FR2459286A1 - Procede pour produire de la l-phenylalanine par fermentation - Google Patents

Procede pour produire de la l-phenylalanine par fermentation Download PDF

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Abstract

UN PROCEDE POUR PRODUIRE DE LA L-PHENYLALANINE PAR FERMENTATION CONSISTE A CULTIVER DANS UN MILIEU DE CULTURE UN MICRO-ORGANISME PRODUCTEUR DE L-PHENYLALANINE FORME PAR INCORPORATION D'UN PLASMIDE HYBRIDE A UNE SOUCHE RECEVEUSE DU GENRE ESCHERICHIA COLI ET A RECUPERER LA L-PHENYLALANINE ACCUMULEE DANS LE MILIEU DE CULTURE, CE PLASMIDE HYBRIDE AYANT ETE FORME PAR INSERTION D'UN FRAGMENT D'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE POSSEDANT UNE INFORMATION GENETIQUE CONCERNANT LA PRODUCTION DE LA L-PHENYLALANINE ET OBTENU A PARTIR D'UN MUTANT RESISTANT AUX ANALOGUES DE LA PHENYLALANINE DU GENRE ESCHERICHIA.

Description

La présente invention concerne un procédé pour produire
de la L-phénylalanine par fermentation.
On sait utiliser, pour la production par fermentation de la Lphénylalanine, des mutants auxotLophes ou résistant aux drogues appartenant aux genres Brevibacterium, Corynebacterium et Escherichia (brevets des Etats-Unis d'Amérique n0 2 973 304 et
n 3 660 235).
La demanderesse a choisi un mutant du genre Escherichia résistant aux analogues de la phénylalanine comme donneur d'acide désoxyribonucléique (appelé ci-après ADN), puis a obtenu à partir du mutant un fragment d'ADN possédant l'information génétique concernant la production de Lphénylalanine puis a finalement inséré le fragment d'ADN dans un plasmide obtenu à partir d'Escherichia coli. Le plasmide recombinant a été introduit avec succès dans un micro-organisme du genre Escherichia. On a constaté que le micro-organisme de l'invention produit de la phénylalanine avec un rendement bien supérieur à celui des mutants producteurs de L-phénylalanine du genre Escherichia
connus à ce jour.
Le mutant du grene Escherichia résistant aux analogues de la phénylalanine est connu et on l'obtient selon les techniques
habituelles de mutation artificielle.
Les analogues de phénylalanine que l'on utilise dans l'invention inhibent le développement du micro-organisme du genre Escherichia mais cette inhibition est supprimée en partie ou en totalité par la présence de Lphénylalanine. On peut citer comme
exemples de tels analogues de la phénylalanine, l'o-, m- ou p-
fluorophénylalanine, l'o-, m- ou p-aminophénylalanine, la 3-phényl-
sérine, la cyclohexylalanine, l'acide a-amino P-phényléthanesulfo-
nique, l'o-, m- ou p-chlorophénylalanine, l'o-, m- ou p-bromophényl-
alanine, la P-(thiényl-2)alanine, la 5-(thiényl-3)alanine, la P-(furyl-2) alanine, la P-(pyrrolyl-2)alanine, la (cyclopentène-l yl)-l alanine, la (cyclohexène-l yl)-l alanine, l'acide amino-2 méthyl-4 hexène-4 oque, la S-(dichloro-l,2 vinyl)cystéine, la -pyridyl-4) alanine, la P-(pyridyl-2) alanine, la P-(pyrazolyl-4)alanine et la
p-nitrophénylalanine.
Le donneur d'ADN que l'on utilise dans l'invention peut également être un mutant qui, au lieu de résister aux analogues de la phénylalanine, présente une résistance aux analogues du tryptophane tels que le fluoro-5 tryptophane, une résistance à la (thiényl-2)alanine ou dont le développement nécessite de la tyrosine. On extrait l'ADN chromosomique du mutant de façon habituelle et on le traite avec une endonucléase de restriction selon
un procédé habituel.
On traite également l'ADN du plasmide ou du phage utilisé comme ADN vecteur, avec une endonucléase de restriction de façon analogue. On peut utiliser divers types d'endonucléases de
restriction si la digestion de l'ADN chromosomique est partielle.
Ensuite, on soumet à une réaction de réunion l'ADN chromosomique ayant subi la digestion et l'ADN vecteur ayant subi
la digestion.
On peut également pour effectuer la recombinaison de l'ADN, incorporer au fragment d'ADN chromosomique et à l'ADN vecteur clivé de la terminaltransférase, de l'acide désoxyadénylique et de l'acide thymidylique ou de l'acide désoxyguanylique et de l'acide désoxycytidylique et soumettre le fragment d'ADN chromosomique
modifié et l'ADN vecteur clivé modifié à une réaction de réunion.
Comme ADN vecteur on peut utiliser des vecteurs clas-
siques tels que Col El, pSC 101, pBR 322, R6K, un phage et leurs dérivés. On peut incorporer l'ADN hybride ainsi obtenu à un micro-organisme du grenre Escherichia selon une technique classique de transformation. On sélectionne le transformant désiré avec un
milieu sur lequel peut se développer un clone présentant les carac-
téristiques de production de la phénylalanine que possède le frag-
ment d'ADN chromosomique et/ou celles que possède l'ADN vecteur.
Comme receveur de l'ADN hybride, on peut utiliser une
souche quelconque du genre Escherichia.
Pour accroître la productivité, il est souhaitable que le receveur ait un besoin nutritionnel donné, par exemple un besoin
en tyrosine, tryptophane, isoleucine, méthionine, histidine, argi-
nine, proline, leucine, lysine, thréonine, sérine, adénine, guanine
ou xanthine et une résistance par exemple aux analogues de la tyro-
sine, aux analogues du tryptophane, aux sulfamides, isolément ou en combinaison. On préfère que l'ADN donneur possède la résistance ou
le besoin nutritionnel.
Le procédé de culture de la souche productrice de L-phénylalanine ainsi obtenue est classique et semblable aux procédés
de culture des micro-organismes connus producteurs de L-phénylalanine.
Donc le milieu de culture est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et, lorsqu'il est nécessaire, des substances nutritives organiques oeorkdus telles que des vitamines ou des amino-acides. On peut citer comme exemples de sources de carbone, le glucose, le saccharose, le lactose, l'hydrolysat d'amidon et la mélasse. On peut utiliser comme sources
d'azote, l'ammoniac gazeux, l'ammoniaque aqueuse, les sels d'ammo-
nium et autres. Dans le cas o on ajoute au milieu un acide organique tel que l'acide fumarique, l'acide citrique, l'acide acétique,
l'acide gluconique, l'acide tartrique et l'acide malique, le rende-
ment en L-phénylalanine est généralement amélioré.
On effectue la culture en aérobiose avec ajustement du pH et de la température du milieu à des valeurs appropriées et
on poursuit la culture jusqu'à arrêt de la formation de la L-phényl-
alanine.
On peut récupérer de façon classique la L-phénylala-
nine accumulée dans le milieu de culture.
Le procédé de l'invention permet d'obtenir la L-phényl-
alanine avec un rendement supérieur à celui des procédés connus. De plus la quantité d'amino-acides formés conme sous-produits est faible
et par conséquent on peut récupérer la L-phénylalanine avec un ren-
dement élevé selon un procédé simple.
L'invention est illustrée par les exemples non limi-
tatifs suivants.
Exemple 1
(1) Préparation d'ADN chromosomigue _os sédant une information
génétigueconcernant la 2roduction de L-ehénylalanine.
On cultive Escherichia coli AJ 11380, qui est un mutant résistant à la pfluorophénylalanine et est produit à partir de la souche K-12 (ATCC 10798) , à 37 C pendant 3 heures en agitant dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose, et 0, 5 g/dl de chlorure
de sodium (pH ajusté à 7,2) et on recueille les cellules bacté-
riennes pendant la phase de croissance exponentielle. On extrait l'ADN chromosomique selon le procédé classique au phénol et on
obtient 5,0 mg d'ADN purifié.
(2) Préparation de l'ADN vecteur.
Comme vecteurs on utilise l'ADN du plasmide pBR 322 qui contient à la fois des gènes de résistance à l'ampicilline et à
la tétracycline comme marqueurs, de la façon suivante.
On incube une souche d'Escherichia coli K-12 portant le plasmide pBR 322 à 37 C dans un litre de milieu glucosé au "casamino acid" et aux sels minéraux, contenant par litre 2 g de glucose, 1 g de chlorure d'ammonium, 6 g de phosphate disodique, 3 g de phosphate monopotassique, 5 g de chlorure de sodium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,015 g de chlorure de calcium dihydraté, 20 g de "casamino acid", 0,05 g de Ltryptophane, 0,05 g
de thymine et 0l0,ug de chlorhydrate de thiamine (pH ajusté à 7,2).
Après incubation jusque vers la fin de la phase logarithmique, on ajoute au milieu de culture 170 "g/ml de chloramphénicol. Pendant
ces opérations, l'ADN de plasmide se développe et s'accumule abon-
damment dans les cellules bactériennes.
Après 16 heures d'incubation, on recueille les cel-
lules puis on les lyse par traitement par le lysozyme et le dodécyl-
sulfate de sodium. On centrifuge le lysat à 30 000 x g pendant 1 heure pour obtenir un surnageant. Après concentration du surnageant
on obtient 550 ug d'ADN de plasmide par fractionnement avec centri-
fugation dans un gradient de densité équilibré à base de chlorure
de césium et de bromure d'éthidium.
(3) Insertion du frament d'ADN chromosomigue dans le vecteur.
________________-- -- - -- - ___ _ __ _ __ _ __ ___ ______________
On traite 10 pg de l'ADN chromosomique avec chacune des endonucléases de restriction suivantes: EcoRI, Pst I, Hind III et Bam HI à 37 C pendant respectivement 5, 10, 20, 30 et 60 minutes
pour cliver les chalnes d'ADN puis on chauffe à 65 C pendant 5 mi-
nutes. On traite également 10 pg de l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de restriction EcoRI, Pst I, Hind III et Bam HI à 37 C pendant 1 heure pour cliver totalement l'ADN puis on chauffe à
C pendant 5 minutes.
On soumet la solution d'ADN chromosomique ayant subi la digestion et la solution d'ADN vecteur clivé et on effectue une réaction de réunion des fragments d'ADN avec l'ADN-ligase de phage T4 en présence d'ATP et de dithiotréitol à 10 C pendant 24 heures. On chauffe ensuite le mélange réactionnel à 65 C pendant 5 minutes et on ajoute un volume double d'éthanol. On recueille l'ADN recombinant
ainsi précipité.
(4) Transformation énétiue par le _plasm!ide hybride portant l'infor-
mation génétigue concernant la production de phénylalanine.
On cultive dans 10 ml de milieu L à 37 C et en agitant une souche nécessitant de la L-phénylalanine d'Escherichia coli n 123
que l'on a obtenue par mutagénèse par la N-méthyl N'-nitro N-nitroso-
guanidine d'Escherichia coli K-12.
On recueille les cellules pendant la phase de crois-
sance exponentielle et on les met en suspension dans une solution 0,1 M en chlorure de magnésium puis dans une solution 0,1 M en chlorure
de calcium dans un bain-marie glacé pour préparer des cellules "com-
pétentes" capables de fixer l'ADN.
On ajoute l'ADN obtenu dans le stade (3) qui contient
le plasmide hybride vecteur d'ADN étranger dans la solution de cel-
lules compétentes. On maintient la suspension au bain-marie glacé pendant 30 minutes puis on chauffe à 420C pendant 2 minutes et on laisse à nouveau reposer au bain-marie glacé pendant 30 minutes. On ensemence ensuite le milieu L avec les cellules ayant ainsi incorporé le plasmide hybride vecteur d'ADN étranger et on agite le milieu à 370C pendant 3 heures pour achever la réaction de transformation. On recueille les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une petite portion de la suspension cellulaire sur une boite
de gélose contenant par litre 2 g de glucose, 1 g de sulfate d'am-
monium, 7 g de phosphate dipotassique, 2 g de phosphate monopotassique, 0$1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de citrate de sodium
dihydraté et 2 g de gélose (pH ajusté à 7,2). On incube la botte à 37*C.
Apres trois jours d'incubation, on recueille toutes les colonies for-
mées, on les purifie et on les isole. Le transformant est constitué des colonies qui résistent à au moins un des deux antibiotiques que
sont l'ampicilline et la tétracycline et qui sont capables de pro-
duire de la phénylalanine. On détermine la résistance à l'ampicilline (50, ug/ml) et à la tétracycline (5 pg/ml) avec du milieu géiosé L et on détermine la capacité de production de la L-phénylalanine par for- mation d'un halo sur un milieu gélosé minimal o l'on a préalablement étalé la souche mutante d'Escherichia coli n 123 nécessitant de la phénylalanine. (5) Production de L-phénylalanine par la nouvelle souche _productrice O __e_ _h_.Z_.-_ ______
Le tableau I ci-après illustre les résultats expéri-
mentaux de la production par fermentation de L-phénylalanine avec la souche AJ 11379 (NRRL B-12117) qui est un des clones obtenus dans le stade (4). Cette souche a été adressée par courrier recommandé à l'Institut de Recherches sur les Fermentations, Ministère des Sciences et Technologies Industrielles du Japon le 15 juin 1979 avec le numéro d'enregistrement 104 wo (en japonais le caractère "t") a 137, et
elle y a été immatriculée Ferm-P 5043.
Le milieu de fermentation utilisé contient 5 g/dl de
glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2 g/dl de phosphate mono-
potassique, 0,1 g/dl de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 1 000 >g/1 de chlorhydrate de thiamine, 1 pg /dl de sulfate ferreux heptahydraté, 1 ug/dl de sulfate de manganèse tétrahydraté et 2,5 g/dl de carbonate de calcium (stérilisé séparément)
et le pH est ajusté à 7,0.
On introduit 20 ml du milieu de fermentation dans un
flacon de fermentation-de 500 ml, on ensemence avec une anse d'inocu-
lum du micro-organisme étudié et on cultive à 31 C pendant 72 heures.
On effectue la détermination microbiologique de la quantité de Lphénylalanine présente dans le bouillon de fermentation surnageant.
TABLEAU I
Micro-organisme étudié Quantité de L-phénylalanine accumulée (mg/dl Escherichia coli AJ 11380 30 Escherichia coli AJ 11379 120
2459Z86
(6) Incorporation du plasmidehbride à des souches ne nécessitant
pas deL:pthényleleUine.
On isole le plasmide hybride contenu dans la souche AJ 11379 selon un procédé semblable à celui décrit dans le stade (2) et on l'incorpore à Escherichia coli K-12 (ATCC 10798), Escherichia coli n 22 (souche nécessitant de la L-tyrosine dérivant de K-12), Escherichia coli n 176 (souche résistant à la p-fluorophénylalanine dérivant de K-12) ou Escherichia coli no 67 (souche nécessitant de la L-tyrosine et résistant à la p-fluorophénylalanine dérivant de
K-12).
On utilise les transformants AJ 11569 (NRRL B-12144), AJ 11570 (NRRL B12145), AJ 11571 (NRRL B-12146) et AJ 11572 (NRRL B-12147) que l'on obtient par sélection des colonies résistant à l'ampicilline et à la tétracycline et les souches receveuses, dans un
procédé de production par fermentation de la L-phénylalanine sem-
blable à celui décrit dans le stade (5) si ce n'est qu'on ajoute mg/dl de L-tyrosine au milieu de fermentation dans le cas des
souches n 22, AJ 11570, n 67 et AJ 11572.
On mesure la quantité de L-phénylalanine produite par détermination microbiologique. Les résultats figurent dans le
tableau II.
TABLEAU II
Souche Receveur ou transformant marqueur L-phénylalanine (g/l) K-12 receveur (sauvage) 0,00 AJ 11569transformant AmPt *l TCr*2, PFPrk3 1,16 N 22 receveur Tyr- 0,36 AJ 11570 transformant Tyr-, Ampr, TC', PFP 2,80 NG 17 6 receveur PFPr 0,40 AJ 11571 transformant PFP r, AP, TCr 1,30 N 67 receveur Tyr-, PFPr 2,00 J 11572 transformant Tyr-, PFPr, AmpTC 3,90 *1: résistant à l'aupicilline *2: résistant à la tétracycline
*3: résistant à la p-fluorophénylalanine.
X4 5 928 6
Bien entendu diverses modifications peuvent être
apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui vien-
nent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans
sortir du cadre de l'invention.

Claims (2)

R E V E N D I C A T I O N S
1. Procédé pour préparer de la L-phénylalanine par fer-
mentation caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de L-phénylalanine que l'on
a formé par incorporation d'un plasmide hybride à une souche rece-
veuse du genre Escherichia, et à récupérer la L-phénylalanine accumu- lée dans le milieu de culture, ce plasmide hybride ayant été formé par insertion d'un fragment d'acide désoxyribonucléique possédant
une information génétique concernant la production de L-phénylala-
nine et obtenu à partir d'un mutant résistant aux analogues de la
phénylalanine du grenre Escherichia.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de L-phénylalanine est Escherichia coli NRRL B-12117, Escherichia coli NRRL B-12144, Escherichia coli NRRL B-12145, Escherichia coli NRRL B-12146 ou Escherichia coli
NRRL B-12147.
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