JPH0761267B2 - 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 - Google Patents
組換えベクタ−及びそれを有する細菌Info
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- JPH0761267B2 JPH0761267B2 JP61066532A JP6653286A JPH0761267B2 JP H0761267 B2 JPH0761267 B2 JP H0761267B2 JP 61066532 A JP61066532 A JP 61066532A JP 6653286 A JP6653286 A JP 6653286A JP H0761267 B2 JPH0761267 B2 JP H0761267B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- biotin
- recombinant vector
- plasmid
- escherichia coli
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- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な組換えベクター及びそれを含む細菌に関
し、さらに詳しくは、デスチオビオチンからビオチンを
生合成する反応に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸（DNA）を組込んだ組換えベクター及びそれを含有
する細菌に関する。
し、さらに詳しくは、デスチオビオチンからビオチンを
生合成する反応に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸（DNA）を組込んだ組換えベクター及びそれを含有
する細菌に関する。
（従来の技術） ビオチンは、動物、植物、微生物などにとって必要なビ
タミンであり、遺伝子組み換え技術の応用による工業的
な生産が強く望まれている物質である。しかし、ビチオ
ン生合成反応に関与する遺伝情報の解析は、大腸菌につ
いては実施されている〔ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー94、2065（1967），ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー112、830（1972），ネーチャー276,689（197
8）など〕ものの、大腸菌によるビチオン産生量はきわ
めて微量であり、工業的実用化の点から見ればまったく
不十分なものであった。
タミンであり、遺伝子組み換え技術の応用による工業的
な生産が強く望まれている物質である。しかし、ビチオ
ン生合成反応に関与する遺伝情報の解析は、大腸菌につ
いては実施されている〔ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー94、2065（1967），ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー112、830（1972），ネーチャー276,689（197
8）など〕ものの、大腸菌によるビチオン産生量はきわ
めて微量であり、工業的実用化の点から見ればまったく
不十分なものであった。
一方、バチルス属に属する微生物を培養することにより
ビオチンを産生する方法も知られており、大腸菌に比較
してはるかに多量のビオチンを産生する菌も見い出され
ている（例えば特開昭56−160998号、同58−60996号、
同58−152495号など）。しかし、バチルス属細菌のビチ
オン生合成に関与する遺伝情報の解析はほとんどなされ
ておらず、それゆえ遺伝子組換え技術にそれを応用する
ことはきわめて困難な状態にあった。
ビオチンを産生する方法も知られており、大腸菌に比較
してはるかに多量のビオチンを産生する菌も見い出され
ている（例えば特開昭56−160998号、同58−60996号、
同58−152495号など）。しかし、バチルス属細菌のビチ
オン生合成に関与する遺伝情報の解析はほとんどなされ
ておらず、それゆえ遺伝子組換え技術にそれを応用する
ことはきわめて困難な状態にあった。
（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下でバチルス属
細菌からビオチン生合成に関与する遺伝情報を担うDNA
を採取すべく鋭意検討の結果、ビオチン生合成経路の最
終経路であるデスチビオチンからビオチンを生合成する
反応に関与する遺伝情報を担うDNA（以下、ビチオン合
成酵素をコードするDNAを称することがある）の採取に
成功し、かつそのDNAを組込んだ組換えベクターによっ
て形質転換された細菌は高いビオチン産生能を有するこ
とを見い出し、本発明を完成するに到った。
細菌からビオチン生合成に関与する遺伝情報を担うDNA
を採取すべく鋭意検討の結果、ビオチン生合成経路の最
終経路であるデスチビオチンからビオチンを生合成する
反応に関与する遺伝情報を担うDNA（以下、ビチオン合
成酵素をコードするDNAを称することがある）の採取に
成功し、かつそのDNAを組込んだ組換えベクターによっ
て形質転換された細菌は高いビオチン産生能を有するこ
とを見い出し、本発明を完成するに到った。
（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、第一の発明として、ビチオン
産生能を有するバチルス属細菌から採取したデスチオビ
オチンからビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情
報を担うDNAを組み込んだ組換えベクターであって、該D
NAが、MboI,TaqI,RsaI,TaqI,RsaI,MboI,MboI,HindII,Ta
qI,TaqI,TaqI,HindIIIの順に並ぶ制限酵素切断点を持つ
約1.5kbのDNA断片、MboI,HindIII,HindIII、EcoRIの順
に並ぶ制限酵素切断点を持つ約3.5kbのDNA断片、及びMb
oI,HindIII,HindIII,EcoRI,SalI,HindIII,PstI,EcoRI,B
amHIの順に並ぶ制限酵素切断点を持つ約8.2kbのDNA断片
より成る群から選ばれるDNA断片を含むDNAである組換え
ベクターが提供され、第二の発明として、ビオチン産生
能を有するバチルス属細菌から採取したデスチオビオチ
ンからビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情報を
担うDNAを組み込んだ組換えベクターによって形質転換
または形質導入された細菌が提供される。
産生能を有するバチルス属細菌から採取したデスチオビ
オチンからビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情
報を担うDNAを組み込んだ組換えベクターであって、該D
NAが、MboI,TaqI,RsaI,TaqI,RsaI,MboI,MboI,HindII,Ta
qI,TaqI,TaqI,HindIIIの順に並ぶ制限酵素切断点を持つ
約1.5kbのDNA断片、MboI,HindIII,HindIII、EcoRIの順
に並ぶ制限酵素切断点を持つ約3.5kbのDNA断片、及びMb
oI,HindIII,HindIII,EcoRI,SalI,HindIII,PstI,EcoRI,B
amHIの順に並ぶ制限酵素切断点を持つ約8.2kbのDNA断片
より成る群から選ばれるDNA断片を含むDNAである組換え
ベクターが提供され、第二の発明として、ビオチン産生
能を有するバチルス属細菌から採取したデスチオビオチ
ンからビオチンを生合成する反応に関与する遺伝情報を
担うDNAを組み込んだ組換えベクターによって形質転換
または形質導入された細菌が提供される。
本発明において、ビオチン合成酵素をコードするDNAを
採取する目的を用いられる微生物は、バチルス属とくに
バチルス・スフェリカスに属するビオチン生産菌、すな
わちビオチン生合成の酵素系を有している微生物である
限り、自然界から新たに分離された菌株でも既存の培養
菌株でもよく、また、これらの菌株を通常の微生物突然
変異誘発法（例えば、紫外線,X線，γ線照射などの物理
的処理やニトロソグアニジンなどの薬剤による化学的処
理による方法）で処理することによって得られた菌株で
あっても良い。さらに、ビオチン産生能を高めるために
上記菌株にアクチチアジン酸（すなわちアシドマイシ
ン）またはアクチチアジン酸及び５−（２−チエニル）
吉草酸のそれぞれ単独、あるいは双方に対する耐生を付
与した菌株などであっても良い。このような菌株の具体
例としては、例えば、バチルス・スフェリカス（Bacill
us sphaericus）IFO3525や、そのＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理変異株（微工研寄託
番号−6422、同−6421、同−6143）などが例示される。
採取する目的を用いられる微生物は、バチルス属とくに
バチルス・スフェリカスに属するビオチン生産菌、すな
わちビオチン生合成の酵素系を有している微生物である
限り、自然界から新たに分離された菌株でも既存の培養
菌株でもよく、また、これらの菌株を通常の微生物突然
変異誘発法（例えば、紫外線,X線，γ線照射などの物理
的処理やニトロソグアニジンなどの薬剤による化学的処
理による方法）で処理することによって得られた菌株で
あっても良い。さらに、ビオチン産生能を高めるために
上記菌株にアクチチアジン酸（すなわちアシドマイシ
ン）またはアクチチアジン酸及び５−（２−チエニル）
吉草酸のそれぞれ単独、あるいは双方に対する耐生を付
与した菌株などであっても良い。このような菌株の具体
例としては、例えば、バチルス・スフェリカス（Bacill
us sphaericus）IFO3525や、そのＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理変異株（微工研寄託
番号−6422、同−6421、同−6143）などが例示される。
これら細菌株からビオチン合成酵素をコードするDNAを
採取する方法については特に限定された方法を用いる必
要はなく、例えば上記細菌株から全DNAを常法により単
離精製し、制限酵素で切断したあと、該制限酵素と同じ
接着末端をDNAに生じさせることのできる制限酵素で切
断したベクターと酵素的に結合させ、得られた組換えベ
クターを用いてデスチオビオチンからビオチンへの生合
成能の欠失したビオチン要求性変異株を形質転換（また
は形質導入）し、得られた形質転換株の中からビオチン
産生能を付与された菌株を選択すれば良い。
採取する方法については特に限定された方法を用いる必
要はなく、例えば上記細菌株から全DNAを常法により単
離精製し、制限酵素で切断したあと、該制限酵素と同じ
接着末端をDNAに生じさせることのできる制限酵素で切
断したベクターと酵素的に結合させ、得られた組換えベ
クターを用いてデスチオビオチンからビオチンへの生合
成能の欠失したビオチン要求性変異株を形質転換（また
は形質導入）し、得られた形質転換株の中からビオチン
産生能を付与された菌株を選択すれば良い。
本発明において組換えベクターを構築するためのベクタ
ーとしては、前記ビオチン要求性変異株を形質転換（ま
たは形質導入）し得るものならどんなものでも良く、例
えばビオチン要求性変異株として大腸菌を用いる場合、
EK系プラスミドベクターとしてストリンゼント型のpSC1
01,pRK353,pRK646,pRK248,pDF41など，リラックス型の
ものとしてColE1,pVH51,pAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR
313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY
2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK2004,pACYC1,pACYC184,pUC
8,pUC9,など、λgt系ファージベクターとしてλgt・λ
C,λgt・λB,λWES・λC,λWES・λB,λZJvir・λ
Ｂ′，λALO・λB,λWES・T5622,λDamなどが用いられ
る。これらのベクターのなかではプラスミドベクターが
とくに賞用される。
ーとしては、前記ビオチン要求性変異株を形質転換（ま
たは形質導入）し得るものならどんなものでも良く、例
えばビオチン要求性変異株として大腸菌を用いる場合、
EK系プラスミドベクターとしてストリンゼント型のpSC1
01,pRK353,pRK646,pRK248,pDF41など，リラックス型の
ものとしてColE1,pVH51,pAC105,RSF2124,pCR1,pMB9,pBR
313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR327,pBR328,pKY2289,pKY
2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK2004,pACYC1,pACYC184,pUC
8,pUC9,など、λgt系ファージベクターとしてλgt・λ
C,λgt・λB,λWES・λC,λWES・λB,λZJvir・λ
Ｂ′，λALO・λB,λWES・T5622,λDamなどが用いられ
る。これらのベクターのなかではプラスミドベクターが
とくに賞用される。
また、上記ビオチン要求性変位株としては、バチルス属
の遺伝情報を担うDNAが該菌体内で発現可能な菌株であ
ればいずれでも良く、そのような変異株は公知の方法に
よって再現性よく得ることができる（例えばジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol）115,p662,19
73年：プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス・イン・USA（Pro.Natl.Acad.Sci.US
A）69,p2219,1972年：ヴィロロジー（Virology）42,p47
4,1970年など）。
の遺伝情報を担うDNAが該菌体内で発現可能な菌株であ
ればいずれでも良く、そのような変異株は公知の方法に
よって再現性よく得ることができる（例えばジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol）115,p662,19
73年：プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス・イン・USA（Pro.Natl.Acad.Sci.US
A）69,p2219,1972年：ヴィロロジー（Virology）42,p47
4,1970年など）。
例えばエシェリヒア・コリC600〔プロシーディング・オ
ブ・ナチュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス714579
（1974）〕を、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー94
1930（1967）記載の方法に準じて変異誘導処理して得ら
れるデスチオビオチンからビオチンへの生合成能の欠如
した菌株（以下、エシェリヒア・コリK3と呼ぶ）を利用
することができる。
ブ・ナチュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス714579
（1974）〕を、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー94
1930（1967）記載の方法に準じて変異誘導処理して得ら
れるデスチオビオチンからビオチンへの生合成能の欠如
した菌株（以下、エシェリヒア・コリK3と呼ぶ）を利用
することができる。
形質転換の方法についてもなんら限定すべきものではな
く、例えば、ビオチン要求性変異株として上記エシェリ
ヒア・コリK3を用いる場合は、塩化カルシウムで菌体を
処理する常法に従って実施しうる（例えばジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー53,154（1970）参
照）。
く、例えば、ビオチン要求性変異株として上記エシェリ
ヒア・コリK3を用いる場合は、塩化カルシウムで菌体を
処理する常法に従って実施しうる（例えばジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー53,154（1970）参
照）。
かくして得られるビオチン要求性変異株の形質転換体の
中から、バチルス属細菌由来のビオチン合成酵素をコー
ドするDNAが組み込まれた組換えベクターによって新た
にビオチン産生能を付与された菌株を選択する場合は、
例えば、親株のビオチン要求性変異株が成育可能は培地
の組成から、ビオチンが実質的に除去された培地を用い
て、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育可
能な菌株を選択すれば良い。
中から、バチルス属細菌由来のビオチン合成酵素をコー
ドするDNAが組み込まれた組換えベクターによって新た
にビオチン産生能を付与された菌株を選択する場合は、
例えば、親株のビオチン要求性変異株が成育可能は培地
の組成から、ビオチンが実質的に除去された培地を用い
て、該形質転換株をスクリーニングし、該培地で生育可
能な菌株を選択すれば良い。
こうして得られる一例示形質転換株をエシェリヒア・コ
リK3（pSB01）と命名し、またエシェリヒア・コリK3（p
SB01）の培養菌体から単離されるハイブリッドプラスミ
ドをpSB01と命名し、pSB01の制限酵素切断点地図を第１
図に示す。第１図からpSB01中に含まれるビオチンの生
合成に関与する遺伝情報を担うDNAは、MboIに始まり、H
indIII,HindIII,EcoRI,SalI,HindIII,PatI,EcoRI,BamHI
の順に並ぶ約8.2kbのDNA断片（第１図中の斜線を付した
部分）中に存在することが理解されよう。なお、この地
図中のMboIは出発点を示すものであり、この部位以外に
MboIが存する可能性を否定するものではない。
リK3（pSB01）と命名し、またエシェリヒア・コリK3（p
SB01）の培養菌体から単離されるハイブリッドプラスミ
ドをpSB01と命名し、pSB01の制限酵素切断点地図を第１
図に示す。第１図からpSB01中に含まれるビオチンの生
合成に関与する遺伝情報を担うDNAは、MboIに始まり、H
indIII,HindIII,EcoRI,SalI,HindIII,PatI,EcoRI,BamHI
の順に並ぶ約8.2kbのDNA断片（第１図中の斜線を付した
部分）中に存在することが理解されよう。なお、この地
図中のMboIは出発点を示すものであり、この部位以外に
MboIが存する可能性を否定するものではない。
むろん本発明に含まれるビオチン合成酵素をコードする
DNAを組み込んだ組換えベクターは、pSB01に限るもので
はない。例えば、pSB01のもつ個有の制限酵素切断サイ
トを利用し、前記DNAを組み込んだプラスミドを新たにp
SB01から誘導することも可能であり、具体的にはpSB01
を、例えば、制限酵素EcoRIで完全分解したあと、酵素
的な再結合反応を実施し、得られたプラスミド混合物を
用いてデスチオビオチンからビオチンへの生合成能の欠
如した菌株を形質転換し、得られた形質転換株の中から
ビオチン産生能を付与された菌株で、pSB01よりも小型
のプラスミドを持つ菌株を選択すれば良い。
DNAを組み込んだ組換えベクターは、pSB01に限るもので
はない。例えば、pSB01のもつ個有の制限酵素切断サイ
トを利用し、前記DNAを組み込んだプラスミドを新たにp
SB01から誘導することも可能であり、具体的にはpSB01
を、例えば、制限酵素EcoRIで完全分解したあと、酵素
的な再結合反応を実施し、得られたプラスミド混合物を
用いてデスチオビオチンからビオチンへの生合成能の欠
如した菌株を形質転換し、得られた形質転換株の中から
ビオチン産生能を付与された菌株で、pSB01よりも小型
のプラスミドを持つ菌株を選択すれば良い。
こうして得られる一例示形質転換菌株をエシェリヒア・
コリK3（pSB03）と命名し、またその培養菌体から単離
されるハイブリッドプラスミドをpSB03と命名した。pSB
03の制限酵素切断点地図は第２図に示すとうりであり、
ビオチン合成酵素をコードするDNAは、MbolにはじまりH
indIII,HindIII,EcoRI,BamHIの順に並ぶ約4.5kbのDNA断
片（第２図中の斜線を付した部分）中に存在することが
理解されよう。なお、この約4.5kbのDNA断片はもとの約
8.2kgのDNA断片中の約3.5kbの部分（すなわちMboIからE
coRIまでの部分）と約1kbの部分（すなわちEcoRIからBa
mHIまでの部分）が結合したものであるが、約1kbのDNA
部分を別途pBR322に組込み、それをビオチン要求性変異
株に形質転換したところ、ビオチン産生能を示さなかっ
たことから、ビオチン合成酵素をコードする部分はMboI
からEcoRIまでの約3.5kbの断片中に存在することが確認
された。
コリK3（pSB03）と命名し、またその培養菌体から単離
されるハイブリッドプラスミドをpSB03と命名した。pSB
03の制限酵素切断点地図は第２図に示すとうりであり、
ビオチン合成酵素をコードするDNAは、MbolにはじまりH
indIII,HindIII,EcoRI,BamHIの順に並ぶ約4.5kbのDNA断
片（第２図中の斜線を付した部分）中に存在することが
理解されよう。なお、この約4.5kbのDNA断片はもとの約
8.2kgのDNA断片中の約3.5kbの部分（すなわちMboIからE
coRIまでの部分）と約1kbの部分（すなわちEcoRIからBa
mHIまでの部分）が結合したものであるが、約1kbのDNA
部分を別途pBR322に組込み、それをビオチン要求性変異
株に形質転換したところ、ビオチン産生能を示さなかっ
たことから、ビオチン合成酵素をコードする部分はMboI
からEcoRIまでの約3.5kbの断片中に存在することが確認
された。
同様にpSB03を、例えば、制限酵素HindIIIで完全分解
し、HindIIIで切断した他のベクターと酵素的な再結合
を実施し、得られた形質転換菌株の中からビオチン産生
能を付与された菌株を選択することによってより小型の
プラスミドを持つ菌株を得ることができる。
し、HindIIIで切断した他のベクターと酵素的な再結合
を実施し、得られた形質転換菌株の中からビオチン産生
能を付与された菌株を選択することによってより小型の
プラスミドを持つ菌株を得ることができる。
こうして得られる形質転換株の例としては、エシェリヒ
ア・コリK3（pSB16）、エシェリヒア・コリK3（pSB10
3）、エシェリヒア・コリK3（pSB202）などが挙げられ
る。これらの形質転換株中に存在するプラスミドpSB16,
pSB103又は、pSB202の制限酵素切断地図は第３〜５図に
示すとうりであり、そのなかに組み込まれたバチルス属
細菌由来のDNA断片の制限酵素切断地図は第６図に示す
とうりである。この結果からビオチン合成酵素をコード
するDNAは、MboIに始まりTaqI,RsaI,TaqI,RsaI,MboI,Mb
oI,HindII,TaqI,TaqI,TaqI,HindIIIの順に並ぶ約1.5kb
のDNA断片中に存在することが理解されよう。
ア・コリK3（pSB16）、エシェリヒア・コリK3（pSB10
3）、エシェリヒア・コリK3（pSB202）などが挙げられ
る。これらの形質転換株中に存在するプラスミドpSB16,
pSB103又は、pSB202の制限酵素切断地図は第３〜５図に
示すとうりであり、そのなかに組み込まれたバチルス属
細菌由来のDNA断片の制限酵素切断地図は第６図に示す
とうりである。この結果からビオチン合成酵素をコード
するDNAは、MboIに始まりTaqI,RsaI,TaqI,RsaI,MboI,Mb
oI,HindII,TaqI,TaqI,TaqI,HindIIIの順に並ぶ約1.5kb
のDNA断片中に存在することが理解されよう。
このようにして得られる組換えベクターの宿主として
は、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリJM10
3などのごときエシェリヒア属細菌が例示されるが、必
ずしもこれに限られるものではない。
は、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリJM10
3などのごときエシェリヒア属細菌が例示されるが、必
ずしもこれに限られるものではない。
例えば組換えベクターからビオチン合成酵素をコードす
るDNA断片を取り出し、バチルス属細菌を形質転換でき
るベクターに組み込んで、バチルス属細菌を改めて形質
転換（または形質導入）し、ビオチン生合成に関与する
遺伝情報を増幅した形で菌体内に保持したバチルス属形
質転換菌体を得ることも、当然、本発明に含まれる。具
体的には、例えば、pSB01,pSB03,pSB16,pSB103あるいは
pSB202と、pUB110（ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.Bacteriol）134,p.318,1978年）とから、バチル
ス属菌体内で自立増殖可能で、かつビオチン合成酵素を
コードするDNAを組み込んだ組換えベクターを構築し、
ジャーナル・オブ・ジェネラル、マイクロバイオルジー
130,203（1984）記載の方法に準じてバチルス・スフェ
リカスIFO3525を形質転換することにより目的を達成す
ることができる。
るDNA断片を取り出し、バチルス属細菌を形質転換でき
るベクターに組み込んで、バチルス属細菌を改めて形質
転換（または形質導入）し、ビオチン生合成に関与する
遺伝情報を増幅した形で菌体内に保持したバチルス属形
質転換菌体を得ることも、当然、本発明に含まれる。具
体的には、例えば、pSB01,pSB03,pSB16,pSB103あるいは
pSB202と、pUB110（ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.Bacteriol）134,p.318,1978年）とから、バチル
ス属菌体内で自立増殖可能で、かつビオチン合成酵素を
コードするDNAを組み込んだ組換えベクターを構築し、
ジャーナル・オブ・ジェネラル、マイクロバイオルジー
130,203（1984）記載の方法に準じてバチルス・スフェ
リカスIFO3525を形質転換することにより目的を達成す
ることができる。
さらにシュードモナス属の細菌を宿主とし、ベクターと
してプラスミドRSF1010とその誘導体〔イン・プラスミ
ズ・オブ・メディカル，エンバイロナメンタル・アンド
・コマーシャル・インポータンス（In Plasmids of Med
ical,Environmental and Commercial Inportance）,p41
1,1979年〕を用いることによっても、同様に目的を達成
することができる。
してプラスミドRSF1010とその誘導体〔イン・プラスミ
ズ・オブ・メディカル，エンバイロナメンタル・アンド
・コマーシャル・インポータンス（In Plasmids of Med
ical,Environmental and Commercial Inportance）,p41
1,1979年〕を用いることによっても、同様に目的を達成
することができる。
このようにして得られる形質転換体は、ビオチン産生能
に優れていること以外、親株と同じ性質を有する。従っ
て、宿主として用いる親株の場合と同様の条件で培養す
ることができる。
に優れていること以外、親株と同じ性質を有する。従っ
て、宿主として用いる親株の場合と同様の条件で培養す
ることができる。
（発明の効果） かくして本発明によれば、ビオチン産生能を有するバチ
ルス属細菌から採取したビオチン合成酵素をコードする
DNAを組み込んだ組換えベクターで細菌を形質転換（ま
たは形質導入）することにより、ビチオン産生能に優れ
た細菌を得ることができる。
ルス属細菌から採取したビオチン合成酵素をコードする
DNAを組み込んだ組換えベクターで細菌を形質転換（ま
たは形質導入）することにより、ビチオン産生能に優れ
た細菌を得ることができる。
（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例1. （１）全DNA断片の調製 バチルス・スフェリカスIFO3525のアクチチアジン酸及
び５−（２−チエニル）−吉草酸併用耐性株（微工研菌
寄託番号−6421）を１のLB培地（バクトトリプトン１
％，イーストイクストラクト0.5％,NaC１％，グルコ
ース0.1％;pH7.5に調整）中28℃で約５時間振盪培養を
行ない、対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。こ
の菌体からフェノール法〔バイオケミ・バイオフィズ・
アクタ（Biochem.Biophys.Acta）72,619〜,1973年〕に
より全DNAを抽出、精製し、最終的に全DNA3.0mgを得
た。
び５−（２−チエニル）−吉草酸併用耐性株（微工研菌
寄託番号−6421）を１のLB培地（バクトトリプトン１
％，イーストイクストラクト0.5％,NaC１％，グルコ
ース0.1％;pH7.5に調整）中28℃で約５時間振盪培養を
行ない、対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。こ
の菌体からフェノール法〔バイオケミ・バイオフィズ・
アクタ（Biochem.Biophys.Acta）72,619〜,1973年〕に
より全DNAを抽出、精製し、最終的に全DNA3.0mgを得
た。
得られた全DNA500μｇをとり、制限エンドヌクレアーゼ
MboIを加え、37℃、30分間反応させて部分的に切断し、
次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約4kb
から約10kbのDNA断片を回収した。
MboIを加え、37℃、30分間反応させて部分的に切断し、
次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約4kb
から約10kbのDNA断片を回収した。
（２）ベクターpBR322の切断 アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性をマーカーと
してもつpBR322（市販品、ファルマシア社製）を制限エ
ンドヌクアレーゼBamHIで完全分解せしめた後、アルカ
リホスファターゼで処理した。
してもつpBR322（市販品、ファルマシア社製）を制限エ
ンドヌクアレーゼBamHIで完全分解せしめた後、アルカ
リホスファターゼで処理した。
（３）再結合反応 （１）で調製したDNA断片（0.1μｇ）および（２）で調
製した開裂されたpBR322（0.1μｇ）を10mM MgCl2,1mM
ATPおよび10mMデチオスレイトールを含むpH7.4の50mMト
リス−塩酸中でT4DNAリガーゼ0.3単位と共に混合し、４
℃で一晩反応させることによってDNA断片をpBR322に組
込んだハイブリッドプラスミドを得た。
製した開裂されたpBR322（0.1μｇ）を10mM MgCl2,1mM
ATPおよび10mMデチオスレイトールを含むpH7.4の50mMト
リス−塩酸中でT4DNAリガーゼ0.3単位と共に混合し、４
℃で一晩反応させることによってDNA断片をpBR322に組
込んだハイブリッドプラスミドを得た。
（４）ハイブリッドプラスミドの大腸菌への導入 エシェリヒア・コリDHI〔モレキュラー・クローニング
・ア・ラボラトリイ・マニュアル（Molecular Cloning
A Laboratory Manual）p.505,1982年〕を100mlのφ培地
（イーストイクストラクト0.5％，バクトトリプトン２
％、MgSO40.5％;pH7.6に調整）中37℃で約２時間半振盪
培養を行ない、対数増殖期に菌体を遠心分離により集め
た。この菌体をtfb I液（30mM酢酸カリウム、100mM RbC
l,10mMCaCl2、50mM MnCl2,15％グリセリン;pH5.8に調
整）40mlで洗浄し、得られた菌体をtfbII液（10mM MOP
S,75mM CaCl2,10mM RbCl,15％グリセリン;pH6.5に調
整）10mlに懸濁し、０℃で90分間静置し、許容（コンピ
テント）細胞とした。
・ア・ラボラトリイ・マニュアル（Molecular Cloning
A Laboratory Manual）p.505,1982年〕を100mlのφ培地
（イーストイクストラクト0.5％，バクトトリプトン２
％、MgSO40.5％;pH7.6に調整）中37℃で約２時間半振盪
培養を行ない、対数増殖期に菌体を遠心分離により集め
た。この菌体をtfb I液（30mM酢酸カリウム、100mM RbC
l,10mMCaCl2、50mM MnCl2,15％グリセリン;pH5.8に調
整）40mlで洗浄し、得られた菌体をtfbII液（10mM MOP
S,75mM CaCl2,10mM RbCl,15％グリセリン;pH6.5に調
整）10mlに懸濁し、０℃で90分間静置し、許容（コンピ
テント）細胞とした。
この許容細胞懸濁液0.2mlに（３）で得たハイブリッド
プラスミド0.1μｇを加えて０℃で30分間静置した。42
℃で90秒間保った後、φ培地0.8mlを加えて37℃で１時
間培養したのち、この培養液0.1mlを100μg/mlアンピシ
リンを含むLB培地の1.5％寒天培地に塗抹し、37℃にて
一晩培養した。
プラスミド0.1μｇを加えて０℃で30分間静置した。42
℃で90秒間保った後、φ培地0.8mlを加えて37℃で１時
間培養したのち、この培養液0.1mlを100μg/mlアンピシ
リンを含むLB培地の1.5％寒天培地に塗抹し、37℃にて
一晩培養した。
次いで、出現したコロニー約2,500個を爪揚枝で釣菌
し、15μg/mlテトラサイクリンを含むLB培地の1.5％寒
天培地に植菌し、37℃にて一晩培養した。これより、ア
ンピシリンを含む培地上にて生育可能であり、テトラサ
イクリンを含む培地上では生育不可能なアンピシリン耐
性、テトラサイクリン感受性株約1000株を得た。
し、15μg/mlテトラサイクリンを含むLB培地の1.5％寒
天培地に植菌し、37℃にて一晩培養した。これより、ア
ンピシリンを含む培地上にて生育可能であり、テトラサ
イクリンを含む培地上では生育不可能なアンピシリン耐
性、テトラサイクリン感受性株約1000株を得た。
（５）ハイブリッドプラスミドの単離 かくして得られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性株を５つのグループに分け（その各グループは約
200の異なるハイブリッドプラスミドを含む）、50μｇ
のアンピシリンを含むLB培地50ml中で37℃で一晩振盪培
養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。この菌体か
らビルンボイム（Birnboim）とドーリー（Doly）の方法
〔ヌクレイック・アシド・リサーチ（Nucleic Acid Re
s.）７,1513〜，（1979）〕によりプラスミドDNAを抽出
した。このようにして得られたプラスミドDNAは、ベク
ターであるpBR322にバチルス・スフェリカスIFO3525よ
り得た様々なDNA断片が挿入されたものであり、このハ
イブリッドプラスミドDNA群における挿入DNA断片の平均
鎖長は約6kbであった。
感受性株を５つのグループに分け（その各グループは約
200の異なるハイブリッドプラスミドを含む）、50μｇ
のアンピシリンを含むLB培地50ml中で37℃で一晩振盪培
養を行ない、遠心分離により菌体を集めた。この菌体か
らビルンボイム（Birnboim）とドーリー（Doly）の方法
〔ヌクレイック・アシド・リサーチ（Nucleic Acid Re
s.）７,1513〜，（1979）〕によりプラスミドDNAを抽出
した。このようにして得られたプラスミドDNAは、ベク
ターであるpBR322にバチルス・スフェリカスIFO3525よ
り得た様々なDNA断片が挿入されたものであり、このハ
イブリッドプラスミドDNA群における挿入DNA断片の平均
鎖長は約6kbであった。
（６）ビオチン要求性大腸菌へのハイブリッドプラスミ
ドの導入 エシェリヒア・コリC600からパイ（Pai）とリヒシュタ
イン（Lichstein）の方法〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（J.Bacteriol）94,p1930,1967年〕に準じて
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異誘導処理し、デスチオビオチンからビオチンへの生
合成能を欠失した変異株エシェリヒア・コリK3を得た。
これを100mlのLB培地中37℃で約２時間半振盪培養し、
対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体を
クシュナー（Kushner）の方法〔ジュネティック・エン
ジニアリング（Genetic Engineering）p.17,1978年〕に
より許容細胞とした。
ドの導入 エシェリヒア・コリC600からパイ（Pai）とリヒシュタ
イン（Lichstein）の方法〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（J.Bacteriol）94,p1930,1967年〕に準じて
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異誘導処理し、デスチオビオチンからビオチンへの生
合成能を欠失した変異株エシェリヒア・コリK3を得た。
これを100mlのLB培地中37℃で約２時間半振盪培養し、
対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体を
クシュナー（Kushner）の方法〔ジュネティック・エン
ジニアリング（Genetic Engineering）p.17,1978年〕に
より許容細胞とした。
次に（５）で得たハイブリッドプラスミドDNA群を各グ
ループごとに0.1μｇずつ上記許容細胞懸濁液0.2mlに加
えて０℃で30分間静置した。43.5℃で30秒間保った後、
LB培地1.8mlを加えて37℃で１時間培養したのち、遠心
分離によって集菌した。この菌体を0.85％NaClで２回洗
浄した後、0.85％NaClmlに懸濁した。次に菌体懸濁液
0.1mlを50μg/mlアンピシリンを含むCA培地〔グリセリ
ン２％，カザミノ酸（ビタミンフリー）１％，K2HPO40.
2％，KH2PO40.1％，MgSO4・7H2O0.05％，FeSO4・7H2O0.
001％，MnSO4・４〜6H2O0.001％，チアミン塩酸塩0.000
01％〕の1.5％寒天培地に塗抹し、37℃にて二晩培養し
た。生じた２つのコロニーはアンピシリン耐性、ビオチ
ン非要求性であり、かくして目的とするビオチンの生合
成に関与する遺伝情報を担うNDAを組込んだハイブリッ
ドプラスミドによる形質転換株２株を得た。
ループごとに0.1μｇずつ上記許容細胞懸濁液0.2mlに加
えて０℃で30分間静置した。43.5℃で30秒間保った後、
LB培地1.8mlを加えて37℃で１時間培養したのち、遠心
分離によって集菌した。この菌体を0.85％NaClで２回洗
浄した後、0.85％NaClmlに懸濁した。次に菌体懸濁液
0.1mlを50μg/mlアンピシリンを含むCA培地〔グリセリ
ン２％，カザミノ酸（ビタミンフリー）１％，K2HPO40.
2％，KH2PO40.1％，MgSO4・7H2O0.05％，FeSO4・7H2O0.
001％，MnSO4・４〜6H2O0.001％，チアミン塩酸塩0.000
01％〕の1.5％寒天培地に塗抹し、37℃にて二晩培養し
た。生じた２つのコロニーはアンピシリン耐性、ビオチ
ン非要求性であり、かくして目的とするビオチンの生合
成に関与する遺伝情報を担うNDAを組込んだハイブリッ
ドプラスミドによる形質転換株２株を得た。
（７）ハイブリッドプラスミドの解析 （６）で得られた形質転換株２株を50μg/mlアンピシリ
ンを含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集
菌後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイ
ブリッドプラスミドNDAを抽出した。
ンを含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集
菌後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイ
ブリッドプラスミドNDAを抽出した。
それぞれの株から得られたハイブリッドプラスミドDNA
は、共に全鎖長約12.5kbであり、約8.2kbのDNA断片が挿
入されていた。この２つのハイブリッドプラスミドDNA
について、各種の制限エンドヌクレアーゼ（BamHI,Hind
III,PstI,EcoRI,SalI）による切断パターンを作成し比
較したところ、まったく同一のパターンを有しているこ
とから２つのハイブリッドプラスミドDNAは同一のもの
であることが判明した。なお、このハイブリッドプラス
ミドはBglII,XhoI,KpnIによる切断点を有していないこ
とも確認された。このハイブリッドプラスミドDNAをpSB
01と命名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第
１図に示す。なお、第１図中の数字はbpの概略値を示し
たものである。
は、共に全鎖長約12.5kbであり、約8.2kbのDNA断片が挿
入されていた。この２つのハイブリッドプラスミドDNA
について、各種の制限エンドヌクレアーゼ（BamHI,Hind
III,PstI,EcoRI,SalI）による切断パターンを作成し比
較したところ、まったく同一のパターンを有しているこ
とから２つのハイブリッドプラスミドDNAは同一のもの
であることが判明した。なお、このハイブリッドプラス
ミドはBglII,XhoI,KpnIによる切断点を有していないこ
とも確認された。このハイブリッドプラスミドDNAをpSB
01と命名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第
１図に示す。なお、第１図中の数字はbpの概略値を示し
たものである。
次にpSB01プラスミドDNAに挿入されているDNA断片がバ
チルス・スフェリカスIFO3525のDNA断片であることを証
明する為に、サザン・ハイブリダイゼーションを行なっ
た。まず、（１）で抽出、精製した全DNAを制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで切断せしめたのち、生成物をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、サザン（Southern）の方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（J.Mo
l.Biol.）98,p503,1975年〕によりニトロセルロースフ
ィルターに移行した。これとは別にpSB01プラスミドDNA
1μｇを32Pにより標識してプローブDNAとした。調製は
リグビー（Rigby）らの方法〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ・Mol・Biol）113,p237,19
77年〕に従ってニックトランスレーシションにより行な
い、114×106cpm/μg DNAの比活性を有するプローブDNA
を得た。このプローブDNA0.1μｇを使用して、先に用意
したニトロセルロースフィルターに対して以下の手順に
従いハイブリダイゼーションを行なった。まずフィルタ
ーをSSC（0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム）の６
倍濃縮液とDenhardt液（0.02％ウシ血清アルブミン、0.
02％ポリビニールピロリドン、0.02％フィコール）20ml
に熱処理したサケ精子DNAを20μg/mlとなるように加え
て65℃で４時間予備的ハイブリダイゼーションを行なっ
た。その後、SSCの６倍濃縮液とDenhardt液、0.5％SDS
からなるハイブリダイゼーションバッファー20mlに熱処
理したサケ精子DNAを50μg/mlとなるように加え、熱処
理したプローブDNA0.1μｇをさらに加えて、67℃で１晩
ハイブリダイゼーションした。次いでフィルターをハイ
ブリダイゼーションバッファーでよく洗い、さらにSSC
の６倍濃縮液中65℃で30分間洗い、SSCの２倍濃縮液中6
5℃で30分間洗い、これを２回繰返した後、風乾後オー
トラジオグラフィーした。この結果、全DNA中にこのプ
ロープDNAに対して反応する断片があることが確認さ
れ、pSB01プラスミドDNA中の約8.2kb挿入DNA断片はバチ
ルス・スフェリカスIFO3525のDNA断片であることが証明
された。
チルス・スフェリカスIFO3525のDNA断片であることを証
明する為に、サザン・ハイブリダイゼーションを行なっ
た。まず、（１）で抽出、精製した全DNAを制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで切断せしめたのち、生成物をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、サザン（Southern）の方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（J.Mo
l.Biol.）98,p503,1975年〕によりニトロセルロースフ
ィルターに移行した。これとは別にpSB01プラスミドDNA
1μｇを32Pにより標識してプローブDNAとした。調製は
リグビー（Rigby）らの方法〔ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ・Mol・Biol）113,p237,19
77年〕に従ってニックトランスレーシションにより行な
い、114×106cpm/μg DNAの比活性を有するプローブDNA
を得た。このプローブDNA0.1μｇを使用して、先に用意
したニトロセルロースフィルターに対して以下の手順に
従いハイブリダイゼーションを行なった。まずフィルタ
ーをSSC（0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム）の６
倍濃縮液とDenhardt液（0.02％ウシ血清アルブミン、0.
02％ポリビニールピロリドン、0.02％フィコール）20ml
に熱処理したサケ精子DNAを20μg/mlとなるように加え
て65℃で４時間予備的ハイブリダイゼーションを行なっ
た。その後、SSCの６倍濃縮液とDenhardt液、0.5％SDS
からなるハイブリダイゼーションバッファー20mlに熱処
理したサケ精子DNAを50μg/mlとなるように加え、熱処
理したプローブDNA0.1μｇをさらに加えて、67℃で１晩
ハイブリダイゼーションした。次いでフィルターをハイ
ブリダイゼーションバッファーでよく洗い、さらにSSC
の６倍濃縮液中65℃で30分間洗い、SSCの２倍濃縮液中6
5℃で30分間洗い、これを２回繰返した後、風乾後オー
トラジオグラフィーした。この結果、全DNA中にこのプ
ロープDNAに対して反応する断片があることが確認さ
れ、pSB01プラスミドDNA中の約8.2kb挿入DNA断片はバチ
ルス・スフェリカスIFO3525のDNA断片であることが証明
された。
一方、エシュリヒア・コリのビオチンオペロンをプロー
ブとしてギブス（Gibbs）らの方法〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・イン
・USA（Proc.Nati.Acad.Sci.USA）81,p3365,1984年〕に
従って、バチルス・スフェリカスIFO3525全DNAのEcoRI
切断断片に対し、サザン・ハイブリダイゼーションを実
施した。この時、DNA間で相補性があればハイブリダイ
ズする条件でもハイブリダイズしなかったことから、エ
シェリヒア・コリのビオチンオペロンとバチルス・スフ
ェリカスのDNAとの間では相補性が極めて低いこと、従
ってpSB01の挿入DNA断片はエシェリヒア・コリのものと
は大きく異なることが判明した。
ブとしてギブス（Gibbs）らの方法〔プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・イン
・USA（Proc.Nati.Acad.Sci.USA）81,p3365,1984年〕に
従って、バチルス・スフェリカスIFO3525全DNAのEcoRI
切断断片に対し、サザン・ハイブリダイゼーションを実
施した。この時、DNA間で相補性があればハイブリダイ
ズする条件でもハイブリダイズしなかったことから、エ
シェリヒア・コリのビオチンオペロンとバチルス・スフ
ェリカスのDNAとの間では相補性が極めて低いこと、従
ってpSB01の挿入DNA断片はエシェリヒア・コリのものと
は大きく異なることが判明した。
（８）形質転換の再現性の確認 pSB01プラスミドDNAを用いて（６）で述べた方法により
エシェリヒア・コリK3を再度形質転換したところ、pSB0
1をプラスミドとして所有するエシェリヒア・コリK3す
べてがアンピシリン耐性、ビオチン非要求性となった。
これより、pSB01プラスミドDNAはエシェリヒア・コリK3
のデスチオビオチンからビオチンへの生合成能欠失を相
補しうる遺伝情報を持ったバチルス・スフェリカスIFO3
525のDNA断片を少なくとも所有していることが判明し
た。
エシェリヒア・コリK3を再度形質転換したところ、pSB0
1をプラスミドとして所有するエシェリヒア・コリK3す
べてがアンピシリン耐性、ビオチン非要求性となった。
これより、pSB01プラスミドDNAはエシェリヒア・コリK3
のデスチオビオチンからビオチンへの生合成能欠失を相
補しうる遺伝情報を持ったバチルス・スフェリカスIFO3
525のDNA断片を少なくとも所有していることが判明し
た。
このpSB01プラスミドDNAをプラスミドとして所有するエ
シェリヒア・コリK3をエシェリヒア・コリK3（pSB01）
と命名した。なお、この菌は寄託番号8368として微工研
に寄託されている。
シェリヒア・コリK3をエシェリヒア・コリK3（pSB01）
と命名した。なお、この菌は寄託番号8368として微工研
に寄託されている。
実施例2. （１）ハイブリッドプラスミドの再構築 実施例１で得たpSB01プラスミドDNA1μｇを制限エンド
ヌクレアーゼEcoRIで完全分解し、得られた３種のDNA断
片の混合物１μｇを10mM MgCl2,1m MATPおよび10mMデチ
オスライトールを含むpH7.4の50mMトリス−塩酸中でT4D
NAリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応させる
ことにより再結合を行った。
ヌクレアーゼEcoRIで完全分解し、得られた３種のDNA断
片の混合物１μｇを10mM MgCl2,1m MATPおよび10mMデチ
オスライトールを含むpH7.4の50mMトリス−塩酸中でT4D
NAリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応させる
ことにより再結合を行った。
（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換 上記のT4DNAリガーゼによる反応混合物0.1μｇを用いる
こと以外は実施例１の（６）と同様にしてハイブリッド
プラスミドによる形質転換株を得た。
こと以外は実施例１の（６）と同様にしてハイブリッド
プラスミドによる形質転換株を得た。
（３）ハイブリッドプラスミドの解析 （２）で得られた形質転換株を50μg/mlアンピシリンを
含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイブ
リッドプラスミドDNAを抽出した。抽出したプラスミドD
NAのうち最小のものは、全鎖長約8.8kbであり、pSB01プ
ラスミドDNAから約3.7kbのEcoRI切断断片が欠落したも
のであった。このハイブリッドプラスミドをpSB03と命
名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２図に
示す。
含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイブ
リッドプラスミドDNAを抽出した。抽出したプラスミドD
NAのうち最小のものは、全鎖長約8.8kbであり、pSB01プ
ラスミドDNAから約3.7kbのEcoRI切断断片が欠落したも
のであった。このハイブリッドプラスミドをpSB03と命
名し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２図に
示す。
このpSB03プラスミドDNAを所有するエシェリヒア・コリ
K3をエシェリヒア・コリK3（pSB03）と命名した。（微
工研寄託番号8369）。
K3をエシェリヒア・コリK3（pSB03）と命名した。（微
工研寄託番号8369）。
実施例3. エシェリヒア・コリK3（pSB01）、エシェリヒア・コリK
3（pSB03）及びpBR322をプラスミドとして所有するエシ
ェリヒア・コリC600（pSB322）の３種の菌株を、50μg/
mlアンピシリンを含むCA培地（条件Ａ）または50μg/ml
のアンピシリンと10μg/mlのDL−デスチオビオチンを含
むCA培地（条件Ｂ）3mlにそれぞれ植菌し、37℃で４日
間振盪培養した。また50μg/mlのアンピシリンを含むCA
培地3mlにそれぞれ３株を植菌し、37℃で１日間振盪培
養後、ピメリン酸を1mg/mlとなるように添加し、さらに
３日間振盪培養を行った（条件Ｃ）。
3（pSB03）及びpBR322をプラスミドとして所有するエシ
ェリヒア・コリC600（pSB322）の３種の菌株を、50μg/
mlアンピシリンを含むCA培地（条件Ａ）または50μg/ml
のアンピシリンと10μg/mlのDL−デスチオビオチンを含
むCA培地（条件Ｂ）3mlにそれぞれ植菌し、37℃で４日
間振盪培養した。また50μg/mlのアンピシリンを含むCA
培地3mlにそれぞれ３株を植菌し、37℃で１日間振盪培
養後、ピメリン酸を1mg/mlとなるように添加し、さらに
３日間振盪培養を行った（条件Ｃ）。
培養後、培養液1mlを遠心分離して菌体を沈殿させ、そ
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を120℃で3
0分間処理後、ラクトバシルス・プランタラム（Lactoba
cillus plantarum ATCC8014）による微生物定量法によ
り上清中に蓄積したビオチンを定量した。
の上清を試験管に移した。次いで、この上清を120℃で3
0分間処理後、ラクトバシルス・プランタラム（Lactoba
cillus plantarum ATCC8014）による微生物定量法によ
り上清中に蓄積したビオチンを定量した。
各々の場合におけるビチオンの蓄積量を第１表に示す。
第１表の結果から、本発明の微生物はエシェリヒア・コ
リC600（pBR322）に比べ大量のビオチンを培地中に蓄積
することが明らかである。
リC600（pBR322）に比べ大量のビオチンを培地中に蓄積
することが明らかである。
なお、本発明に係る微生物のビオチンの蓄積量は、エシ
ェリヒア・コリの種々のビオチン高産生変異株〔たとえ
ばジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l）122p66.1975年〕と比較しても高い値を示しており、
このことからバチルス属細菌に由来するビオチンの産生
に関与する遺伝子の有用性が理解されよう。
ェリヒア・コリの種々のビオチン高産生変異株〔たとえ
ばジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l）122p66.1975年〕と比較しても高い値を示しており、
このことからバチルス属細菌に由来するビオチンの産生
に関与する遺伝子の有用性が理解されよう。
実施例4. （１）ハイブリッドプラスミドの再構築 実施例２で得たpSB03プラスミドDNA3μｇを制限エンド
ヌクレアーゼHindIIIで完全分解した。これとは別にpBR
322 1μｇを制限エンドヌクレアーゼHindIIIで完全分解
した。次いでpSB03を切断して得られた３種のDNA断片
（１μｇ）と開裂されたpBR322（１μｇ）を10mM MgC
l2,1mM ATPおよび10mMデチオスレイトールを含むpH7.4
の50mMトリス−塩酸中でT4DNAリガーゼ３単位と共に混
合し、反応混合物を調製した。これをそれぞれ４℃で一
晩反応させることによってハイブリッドプラスミドを得
た。
ヌクレアーゼHindIIIで完全分解した。これとは別にpBR
322 1μｇを制限エンドヌクレアーゼHindIIIで完全分解
した。次いでpSB03を切断して得られた３種のDNA断片
（１μｇ）と開裂されたpBR322（１μｇ）を10mM MgC
l2,1mM ATPおよび10mMデチオスレイトールを含むpH7.4
の50mMトリス−塩酸中でT4DNAリガーゼ３単位と共に混
合し、反応混合物を調製した。これをそれぞれ４℃で一
晩反応させることによってハイブリッドプラスミドを得
た。
（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換 上記の反応混合物１μｇを用いること以外は実施例１の
（６）と同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質
転換株を得た。
（６）と同様にしてハイブリッドプラスミドによる形質
転換株を得た。
（３）ハイブリッドプラスミドの解析 （２）で得られた形質転換株を50μg/mlアンピシリンを
含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイブ
リッドプラスミドDNAを抽出した。抽出したプラスミドD
NAのうち最小のものは全鎖長約6.2kbであった。このプ
ラスミドはpSB03DNAの約2.0kb HindIII切断断片が挿入
されたものであり、pSB16と命名した。
含むCA培地5ml中で一晩振盪培養して遠心分離で集菌
後、前述のビルンボイムとドーリーの方法によりハイブ
リッドプラスミドDNAを抽出した。抽出したプラスミドD
NAのうち最小のものは全鎖長約6.2kbであった。このプ
ラスミドはpSB03DNAの約2.0kb HindIII切断断片が挿入
されたものであり、pSB16と命名した。
この挿入断片中に含まれるバチルス・スフェリカスIFO3
525由来のDNA断片はMboIからHindIIIまでの約1.5kbであ
り、その詳細な制限エンドヌクレアーゼ切断地図は第６
図に示すとうりである。なおpSB16プラスミドDNAを所有
するエシェリヒア・コリK3をエシェリヒア・コリK3（pS
B16）と命名した。
525由来のDNA断片はMboIからHindIIIまでの約1.5kbであ
り、その詳細な制限エンドヌクレアーゼ切断地図は第６
図に示すとうりである。なおpSB16プラスミドDNAを所有
するエシェリヒア・コリK3をエシェリヒア・コリK3（pS
B16）と命名した。
実施例5. 実施例４で用いたpBR322に代えてpUC9（市販品、ファル
マシア社製）を用いること以外は実施例４と同様にして
実験を行い、pSB16の場合と同様に約2.0kbのDNA断片を
挿入した全鎖長約4.6kbのハイブリッドプラスミド（pSB
103）を得た。次いでこのpSB103を用いて実施例４と同
様にしてエシェリヒア・コリK3を形質転換することによ
り、エシェリヒア・コリK3（pSB103）を得た。
マシア社製）を用いること以外は実施例４と同様にして
実験を行い、pSB16の場合と同様に約2.0kbのDNA断片を
挿入した全鎖長約4.6kbのハイブリッドプラスミド（pSB
103）を得た。次いでこのpSB103を用いて実施例４と同
様にしてエシェリヒア・コリK3を形質転換することによ
り、エシェリヒア・コリK3（pSB103）を得た。
実施例6. 実施例４で用いたpBR322に代えてpUC8（市販品、ファル
マシア社製）を用いること以外は実施例４と同様にして
実験を行い、pSB16の場合と同様に約2.0kbのDNA断片を
挿入した全鎖長約4.6kbのハイブリッドプラスミド（pSB
202）を得た。次いでこのpSB202を用いて実施例４と同
様にしてエシェリヒア・コリK3を形質転換することによ
りエシェリヒア・コリK3（pSB202）を得た。
マシア社製）を用いること以外は実施例４と同様にして
実験を行い、pSB16の場合と同様に約2.0kbのDNA断片を
挿入した全鎖長約4.6kbのハイブリッドプラスミド（pSB
202）を得た。次いでこのpSB202を用いて実施例４と同
様にしてエシェリヒア・コリK3を形質転換することによ
りエシェリヒア・コリK3（pSB202）を得た。
実施例7. エシェリヒア・コリK3（pSB01）、エシェリヒア・コリK
3（pSB03）、エシェリヒア・コリK3（pSB16）、エシェ
リヒア・コリK3（pSB103）、エシェリヒア・コリK3（pS
B202）、及びpBR322をプラスミドとして所有するエシェ
リヒア・コリC600（pBR322）の６種の菌株を、50μg/ml
のアンピシリンと10μg/mlのDL−デスチオビオチンを含
むGP培地〔グリセリン２％、プロテオース・ペプトン５
％、カザミノ酸（ビタミンフリー）0.5％、K2HPO40.1
％、KCl0.05％、MgSO4・7H2O0.05％、MnSO4・４〜6H2O
0.001％、FeSO4・7H2O0.001％、チアミン塩酸塩0.00000
2％、pH7.0〕3mlにそれぞれ植菌し、37℃で４日間振盪
培養した。
3（pSB03）、エシェリヒア・コリK3（pSB16）、エシェ
リヒア・コリK3（pSB103）、エシェリヒア・コリK3（pS
B202）、及びpBR322をプラスミドとして所有するエシェ
リヒア・コリC600（pBR322）の６種の菌株を、50μg/ml
のアンピシリンと10μg/mlのDL−デスチオビオチンを含
むGP培地〔グリセリン２％、プロテオース・ペプトン５
％、カザミノ酸（ビタミンフリー）0.5％、K2HPO40.1
％、KCl0.05％、MgSO4・7H2O0.05％、MnSO4・４〜6H2O
0.001％、FeSO4・7H2O0.001％、チアミン塩酸塩0.00000
2％、pH7.0〕3mlにそれぞれ植菌し、37℃で４日間振盪
培養した。
培養後、培養液1mを遠心分離して菌体を沈殿させ、その
上清を試験管に移した。次いで、この上清を120℃で30
分間処理後、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobac
illus plantarum ATCC8014）による微生物定量法により
上清中に蓄積したビオチンを定量した。各々の菌株によ
るビオチンの蓄積量を第２表に示す。
上清を試験管に移した。次いで、この上清を120℃で30
分間処理後、ラクトバシルス・プランタラム（Lactobac
illus plantarum ATCC8014）による微生物定量法により
上清中に蓄積したビオチンを定量した。各々の菌株によ
るビオチンの蓄積量を第２表に示す。
第２表の結果から、本発明の微生物はいずれもビオチン
産生能を有することが理解されよう。
産生能を有することが理解されよう。
第１〜５図はそれぞれpSB01プラスミドDNA、pSB03プラ
スミドDNA、pSB16プラスミドDNA、pSB103プラスミドDNA
及びpSB202プラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ切
断地図を示し、第６図はpSB16に挿入されたバチルス属
細菌由来のDNA断片の制限エンドヌクレアーゼ切断地図
を示す。
スミドDNA、pSB16プラスミドDNA、pSB103プラスミドDNA
及びpSB202プラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ切
断地図を示し、第６図はpSB16に挿入されたバチルス属
細菌由来のDNA断片の制限エンドヌクレアーゼ切断地図
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】ビオチン産生能を有するバチルス・スフェ
リカスIFO3525のアクチアジン酸及び５−（２−チエニ
ル）−吉草酸併用耐性株（微工研条寄第−1098号）から
採取したデスチオビオチンからビオチンを生合成する反
応に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ組換えベ
クターであって、該DNAが、（１）、（２）および
（３）で表される制限酵素切断点を有する約1.5kb、約
3.5kbおよび約8.2kbのDNA断片よりなる群から選ばれるD
NA断片を含むDNAである組換えベクター。 - 【請求項２】ベクターがプラスミドである特許請求の範
囲第１項記載の組換えベクター。 - 【請求項３】ビオチン産生能を有するバチルス・スフェ
リカスIFO3525のアクチアジン酸及び５−（２−チエニ
ル）−吉草酸併用耐性株（微工研条寄第−6421号）から
採取したデスチオビオチンからビオチンを生合成する反
応に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ組換えベ
クターであって、該DNAが、（１）、（２）および
（３）で表される制限酵素切断点を有する約1.5kb、約
3.5kbおよび約8.2kbのDNA断片よりなる群から選ばれるD
NA断片を含むDNAである組換えベクターよって形質転換
または形質導入された細菌。 - 【請求項４】細菌がエシェリヒア属、バチルス属または
ジュードモナス属に属するものである特許請求の範囲第
３項記載の細菌。 - 【請求項５】組換えベクターがハイブリッドプラスミド
である特許請求の範囲第４項記載の細菌。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61066532A JPH0761267B2 (ja) | 1985-07-29 | 1986-03-25 | 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 |
| EP19870300716 EP0240105B1 (en) | 1986-03-25 | 1987-01-28 | A gene coding for biotin synthetase and utilization thereof |
| DE19873786578 DE3786578T2 (de) | 1986-03-25 | 1987-01-28 | Biotin-Synthetase kodierendes Gen und dessen Verwendung. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-166992 | 1985-07-29 | ||
| JP16699285 | 1985-07-29 | ||
| JP61066532A JPH0761267B2 (ja) | 1985-07-29 | 1986-03-25 | 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62275684A JPS62275684A (ja) | 1987-11-30 |
| JPH0761267B2 true JPH0761267B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=26407721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61066532A Expired - Lifetime JPH0761267B2 (ja) | 1985-07-29 | 1986-03-25 | 組換えベクタ−及びそれを有する細菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0761267B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6344889A (ja) * | 1986-04-24 | 1988-02-25 | Nippon Zeon Co Ltd | ビオチン合成酵素をコ−ドする遺伝子とその利用 |
| EP0635572A3 (en) | 1993-06-25 | 1995-03-08 | Hoffmann La Roche | Biosynthesis of biotin in bacillus subtilis. |
-
1986
- 1986-03-25 JP JP61066532A patent/JPH0761267B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62275684A (ja) | 1987-11-30 |
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