JPH0511960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造
法に関するものである。 発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造法について
はブレビバクテリウム属（特公昭51−23593、同
51−23594）、バチルス属（特公昭50−13358）等
の突然変異株を用いる方法が知られている。 本発明者らは上述の様な従来のＬ−ヒスチジン
の製造法に対し、ヒスチジンアンタゴニストに耐
性を有するバチルス属の変異株の染色体より得た
ヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子
領域が組み込まれているベクターを含有している
バチルス属の細菌が、高い収率でＬ−ヒスチジン
を生産することを知つた。 ヒスチジンアンタゴニストとは、バチルス属の
微生物の増殖を抑制するようなものであるがその
抑制はＬ−ヒスチジンが培地中に共存すれば全体
的または部分的に解除されるようなものである。
例えば、１，２，４−トリアゾールアラニン、２
−チアゾールアラニン、α−メチルヒスチジン、
３−アミノ−１，２，４−トリアゾールなどがあ
る。 ヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝
子の供与菌はバチルス属のヒスチジンアンタゴニ
ストの耐性を有する変異株ならどのような菌株で
もよいが耐性のより高いものが望ましい。また多
くの場合Ｌ−ヒスチジン生産能がより高いものを
遺伝子供与菌として用いればよりよい結果が得ら
れる。遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する
方法は、例えばJ.Bacteriol.，89、1065（1965）に
記載されているような通常の方法で行うことがで
きる。ベクターDNAとしては、どのようなもの
でもよい。例えばスタフイロコツカス属微生物由
来のpT127、pC194、pC221、pC223、pUB112
（以上Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、1680（1977）
参照）、pUB110（J.Bacteriol.，134、318（1978）
参照）、pTP4、pTP5（以上Microbiol.Letters，
５、55（1978）参照）、枯草菌由来のpLS15、
pLS28（以上J.Baeteriol.，131、699（1977）参
照）、pL13（J.Bacteriol.，129、1487（1977）参
照）、pPL1、pPL2（以上J.Bacteriol.，124、484
（1975）参照）等がある。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いた切断する。それぞれ
のベクターには、適した制限エンドヌクレアーゼ
があるが、それは上記ベクターについての記載が
ある文献に示されている。染色体DNAについて
は制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的に
行なわれるように反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が使用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法はリガ
ーゼを用いる通常の方法が使用できる。一方、タ
ーミナルトランスフエラーゼを用いて染色体
DNA断片と開裂したベクターDNAとに、デオキ
シアデニル酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付
加し、混合した後アニーリングして連結せしめる
方法も利用しうる。 かくして得られた染色体DNA断片とベクター
の結合物の受容菌はバチルス属の微生物ならばど
のようなものでもよいが、Ｌ−ヒスチジン要求菌
を用いれば形質転換株を選択する際に好都合であ
る。もちろんよりＬ−ヒスチジン生産農が高い菌
株より誘導したＬ−ヒスチジン要求菌を用いれば
より好ましい結果が得られる。組換えDNAを上
記のようなDNA受容菌に導入するには、例えば
Molec.Ger.Genet.，168、111（1979）に記載され
ているような通常の形質転換法が使用できる。 形質転換株のうちよりＬ−ヒスチジン生産能を
有しヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与する遺
伝子領域が組み込まれているベクターを含有する
形質転換株を選択するには、例えばDNA受容菌
としてＬ−ヒスチジン要求菌を用いヒスチジンア
ンタゴニストを含有し、Ｌ−ヒスチジンを含有し
ない培地に生育し得るような菌株を選択すればよ
い。又、ベクターDNAのマーカーの性質を併せ
もつ菌株を選別できるような培地を用いればより
選別が容易である。このようにして一旦選別され
たヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝
子領域が組み込まれている組換えベクターは
DNA受容菌より抽出後他のDNA受容菌、例えば
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する受容菌に導入する
事ができる。 かくして得られたＬ−ヒスチジン生産菌を用い
てＬ−ヒスチジンを製造する方法は従来のＬ−ヒ
スチジン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち
培地としては炭素源、窒素源、無機イオン更に必
要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量要素
を含有する通常のものである。炭素源としてはグ
ルコース、シユークロース等及びこれらを含有す
る澱粉加水分解物等が用いられる。窒素源として
はアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培
地のPH及び温度を適宜調節しつつ実質的にＬ−ヒ
スチジンの生成蓄積が停止するまで行なわれる。
かくして培養液中には著量のＬ−ヒスチジンが生
成蓄積される。培養液よりＬ−ヒスチジンを採取
するには通常の方法が適用できる。 実施例 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株）からニトロソグアニジン変異
処理によつて誘導したヒスチジン生産菌AJ11733
（FERM−P6246）（１，２，４−DL−トリアゾ
ールアラニン耐性、アルギニン、ロイシン複要求
性）を原株とし、これより次の様な方法で新規ヒ
スチジン生産菌を造成した。 (1) 染色体DNAの調製 AJ11733株を１の「Bact−Penassay
Broth」（商品名Difco製）中30℃で約２時間振
盪培養を行ない対数増殖期の菌体を集菌後通常
のDNA抽出法（J.Bacteriol.，89、1065
（1965））により染色体DNAを抽出、精製し最
終4.0mgを得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 Ｌ−ヒスチジン生産能を支配する遺伝子領域
をクローニングするため、そのベクターとなる
自己増殖DNAとしてカナマイシン耐性、ネオ
マイシン耐性プラスミドの１種pUB110を用い
た。(1)で得た染色体DNA10μｇとベクター
DNA5μｇをそれぞれとり、各々に制限エンド
ヌクレアーゼの１種EcoRを37℃１時間作用
させてDNA鎖を切断した。65℃、10分の熱処
理後両反応液を混合しATP及びジチオスライ
トール存在下、T₄フアージ由来のDNAリガー
ゼにて10℃にて24時間、DNA鎖の連結反応を
行つた。 (3) ヒスチジン生産遺伝子を担つたプラスミドに
よる形質転換 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求性）からニトロソグアニジン変
異処理によつて誘導したＬ−ヒスチジン要求株
AJ11732（FERM−P6245）を「Penassay
Broth」（Difco）に接種して30℃にて一晩振盪
培養を行ない第培養培地（グルコース0.5
ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄ 0.2ｇ／dl、KH₂PO₄ 0.6
ｇ／dl、K₂HPO₄ 1.4ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O
0.02ｇ／dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl、
酵母エキス0.2ｇ／dl、Ｌ−ヒスチジン10mg／
dl、Ｌ−アルギニン25mg／dl及びＬ−ロイシン
５mg／dlを含む）に接種し37℃にて４時間振盪
培養を行なつた後、さらに第培養培地（グル
コース0.5ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄ 0.2ｇ／dl、
KH₂PO₄ 0.6ｇ／dl、K₂HPO₄ 1.4ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O 0.12ｇ／dl、クエン酸ナトリ
ウム0.1ｇ／dl、酵母エキス0.02ｇ／dl、Ｌ−
アルギニン５mg／dl及びＬ−ロイシン0.5mg／
dlを含む）へ接種し37℃にて1.5時間振盪培養
を行なうことによつていわゆるコンピテントな
（DNA取込能を有する）細胞を調製した（参考
文献；J.Bacteriol.，81、741（1961））。このコ
ンピテント細胞懸濁液に(2)で得たDNAの溶液
を加えて37℃でさらに２時間振盪培養を行なつ
て形質転換反応を完了させた後、細胞懸濁液を
カナマイシン5μｇ／ml含有最小培地プレート
（KH₂PO₄ 0.6ｇ／dl、K₂HPO₄ 1.4ｇ／dl、
（NH₄）₂SO₄ 0.2ｇ／dl、クエン酸ナトリウム
0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ／dl、及び
グルコース0.5ｇ／dlを含みPH7.2に調節した培
地を基本最小培地とし、これに寒天２％及び使
用菌の栄養要求物質Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイ
シンを各々10mg／dlさらに１，２，４−トリア
ゾールアラニンを50mg／dl添加した。）に塗沫
し37℃で培養した。３日後に上記培地上に３個
のコロニーが出現したのでこれを釣菌し各クロ
ーンをそれぞれ純粋に分離した。 得られた形質転換株はいずれも用いた受容菌
AJ11732と異なつてヒスチジン非要求性かつ
１，２，４−トリアゾールアラニン耐性であ
る。このことは染色体DNA上のヒスチジン生
合成及びヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与
する遺伝子領域がpUB110プラスミド上の
DNAに挿入されて生じた新規プラスミドDNA
を取込んだ細胞のみがコロニーとして選択され
てきたことを意味する。 (4) ヒスチジン生合成系遺伝子領域を担う
pUB110の抽出 (3)で得られたクローンのうちAJ11734
（FERM−P6247）を用いてC.I.Kadoらの方法
（J.Bacteriol.，145、1365（1981））に基づいた
フエノールによるDNA抽出法により菌体の
DNAを抽出しアガロースゲル電気泳動により
プラスミドDNAと染色体DNAを分離し、プラ
スミドDNAを含むアガロースゲルよりヒスチ
ジン生合成系遺伝子領域を担うpUB110を抽出
した後透析して精製した。こうして得られた新
規プラスミドを(3)で述べたのと同様の方法によ
つて今度は原株のAJ11733（ヒスチジン非要求
性でヒスチジンを生産する）へ形質転換法によ
り挿入し、カナマイシ耐性株AJ11735（FERM
−P6248を得た。 (5) 新規ヒスチジン生産菌によるヒスチジン生産
(4)で得られたAJ11734、AJ11735株を培養した
結果を第１表に示す。培養は500ml肩付フラス
コ中にヒスチジン生産培地（グルコース８ｇ／
dl、NH₄Cl １ｇ／dl、KCl 0.2ｇ／dl、
KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／
dl、「カザミノ酸」（Difco）0.4ｇ／dl、
FeSO₄・4H₂O １mg／dl、MnSO₄・4H₂O1
mg／dl、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン各20
mg／dl及びCaCO4ｇ／dlを含む（PH7.0））を20
mlずつ分注し菌体を接種後30℃、96時間振盪培
養して行なつた。尚、AJ11734とAJ11735のと
きはカナマイシン5μｇ／mlを生産培地に添加
してある。対照として原株AJ11733を同様の条
件で発酵を行なつた。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属のヒスチジンアンタゴニストに耐
   性を有する変異株より得たヒスチジンアンタゴニ
   スト耐性に関与する遺伝子領域が組み込まれてい
   るベクターを、バチルス属の微生物に含有せしめ
   たＬ−ヒスチジン生産性微生物を培養し、培地中
   に蓄積したＬ−ヒスチジンを採取する事を特徴と
   するＬ−ヒスチジンの製造法。