JPH024276B2 - - Google Patents

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JPH024276B2
JPH024276B2 JP54075483A JP7548379A JPH024276B2 JP H024276 B2 JPH024276 B2 JP H024276B2 JP 54075483 A JP54075483 A JP 54075483A JP 7548379 A JP7548379 A JP 7548379A JP H024276 B2 JPH024276 B2 JP H024276B2
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acid
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Ajinomoto Co Inc
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Description

【発明の詳細な説明】
この発明は発酵法によるＬ−フエニールアラニ
ンの製造法に関するものである。 発酵法によるＬ−フエニールアラニンの製造法
については、いくつかの人工変異株を用いる方法
が知られている。 これに対し本発明者らは、デオキシリボ核酸
（以下DNA）と記す）供与菌としてエシエリヒア
属のフエニールアラニンアナログに耐性を有する
変異株を選択し、これにより、Ｌ−フエニールア
ラニンの合成に関与する遺伝情報を有するDNA
を抽出し、ついでこのＬ−フエニールアラニンの
合成に関与する遺伝情報を有するDNAを組み込
んだベクターを得、これをエシエリヒア属の微生
物に導入することに成功した。 本発明の微生物を用いることによつて、従来の
突然変異株を用いる方法に比べて、極めて高い収
率でＬ−フエニールアラニンを生産できる。 エシエリヒア属のフエニールアラニンアナログ
に耐性を有する変異株は通常の人工変異操作をエ
シエリヒア属の微生物に施すことにより得られ
る。 本発明でいうフエニールアラニンアナログとは
エシエリヒア属の微生物の増殖を抑制するが、こ
の抑制はＬ−フエニールアラニンによつて部分的
又は全体的に解除されるようなものをいう。例え
ばｏ−，ｍ−又はｐ−フルオロフエニールアラニ
ン，ｏ−，ｍ−又はｐ−アミノフエニールアラニ
ン，β−フエニールアラニン，シクロヘキシルア
ラニン，α−アミノ−β−フエニール−エタンス
ルホン酸，ｏ−，ｍ−又はｐ−クロロフエニール
アラニン，ｏ−，ｍ−又はｐ−ブロモフエニール
アラニン，β−２−チエニールアラニン，β−３
−チエニールアラニン，β−２−フリルアラニ
ン，β−２−ピロールアラニン，１−シクロペン
テン−１−アラニン，１−シクロヘキセン−１−
アラニン，２−アミノ−４−メチル−４−ヘキセ
ン酸，ｓ−（１，２−ジクロロビニル）−システイ
ン，β−４−ピリジルアラニン，β−２−ピリジ
ルアラニン，β−４−ピラゾルアラニン，ｐ−ニ
トロフエニールアラニン等がある。 本発明のDNA供与菌として、前記フエニール
アナログ耐性変異株のほかに更に５−Ｆ−トリプ
トフアン等のトリプトフアンアナログ耐性，２−
チエニールアラニン耐性、チロシン要求性を有す
る菌等が使用できる。 これらDNA供与菌より染色体DNAを常法によ
り抽出し、常法により制限エンドヌクレアーゼで
処理し、同様に処理したベクターとして用いるプ
ラスミドもしくはフアージのDNAと混和し、リ
ガーゼによつて連結せしめる。染色体DNAにつ
いてのこの操作を浅く、すなわち部分分解で止ま
るようにすれば、多くの制限酵素が本実験の目的
に有効である。一方、ターミナルトランスフエラ
ーゼを用いて、染色体DNA断片と開裂したベク
ターDNAとに、デオキシアデニル酸とチミジル
酸もしくはデオキシグアニル酸とデオキシシチジ
ル酸とをそれぞれ付加し、混和したのちリガーゼ
で連絡せしめる方法も利用しうる。 ベクターDNAとしてはColE1の系統，pSC101
の系統，pBR322の系統，R6Kの系統，入フアー
ジの系統など通常用いられる全てのものが採用さ
れうる。 以上のようにして得た染色体DNA断片とベク
ターの結合物を形質転換法によつてエシエリヒア
属の菌体に入れ、遺伝形質として安定するまで短
時間増殖せしめたのち、所望の染色体上の遺伝形
質もしくは、ベクターのもつ形質もしくはそれら
両者を併せもつ菌のクローンを選択的に生育せし
める培地を用いて、所望の形質転換株を得る。こ
のとき用いるDNAの受容菌としては、エシエリ
ヒア属の菌ならば特に支障なく用いられ、カイー
1776等のEK−２ランクのものも使用可能である。
生産性を向上させるためには、チロシン、トリプ
トフアン、イソロイシン、メチオニン、ヒスチジ
ン、アルギニン、プロリン、ロイシン、リジン、
スレオニン、セリン、アデニン、グアニン、キサ
ンチン等の要求性、チロシンアナログ耐性、トリ
プトフアンアナログ耐性、ヒスチジンアナログ耐
性、サルフア剤耐性、等の性質を単独に付与する
か、又は二つ以上組み合わせた性質を付与するの
がよい。尚、これらの要求性耐性は当然DNA供
与菌についても付与されていた方が望ましい場合
が多い。 かくして得られたＬ−フエニールアラニン生産
菌を培養する方法は、従来のＬ−フエニールアラ
ニン生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、培
地としては、炭素源、窒素源、無機イオン更に必
要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常のものである。 炭素源としては、グルコース、シユクロース、
ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、糖蜜、ホエイ等が用いられる。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩その他が使用できる。 培地にフマル酸、クエン酸、酢酸、グルコン
酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸を添加すればよ
り好ましい結果が得られる場合が多い。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−フエニールアラニンの
生成蓄積が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ−フエニールア
ラニンが生成蓄積される。培養液よりＬ−フエニ
ールアラニンを採取するには通常の方法が適用で
きる。 本発明の微生物を用いることにより、従来知ら
れているエシエリヒア・コリーのＬ−フエニール
アラニン生産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−フエニ
ールアラニンの生成収率が高いばかりでなく、更
にＬ−フエニールアラニン以外のアミノ酸の副生
量が極めて少なく、Ｌ−フエニールアラニンの分
離・採取の際に好都合である。 実施例 １ (1) フエニールアラニン過剰生産能を遺伝情報に
もつた染色体DNAの調製 AJ11380株（Ｋ−12株（ATCC 10798）より
誘導したＰ−フルオロフエニルアラニン耐性
株）を１のＬ培地（ペプトン１％，酵母エキ
ス0.5％，グルコース0.1％，NaCI0.5％，PH7.2
に調整）中37℃で約３時間振盪培養を行い、対
数増殖期の菌体を集菌後、フエノール法による
通常のDNA抽出法によつて染色体DNAを抽出
精製し、最終5.0mgを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてアンピシリン耐性、テトラサ
イクリン耐性プラスミドの１種、BR322の
DNAを次のようにして調製した。まず、
BR322をプラスミドとして保有するエシエリ
ヒア・コリーＫ−12株の１種を１のグルコー
ス・カザミノ酸・無機塩培地（グルコース２
ｇ，NH4CI １ｇ，Na2HPO4 ６ｇ，KH2PO4
３ｇ，NaCI ５ｇ，MgSO4・7H2O 0.1ｇ，
CaCI2・2H2O 0.015ｇ，カザミノ酸20ｇを１
の水に溶解後、PH7.2に調整したものを基本培
地として用い、これにＬ−トリプトフアン 0.05ｇ，チミン0.05ｇ，サイアミン（塩酸
塩）100μｇを添加）に接種し、37℃で対数後
期まで培養したのち170μｇ／mlのクロラムフ
エニコールを添加し、更に培養した。 クロラムフエニコール添加後、16時間目に集菌
し、リゾチーム・SDS処理によつて溶菌させ、
30000ｇ、１時間の超遠心により上清を得た。
これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウム
クロライド−エチジウムブロマイド平衝密度勾
配遠心法によつて最終550μｇのpBR322プラス
ミドDNAを分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇを取り、制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRI、PstI、Hind、
BamHIをそれぞれ与え、37℃で５分、10分、
20分、30分、60分反応させ、DNA鎖を種々の
程度に切断した。(2)で得たベクターDNAの場
合は60分反応させ、完全に切断せしめた。65
℃、５分の熱処理後、両反応液を混合し、
ATR及びジチオスレイトール存在下、T4フア
ージ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時
間DNA鎖の連結反応を行つた。65℃、５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加え
て連結反応終了後のDNAを沈澱採取した。 (4) フエニールアラニン過剰生産遺伝子を担つた
プラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫー12株からニトロソグ
アニジン変異処理によつて誘導したフエニール
アラニン要求株No.123株をＬ培地10mlに接種し、
37℃で振盪培養を行い対数増殖期中期まで生育
させた後集菌し、これを氷冷下0.1MMgCI2、
0.1MCaCI2各溶液に順次懸濁させることによつ
ていわゆるコンピテントな（DNA取り込み能
を有する）細胞を調製した。このコンピテント
細胞懸濁液に、(3)で得たDNA（フエニールアラ
ニン過剰生産遺伝子を担つたプラスミドDNA
が含まれる）の溶解液を加えて氷冷下30分反応
させ、直ちに42℃、２分のヒートシヨツクを与
えた後、再び氷冷下に30分放置してDNAを細
胞内に取り込ませた。次に、この細胞懸濁液の
一定量を新たなＬ培地に接種し、37℃、３時間
振盪培養を行つて形質転換反応を完了させた
後、集菌洗滌し、再懸濁液を最少培地プレート
（グルコース２ｇ、（NH4）2SO4 １ｇ、
K2HPO4 ７ｇ、KH2PO4 ２ｇ、MgSO4・
7H2O 0.01ｇ、クエン酸ナトリウム0.5ｇを１
の水に溶解し、PH7.2に調整したものを基最
少培地とし、これに寒天２％を加えて殺菌した
固形培地）に塗抹し、37℃で３時間培養した。
生じたコロニーを釣菌し、そのアンピシリン
（50μｇ／ml）及びテトラサイクリン（5μｇ／
ml）の耐性度を、固形Ｌ培地で検定した。さら
にフエニルアラニン過剰生産能を有する菌株を
採取するためにフエニルアラニン要求性変異株
No.123全面に塗布した最小培地平板上に上記コ
ロニーを移植した。フエニルアラニン分泌コロ
ニーの周囲にはフエニルアラニン要求性菌が生
育するのでハローが観察され容易に過剰生産菌
を識別することができた。少くとも一種の上記
抗生物質に耐性を有し、かつフエニールアラニ
ンの過剰生産能を有するコロニーを目的とする
形質転換株として純化し、保存した。 (5) 新規フエニールアラニン生産株によるＬ−フ
エニールアラニンの生産 (4)で得られた菌株のうち、AJ 11379（FERM
−Ｐ 5043）を、DNA供与菌であるAJ 11380
と比較して、Ｌ−フエニールアラニンの発酵生
産を検定した結果を第１表に示す。 培養方法は、下記培地組成を20mlずつ500ml
容フラスコに分注し、これに第１表に示す微生
物を１白金耳植えつけ、31℃で72時間培養し
た。培養液の遠心上清中のＬ−フエニールアラ
ニンはバイオアツセイ法で定量した。
【表】 培地組成： グルコース５ｇ／dl、硫酸アンモニウム2.5
ｇ／dl、リン酸第一カリ0.2ｇ／dl、硫酸マグ
ネシウム・７水塩0.1ｇ／dl、酵母エキス0.1
ｇ／dl、サイアミン・塩酸塩1000γ／、
FeSO4・7H201mg／dl、MnSO4・4H2O1mg／
dl、炭酸カルシウム2.5ｇ／dl（別殺菌）、PH
７・０。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ エシエリヒア属のフエニールアラニンアナロ
    グに耐性を有する変異株より得たＬ−フエニール
    アラニンの合成に関与する遺伝情報を担うデオキ
    シリボ核酸を組み込んだベクターを、エシエリヒ
    ア属の微生物に含有せしめたＬ−フエニールアラ
    ニン生産性微生物を培養し、培養液中に蓄積した
    Ｌ−フエニールアラニンを採取することを特徴と
    するＬ−フエニールアラニンの製造法。
JP7548379A 1979-06-15 1979-06-15 Preparation of l-phenylalanine by fermentation Granted JPS561890A (en)

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