JP2634606B2 - プラスミドｐＢＹ５０３ - Google Patents
プラスミドｐＢＹ５０３Info
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規なプラスミドpBY503に関する。更に詳
しくは、本発明はブレビバクテリウム・スタチオニス
（Brevibacterium stationis）IFO12144（FERM BP-251
5）に由来する新規な環状プラスミドに関する。
しくは、本発明はブレビバクテリウム・スタチオニス
（Brevibacterium stationis）IFO12144（FERM BP-251
5）に由来する新規な環状プラスミドに関する。
本発明のプラスミドは、遺伝子組換え用ベクターとし
て、例えばホルモン等の生理活性物質の生産を目的とす
る外来遺伝子のクローニングなどにおいて有用であると
考えられる。
て、例えばホルモン等の生理活性物質の生産を目的とす
る外来遺伝子のクローニングなどにおいて有用であると
考えられる。
先行技術 ブレビバクテリウム属を含むコリネ型細菌は、各種ア
ミノ酸生産菌として工業的に有用な微生物であり、その
宿主−ベクター系の開発は以前から期待され、DNA組み
換え技術による工業用微生物の育種、改良がコリネ型細
菌において試みられている。そのためにはまず、コリネ
型細菌に属する菌株を宿主とするに適したベクターの開
発が必須であり、プラスミドの検索が行なわれている。
ミノ酸生産菌として工業的に有用な微生物であり、その
宿主−ベクター系の開発は以前から期待され、DNA組み
換え技術による工業用微生物の育種、改良がコリネ型細
菌において試みられている。そのためにはまず、コリネ
型細菌に属する菌株を宿主とするに適したベクターの開
発が必須であり、プラスミドの検索が行なわれている。
現在までにコリネ型細菌から見い出されたベクターと
なりえるプラスミドとしては、pCG1（特開昭57-134500
号公報）、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pAM330（特
開昭58-67699号公報）、pBL100（特開昭60-120992号公
報）、pBY501（特開昭60-248182号公報）、pBY502（特
開昭61-179751号公報）などが知られているが、DNA組換
え技術によりコリネ型細菌をさらに工業的有用な微生物
に育種、改良するためには、様々な特徴を有するプラス
ミドベクターの開発が必要であり、そのために新たなプ
ラスミドの発見及び単離が望まれている。
なりえるプラスミドとしては、pCG1（特開昭57-134500
号公報）、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pAM330（特
開昭58-67699号公報）、pBL100（特開昭60-120992号公
報）、pBY501（特開昭60-248182号公報）、pBY502（特
開昭61-179751号公報）などが知られているが、DNA組換
え技術によりコリネ型細菌をさらに工業的有用な微生物
に育種、改良するためには、様々な特徴を有するプラス
ミドベクターの開発が必要であり、そのために新たなプ
ラスミドの発見及び単離が望まれている。
本発明の構成 本発明者らはコリネ型細菌であり、ブレビバクテリウ
ム属に属する菌株を用いて工業的に有用な宿主−ベクタ
ー系を開発すべく鋭意研究を行った結果、今回、ブレビ
バクテリウム・スタチオニスの或る種の菌株から工業的
に有用な宿主−ベクター系におけるベクターとして利用
可能な新規な環状プラスミドを見い出し、本発明を完成
した。
ム属に属する菌株を用いて工業的に有用な宿主−ベクタ
ー系を開発すべく鋭意研究を行った結果、今回、ブレビ
バクテリウム・スタチオニスの或る種の菌株から工業的
に有用な宿主−ベクター系におけるベクターとして利用
可能な新規な環状プラスミドを見い出し、本発明を完成
した。
しかして、本発明によれば、ブレビバクテリウム・ス
タチオニスIFO12144（FERM BP-2515;この菌株はATCC144
03と同一である）に由来する、分子量が約10メガダルト
ンであって、かつ下記第１表に記載の制限酵素に対する
分解特性を示すことを特徴とする新規な環状プラスミド
が提供される。
タチオニスIFO12144（FERM BP-2515;この菌株はATCC144
03と同一である）に由来する、分子量が約10メガダルト
ンであって、かつ下記第１表に記載の制限酵素に対する
分解特性を示すことを特徴とする新規な環状プラスミド
が提供される。
以下このプラスミドを「プラスミドpBY503」と称し、
さらに詳しく説明する。
さらに詳しく説明する。
発明の具体的説明 本発明のプラスミドはブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIFO12144（FERM BP-2515）から単離される新規な環
状プラスミドである。上記菌株からの該プラスミドの分
離、精製は、それ自体既知の手段を用いて行なうことが
できる。例えば、Journal of Bacteriology、129、14
88（1977）に記載の方法；Journal of Bacteriolog
y、135、227-228（1977）に記載の方法及びT.Maniati
s、E.F.Fritsch、J.Sambrook:“Molecular Cloning A L
aboratory Manual"、Cold Spring Harbor Laboratory、
Cold Spring Harbor N.Y.（1982）に記載の方法が挙げ
られる。特に、方法は、穏和な条件下で溶菌処理を施
すため、目的とするプラスミドに切断等の損害を与える
ことなく、収率良くプラスミドを分離することが可能で
あり、好適である。
ニスIFO12144（FERM BP-2515）から単離される新規な環
状プラスミドである。上記菌株からの該プラスミドの分
離、精製は、それ自体既知の手段を用いて行なうことが
できる。例えば、Journal of Bacteriology、129、14
88（1977）に記載の方法；Journal of Bacteriolog
y、135、227-228（1977）に記載の方法及びT.Maniati
s、E.F.Fritsch、J.Sambrook:“Molecular Cloning A L
aboratory Manual"、Cold Spring Harbor Laboratory、
Cold Spring Harbor N.Y.（1982）に記載の方法が挙げ
られる。特に、方法は、穏和な条件下で溶菌処理を施
すため、目的とするプラスミドに切断等の損害を与える
ことなく、収率良くプラスミドを分離することが可能で
あり、好適である。
すなわち、上記方法においては、菌体をリゾチーム
処理により溶菌させ、溶菌液にフエノール・クロロホル
ム処理を施す。同処理液からプラスミドをエタノール沈
澱画分に回収後、エチジウムブロマイドを含む塩化セシ
ウム平衡密度勾配遠心にかけて単離することができる。
処理により溶菌させ、溶菌液にフエノール・クロロホル
ム処理を施す。同処理液からプラスミドをエタノール沈
澱画分に回収後、エチジウムブロマイドを含む塩化セシ
ウム平衡密度勾配遠心にかけて単離することができる。
このようにして分離したプラスミドの分子量並びに各
制限酵素により分解特性は、以下のようにして調べるこ
とができる。
制限酵素により分解特性は、以下のようにして調べるこ
とができる。
制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素存在下
で本発明のプラスミドを完全消化し、それらの消化物を
0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能な断片
の数から決定することができる。
で本発明のプラスミドを完全消化し、それらの消化物を
0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能な断片
の数から決定することができる。
分子量は大腸菌のラムダフアージのDNAをHind IIIで
消化して得られる分子量既知の断片（分子量の大きい順
に15.0、6.1、4.2、2.8、1.5、1.3、0.3、0.08メガダル
トンの大きさを有する）の同一アガロースゲル上での泳
動距離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドの各
断片の分子量を算出し、それらをそれぞれ加算して求め
る。
消化して得られる分子量既知の断片（分子量の大きい順
に15.0、6.1、4.2、2.8、1.5、1.3、0.3、0.08メガダル
トンの大きさを有する）の同一アガロースゲル上での泳
動距離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドの各
断片の分子量を算出し、それらをそれぞれ加算して求め
る。
その結果、本発明の新規なプラスミドは分子量が約10
メガダルトンであり、更に各種制限酵素による分解特性
は次の通りである。本プラスミドはEcoRIで４箇所、Kpn
Iで３箇所、BamHIで１箇所、SauI及びSalIで２箇所切断
される。本発明においては、このような特性を有する新
規なプラスミドを「プラスミドpBY503」と命名した。
メガダルトンであり、更に各種制限酵素による分解特性
は次の通りである。本プラスミドはEcoRIで４箇所、Kpn
Iで３箇所、BamHIで１箇所、SauI及びSalIで２箇所切断
される。本発明においては、このような特性を有する新
規なプラスミドを「プラスミドpBY503」と命名した。
本発明により提供されるプラスミドは、コリネ型細菌
に属する菌株から分離されたもので、同菌株及びその類
縁菌を宿主として自律増殖が可能である。従って当プラ
スミドから自律増殖の機能を損うことなく一部の領域を
欠失したり、別のDNAを挿入付加して加工した誘導体は
コリネ型細菌及びその類縁菌を宿主とするプラスミドベ
クターとして極めて有用である。
に属する菌株から分離されたもので、同菌株及びその類
縁菌を宿主として自律増殖が可能である。従って当プラ
スミドから自律増殖の機能を損うことなく一部の領域を
欠失したり、別のDNAを挿入付加して加工した誘導体は
コリネ型細菌及びその類縁菌を宿主とするプラスミドベ
クターとして極めて有用である。
実施例 実施例１ （１）プラスミドpBY-503の分離と精製 ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium
stationis）IFO12144（FERM BP-2515）をグルコースを
炭素源とする半合成培地（尿素2g、(NH4)2SO4、7g、K2H
PO4 0.5g、KH2PO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、FeSO4・7H
2O 6mg、MnSO4・４〜6H2O 6mg、酵母エキス2.5g、カザ
ミノ酸5g、ビオチン200μｇ、チアミン塩酸塩200μｇ、
グルコース20g及び寒天20gを純水１に溶かしてpH7.2
に調整した寒天培地）に植菌し30℃で一晩培養した後、
菌体を集菌し、10mg/mlの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、10
mM EDTA、50mMグルコース］10mlに懸濁し、37℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ・SDS液［0.2N NaOH、
１％（w/v）SDS］20mlを添加し、緩やかに混和して室温
にて５分間静置した。
stationis）IFO12144（FERM BP-2515）をグルコースを
炭素源とする半合成培地（尿素2g、(NH4)2SO4、7g、K2H
PO4 0.5g、KH2PO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、FeSO4・7H
2O 6mg、MnSO4・４〜6H2O 6mg、酵母エキス2.5g、カザ
ミノ酸5g、ビオチン200μｇ、チアミン塩酸塩200μｇ、
グルコース20g及び寒天20gを純水１に溶かしてpH7.2
に調整した寒天培地）に植菌し30℃で一晩培養した後、
菌体を集菌し、10mg/mlの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、10
mM EDTA、50mMグルコース］10mlに懸濁し、37℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ・SDS液［0.2N NaOH、
１％（w/v）SDS］20mlを添加し、緩やかに混和して室温
にて５分間静置した。
次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［5M酢酸カリウ
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］15mlを
添加し、充分混和してから氷水中に５分間静置した。溶
菌物全量を遠心管に移し、４℃で10分間、15,000×ｇの
遠心分離にかけ、上澄液を得た。
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］15mlを
添加し、充分混和してから氷水中に５分間静置した。溶
菌物全量を遠心管に移し、４℃で10分間、15,000×ｇの
遠心分離にかけ、上澄液を得た。
これに等量のフエノール−クロロホルム液（フエノー
ル−クロロホルム1:1混和液）を加えて懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000×ｇの遠心分離にか
け、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、−20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000×ｇ
の遠心分離にかけ、沈澱を回収した。
ル−クロロホルム1:1混和液）を加えて懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000×ｇの遠心分離にか
け、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、−20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000×ｇ
の遠心分離にかけ、沈澱を回収した。
沈澱を減圧乾燥後、TE緩衝液［トリス10mM、EDTA1m
M、HClにてpH＝８に調製］2mlに溶解した。溶解液に塩
化セシウム溶液［５倍濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシ
ウム170gを溶解させた液］15mlと10mg/mlエチジウムブ
ロマイド溶液1mlを加えて、密度を1.392g/mlに合わせ
た。この溶液を12℃で42時間、116,000×ｇの遠心分離
を行なった。
M、HClにてpH＝８に調製］2mlに溶解した。溶解液に塩
化セシウム溶液［５倍濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシ
ウム170gを溶解させた液］15mlと10mg/mlエチジウムブ
ロマイド溶液1mlを加えて、密度を1.392g/mlに合わせ
た。この溶液を12℃で42時間、116,000×ｇの遠心分離
を行なった。
プラスミドpBY503は紫外線照射により遠心管内で下方
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY503
を含む分画液を得た。
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY503
を含む分画液を得た。
次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
にTE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウ
ム溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノー
ルを加え、−20℃に１時間静置した。この溶液を15,000
×ｇの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY
503を得た。
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
にTE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウ
ム溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノー
ルを加え、−20℃に１時間静置した。この溶液を15,000
×ｇの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY
503を得た。
（２）制限酵素による分解及び分子量測定 前記で調製したプラスミドpBY503をTE緩衝液に溶解
し、過剰量の制限酵素（EcoRI、BamHI、KpnI及びSalIは
宝酒造社製;SauIはベーリンジヤー・マンハイム山之内
社製）を各々の制限酵素適正条件にて反応させた。
し、過剰量の制限酵素（EcoRI、BamHI、KpnI及びSalIは
宝酒造社製;SauIはベーリンジヤー・マンハイム山之内
社製）を各々の制限酵素適正条件にて反応させた。
消化した試料は常法に従い、エチジウムブロマイド１
μg/mlを含有する0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。泳動後、紫外線ランプをゲル平板上に照射すること
で現われるDNA断片の数を測定した。また、各断片の泳
動距離から各々の分子量を算出し、それらを加算してプ
ラスミドpBY503の分子量を求めた。
μg/mlを含有する0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。泳動後、紫外線ランプをゲル平板上に照射すること
で現われるDNA断片の数を測定した。また、各断片の泳
動距離から各々の分子量を算出し、それらを加算してプ
ラスミドpBY503の分子量を求めた。
なお、分子量は同一アガロースゲル上で同時に泳動し
たラムダフアージDNAのHind III消化で生成する分子量
既知の各断片の泳動距離で描かれる標準線に基づいて算
出した。結果を第２表に示す。
たラムダフアージDNAのHind III消化で生成する分子量
既知の各断片の泳動距離で描かれる標準線に基づいて算
出した。結果を第２表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 島津 光伸 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brev
ibacterium stationis）IFO12144に由来し、分子量が約
10メガダルトンであり、制限酵素切断部位数がEcoRI:
4、BamHI:1、SauI:2、KpnI:3、SalI:2であることを特徴
とする環状プラスミドpBY503。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62252379A JP2634606B2 (ja) | 1987-10-08 | 1987-10-08 | プラスミドｐＢＹ５０３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62252379A JP2634606B2 (ja) | 1987-10-08 | 1987-10-08 | プラスミドｐＢＹ５０３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0195785A JPH0195785A (ja) | 1989-04-13 |
| JP2634606B2 true JP2634606B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=17236492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62252379A Expired - Fee Related JP2634606B2 (ja) | 1987-10-08 | 1987-10-08 | プラスミドｐＢＹ５０３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2634606B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3748076B2 (ja) | 2003-10-22 | 2006-02-22 | 船井電機株式会社 | 液晶テレビジョン、パネル表示型テレビジョン |
| JP6785444B1 (ja) | 2020-02-06 | 2020-11-18 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 情報処理装置 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
| JPS60120992A (ja) * | 1983-12-05 | 1985-06-28 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐＢＬ１００ |
| JPS60248182A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | プラスミド↓ｐＢＹ５０１ |
-
1987
- 1987-10-08 JP JP62252379A patent/JP2634606B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
| JPS60120992A (ja) * | 1983-12-05 | 1985-06-28 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐＢＬ１００ |
| JPS60248182A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | プラスミド↓ｐＢＹ５０１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0195785A (ja) | 1989-04-13 |
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