉｍｇ／ｌ、ビオチン０．ｓ ｅＩｇ／ｌ 、アデニン
１ｏｍｇ／ｄｅｓ グルタミン酸ナトリウムｌＯ■／
ｄｉ 、及び炭酸カルシウム５ｙ／ｄｌ（別殺菌添加）
を含みｐＨ８，０に調節した液体培地を用い、５０（Ｉ
ｔ／容フラスコに培地２０ｍ１を入れ、これに第２表ｅ
こ示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ、３１Ｃで７
０時間培養した。培養後、遠心上清液中のし一リジンを
ミクロバイオアンセイ法により定量した。
第 ２ 表
試験菌株 Ｌ−リジン蓄積量（Ｑ／ｄｉ ）４２
２ １ ２０扁（１７
，１２ ＡＪ１１５７５ ２３５
２ １ ２０扁（１７
，１２ ＡＪ１１５７５ ２３５
第１図は、ｐＡＭ３３０の制限酵素切断地図を示す。第
２図は、ｐＡＭ２８６の制限酵素切断地図を示す。 特許出願人 味の素株式会社 第１図 入ｂａ ｌ（ｂ５ ） ＢｃｌＩ（４４）
第１頁の続き ０発 明 者 石田雅昭 川崎市川崎区観音２−、−２０−８ ０発 明 者 中森茂 横浜市金沢区釜利谷町２１５３−１８ ０発 明 者 百瀬春生 ・アメリカ合衆国シシガン州イー ストランシング會パインクレス トドライブ１９６８Ｍ４８８２３
２図は、ｐＡＭ２８６の制限酵素切断地図を示す。 特許出願人 味の素株式会社 第１図 入ｂａ ｌ（ｂ５ ） ＢｃｌＩ（４４）
第１頁の続き ０発 明 者 石田雅昭 川崎市川崎区観音２−、−２０−８ ０発 明 者 中森茂 横浜市金沢区釜利谷町２１５３−１８ ０発 明 者 百瀬春生 ・アメリカ合衆国シシガン州イー ストランシング會パインクレス トドライブ１９６８Ｍ４８８２３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量３．０ ＋０．１メガダルトンであって、第
１図に示す制限酵素切断地図を有するプラスミ ド。 ２ 分子量３．０±０．１メガダルトンであって、第１
図に示す制限酵素切断地図を有し、外来遺伝子が挿入さ
れているプラスミド。 ３ 分子量３．０±０．１メガダルトンであって、第
１図に示す制限酵素切断地図を有し、外来遺伝子が挿入
されていて、宿主微生物内ｔこ取り込まれているプラス
ミド。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56165511A JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | プラスミド |
| DE8282109562T DE3279371D1 (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Plasmid |
| EP19820109562 EP0077548B1 (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56165511A JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5867699A true JPS5867699A (ja) | 1983-04-22 |
| JPS6411280B2 JPS6411280B2 (ja) | 1989-02-23 |
Family
ID=15813777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56165511A Granted JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | プラスミド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0077548B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5867699A (ja) |
| DE (1) | DE3279371D1 (ja) |
Cited By (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58105999A (ja) * | 1981-12-17 | 1983-06-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規ベクタ−プラスミド |
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
| JPS6062994A (ja) * | 1983-08-24 | 1985-04-11 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| JPS61152289A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-10 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド及びそれを有する細菌 |
| JPH0195785A (ja) * | 1987-10-08 | 1989-04-13 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | プラスミドｐＢＹ５０３ |
| US5547864A (en) * | 1993-01-13 | 1996-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Coryneform bacteria deficient in a cell surface protein |
| WO2008114721A1 (ja) | 2007-03-14 | 2008-09-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| WO2009028582A1 (ja) | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | イソプロパノール生産能を有する形質転換体 |
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