JP2890526B2 - 新規なｄｎａ - Google Patents
新規なｄｎａInfo
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- JP2890526B2 JP2890526B2 JP25839189A JP25839189A JP2890526B2 JP 2890526 B2 JP2890526 B2 JP 2890526B2 JP 25839189 A JP25839189 A JP 25839189A JP 25839189 A JP25839189 A JP 25839189A JP 2890526 B2 JP2890526 B2 JP 2890526B2
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- Japan
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- plasmid
- dna
- solution
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能
を司る新規なDNA領域に関する。
を司る新規なDNA領域に関する。
ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、ア
ミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業
的に有用な微生物であるが、組換えDNA技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシェリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特にコリネ型細菌を宿主とする工業的に
有用なプラスミドベクターの開発が望まれている。
ミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業
的に有用な微生物であるが、組換えDNA技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシェリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特にコリネ型細菌を宿主とする工業的に
有用なプラスミドベクターの開発が望まれている。
一般に造成プラスミドの宿主内での安定性に関して、
従来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入
遺伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が報告されてい
る。その原因には、組換えプラスミドのサイズが問題と
なっており挿入する有用遺伝子によってはトリプトファ
ンオペロンの様に8kbの長さになり、挿入遺伝子内に存
在しない制限酵素によるベクターへのクローニングが困
難となる。従って、小型化したベクタープラスミドの開
発が望まれる。
従来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入
遺伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が報告されてい
る。その原因には、組換えプラスミドのサイズが問題と
なっており挿入する有用遺伝子によってはトリプトファ
ンオペロンの様に8kbの長さになり、挿入遺伝子内に存
在しない制限酵素によるベクターへのクローニングが困
難となる。従って、小型化したベクタープラスミドの開
発が望まれる。
また、プラスミド上に存在するトランスポゾン様配列
（G.Grandi,M.Motles and V.Sgaramella:plasmid,６,p9
9（1981）や、ある一部のDNA領域のために、複製増殖が
不安定になることが知られており、プラスミド上の複製
増殖機能を司るDNA領域のみの純化が望まれている。
（G.Grandi,M.Motles and V.Sgaramella:plasmid,６,p9
9（1981）や、ある一部のDNA領域のために、複製増殖が
不安定になることが知られており、プラスミド上の複製
増殖機能を司るDNA領域のみの純化が望まれている。
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司るDNA領域が、プラ
スミドpBY502に由来する全長が1.1kbのDNA断片内又はプ
ラスミドpBY503に由来する全長が2.9kbのDNA断片内に存
在し、これらのDNA断片を組み込んで造成したプラスミ
ドがコリネ型細菌内で複製増殖可能なことを見い出し本
発明を完成するに至った。
内でプラスミドの複製増殖機能を司るDNA領域が、プラ
スミドpBY502に由来する全長が1.1kbのDNA断片内又はプ
ラスミドpBY503に由来する全長が2.9kbのDNA断片内に存
在し、これらのDNA断片を組み込んで造成したプラスミ
ドがコリネ型細菌内で複製増殖可能なことを見い出し本
発明を完成するに至った。
かくして、本発明によればコリネ型細菌（Ａ）である
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233由来菌株内で、プ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含む、プラスミ
ドpBY502由来の全長1.1kbのDNA領域（ａ）及びプラスミ
ドpBY503由来の全長が2.9kbのDNA領域（ａ）、並びにこ
れらのDNA領域（ａ）が導入されたコリネ型細菌（Ａ）
内で複製増殖可能なプラスミドベクターが提供される。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233由来菌株内で、プ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含む、プラスミ
ドpBY502由来の全長1.1kbのDNA領域（ａ）及びプラスミ
ドpBY503由来の全長が2.9kbのDNA領域（ａ）、並びにこ
れらのDNA領域（ａ）が導入されたコリネ型細菌（Ａ）
内で複製増殖可能なプラスミドベクターが提供される。
本発明のDNA領域（ａ）の供給源となるプラスミドpBY
502は、本願発明者等によりブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavam）MJ-233（FERM BP-149
7）から新たに分離されたプラスミドであり、その詳細
は特開昭63-36787号明細書に開示されている。また、プ
ラスミドpBY503は、本願発明者等によりブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO1
2144（FERM BP-2515）から新たに分離されたプラスミド
であり、その詳細は特開平1-95785号明細書に開示され
ている。
502は、本願発明者等によりブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavam）MJ-233（FERM BP-149
7）から新たに分離されたプラスミドであり、その詳細
は特開昭63-36787号明細書に開示されている。また、プ
ラスミドpBY503は、本願発明者等によりブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO1
2144（FERM BP-2515）から新たに分離されたプラスミド
であり、その詳細は特開平1-95785号明細書に開示され
ている。
本発明のDNA領域（ａ）は、上記のプラスミドpBY502
又はプラスミドpBY503から適当な制限酵素で切り出され
たものであって、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を有するものである限り特に限定されるものでは
ない。その具体例としては、例えば、プラスミドpBY502
から制限酵素SaclとBamHlによって切り出される長さが
1.1kbのDNA断片、プラスミドpBY503から制限酵素Smalと
Sphlによって切り出される長さが2.9kbのDNA断片、また
はこれらのDNA断片の全体であっても良く、その一部断
片であっても良い。上記の1.1kbのDNA断片の各種制限酵
素による認識部位数および切断断片の分子量（長さ）を
表１に、2.9kbのDNA断片の各種制限酵素による認識部位
数および切断断片の分子量（長さ）を表２に示す。な
お、本明細書中に記載したプラスミド又はDNA断片の分
子量（長さ）は、アガロースゲル電気永動法で測定した
値である。
又はプラスミドpBY503から適当な制限酵素で切り出され
たものであって、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を有するものである限り特に限定されるものでは
ない。その具体例としては、例えば、プラスミドpBY502
から制限酵素SaclとBamHlによって切り出される長さが
1.1kbのDNA断片、プラスミドpBY503から制限酵素Smalと
Sphlによって切り出される長さが2.9kbのDNA断片、また
はこれらのDNA断片の全体であっても良く、その一部断
片であっても良い。上記の1.1kbのDNA断片の各種制限酵
素による認識部位数および切断断片の分子量（長さ）を
表１に、2.9kbのDNA断片の各種制限酵素による認識部位
数および切断断片の分子量（長さ）を表２に示す。な
お、本明細書中に記載したプラスミド又はDNA断片の分
子量（長さ）は、アガロースゲル電気永動法で測定した
値である。
表１ 制限酵素 認識部位数 分子量［メガダルトン］ Sphl １ 0.6（0.9）ｘ,0.1（0.2） Baｌ １ 0.4（0.6）,0.3（0.5） Clal １ 0.6（1.0）,0.1（0.1） ｘ ：（ ）内は長さ（kb）を示す。
表２ 制限酵素 認識部位数 分子量［メガダルトン］ Pstl ２ 1.4（2.2）,0.5（0.7） Xbal ３ 1.3（2.0）,0.5（0.8）,0.1
（0.1）ｘ ：（ ）内は長さ（kb）を示す。
（0.1）ｘ ：（ ）内は長さ（kb）を示す。
上記DNA断片を利用したプラスミドベクターを造成す
る方法としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）からプラスミドpBY502DNAを抽出し、
制限酵素BamHlとSacl処理により長さが1.1kbのDNA断片
を、又はブレビバクテリウム・スタチオニスIFO12144
（FERM BP-2515）からプラスミドpBY503DNAを抽出し、
制限酵素SmalとSphl処理により長さが2.9kbのDNA断片を
得る。次に、上記で得たいずれかのDNA断片と、プラス
ミドpHSG398（宝酒造製）又はプラスミドpHSG298（宝酒
造製）を同様の制限酵素で処理したものと酵素処理によ
って結合させることにより造成することができる。
る方法としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）からプラスミドpBY502DNAを抽出し、
制限酵素BamHlとSacl処理により長さが1.1kbのDNA断片
を、又はブレビバクテリウム・スタチオニスIFO12144
（FERM BP-2515）からプラスミドpBY503DNAを抽出し、
制限酵素SmalとSphl処理により長さが2.9kbのDNA断片を
得る。次に、上記で得たいずれかのDNA断片と、プラス
ミドpHSG398（宝酒造製）又はプラスミドpHSG298（宝酒
造製）を同様の制限酵素で処理したものと酵素処理によ
って結合させることにより造成することができる。
このようにして造成される、複製増殖機能を司る遺伝
子を含む、コリネ型細菌内で自律増殖可能なプラスミド
ベクターには、さらに薬剤耐性遺伝子を含むDNA断片、
安定化遺伝子を含むDNA断片、諸種の産業上有用な物質
をコードする構造遺伝子を含むDNA断片、この構造遺伝
子の発現を制御する遺伝子を含むDNA断片等を組み込
み、産業上有用なプラスミドベクターとすることができ
る。この有用遺伝子等で組み換えられたプラスミドベク
ターを宿主微生物に導入し培養することにより、有用遺
伝子にコードされた有用物質を安定に、効率よく生産す
ることが可能となる。
子を含む、コリネ型細菌内で自律増殖可能なプラスミド
ベクターには、さらに薬剤耐性遺伝子を含むDNA断片、
安定化遺伝子を含むDNA断片、諸種の産業上有用な物質
をコードする構造遺伝子を含むDNA断片、この構造遺伝
子の発現を制御する遺伝子を含むDNA断片等を組み込
み、産業上有用なプラスミドベクターとすることができ
る。この有用遺伝子等で組み換えられたプラスミドベク
ターを宿主微生物に導入し培養することにより、有用遺
伝子にコードされた有用物質を安定に、効率よく生産す
ることが可能となる。
以上に述べた、本発明のプラスミドベクターで形質転
換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-149
7）、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233-AB-41（FER
M BP-1498）、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233-AB
T-11（FERM BP-1500）、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ-233-ABD-21（FERM BP-1499）等が挙げられる。
換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-149
7）、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233-AB-41（FER
M BP-1498）、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233-AB
T-11（FERM BP-1500）、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ-233-ABD-21（FERM BP-1499）等が挙げられる。
なお、上記のFERM BP-1498の菌株は、FERM BP-1497の
菌株を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与されたエタノール資化性微生物である（特公昭59-283
98号公報３〜４欄参照）。また、FERM BP-1500号の菌株
は、FERM BP-1497の菌株を親株としたＬ−α−アミノ酪
酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開昭62-5
1998号公報参照）。さらに、FERM BP-1499の菌株はFERM
BP-1497の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭61-177993号公報参
照）。
菌株を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与されたエタノール資化性微生物である（特公昭59-283
98号公報３〜４欄参照）。また、FERM BP-1500号の菌株
は、FERM BP-1497の菌株を親株としたＬ−α−アミノ酪
酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開昭62-5
1998号公報参照）。さらに、FERM BP-1499の菌株はFERM
BP-1497の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭61-177993号公報参
照）。
宿主微生物としてブレビバクテリウム・フラバムMJ-2
33を用いる場合には、本菌株が保有するプラスミドpBY5
02（特開昭63-36787号明細書参照）により形質転換が困
難になる場合があるので、そのような場合は、本菌株よ
り予めプラスミドpBY502を除去することが望ましい。こ
のプラスミドは、例えば、継代培養を繰り返すことによ
り自然に脱落させることも可能であるし、人為的に例え
ばBact.Rev.,36,361〜405（1972）に記載の方法によ
り、除去することも可能である。
33を用いる場合には、本菌株が保有するプラスミドpBY5
02（特開昭63-36787号明細書参照）により形質転換が困
難になる場合があるので、そのような場合は、本菌株よ
り予めプラスミドpBY502を除去することが望ましい。こ
のプラスミドは、例えば、継代培養を繰り返すことによ
り自然に脱落させることも可能であるし、人為的に例え
ばBact.Rev.,36,361〜405（1972）に記載の方法によ
り、除去することも可能である。
プラスミドを人為的に除去する方法の一例を具体的に
示せば以下のとおりである。
示せば以下のとおりである。
宿主ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233の生育を不
完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度:0.2〜
50μg/ml）もしくはエチジウムブロミド（濃度:0.2〜50
μg/ml）等を含む培地に、1ml当り約10細胞になるよう
に植菌し、生育を不完全に阻害しながら、約24時間35℃
で培養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、35℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行ない、プラスミドが除去されている
菌株を選択する。この操作によりpBY502が除去されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ-233由来菌株が得られ
る。
完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度:0.2〜
50μg/ml）もしくはエチジウムブロミド（濃度:0.2〜50
μg/ml）等を含む培地に、1ml当り約10細胞になるよう
に植菌し、生育を不完全に阻害しながら、約24時間35℃
で培養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、35℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行ない、プラスミドが除去されている
菌株を選択する。この操作によりpBY502が除去されたブ
レビバクテリウム・フラバムMJ-233由来菌株が得られ
る。
前記した本発明のプラスミドベクターによる上記宿主
微生物の形質転換は、それ自体既知の方法、例えばCalv
in,N.M and Hanawalt,P.C,Journal of Bacteriology,17
0、2796（1988）;Ito,K.,Nishida.T and Izaki,K、Agri
cultural and Biological Chemistry,52、293（1988）
等の文献に記載の方法により、例えば宿主微生物にパル
ス波を通電することにより行うことができる。
微生物の形質転換は、それ自体既知の方法、例えばCalv
in,N.M and Hanawalt,P.C,Journal of Bacteriology,17
0、2796（1988）;Ito,K.,Nishida.T and Izaki,K、Agri
cultural and Biological Chemistry,52、293（1988）
等の文献に記載の方法により、例えば宿主微生物にパル
ス波を通電することにより行うことができる。
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
しかしながら、下記の実施例は本発明について具体的な
認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによ
って本発明の範囲は何ら限定されるものではない。
しかしながら、下記の実施例は本発明について具体的な
認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによ
って本発明の範囲は何ら限定されるものではない。
実施例１ プラスミドpBY502由来の1.1kbのDNA断片とプ
ラスミドpHSG398からなるプラスミドpCRY2Aの造成 Ａ）プラスミドpBY502の調製 プラスミドpBY502は、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ-233（FERM BP-1497）から新たに分離された分子量が
約30メガダルトンのプラスミドであり、特開昭63-36787
号明細書記載のプラスミドである。プラスミドpBY502は
次のようにして調製した。
ラスミドpHSG398からなるプラスミドpCRY2Aの造成 Ａ）プラスミドpBY502の調製 プラスミドpBY502は、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ-233（FERM BP-1497）から新たに分離された分子量が
約30メガダルトンのプラスミドであり、特開昭63-36787
号明細書記載のプラスミドである。プラスミドpBY502は
次のようにして調製した。
半合成培地Ａ培地［組成：尿素2g、(NH4)2SO47g、K2H
PO40.5g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4・7H2O6mg、Mn
SO4４〜６H2O6mg、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビ
チオン20mg、塩酸チアミン200μｇ、グルコース20g、純
水１］１に、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾチームを
含む緩衝液［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、10mM EDTA、50mMグルコース］20mlに懸濁し、37
℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ−SDS液［0.2
N NaOH、１％（w/v）SDS］40mlを添加し、緩やかに混和
して室温にて15分間静置した。
PO40.5g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4・7H2O6mg、Mn
SO4４〜６H2O6mg、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビ
チオン20mg、塩酸チアミン200μｇ、グルコース20g、純
水１］１に、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233
（FERM BP-1497）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾチームを
含む緩衝液［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、10mM EDTA、50mMグルコース］20mlに懸濁し、37
℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ−SDS液［0.2
N NaOH、１％（w/v）SDS］40mlを添加し、緩やかに混和
して室温にて15分間静置した。
次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［5M酢酸カリウ
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］30mlを
添加し、充分混和してから氷水中に15分間静置した。
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］30mlを
添加し、充分混和してから氷水中に15分間静置した。
溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で10分間、15,000Xg
の遠心分離にかけ、上澄液を得た。
の遠心分離にかけ、上澄液を得た。
これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノー
ル／クロロホルム＝1/1混和液）を加え懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000Xgの遠心分離にかけ、
水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加え、−
20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000Xgの遠心分
離にかけ、沈澱を回収した。
ル／クロロホルム＝1/1混和液）を加え懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000Xgの遠心分離にかけ、
水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加え、−
20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000Xgの遠心分
離にかけ、沈澱を回収した。
沈澱を減圧乾燥後、TE緩衝液［トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン10mM、EDTA1mM;HClにてpH8.0に調
整］2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170gを溶解した溶
液］15mlと10mg/mlエチジウムブロマイド溶液1mlを加え
て、密度を1.392g/mlに合わせた。この溶液を12℃で42
時間、116,000Xgの遠心分離を行なった。
チル）アミノメタン10mM、EDTA1mM;HClにてpH8.0に調
整］2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170gを溶解した溶
液］15mlと10mg/mlエチジウムブロマイド溶液1mlを加え
て、密度を1.392g/mlに合わせた。この溶液を12℃で42
時間、116,000Xgの遠心分離を行なった。
プラスミドpBY502は紫外線照射により遠心管内で下方
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY502
を含む分画液を得た。
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY502
を含む分画液を得た。
次いでこの分画液を当量のイソアミルアルコールで４
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
TE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得ら
れたプラスミドpBY502を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノール
を加え、−20℃にて１時間静置した。この溶液を15,000
Xgの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY50
2を約20μｇ得た。
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
TE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得ら
れたプラスミドpBY502を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノール
を加え、−20℃にて１時間静置した。この溶液を15,000
Xgの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY50
2を約20μｇ得た。
Ｂ）プラスミドpHSG398の準備 プラスミドpHSG398は、エシェリヒア・コリ内で複製
し、クロラムフェニコール耐性を発現する分子量が約1.
4メガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒
造より購入可能である。
し、クロラムフェニコール耐性を発現する分子量が約1.
4メガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒
造より購入可能である。
Ｃ）プラスミドpCRY2Aの造成 プラスミドpHSG398（宝酒造製）0.5μｇに制限酵素Sa
clとBamHl（各々1unit）を37℃１時間反応させ、プラス
ミドDNAを完全に分解した。
clとBamHl（各々1unit）を37℃１時間反応させ、プラス
ミドDNAを完全に分解した。
前記Ａ）項で調製したプラスミドpBY502 2μｇに制限
酵素SaclとBamHl（各々1unit）を37℃で30分間反応さ
せ、プラスミドDNAを部分分解した。
酵素SaclとBamHl（各々1unit）を37℃で30分間反応さ
せ、プラスミドDNAを部分分解した。
両者のプラスミドDNA分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために65℃で10分間加熱処理した後、該失活溶
液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.
6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP及び
T4リガーゼ1unitになるように各成分を強化し、16℃で1
5時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリJ
M109コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
活化するために65℃で10分間加熱処理した後、該失活溶
液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.
6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP及び
T4リガーゼ1unitになるように各成分を強化し、16℃で1
5時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリJ
M109コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は30μg/ml（最終濃度）のクロラムフェニ
コール、100μg/ml（最終濃度）IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、100μg/ml（最終濃
度）Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプ
トン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、純水１;pH7.2）で3
7℃にて24時間培養し、生育株として得られた。これら
生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択
し、各々プラスミドDNAをアルカリ−SDS法［T.Maniati
s,E.F.Fritsch、J.Sambrook、“Molecular cloning"（1
982）90〜91参照］により抽出した。
コール、100μg/ml（最終濃度）IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、100μg/ml（最終濃
度）Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプ
トン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、純水１;pH7.2）で3
7℃にて24時間培養し、生育株として得られた。これら
生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択
し、各々プラスミドDNAをアルカリ−SDS法［T.Maniati
s,E.F.Fritsch、J.Sambrook、“Molecular cloning"（1
982）90〜91参照］により抽出した。
次に形質転換を電気パルス法を用いて実施した。
まずブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERMBP−
1497）プラスミド除去株を100mlの前記Ａ培地で対数増
殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/mlに
なるように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液［272mM
Sucrose,7mM KH2PO4 1mM MgCl2:pH7.4］にて洗浄する。
さらに菌体を遠心分離にて集め、5mlのパルス用溶液に
懸濁し、0.75mlの細胞と上記で得たプラスミドDNA溶液5
0μｌを混合し、氷中にて20分間静置する。ジーンパル
サー（バイオラド社製）を用いて、2,500ボルト、25μF
Dに認定し、パルスを印加後氷中に20分間静置する。全
量を3mlの前記Ａ培地に移し30℃にて１時間培養後、ク
ロラムフェニコール３μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ
寒天培地に植菌し30℃で２〜３日間培養する。出現した
クロラムフェニコール耐性株より、前記Ａ）項に記載の
方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種
制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下記表
３に示す。
1497）プラスミド除去株を100mlの前記Ａ培地で対数増
殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/mlに
なるように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液［272mM
Sucrose,7mM KH2PO4 1mM MgCl2:pH7.4］にて洗浄する。
さらに菌体を遠心分離にて集め、5mlのパルス用溶液に
懸濁し、0.75mlの細胞と上記で得たプラスミドDNA溶液5
0μｌを混合し、氷中にて20分間静置する。ジーンパル
サー（バイオラド社製）を用いて、2,500ボルト、25μF
Dに認定し、パルスを印加後氷中に20分間静置する。全
量を3mlの前記Ａ培地に移し30℃にて１時間培養後、ク
ロラムフェニコール３μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ
寒天培地に植菌し30℃で２〜３日間培養する。出現した
クロラムフェニコール耐性株より、前記Ａ）項に記載の
方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種
制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下記表
３に示す。
表３ 制限酵素 認識部位数 分子量［メガダルトン］ Sacl １ 2.2（3.3）ｘ BamHl １ 2.2（3.4） Sphl ２ 1.6（2.4）,0.6（0.9） Baｌ １ 2.2（3.3） Clal １ 2.2（3.3） ｘ ：（ ）は長さ（kb）を示す。
上記制限酵素の切断断片により特徴づけられるプラス
ミドをpCRY2Aと命名した。
ミドをpCRY2Aと命名した。
以上の結果から、プラスミドpBY502由来の1.1kbのDNA
断片内に、プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子が存
在することを確認した。
断片内に、プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子が存
在することを確認した。
実施例２ プラスミドpCRY2及びpCRY2Aの複製増殖能評
価 プラスミドpCRY2と実施例１で造成したプラスミドpCR
Y2Aの複製増殖能を、これらのプラスミド上にコードさ
れているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）の活性を指標として比較検討した。
価 プラスミドpCRY2と実施例１で造成したプラスミドpCR
Y2Aの複製増殖能を、これらのプラスミド上にコードさ
れているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）の活性を指標として比較検討した。
上記のプラスミドpCRY2は、本願発明者らが新規に造
成し、先に提案したプラスミドベクターであり、プラス
ミドpBY502に由来する全長が4.1kbの複製増殖機能を司
るDNA領域とプラスミドpHSG398に由来するDNA領域を保
有するものである（特開平1-191686号明細書参照）。こ
のプラスミドは実施例１で造成したプラスミドpCRY2Aの
親プラスミドに相当する。
成し、先に提案したプラスミドベクターであり、プラス
ミドpBY502に由来する全長が4.1kbの複製増殖機能を司
るDNA領域とプラスミドpHSG398に由来するDNA領域を保
有するものである（特開平1-191686号明細書参照）。こ
のプラスミドは実施例１で造成したプラスミドpCRY2Aの
親プラスミドに相当する。
プラスミドpCRY2あるいはpCRY2Aを保有するブレビバ
クテリウム・フラバムMJ233株を、クロラムフェニコー
ル３μg/ml（最終濃度）添加した半合成Ａ培地（実施例
１に記載）に植菌し、一晩前培養した後に、同培地100m
lを含んだ500ml三角フラスコに１％v/v植菌し、６時間
培養したものを集菌し、CATの活性測定に用いた。CAT活
性は、W.V.Shawらの方法〔J.Bacteriology Jan.（196
8） 28〜36参照〕に従った。その結果を表４にプラスミ
ドpCRY2を保有する菌株の活性を１とした相対活性で示
した。
クテリウム・フラバムMJ233株を、クロラムフェニコー
ル３μg/ml（最終濃度）添加した半合成Ａ培地（実施例
１に記載）に植菌し、一晩前培養した後に、同培地100m
lを含んだ500ml三角フラスコに１％v/v植菌し、６時間
培養したものを集菌し、CATの活性測定に用いた。CAT活
性は、W.V.Shawらの方法〔J.Bacteriology Jan.（196
8） 28〜36参照〕に従った。その結果を表４にプラスミ
ドpCRY2を保有する菌株の活性を１とした相対活性で示
した。
表４ 菌 株 CAT活性（相対活性） pCRY2A保有 1.5 pCRY2 保有 １ 表４より、親プラスミドの複製増殖機能を司るDNA領
域4.1kbより1.1kbに小型化することにより、親プラスミ
ドの1.5倍の複製増殖能を保持することを確認した。
域4.1kbより1.1kbに小型化することにより、親プラスミ
ドの1.5倍の複製増殖能を保持することを確認した。
実施例３ プラスミドpBY503由来の2.9kbのDNA断片とプ
ラスミドpHSG398からなるプラスミドpCRY2.9の造成 Ａ）プラスミドpBY503の調製 プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIF012144（FERM BP-2515）から新たに分離された分
子量が約10メガダルトンのプラスミドであり、特開平1-
95785号明細書記載のプラスミドである。プラスミドpBY
503は次のようにして調製した。
ラスミドpHSG398からなるプラスミドpCRY2.9の造成 Ａ）プラスミドpBY503の調製 プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIF012144（FERM BP-2515）から新たに分離された分
子量が約10メガダルトンのプラスミドであり、特開平1-
95785号明細書記載のプラスミドである。プラスミドpBY
503は次のようにして調製した。
半合成培地Ａ培地［組成：尿素2g、(NH4)2SO47g、K2H
PO40.5g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4・7H2O6mg、MnS
O4４〜６H206mg、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビチ
オン200μｇ、塩酸チアミン200μｇ、グリコース20g、
純水１］１に、ブレビバクテリウム・スタチオニス
IF012144（FERM BP-2515）を対数増殖期後期まで培養
し、菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリ
ゾチームを含む緩衝液［25mMトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、10mM EDTA、50mMグリコース］20ml
に懸濁し、37℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ
−SDS液［0.2N NaOH、１％（w/v）SDS］40mlを添加し、
緩やかに混和して室温にて15分間静置した。
PO40.5g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4・7H2O6mg、MnS
O4４〜６H206mg、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、ビチ
オン200μｇ、塩酸チアミン200μｇ、グリコース20g、
純水１］１に、ブレビバクテリウム・スタチオニス
IF012144（FERM BP-2515）を対数増殖期後期まで培養
し、菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリ
ゾチームを含む緩衝液［25mMトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、10mM EDTA、50mMグリコース］20ml
に懸濁し、37℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ
−SDS液［0.2N NaOH、１％（w/v）SDS］40mlを添加し、
緩やかに混和して室温にて15分間静置した。
次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［5M酢酸カリウ
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］30mlを
添加し、充分混和してから氷水中に15分間静置した。
ム溶液60ml、酢酸11.5ml、純水28.5mlの混合液］30mlを
添加し、充分混和してから氷水中に15分間静置した。
溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で10分間、15,000Xg
の遠心分離にかけ、上澄液を得た。
の遠心分離にかけ、上澄液を得た。
これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノー
ル／クロロホルム＝1/1混和液）を加え懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000Xgの遠心分離にかけ、
水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加え、−
20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000Xgの遠心分
離にかけ、沈澱を回収した。
ル／クロロホルム＝1/1混和液）を加え懸濁後、遠心管
に移し、室温下で５分間、15,000Xgの遠心分離にかけ、
水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加え、−
20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000Xgの遠心分
離にかけ、沈澱を回収した。
沈澱を減圧乾燥機、TE緩衝液［トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン10mM、EDTA1mM;HClにてpH8.0に調
製］2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170gを溶解した溶
液］15mlと10mg/mlエチジウムブロマイド溶液1mlを加え
て、密度を1.392g/mlに合わせた。この溶液を12℃で42
時間、116,000Xgの遠心分離を行なった。
チル）アミノメタン10mM、EDTA1mM;HClにてpH8.0に調
製］2mlに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシウム170gを溶解した溶
液］15mlと10mg/mlエチジウムブロマイド溶液1mlを加え
て、密度を1.392g/mlに合わせた。この溶液を12℃で42
時間、116,000Xgの遠心分離を行なった。
プラスミドpBY503は紫外線照射により遠心管内で下方
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY503
を含む分画液を得た。
のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で遠
心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY503
を含む分画液を得た。
次いでこの分画液を当量のイソアミルアルコールで４
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
TE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得ら
れたプラスミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノール
を加え、−20℃にて１時間静置した。この溶液を15,000
Xgの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY50
3を約20μｇ得た。
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
TE緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得ら
れたプラスミドpBY503を含む透析液に3M酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量のエタノール
を加え、−20℃にて１時間静置した。この溶液を15,000
Xgの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY50
3を約20μｇ得た。
Ｂ）プラスミドpHSG398の準備 プラスミドpHSG398は、エシェリヒア・コリ内で複製
し、クロラムフェニコール耐性を発現する分子量が約1.
4メガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒
造より購入可能である。
し、クロラムフェニコール耐性を発現する分子量が約1.
4メガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒
造より購入可能である。
Ｃ）プラスミドpCRY2.9の造成 プラスミドpHSG398（宝酒造製）0.5μｇに制限酵素Sm
alとSphl（各々1unit）を37℃１時間反応させ、プラス
ミドDNAを完全に分解した。 前記Ａ）項で調製したプ
ラスミドpBY503 2μｇに制限酵素SmalとSphl（各々1uni
t）を37℃で30分間反応させ、プラスミドDNAを部分分解
した。
alとSphl（各々1unit）を37℃１時間反応させ、プラス
ミドDNAを完全に分解した。 前記Ａ）項で調製したプ
ラスミドpBY503 2μｇに制限酵素SmalとSphl（各々1uni
t）を37℃で30分間反応させ、プラスミドDNAを部分分解
した。
両者のプラスミドDNA分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために65℃で10分間加熱処理した後、該失活溶
液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.
6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP及び
T4リガーゼ1unitになるように各成分を強化し、16℃で1
5時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリJ
M109コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
活化するために65℃で10分間加熱処理した後、該失活溶
液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.
6、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP及び
T4リガーゼ1unitになるように各成分を強化し、16℃で1
5時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリJ
M109コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は30μg/ml（最終濃度）のクロラムフェニ
コール、100μg/ml（最終濃度）IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、100μg/ml（最終濃
度）Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプ
トン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、純水１;pH7.2）で3
7℃にて24時間培養し、生育株として得られた。これら
生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択
し、各々プラスミドDNAをアルカリ−SDS法［T.Maniati
s,E.F.Fritsch、J.Sambrook、“Molecular cloning"（1
982）90〜91参照］により抽出した。
コール、100μg/ml（最終濃度）IPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、100μg/ml（最終濃
度）Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプ
トン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、純水１;pH7.2）で3
7℃にて24時間培養し、生育株として得られた。これら
生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択
し、各々プラスミドDNAをアルカリ−SDS法［T.Maniati
s,E.F.Fritsch、J.Sambrook、“Molecular cloning"（1
982）90〜91参照］により抽出した。
次に形質転換を電気パルス法を用いて実施した。
まずブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-
1497）プラスミド除去株を100mlの前記Ａ培地で対数増
殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/mlに
なるように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液［272mM
Sucrose,7mM KH2PO41mM MgCl2:pH7.4］にて洗浄する。
さらに菌体を遠心分離にて集め、5mlのパルス用溶液に
懸濁し、0.75mlの細胞と上記で得たプラスミドDNA溶液5
0μｌの混合し、氷中にて20分間静置する。ジーンパル
サー（バイオラド社製）を用いて、2,500ボルト、25μF
Dに認定し、パルスを印加後氷中に20分間静置する。全
量を3mlの前記Ａ培地に移し30℃にて１時間培養後、ク
ロラムフェニコール３μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ
寒天培地に植菌し30℃で２〜３日間培養する。出現した
クロラムフェニコール耐性株より、前記Ａ）項に記載の
方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種
制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下記表
５に示す。
1497）プラスミド除去株を100mlの前記Ａ培地で対数増
殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/mlに
なるように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を20mlのパルス用溶液［272mM
Sucrose,7mM KH2PO41mM MgCl2:pH7.4］にて洗浄する。
さらに菌体を遠心分離にて集め、5mlのパルス用溶液に
懸濁し、0.75mlの細胞と上記で得たプラスミドDNA溶液5
0μｌの混合し、氷中にて20分間静置する。ジーンパル
サー（バイオラド社製）を用いて、2,500ボルト、25μF
Dに認定し、パルスを印加後氷中に20分間静置する。全
量を3mlの前記Ａ培地に移し30℃にて１時間培養後、ク
ロラムフェニコール３μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ
寒天培地に植菌し30℃で２〜３日間培養する。出現した
クロラムフェニコール耐性株より、前記Ａ）項に記載の
方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種
制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下記表
５に示す。
上記制限酵素の切断断片により特徴づけられるプラス
ミドをpCRY2.9と命名した。
ミドをpCRY2.9と命名した。
以上の結果から、プラスミドpBY503由来の2.9kbのDNA
断片内に、プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子が存
在することを確認した。
断片内に、プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子が存
在することを確認した。
実施例４ プラスミドpCRY3及びpCRY2.9の複製増殖能評
価 プラスミドpCRY3と実施例３で造成したプラスミドpCR
Y2.9の複製増殖能を、これらのプラスミド上にコードさ
れているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）の活性を指標として比較検討した。
価 プラスミドpCRY3と実施例３で造成したプラスミドpCR
Y2.9の複製増殖能を、これらのプラスミド上にコードさ
れているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）の活性を指標として比較検討した。
上記のプラスミドpCRY3は、本願発明者らが新規に造
成し、先に提案したプラスミドベクターであり、プラス
ミドpBY503に由来する全長が6.0kbの複製増殖機能を司
るDNA領域とプラスミドpHSG398に由来するDNA領域を保
有するものである（特開平1-191686号明細書参照）。こ
のプラスミドは実施例３で造成したプラスミドpCRY2.9
の親プラスミドに相当する。
成し、先に提案したプラスミドベクターであり、プラス
ミドpBY503に由来する全長が6.0kbの複製増殖機能を司
るDNA領域とプラスミドpHSG398に由来するDNA領域を保
有するものである（特開平1-191686号明細書参照）。こ
のプラスミドは実施例３で造成したプラスミドpCRY2.9
の親プラスミドに相当する。
プラスミドpCRY3あるいはpCRY2.9を保有するブレビバ
クテリウム・フラバムMJ233株を、クロラムフェニコー
ル３μg/ml（最終濃度）添加した前記の半合成Ａ培地に
植菌し、一晩前培養した後に、同培地100mlを含んだ500
ml三角フラスコに１％v/v植菌し、６時間培養したもの
を集菌し、CATの活性測定に用いた。CAT活性は、W.V.Sh
awらの方法〔J.Bacteriology Jan.（1968）28〜36参
照〕に従った。その結果を表６にプラスミドpCRY3を保
有する菌株の活性を１とした相対活性で示した。
クテリウム・フラバムMJ233株を、クロラムフェニコー
ル３μg/ml（最終濃度）添加した前記の半合成Ａ培地に
植菌し、一晩前培養した後に、同培地100mlを含んだ500
ml三角フラスコに１％v/v植菌し、６時間培養したもの
を集菌し、CATの活性測定に用いた。CAT活性は、W.V.Sh
awらの方法〔J.Bacteriology Jan.（1968）28〜36参
照〕に従った。その結果を表６にプラスミドpCRY3を保
有する菌株の活性を１とした相対活性で示した。
表６ 菌 株 CAT活性（相対活性） pCRY2.9保有 1.8 pCRY3 保有 １ 表６より、親プラスミドの複製増殖機能を司るDNA領
域6.0kbより2.9kbに小型化することにより、親プラスミ
ドの1.8倍の複製増殖能を保持することを確認した。
域6.0kbより2.9kbに小型化することにより、親プラスミ
ドの1.8倍の複製増殖能を保持することを確認した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (56)参考文献 特開 平１−95785（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−36787（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】コリネ型細菌（Ａ）に属する菌株細胞内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子をからなるDNA
領域（ａ）であって、プラスミドpBY502由来の全長1.1k
bのDNA断片であって制限酵素による認識部位数及び切断
断片の大きさが下記表１に示されるものであるDNA断
片、又は、該DNA領域（ａ）がプラスミドpBY503由来の
全長2.9kbのDNA断片であって制限酵素による認識部位数
及び切断断片の大きさが下記表２に示されるものである
DNA断片であるDNA領域（ａ）。 表１ 制限酵素 認識部位数 分子量［メガダルトン］ Sphl １ 0.6（0.9）ｘ,0.1（0.2） Baｌ １ 0.4（0.6）,0.3（0.5） Clal １ 0.6（1.0）,0.1（0.1） ｘ ：（ ）内は長さ（kb）を示す。 表２ 制限酵素 認識部位数 分子量［メガダルトン］ Pstl ２ 1.4（2.2）,0.5（0.7） Xbal ３ 1.3（2.0）,0.5（0.8）,0.1
（0.1）ｘ ：（ ）内は長さ（kb）を示す。 - 【請求項２】請求項１記載のDNA領域（ａ）が導入され
たコリネ型細菌（Ａ）内で複製増殖可能な組換えプラス
ミドベクター。 - 【請求項３】請求項３記載のプラスミドベクターを用い
て形質転換されたコリネ型細菌（Ａ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25839189A JP2890526B2 (ja) | 1989-10-03 | 1989-10-03 | 新規なｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25839189A JP2890526B2 (ja) | 1989-10-03 | 1989-10-03 | 新規なｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03119992A JPH03119992A (ja) | 1991-05-22 |
| JP2890526B2 true JP2890526B2 (ja) | 1999-05-17 |
Family
ID=17319588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25839189A Expired - Lifetime JP2890526B2 (ja) | 1989-10-03 | 1989-10-03 | 新規なｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2890526B2 (ja) |
-
1989
- 1989-10-03 JP JP25839189A patent/JP2890526B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03119992A (ja) | 1991-05-22 |
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