KR100192024B1 - 신규의 미생물 및 이를 사용한 d-비오틴의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
염색체에 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아속 미생물로부터 클론된 비오틴 유전자가 혼입된 재조합 플라스미드를 도입하고 추가로 외인성 비오틴유전자를 통합함에 의한 d - 비오틴을 생산할 수 있는 숙주 미생물 유래의 미생물, 및 배양 배지에 미생물을 배양하고 배양배지에 d - 비오틴을 형성 및 축적시키고 d - 비오틴을 수집하는 것으로 구성되어 있는 d - 비오틴의 제조방법. 본 발명의 미생물은 특히 d - 비오틴의 생산성이 높으므로, 본 발명의 미생물을 배양함으로써 d - 비오틴을 대량으로 생산할 수 있다.
Description
제1도는 본 발명의 신규의 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) TA5026 및 TA5027의 제조를 도해한 것이다.
제2도는 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA의 제조를 도해한 것이다.
제3도는 재조합 플라스미드 pCHR81중에서 트랜스포존 Tn5의 위치를 나타낸 것이다.
제4도는 재조합 플라스미드 pCHRM304의 제조를 도해한 것이다.
본 발명은 신규의 미생물 및 이를 사용한 d-비오틴의 제조방법에 관한 것이다.
d - 비오틴은 사람 또는 그외의 동물에 필수적인 비타민이며 약제의 원료로서 또는 사료 첨가제로서 사용된다. 통상적인 발효 배지를 사용한 발효법에 의해 D - 비오틴을 제조하는 방법으로서, 에스케리키아(Escherichia) 또는 세라티아(Serratia) 속 유래의 유전학적으로 처리한 미생물을 사용한 방법이 공지되어 있다「참조 : 일본국 특허공고 제500081/1989호, 일본국 특허공개 제155081/1987 호 및 제 27980/1990호」.
그러나, 유전학적으로 처리한 미생물을 사용한 이러한 방법에서 d - 비오틴의 생산효율은 그렇게 높지 않으므로 d - 비오틴의 생산성이 더 높은 신규의 미생물의 제조와 이러한 미생물을 사용하여 충분히 높은 생산 효율의 d - 비오틴을 제조할 수 있는 개선된 공업적 발효법을 개발할 것이 요망되었다.
여러 가지 조사결과, 본 발명자들은 (ⅰ) 에티오닌 또는 S - 아미노에틸시스테인에 대한 내성을 수득하기 위하여 액티티아진산 - 내성 변이주를 돌연변이 시킴으로써 수득한 돌연변이 미생물이 증가된 d - 비오틴 생산성을 나타내고 ; (ⅱ) 세라티아 속 미생물로부터 클론된 d - 비오틴 생산을 담당하는 염색체 데옥시리보핵산(이하, DNA라 한다)단편이 트랜스포존을 이용함으로써 염색체내에 통합된, d - 비오틴 생산성을 나타내며 ; (ⅲ) 이들 d - 비오틴 생산성이 높은 미생물이 클로로 아세트산과 같은 아세트산 유사체에 대하여 부가의 내성을 획득하였을 때, 이러한 미생물은 또한 특히 증가된 d - 비오틴 생산성을 나타내고 ; (ⅳ) 상기 미생물(ⅱ) 또는 (ⅲ)에, 액티티아진산 - 내성 변이주로부터 클론된 비오틴 유전자 단편과 백터를 함유하는 재조합 플라스미드가 혼입되었을 때, 생성된 미생물은 매우 증가된 d - 비오틴 생산성을 나타냄과, 이 미생물(ⅳ)를 이용함으로써 공업적인 규모로 d- 비오틴을 유리하게 제조할 수 있음을 알아내었다.
본 발명의 목적은 숙주 미생물의 염색체에 d - 비오틴을 제조할 수 있는 세라티아 속 미생물로부터 클론된 비오틴 유전자가 혼입된 재조합 플라스미드를 도입하고 추가로 외인성 비오틴 유전자를 통합시킴으로써, d - 비오틴을 생산할 수 있는 숙주 미생물 유래의 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 배양 배지에 d - 비오틴이 형성 및 축적되도록 배양배지에 미생물을 배양하고 생성된 d - 비오틴을 수집하는 것으로 구성되어 있는 d - 비오틴의 제조방법을 제공하는 것이다.
[A] 비오틴의 유전자의 원료 :
본 명세서에서의 비오틴 유전자라 함은, 7,8 - 디아미노펠라르곤산 아미노트랜스퍼라제 코딩 유전자(bioA), 비오틴 신세타제 코딩 유전자(bioB), 7 - 케토 - 8 - 아미노펠라르곤산 신세타제 코딩 유전자(bioF), 피멜로일 - CoA 신세타제코딩 유전자(bioC) 및 데티오비오틴 신세타제 코딩 유전자(bioD)와 같이 생체내에서 d - 비오틴 생산에 참여하는 유전자, 또는 이들 유전자의 일부분을 의미한다. 이러한 유전자의 원료로는 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아 속에 속하는 미생물이 포함된다「참조 : Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, p477(1984)」. 본 발명에서 사용된 비오틴 유전자는, 액티티아진산, 5 - (2 - 티에닐) 발레르산, 데히드로비오틴 등과 같은 비오틴 유사체에 대하여 내성을 나타내는 세라티아 속 미생물로부터 유래된 것이 바람직하다.
이러한 미생물로는 세라티아 마르세센스 SB 303(FERM P-10119) 및 세라티아 마르세센스 SB411과 같이 액티티아진산 내성을 나타내는 미생물이 있다「참조 : 일본국 특허 공개 제 27980/1990 호」. 또한 야생주 세라티아 마르세센스 Sr41 8000(FERM BP-487)과 같이 비오틴 유사체에 대하여 내성을 나타내지 않는 미생물도, 일본국 특허 공개 제 27980/1990호에 기재된 공지의 방법에 의해 비오틴 유사체에 대한 내성을 수득하게 한 후, 비오틴 유전자의 원료로서 적당하게 사용할 수 있다.
또한, 비오틴 유사체에 대한 이외에도, 에티오닌과 같은 메티오닌 유사체에 대한 내성, S - 아미노에틸 - 시스테인과 같은 리신 유사체에 대한 내성, 및 클로로아세트산과 같은 아세트산 유사체에 대한 내성을 나타내는 미생물을 비오틴 유전자 원료로서 사용할 수도 있다.
[B] 백터 플라스미드 :
상기 비오틴 유전자와 함께 재조합 플라스미드를 제조하는데 사용되는 백터 플라스미드는 형질 전환 세포 내에서 복제 가능한 어떠한 플라스미드도 될 수 있으나, 바람직한 것은 카피수가 1 ∼ 수천이며, 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜등과 같은 항생제에 대하여 내성 마커를 함유하며, 또한 lac, tac 또는 trp과 같은 적당한 프로모터를 함유하는 플라스미드이다. 또한, 백터 플라스미드는 par 및 parB와 같이 플라스미드 안정화 유전자를 함유할 수도 있다.
이러한 백터 플라스미드로는 예를 들면, pLG339[참조 : Gene, Vol. 8, p335(1982)], pBR322[참조 : Gene, Vo1. 2, p95(1977)], pUC18[참조 : Gene, Vo1. 33, p103(1985)], pUC19[참조 : Gene, Vol. 33, p103(1985)], pHSG298[참조 : Gene, Vol. 61, p63(1987)], pHSG299[참조 : Gene, Vol. 61. p63(1987)], pKG1022[참조 : Biotechnology, Vol. 6, p1402(1988)], pKT240[참조 : Gene, Vo1. 26, p273(1983)] 등이 있다. 백터 플라스미드의 또 다른 적당한 예로는 Tn5가 트랜스포존으로서 함유되고 카나마이신 - 내성 유전자와 트리메토프림 - 내성 유전자가 선택 마커로서 함유되어 있는 접합성 플라스미드 R388로부터 유래된 온도 - 민감성 복제 가능한 플라스미드인 플라스미드 pCHR81이다[참조 : Gene, Vol. 56, p283(1987)].
상기한 플라스미드는 시판 중인 것이거나, 투명 용균법(cleared lysate method)(참조 : 야스유끼 다까기, Procedure for Experiment in Genetic Engineering, p125, KodanSha 출판, 1980), 또는 알칼리 용균법[참조 : 마니아티스 등, Molecular Cloning, p368, Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A.(1982)]과 같은 통상적인 방법에 의해서 이들 플라스미드를 함유하는 미생물세포로부터 제조할 수 있다.
[C] 숙주 미생물 :
본 발명의 숙주 미생물은 d - 비오틴을 생산할 수 있는 어떠한 미생물도 될 수 있다.
특히, 바람직한 숙주 미생물은 액티티아진산, 5 - (2 - 티에닐)발레르산, 데히드로비오틴 등과 같은 비오틴 유사체, 클로로아세트산 등과 같은 아세트산 유사체, 메티오닌 또는 에티오닌 등과 같은 메티오닌 유사체, 및 S - 아미노에틸시스테인 등과 같은 리신 유사체 중의 하나 또는 이들 모두에 대하여 내성을 갖는 세라티아 속 미생물이다. 가장 바람직한 것은 액티티아진산, 에티오닌 및 S - 아미노에틸시스테인에 대하여 내성을 갖는 세라티아 마르세센스 또는 추가로 클로로아세트산에 대하여 내성을 갖는 세라티아 마르세센스이다.
이러한 숙주 미생물의 예로는 세라티아 마르세센스 SB303(FERM P - 10119) 및 세라티아 마르세센스 SBR411(일본국 특허 공개 제 27980/1990호). 비오틴 유전자를 백터 pLG339에 삽입함으로써 제조된 재조합 플라스미드 pLGM201을 함유하는 세라티아 마르세센스 TA5023(FERM BP-4101)등과 같이 액티티아진산에 대하여 내성을 가지며 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아 마르세센스가 있다. 또한, 야생주 세라티아 마르세센스 Sr 41 8000(FERM BP-487)을 상기 물질에 대하여 내성을 획득하게 한 후 적당하게 사용할 수도 있다.
상기한 내성은 공지의 방법에 의해 숙주 미생물에 부여할 수 있다. 예를 들면, 적당한 미생물에 통상적인 변이 유발 처리를 행한 후, 예를 들면 데이비스 - 밍기올리(Davis - Mingioli)최소 배지 [Journal of Bacteriology, Vol. 60, p17(1950)] 또는 탄소원이 여러 가지 당, 유기산 또는 아미노산으로 대체된 그의 변형 배지와 같이 상기 미생물이 비오틴 유사체, 아세트산 유사체 등에 대한 목적하는 내성을 획득하도록 상기 물질을 보충한 최소 한천 배지 상에서, 27 ∼ 37℃에서 3∼7일간 배양하고 형성된 큰 콜로니를 분리한다. 이어서, 분리된 미생물에 대하여 목적하는 내성을 갖는 미생물을 선택하기 위하여 락토바실루스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)을 이용한 미생물 정량법(참조 : Seikagaku Jikken Koza, Vol. 13, p355)에 의하여 발효 배양 배지 내에서의 d- 비오틴 생산성을 시험한다.
숙주 미생물에 내성을 부여하는 처리는 숙주 미생물의 염색체에 재조합 플라스미드를 도입하거나 외인성 비오틴 유전자를 통합시키기 전 또는 후에 행할 수 있다.
[D] 재조합 플라스미드의 제조:
비오틴 유전자는 예를들면, 투명 용균법[참조 : 야스유끼 다까기, Procedure for Experiment in Genetic Engineering, p125, Kodansha 출판, 1980; 마니아티스 등, Molecular Cloning, p86, Cold Spring harbor Laboratory(1982)]과 같은 통상적인 방법에 의해 비오틴 유전자를 함유하는 상기 미생물로 부터 제조할 수 있다. 예를 들면, 비오틴 유전자를 함유하는 염색체를 적당한 제한 효소로 분해시키고 수득된 유전자 단편을 아가로스 겔 전기영동시킨다. 이어서, 비오틴 유전자 단편을 함유하는 분획을 아가로스 겔로부터 분리하고 투석관을 사용한 전기영동 용출법을 행한다.[참조:마니아티스 등, Molecular Cloning, p164, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)].
이후에, 백터 플라스미드를 적당한 제한 효소(예 : EcoRI, HindIII, BamHI, SalI 등)를 사용하여 부분적으로 분해시키고 수득된 부분적으로 분해된 단편을 DNA 리가아제(예 : T4 리가아제, 이, 콜리 DNA 리가아제 등)에 의해 상기의 비오틴 유전자 단편에 결찰시켜 재조합 플라스미드를 제조한다. 백터플라스미드는 parB와 같이 플라스미드 안정화 유전자를 담당하는 DNA단편이 혼입된 플라스미드[Journal of Molecular Biology, Vol. 203, p119(1988)] 또는 적당한 선택 마커 유전자를 함유하는 플라스미드일 수 있다. 이어서, 제한효소 - 결핍 d - 비오틴 - 요구 변이주[예 : 에스케리키아 콜리 x1776주(ATCC 31244) : Molecular Cloning of Recombinant DNA, p248, ed. by Scott and Werner, Academic Press (1977)등]를 상기에서 수득한 재조합 플라스미드로 형질전환시키고, 7 - 케토 - 8 - 아미노펠라르곤산이 보충된 배양 배지 상에서, 카나마이신에 대하여 내성이 있으며 d - 비오틴을 요구하지 않는 매싱물을 분리한 후 수득한 클론으로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 목적하는 재조합 플라스미드를 수득한다.
[E] 비오틴 유전자가 염색체에 혼입된 숙주 미생물 :
비오틴 유전자가 염색체에 혼입된 숙주 미생물은, 트랜스포존과 마커 유전자를 함유하는 플라스미드에 외인성 비오틴 유전자를 결찰시키고 이 플라스미드를 숙주 미생물에 도입함으로써 제조될 수 있다.
플라스미드로는 염색체에 트랜스포존을 통합시켜 제조한 pCHR81 플라스미드가 있다[Gene, Vol. 56, p283(1987)]. 플라스미드 pCHR81은 혼입된 트랜스포존 Tn5를 함유하며 선택 마크 유전자로서 카나마이신 - 내성 유전자와 트리메토프림 - 내성 유전자가 있다. 외인성 유전자는 SmaI, SalI, BamHI 등과 같은 제한 효소 부위를 이용하여 Tn5의 적당한 부분에 결찰시키고 이어서 생성된 재조합 플라스미드를 숙주 미생물에 도입한다.
재조합 플라스미드를 숙주 미생물에 도입하기 전에, 외인성 유전자가 결찰된 플라스미드를 세라티아 속 미생물의 변형계로 변셩시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이러한 변형은 다까기 및 기스미법 [Journal of Bacteriology, Vol. 161, p1(1985)]에 의해 외인성 유전자를 세라티아 마르세센스 TT392(세라티아 마르세센스 Sr 41의 변이주)[Journal of Bacteriology, Vol. 161, p1(1985)]에 결찰시킨 플라스미드를 도입하고 투명 용균법에 의해 수득된 형질 전환된 미생물로부터 플라스미드를 분리함으로써 수행될 수 있다.
변형된 플라스미드를 다까기 및 기스미법에 의해 숙주 미생물에 도입하고 숙주 미생물을 약 37℃에서 수시간 동안 배양하고, 적당히 희석한 후 수득한 배양 용액을 영양 한천 평판 배지에 도포한다. 이어서, 30℃에서 하룻밤 배양을 행하여 콜로니를 형성하고 카나마이신 내성과 트리메토프림 감수성을 나타내는 콜로니를 선택한다. 클로니를 분리한 후, 미생물 세포로부터의 염색체 DNA를 Tn5 DNA내의 적당한 부위에 상응하는 탐침을 사용하여 서던 블로팅 분석을 행하여 예견된 뉴클레오티드 번호부위에 DNA밴드를 나타내는 균주를 외인성 비오틴 유전자가 염색체에 통합된 세라티아 속의 숙주 미생물로서 확인할 수 있다.
[F] 클론된 비오틴 유전자 단편을 함유하는 재조합 플라스미드를 포함한 세라티아 속 미생물의 제조 :
비오틴 유전자를 백터 플라스미드에 혼입함으로써 제조된 재조합 플라스미드는, 예를 들면 다까기 및 기스미법에 의해 비오틴 유전자가 염색체에 혼입된 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 형질 전환된 미생물은 재조합 플라스미드의 약제 - 내성 마커에 의해 석택될 수 있다. 이렇게 수득된 재조합 미생물로는 예를 들면, 액티티아진산, 에티오닌, S - 아미노에틸 시스테인 및 클로로아세트산에 대하여 내성을 가지며 염색체 내에 외인성 d - 비오틴 유전자 단편을 함유하는 숙주 미생물 세라티아 마르세센스 K8CL48에 d-비오틴 유전자 단편을 함유하는 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA를 도입함으로써 제조된 세라티아 마르세센스 TA5027(FERM BP - 4103); 액티티아진산, 에티오닌 및 S - 아미노 - 에틸시스테인에 대하여 내성이 있으며 염색체 중에 외인성 d - 비오틴 유전자 단편을 함유하는 숙주 미생물 세라티아 마르세센스 ETA23-K8에 d-비오틴 유전자 단편을 함유하는 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA를 도입함으로써 제조된 세라티아 마르세센스 TA5026(FERM BP -4102)등이 있다.
[G] 배양 :
배양 배지에 d - 비오틴이 형성되고 고농도로 축적되도록 d - 비오틴을 생산할 수 있는 제조된 미생물을 배양한다.
d- 비오틴의 제조에 사용되는 배지는 미생물이 생육할 수 있는 어떠한 통상적인 배지도 포함된다. 적당한 배지는 당류(예 : 글루코스, 슈크로스, 당밀 등), 유기산(예 : 푸마르산, 시트르산 등), 또는 알콜(예 : 글리세롤 등)과 같은 탄소원 ; 무기 암모늄염(예 : 황산암모늄, 염화암모늄 등) 또는 우레아와 같은 질소원 ; 및 콘스팁 리쿼, 펩톤, 효모 추출액, 또는 카제인 가수분해물과 같은 유기 영양소 등을 함유한다. 탄소원은 일반적으로 배지의 전체 중량에 대하여 10∼30 중량 %의 양으로 함유되며, 질소원은 일반적으로 배지의 전체 중량에 대하여 1∼3중량 %의 양으로 함유되고, 유기 영양소는 배지의 전체 중량에 대하여 0∼1중량 %의 양으로 함유된다. 또한 배지는 임의적으로 소량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 황산 제1철, 몰리브덴산 나트륨 등을 함유할 수 있다. 또한 배지의 pH를 6∼8로 조절하기 위하여 임의로 탄산칼슘, 암모늄 등을 함유할 수도 있다.
본 발명의 미생물을 상기 배지에 배양하고 3∼7일간 25∼37℃에서의 진탕 배양 또는 호기적 조건하에서의 배양(예 : 호기 배양)에 의해 배양함으로서 배지에 상당량의 d - 비오틴을 형성 및 축적시킬 수 있다. 배지에 형성 및 축적되는 d - 비오틴의 양은 적당한 시간에 또는 배양동안에 연속적으로 배지에 상기 배지 성분을 첨가함으로서 더 증가시킬 수 있다.
[H] 배양 용액으로부터 d - 비오틴의 분리 및 정제 :
d - 비오틴을 함유하는 수득된 배양 용액으로부터 하기의 방법으로 d - 비오틴을 분리 및 정제할 수 있다.
우선, 발효후 용액을 염산으로 산성화한 후 공동 (hollow)필터형 마이크로필터를 사용하여 미생물 세포를 제거한다. 생성된 여과액을 고다공성 합성 흡착제를 채운 컬럼을 통과시켜 여과액 중의 d - 비오틴을 흡착제에 흡착시킨다. 컬럼을 묽은 염산 용액으로 세척한 후 칼럼을 통해 메탄올 - 암모니아 용액(1:9)등을 통과시킴으로써 목적하는 d - 비오틴을 용리시킨다.
이어서, d - 비오틴을 함유하는 용리액을 감압하에 농축시키고 강염기성 음이온 교환수지를 채운 컬럼에 농축액을 통과시켜 수지에 d - 비오틴을 흡착시킨다. 컬럼을 물로 세척한 후 암모니아수 등으로 d - 비오틴을 용리시킨다. 용리액을 감압하에서 재농축시키고 염산 등을 사용하여 약 ph 3.0으로 조정한다. 농축액을 5∼10℃로 냉각시키고 하룻밤 정치 시킴으로서 d - 비오틴을 결정화한다. 수득한 결정을 여과에 의해 분리하고 건조시켜 고수율의 결정형 d - 비오틴을 수득한다.
본 발명을 하기의 실시예에 의해 예시할 것이나 여기에 한정되는 것으로 여기지는 않아야 한다.
실시예에서, d - 비오틴은 락토바실루스 플란타룸을 이용한 미생물 정량법에 의해 측정한다[참조 : Seikagaku Jikken Koza, Vol. 13, p355 : Zenji Nose 등 편집, Tokyo Kagaku Dojin 출판(1975)].
[실시예 1]
(1) 액티티아진산, 에티오닌 및 S - 아미노에틸 시스테인에 대하여 내성을 갖는 숙주 미생물의 제조 :
(A) : 액티티아진산에 대하여 내성을 가지며 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아 마르세센스 SB411 세포(일본국 특허 공개 제 27980/1990호)를 에델버그 등의 방법 [Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 18, p788(1965)]에 의해 변이 유발 처리하고 영양 배양배지(글루코스 0.5%, 펩톤 1.0%, 고기 추출액 0.3%, 효모 추출액 1.0%, 염화나트륨 0.5%)에서 1시간 동안 배양한다. 배양용액을 원심 분리하고(1000xg)수득된 세포를 원심 분리에 의해 생리적 염수로 3회 세척한다. 세포를 생리적 염수에 현탁시키고 60mM DL - 에티오닌을 함유하는 최소 한천 평판 배지(글루코스 0.5%, 인산 2수소칼륨 0.3%, 인산수소 2칼륨 0.7%, 황산마그네슘 7수화물 0.01%, 한천 1.5%)에 플레이트당 1∼10 x 105세포로 도포한다. 30℃에서 5일간 배양후, 형성된 큰 콜로니를 분리하여 에티오닌 - 내성 균주를 수득한다.
(B) : 이어서, 수득한 내성 균주를 일본국 특허 공개 제 27980/1990호에 기재된 방법에 의해 발효배지(슈크로스 10%, 우레아 1%, 인산수소 2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 0.1%, 황산 제 1 철 7 수화물 0.01%, 탄산칼슘 2%)에서의 d - 비오틴의 생산성을 시험하여 친주에 비하여 d - 비오틴의 생산성이 현저하게 증가된 세라티아 마르세센스 ET2를 수득한다.
친주에 의해 생산된 d - 비오틴의 양은 16㎎/ℓ임에 비하여 이 균주에 의해 생산된 d - 비오틴의 양은 24㎎/ℓ이다.
(C) : 수득된 세라티아 마르세센스 ET2세포를 상기의 방법(A)와 동일한 방법으로 변이 유발 처리한 후 50mM S - 아미노에틸 시스테인을 함유하는 최소한천 평판 배지에 1∼10 x 109세포 / 플레이트로 도포한다. 30℃에서 5일간 배양후, 형성된 큰 콜로니를 분리하여 S - 아미노에틸 시스테인 - 내성균주를 수득한다. 이들 균주를 상기 방법 (B)에서와 같이 발효 배지 중에서의 d - 비오틴의 생산성을 시험하여 친주에 비하여 d - 비오틴의 생산성이 현저하게 증가된 세라티아 마르세센스 ETA23을 수득한다.
친주에 의해 생산된 d - 비오틴의 양이 23㎎/ℓ임에 비하여 이 균주에 의해 생산된 d - 비오틴의 양은 33㎎/ℓ이다.
(2) 외인성 비오틴의 숙주 미생물 염색체로의 통합 :
(A) : pCHR81을 함유하는 에스케리키아 콜리 MC1061[Gene, Vol. 56, p283 (1987)]을 0.2%글루코스를 함유하는 L - 브로스(800ml)에 접종하여 30℃에서 16시간동안 진탕 배양시킨다. 세포를 원심 분리에 의해 수집하고 리소짐 및 나트륨 라우릴 슬페이트로 용균시킨다. 이어서, 염화 나트륨을 최종 농도 1M로 용균액을 가하고 생성된 용균액을 원심분리 시킨다(100,000 x g, 30분). 상층액을 분리하고 페놀로 처리하고, 에탄올을 보충하고 원심분리한다. 침전물을 10mM트리스 HCl-1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 2Na(pH 7.5)에 용해시키고 용액을 염화세슘 - 에티듐 브로마이드로 평형화된 밀도 구배 원심분리(200,0000 x g, 16시간)를 행하여 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하여 pCHR81 DNA(0.3mg)를 수득한다(제3도 참조).
(B) : 세라티아 마르세센스 SB303으로부터 단리한 염색체 DNA와 백터 플라스미드 pBR322를 HindIII 및 EcoRI로 처리한 후 이들을 함께 결찰시킴으로서 제조한 재조합 플라스미드 pBM201(참조 : 일본국 특허공개 제 27980 / 1990 : 실시예 2)을 방법(2)(A)와 동일한 방법으로 분리한다. 이 플라스미드의 DNA(0.5mg)를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI으로 완전히 분해시킨 후 아가로스겔 전기영동시키고 6kb DNA 단편을 함유하는 겔을 분리한다. 이 겔을 투석관에 넣고 전기 용출을 행하여 d - 비오틴의 생산을 담당하는 4가지 유전자(즉, bioB, bioF, bioC, bioD 유전자)를 함유하는 6kb DNA 단편(100㎍)을 수득한다.
(C) : 방법(2)(A)에서 수득한 pCHR81 DNA(1μg)을 제한 효소 BamHI를 사용하여 부분 분해시킨다. 10분간 열처리후, 분해된 DNA를 방법(B)의 비오틴 유전자 단편(1㎍)과 혼합하고, DNA사슬을 결찰시키는 통상적인 조건하에서 T4파아지 유래의 DNA리가아제로 혼합물을 처리하여 재조합 플라스미드를 제조한다. 제한 효소 - 결핍 d - 비오틴 - 요구 에스케리키아 콜리 x1776(ATCC 31244)를 수득한 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 형질 전환시킨다. 수득된 형질 전환된 세포를 카나마이신 슬페이트(100㎍/ml)와 d1 - 테티오비오틴(0.2㎍/ml)을 함유하는 최소한천 평판배지(글루코스 0.5%, 황산암모늄 0.1%. 인산수소 2칼륨 0.7%, 인산 2수소칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7 수화물 0.01%, 디아미노피멜산 0.01%, 티미딘 0.004%, 비티민이 없는 카제인 가수분해물 0.2% 한천 1.5%)상에 도포하고 30℃에서 1일간 배양한다. 카나마이신에 대하여 내성을 가지며 d - 비오틴을 요구하지 않는 형성된 콜로니를 분리한다. 10개의 콜로니로부터 추출된 플라스미드 DNA를 제한 효소 BamHI으로 분해시키고 수득된 단편을 아가로스 겔 전기영동 분석하여 pCHR81의 Tn5내의 BamHI부위에 6kb비오틴 유전자 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pCHRM304를 수득한다(제4도 참조). 이 재조합 플라스미드내에서 Tn5단편을 pCHR81에서와 같은 방향으로 결찰시킨다.
(D) : 방법(C)에서 수득한 재조합 플라스미드 pCHRM304의 DNA를 다까기 및 기스미법에 의해, 세라티아 마르세센스의 제한 효소 - 결핍 균주인 TT392균주의 세포에 혼입시켜 형질 전환된 세포를 수득한다. 수득된 형질 전환 세포를 배양한 후, 이로부터 투명 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 단리 및 정제하여 세라티아 마르세센스 변형계에 의해 변형된 재조합 플라스미드의 DNA(250㎍)을 수득한다. 이어서, 이 제조합 플라스미드 DNA를 다까기 및 기스미법에 의해 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아 마르세센스 ETA23에 혼입시키고 세포를 37℃에서 7시간 동안 배양한다. 적당하게 희석시킨후, 배양 용액을 카나마이신 술페이트(50㎍/ml)를 보충한 영향 한천 평판 배지에 도포하고 30℃에서 하룻밤 배양하여 콜로니를 형성한다. 어떻게 수득된 1500개의 콜로니들을 카나마이신 내성 및 트리메토프림 내성의 존재에 대하여 조사하여 카나마이신에 대하여 내성이 있으며 트리메토프림에 대하여 감수성인 8개의 콜로니들을 선택한다.
이들 형질 전환된 균주를 분리하고 염색체 DNA를 세포로부터 추출하여 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 분해시킨다. 수득된 DNA단편을 아가로스겔 전기 영동시키고 탐침으로서 pCHR81에 존재하는 Tn5의 BamHI-SmaI단편(540 bp)를 사용하는 서던 블로팅 분석을 행하여 비오틴 유전자단편(bioB, bioC, BioD 유전자)을 함유하는 Tn5가 카나마이신 내성과 트리메토프림 감수성을 형질 발현하는 형질전환 세포 중의 염색체에 삽입되었음을 확인한다. 이어서, 일본국 특허 공개 제 27980/1990호에 기재된 방법에 의해 발효 배지(슈크로스 10%, 우레아 1%, 인산수소 2칼륨 0.1%, 황산 마그네슘 7, 수화물 0.1%, 황산 제 1철 7수화물 0.01%, 탄산칼슘 2%) 중의 d - 비오틴의 생산성에 대하여 시험하여 친주 세라티아 마르세센스 ETA23-K8에 비하여 d - 비오틴의 생산성이 매우 증가된 균주를 수득한다.
또한, 상기의 서던 블로팅 분석을 행하여, HindIII분해의 경우에, 카나마이신 내성과 트리메토프림 감수성을 형질 발현하는 형질 전환 세포가 대조 pCHRM304의 HindIII단편과 동일한 부위에 DNA밴드를 나타내는 한편, 친주 ETA23의 염색체는 탐침과 반응하는 DNA밴드를 나타내지 않음을 확인한다. 또한 이 분석으로, BamHI분해의 경우에, 카나마이신 내성과 트리메토프림 감수성을 형질 발현하는 형질 전환세포가 대조 pCHRM304의 BamHI단편과는 다른 크기의 DNA밴드를 나타내는 한편, 친주 ETA23의 염색체는 탐침과 반응하는 DNA밴드를 나타내지 않음을 확인한다.
(3) 외인성 비오틴 유전자가 염색체에 통합된 숙주 미생물에 의한 클로로아세트산에 대한 내성획득 :
상기의 방법으로 수득된 세라티아 마르세센스 ETA23-K8세포를 에델버그등의 방법에 의해 변이 유발 처리를 행하고 영양배지에서 1시간 동안 배양한다. 배양용액을 원심분리하고 수득한 세포를 원심분리에 의해 생리적 염수를 사용하여 3회 세척한다. 세포를 생리적 염수에 현탁시키고 클로로아세트산(1mg/ml)을 보충한 최소한천 평판배지(L-프롤린 0.1%, 황산암모늄 0.1%. 인산2수소칼륨 0.3%, 인산수소 2칼륨 0.7%, 황산마그네슘 7수화물 0.01%, 한천 1.5%)상에 플레이트당 1∼10x105세포로 도포한다. 30℃에서 5일간 배양한 후, 형성된 큰 콜로니를 분리하여 클로로아세트산 - 내성균주, 세라티아 마르세센스 K8CL48을 수득한다.
수득된 약제 내성 균주를 발효 배지(글루코스 5%, 우레아 1%, 인산2수소칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 0.1%, 황산제 1철 7 수화물 0.01%, 콘스팁 리쿼 0.6%, 탄산칼슘 2%)중에서의 d - 비오틴의 생산성에 대하여 시험하였으며, 그 결과, 48시간의 배양 동안에 친주가 13mg/ℓ의 d - 비오틴을 생산하였음에 비하여 이 균주는 276㎎/ℓ의 d - 비오틴을 생산하였다.
(4) 비오틴 유전자 단편을 함유하는 재조합 플라스미드의 제조 :
세라티아 마르세센스 TA5023(FERM BP-4101)을 방법(2)(A)와 동일한 방법으로 처리하여 세라티아 마르세센스 SB303으로부터 유래한 비오틴 유전자 단편(bioA, bioB, bioC, bioD유전자)이 백터 pLG339의 EcoRI-HindIII분해 부위에 혼입된 선택 마커로서 카나마이신 - 내성 유전자를 갖는 pLGM201의 DNA를 수득한다.
별도로, 플라스미드 - 안정화 유전자 parB를 갖는 플라스미드 pKG1022를 함유하는 에스케리키아 콜리 HB101로부터, 방법(2)(A)와 동일한 방법으로 pKG1022의 DNA(0.3mg)를 수득하고 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BamHI으로 분해시킨다. 수득한 DNA단편을 아가로스 겔 전기영동시키고 580bp의 DNA밴드를 겔로부터 절단하고 전기 용출법을 행하여 parB영역을 함유하는 DNA단편을 수득한다.
방법(2)(A)와 동일한 방법으로 벡터 pLG339를 함유하는 에스케리키아콜리 c600r-m-(ATCC 33525)로부터 벡터 pLG339 DNA(0.3mg)를 수득한다. 수득한 DNA를 제한 효소 HincII로 분해하고 DNA리가아제를 사용하여, 클레노우 효소를 사용하는 블런트 - 말단인 parB영역을 함유하는 상기의 DNA단편과 분해된 DNA를 결찰시킨다. 에스케리키아 콜리 HB101을 결찰된 DNA를 사용하여 형질전환시킨다. 카나마이신 내성과 테트라사이클린 감수성을 형질 발현하는 클론을 선택하고 플라스미드 DNA의 제한효소 지도에 대하여 분석하여, pLG339의 HincII 부위에 parB가 삽입된 재조합 플라스미드 pLG339p를 수득한다.
재조합 플라스미드 pLGM201 DNA를 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 완전히 분해시킨다. 한편, 상기에서 수득한 pLG339P를 EcoRI을 사용하여 완전히 분해시킨후 HindIII를 사용하여 부분적으로 분해시킨다. pLGM201과 pLG339P의 분해된 두 DNA를 조합하여 에스케리키아 콜리 x1776(ATCC 31244)의 형질 전환에 사용한다. 형질 전환된 세포로부터, 카나마이신에 대하여 내성이며 비오틴을 요구하지 않는 클론을 선택하여 세라티아 마르세센스 SB303으로부터 유리된 비오틴 유전자 단편, 플라스미드 - 안정화 유전자 및 카나마이신 - 내성 유전자를 함유하며 pLGM201의 HincII부위에 parB가 삽입된 플라스미드 pLGM201PHc를 수득한다.
암피실린 - 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pKT240을 함유하는 에스케리키아 콜리 HB101로부터, 방법(2)(A)와 동일한 방법으로 pKT240 DNA를 수득하고 BamHI 및 BstPI으로 분해한다. 수득된 DNA단편을 아가로스 겔전기 영동시켜 겔로부터 3kb의 DNA밴드를 절단하고 전기 용출법을 행하여 암피실린 - 내성 유전자 영역을 함유하는 DNA단편을 수득하다. 이 단편은 클레노우 효소를 사용하는 블런트 - 말단이다.
한편, 상기에서 수득한 pLGM201PHc DNA도 역시 EcoRI과 XhoI로 분해하며 클레노우 효소를 사용하는 블런트 - 말단이다. 이 DNA 및 암피실린 - 내성 유전자 영역을 함유하는 상기의 블런트 - 말단 DNA단편을 DNA 리가아제로 결찰시킨다. 에스케리키아 콜리 C600r-m-를 결찰된 DNA로 형질전환시켜 pLGM201PHc의 카나마이신 - 내성 유전자가 pKT2401유래의 암피실린 - 내성 유전자로 대체된 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA를 수득한다(제2도 참조).
(5) 목적하는 미생물의 제조 :
상기한 방법(4)에서 수득한 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA를 다까기 및 기스미법에 의해 제한 효소 - 결핍주 세라티아 마르세센스 TT392로 도입하여 형질 전환세포를 수득한다. 수득한 형질 전환 세포를 배양한 후, 투명 용균법에 의해 세포로부터 플라스미드 DNA를 단리 및 정제하여 세라티아 마르세센스의 변형계에 의해 변형된 플라스미드(300㎍)를 수득한다.
이어서, 이 플라스미드를 다까기 및 기스미법에 의해 상기에서 수득한 세라티아 마르세센스 ETA24K-8세포에 도입하고 이 세포를 암피실린(500㎍/㎖)을 보충한 영양 한천 평판 배지상에 도포하고 30℃에서 하룻밤 배양한다. 형성된 콜로니를 배지로부터 분리하여 숙주 미생물이 세라티아 마르세센스 ETA24K-8인 재조합 플라스미드 pLGM201PHcA를 함유하는 세라티아 마르세센스 TA5026(FERM BP-4102)를 수득한다(제1도 참조).
제한 효소 분해 지도 분석에 의해 이 균주에 함유된 플라스미드 DNA가 pLGM201PHcA DNA와 동일함을 확인한다.
별도로, 플라스미드 pLGM201PHcA를 다까기 및 기스미법에 의해 상기에서 수득한 세라티아 마르세센스 K8CL48세포에 도입하고 이 세포를 암피실린(500㎍/㎖)을 보충한 영양 한천 평판 배지 상에 도포하고 30℃에서 하룻밤 배양한다. 형성된 클로니를 평판 배지로부터 분리하여 숙주 미생물이 세라티아 마르세센스 K8CL48인 pLGM201PHcA를 함유하는 세라티아 마르세센스 TA5027(FERM BP-4103)을 수득한다(제1도 참조).
제한 효소 분해 지도 분석에 의해 이 균주에 함유된 플라스미드 DNA가 pLGM201PHcA DNA와 동일함에 확인한다.
[실시예 2]
실시예 1에서 수득한 세라티아 마르세센스 TA5026을 암피실린(500㎍/ml)을 함유하는 L - 브로스 한천 사면 배지에서 하룻밤 배양한 후 500ml 진탕 플라스크 중에 슈크로스 15%, 우레아 1.5%, 인산수소 2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제1철 7 수화물 0.01%, 콘 스팁리쿼 0.1% 및 탄산칼슘 1%를 함유하는 멸균 용액(15ml)(여기서 슈크로스는 멸균후 용액에 첨가한다)을 포함한 발효배지에 1루프의 배양 세포를 접종한다. 이어서, 30℃에서 120시간 동안 왕복 진탕 배양(7cm 스트로크 : 120 r.p.m)을 행한다.
상기 배지중에 생성된 d - 비오틴의 양을 측정한다. 결과를 표 1에 나타내었으며 대조 균주가 세라티아 마르세센스 SB411(일본국 특허공개 제27980/1990호)과 세라티아 마르세센스 TA5024(일본국 특허공개 제 27980/1990 호)이며 재조합 플라스미드 pLGM201을 SB411에 도입함으로써 수득되었다.
[실시예 3]
세라티아 마르세센스 TA5026과 세라티아 마르세센스 TA5027 각각을 암피실린(500㎍/ml) 또는 카나마이신 슬페이트(100㎍/ml)를 함유하는 L - 브로스한천 사면 배지, 또는 암피실린이나 카나마이신 슬페이트 어느 것도 함유하지 않는 동일한 L - 브로스 한천 사면 배지에서 하룻밤 배양한 후 500ml진탕 플라스크 중에 글루코스 7%, 우레아 1%, 인산수소 2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 0.1%, 황산 제 1철 7 수화물 0.01%, 콘스팁 리쿼 0.1% 및 탄산칼슘 4%를 함유하는 멸균 용액(15ml)(여기서, 글루코스는 멸균후 용액에 첨가한다)을 포함하는 발효 배지에 1 루프의 배양 세포를 접종한다. 이어서, 30℃에서 120시간동안 왕복 진탕배양(7cm 스트로크 : 120 r.p.m.)을 행한다.
상기 배양 중에 생성된 d - 비오틴의 양을 측정한다. 대조 균주가 세라티아 마르세센스 SB411 및 세라티아 마르세센스 TA5024인 결과를 표 2에 나타내었다.
[실시예 4]
실시예 1에서 수득한 세라티아 마르세센스 TA5026을 암피실린(500㎍/ml)을 함유하는 L - 브로스 한천 사면 배지에서 하룻밤 배양한 후 500ml 진탕 플라스크 중에 슈크로스 10%, 우레아 1%, 인산수소 2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제 1철 7수화물 0.01%, 콘 스팁 리쿼 0.6% 및 탄산 칼슘 1%를 함유하는 멸균용액(30ml)(여기서, 슈크로스는 멸균후 용액에 첨가한다)을 포함하는 전 배양배지에 1루프의 배양세포를 접종한다. 이어서, 30℃에서 24시간 동안 왕복 진탕 배양(7cm 스트로크 ; 120 r.p.m.)을 행한다. 수득한 전배양 용액(14ml)을 발효배지[슈크로스 15%, 우레아 1.5%, 인산수소 2 칼륨 0.08%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제 1철 7 수화물 0.01%, 콘 스팁 리쿼 0.1%, 탄산칼슘 4.2% 및 디스폼(Disfoam) CA220(발포억제제, Nippon Yushi K.K., Japan제조) 0.28% ; 1.0리터]에 접종하고 0.5리터 /분의 통기속도로 30℃에서 1.8리터 자아 발효조에서 배양하는 한편, 진탕속도를 조절하여 용해된 산소 농도를 10%포화 농도로 유지한다. 배양 시작후 48∼120시간에, 별도로 제조한 추가 배지(슈크로스 67.5%, 우레아 5%, 인산수소 2 칼륨 0.15% 및 콘 스팁 리쿼 0.1%)를 5.6ml/h의 유속으로 배지에 연속적으로 가한다. 그리고 별도로, 배양 시작후 48∼120시간에, 24시간마다 0.67ml의 20% 황산마그네슘 7 수화물 및 0.97ml의 2%황산 제 1철 7 수화물을 배지에 가한다. 배양을 144시간 동안 행하여 540㎎/ℓ의 d - 비오틴을 함유하는 배양 용액(약 1.3리터)을 수득한다.
[실시예 5]
실시예 1에서 수득한 세라티아 마르세센스 TA5027을 암피실린(500㎍/ml)을 함유하는 L - 브로스 한천 사면 배지에서 하룻밤 배양한 후 500ml 진탕 플라스크 중에 글루코스 5%, 우레아 1%, 인산수소 2 칼륨 0.1%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제2철 0.01%, 콘 스팁 리쿼 0.6% 및 탄산칼슘 1%를 함유하는 멸균 용액(30ml)(여기서, 클루코스는 멸균후 용액에 첨가한다)을 포함하는 전배양 배지에 1 루프의 배양 세포를 접종한다. 이어서 30℃에서 24시간 동안 왕복진탕 배양(7cm 스트로크 ; 120 r.p.m.)을 행한다. 수득한 전 배양 용액(14ml)을 발효 배지[글루코스 5%, 황산암모늄 0.5%, 인산수소2 칼륨 0.2%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제 2철 0.001%, 콘 스팁리쿼 0.7% 및 디스폼 CA220(발포억제제, Nippon Yushi K.K., Japan 제조) 0.28%(pH 7.0) : 1.0리터]에 접종하고 0.5리터 / 분의 통기 속도로 30℃에서 1.8리터 자아 발효조에서 배양하는 한편, 진탕 속도를 조절하여 용해된 산소 농도가 10%포화 농도로 유지되게 한다. 배양용액을 수산화칼륨 - 암모니아 혼합물을 사용하여 pH 7.4이상으로 조절한다. 배양 시작후 1일 ∼3일에, 별도로 제조한 추가의 배지(글루코스 57.5%, 황산암모늄 0.5%, 인산수소 2칼륨 0.34%, 황산마그네슘 7 수화물 0.2%, 황산 제 2철 0.01% 및 콘스팁 리쿼 2.75%)를 3ml/h∼15ml/h의 유속으로 배지에 연속적으로 가한다. 3일간 배양을 행하여 260㎎/ℓ의 d - 비오틴을 함유하는 배양 용액(약 1.3리터)을 수득한다.
[실시예 6]
실시예 4의 방법에 따라 수득한 배양 용액(6.0리터)을 염산을 사용하여 pH2.7로 산성화한 후 세포를 마이크로필터 [마이크로자(Microza) SP 113, Asahi Chemical Industry Co., Ltd. Japan 제조]로 제거하여 여과액(7.6ℓ)을 수득한다. 수득한 여과액을 고다공성 합성 흡착제(SP207, Mitsubishi Kasei Corporation, Japan제조)를 채운 칼럼(수지의 양 1000ml : 칼럼 지름 40 mm)에 유속 SV=2로 통과시켜 흡착제에 여과액 중의 d-비오틴을 흡착시킨 후 1리터의 묽은 염산(pH 3.0)을 유속 SV=2로 컬럼을 통과시켜 흡착체를 세척한다, 이어서, 유속 SV=2로 메탄올 - 암모니아 용액(1:9)을 칼럼에 통과시킴으로써 d - 비오틴을 용리한다.
상기에서 수득한 용리액(1.8리터)을 회전 증발기를 사용하여 감압하에 농축시켜 농축액(900ml)을 수득한다. 이어서, 수득된 농축액을 SV=2의 유속으로 강염기성 음이온 교환수지 [디아이온(Diaion) SA-11 A, Mitsubishi Kasei Corporation, Japan 제조]를 채운 칼럼(수지의 양 100ml : 칼럼 지름 20mm)에 통과시켜 수지에 d - 비오틴을 흡착시킨다. 칼럼을 물(200ml)로 세척하고, 900ml의 0.2N 염화암모늄 - 0.2N 암모니아(1:1)을 유속 SV=2로 칼럼에 통과시킴으로써 b-biotin을 용리한다. 수득된 용리액(900ml)을 감압하에 농축시켜 부피를 60ml로 하고 농축액을 진한 염산을 사용하여 pH2.7로 조정하고 10℃이하에서 하룻밤 정치시킴으로써 d - 비오틴을 결정화한다. 형성된 결정을 여과에 의해 분리하고 건조시켜 조결정(4.5g)을 수득하며, 이를 수용액으로부터 결정화하여 순수한 d - 비오틴 2.3g을 수득한다.
본 발명의 미생물, 즉, 숙주 미생물의 염색체에 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아속 미생물로부터 클론된 비오틴 유전자가 혼입된 재조합 플라스미드를 도입하고 추가하고 외인성 비오틴 유전자를 통합시킴으로써 d - 비오틴을 생산할 수 있는 숙주 미생물 유래의 미생물이 특히 d - 비오틴의 생산성이 높으므로, 본 발명의 미생물을 배양함으로써 d - 비오틴이 다량으로 제조될 수 있다.
Claims (10)
- 하기를 특징으로 하는 d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아속의 숙주 미생물; ⅰ) 상기 숙주 미생물은 비오틴 유사체, 메티오닌 유사체 및 리신 유사체에 대한 내성을 가지며, ⅱ) 상기 숙주 미생물의 염색체로 외인성 비오틴 유전자가 편입되고, ⅲ) d - 비오틴을 생산할 수 있는 세라티아속의 미생물로부터 클론된 외인성 비오틴 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드로 상기 숙주 미생물을 형질 전환시킨다.
- 제1항에 있어서, 비오틴 유전자가 비오틴 유사체에 대하여 내성이 있는 세라티아속 미생물로부터 클론된 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 벡터 플라스미드 pLG339에 비오틴 유전자를 혼입시켜 제조된 미생물.
- 제1항에 있어서, 비오틴 유사체가 액티티아진산, 5-(2-티에닐)발레르산 및 데히드로비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 메티오닌 유사체에 에티오닌이고, 리신 유사체가 S-아미노에틸시스테인인 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 비오틴 유사체가 액티티아진산이고, 메티오닌 유사체가 에티오닌이고, 리신 유사체가 S-아미노에틸시스테인인 미생물.
- 제1항에 있어서, 숙주 미생물이 아세트산 유사체에 대하여 내성을 갖는 미생물인 미생물.
- 제 6항에 있어서, 비오틴 유사체가 액티티아진산, 5-(2-티에닐)발레르산 및 데히드로 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 메티오닌 유사체가 에티오닌이고, 라신 유사체가 S-아미노에틸시스테인이며, 아세트산 유사체가 클로로아세트산인 미생물.
- 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양 배지중에 배양하여, d - 비오틴이 배양 배지중에 형성 및 축적되고, 생성된 d - 비오틴을 수집함을 특징으로 하는 d - 비오틴의 제조방법.
- d - 비오틴을 생산할 수 있는, 세라티아 마르세센스 TA5026(FERM BP-4102).
- d - 비오틴을 생산할 수 있는, 세라티아 마르세센스 TA5027(FERM BP-4103).
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