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Technisches Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft Genmanipulation und spezieller betrifft sie eine
DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure (auch
bezeichnet als L-2-Aminoadipinsäure oder
L-α-Aminoadipinsäure) beteiligt
ist, und ein Produktionssystem von L-Homoglutaminsäure (hierin nachstehend lediglich
als Homoglutaminsäure
bezeichnet), das dieses verwendet.
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Stand der Technik
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Homoglutaminsäure wird
weit verbreitet in Organismen, wie Pflanzen, einschließlich Cholera
vibrio als ein Bakterium und Mais (Zea mays), den Embryonen von
Fröschen,
gefunden. Homoglutaminsäure
dient als Intermediat der Lysinbiosynthese bei Pilzen etc. und als
ein Vorläufer
bzw. Precursor bei der Biosynthese von β-Lactamantibiotika. Weiterhin
ist Homoglutaminsäure
auch zweckmäßig als
synthetisches Intermediat verschiedener Medikamente, einschließlich Methotrexat-Derivaten
(
WO 92/09436 ).
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Da
die Herstellung von Homoglutaminsäure mittels chemischer Synthese
eine Racemattrennung („optical
resolution") und
eine mehrstufige Reaktion erfordert, ist sie vom Kostenaspekt her
kein zweckmäßiges Mittel.
Andererseits ist ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure aus
L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zum Genus Agrobacterium,
Klebsiella, Alcaligenes, Brevibacterium oder Bacillus gehört, bekannt
(
japanische offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 6-181787 ). Ein Teil der Erfinder der vorliegenden Erfindung
schlug auch ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure aus
L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zum Genus Flavobacterium
gehört,
vor (
WO 96/31616 ).
Jedoch sogar bei dem Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus
wird ernsthaft ein Verfahren gewünscht,
das dazu befähigt
ist, Homoglutaminsäure
effizienter herzustellen.
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Somit
zielten die Erfinder der vorliegenden Erfindung darauf ab, zum Beispiel
durch Genmanipulation das Produktionssystem von Homoglutaminsäure in einem
beliebigen der obigen Mikroorganismen zu verstärken. Als eine Übersicht
hilfreicher Information über
die Manipulation erstellt wurde, zum Beispiel als Teil der Forschungen über den
Biosyntheseweg von Cephamycin C, wurde das Vorhandensein von Lysin-6-Aminotransferase
und L-Δ1-Piperidin-carboxylat-Dehydrogenase, die an der
Umwandlung von L-Lysin zu α-Aminoadipinsäure (oder
Homoglutaminsäure)
von Streptomyces clavuligerus als ein Cephamycin C-produzierender Actinomycet
beteilt sind, bestätigt
und was Erstere angeht, die Position des Gens, das das Enzym codiert
etc. (Fuente et al., Biochem. J. (1997) 327, 59–64).
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Darüber hinaus
berichten Madduri et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(3),
985–988) über die
Klonierung und Lokalisierung eines Gens, das die Lysin-ε-Aminotransferase
steuert, ein Enzym, das die β-Lactam-Biosynthese
in Streptomyces spp. steuert. Sie legten auch dar, dass bei Actinomyceten,
die β-Lactamantibiotika
des Cephem-Typs produzieren, Lysin-ε-Aminotransferase das initiale Enzym
bei der Umwandlung von Lysin zu α-Aminoadipinsäure ist.
Die Autoren verwenden ein zweistufiges Verfahren („Chromosomen-Walking"), um eine lambda-Bibliothek
von genomischer DNA von Streptomyces clavuligerus auf Fragmente,
die L-Lysin-ε-Aminotransferase-Aktivität in S.
lividans exprimierten, zu durchmustern. Die Restriktionsanalyse
der klonierten DNA bestätigte
die Lokalisierung des vermutlichen lat-Gens innerhalb des Clusters
der β-Lactam-Biosynthesegene,
grob etwa in der Mitte zwischen pcbC, dem Strukturgen für die Isopenicillin-N-Synthetase,
und dem vermutlichen cefE-Gen, das die Deacetoxy-cephalosporin-C-Synthetase codiert.
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Hinsichlich
Flavobacterium lutescens (welches ausgehend von Flavobacterium fuscum
re-identifiziert bzw. neu bezeichnet wurde) IFO 3084, verwendet
in einem L-Lysin-Bioassay, ist es bekannt, dass 2-Oxoglutarat-6-Aminotransferase
[oder Lysin-6-Aminotransferase (hierin nachstehend als LAT bezeichnet)],
das den folgenden Weg katalysiert, vorhanden ist (Soda et al., Biochemistry
7 (1968), 4102–4109,
ibid. 4110–4119)
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In
dem obigen Bioassay wird die Absorption des Produktes, das durch
Umsetzung von Piperidin-6-carbonsäure (hierin nachstehend auch
als P6C bezeichnet) mit o-Aminobenzaldehyd erhalten wird, gemessen.
In einem anderen L-Lysin-Bioassay wird die L-Lysin-6-Dehydrogenase-Aktivität von Agrobacterium
tumefaciens benutzt (Misono et al., J. Biochem. (Tokio) 105 (1989),
1002–1008).
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Der
obige IFO 3084-Stamm wird gewöhnlich
in dem L-Lysin-Bioassay, wie oben erwähnt, verwendet und sein Anwendungsverfahren
ist ebenfalls etabliert. Wenn der IFO 3084-Stamm ein Gen, das ein Protein mit P6C
(oder 2-Aminoadipinsäuresemialdehyd,
von welchem angegeben wird, dass er sich in einem lebenden Körper in
einem quantitativen Gleichgewichtszustand mit P6C befindet)-Dehydrogenase
(hierin nachstehend nur als Dehydrogenase bezeichnet)-Aktivität codiert,
zusätzlich
zu LAT aufweist, wäre
der Stamm daher ein Kandidatenbakterium für eine Genklonierung, welche
die Aufgabe der vorliegenden Erfindung erfüllt, nämlich die Aufgabe, ein Gen
bereitzustellen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt
ist.
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Darüber hinaus
beschreiben Yagi et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1980) 614(1),
63–70)
ein neues Aufreinigungsverfahren für die L-Lysin-6-Aminotransferase
aus Flavobacterium lutescens mit einem Molekulargewicht von etwa
116.000, wobei die Hitzebehandlung durch Affinitätschromatographie mit L-Lysylacetamidododecyl-Sepharose
6B ersetzt wurde.
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Coque
et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(19), 6258–6264) entdeckten
ein Gen, das Lysin-6-Aminotransferase codiert, und stellten fest,
dass dieses Gen stromaufwärts
der pcbAB (codiert eine α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthetase)-
und pcbC (codiert Isopenicillin-N-Synthase)-Gene in dem Cluster der
frühen
Cephamycin-Biosynthesegene in Nocardia lac-tamdurans lokalisliert war. Dieses Gen
enthält
ein offenes Leseraster von 1353 Nukleotiden (71,4% G + C), die ein
Protein mit 450 Aminosäuren
mit einer abgeleiteten Molekülmasse
von 48.811 Da codieren. Die Expression von DNA-Fragmenten, die das
lat-Gen tragen, in Streptomyces lividans, führte zu einer hohen L-Lysin-6-Aminotransferase-Aktivität, welche
bei nicht-transformiertem
S. lividans nicht vorhanden war. Das Enzym wurde aus S. lividans
(pULBS8) teilweise aufgereinigt und zeigte eine Molekülmasse von
52.800 Da, wie mittels Sephadex-Gelfiltration
und Polyacrylamidgelelektrophorese berechnet. DNA-Sequenzen, die
stark mit dem lat-Gen von N. lactamdurans hybridisierten, wurden bei
vier Cephamycin-produzierenden Streptomyces-Spezies gefunden, aber
nicht bei vier anderen Actinomyceten, von denen nicht bekannt ist,
dass sie β-Lactame
produzieren, was nahe legt, dass das Gen für die β-Lactam-Biosynthese spezifisch ist und nicht
an dem allgemeinen Lysinkatabolismus beteiligt ist. Das Protein, das
durch das lat-Gen codiert wird, zeigte Ähnlichkeit mit Ornithin-5-Aminotransferasen
und N-Acetylornithin-5-Aminotransferasen und enthielt eine Pyridoxalphosphatbindungs-Konsensus-Aminosäuresequenz um
Lys-300 des Proteins. Die evolutionären Folgen des lat-Gens als
ein wahres β-Lactam-Biosynthesegen werden
diskutiert.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung versuchten die Klonierung des
Lysin-6-Aminotransferase (LAT)-Gens (lat) von Flavobacterium lutescens
und gemäß den Umständen eines
Gens des Bakteriums, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen
P6C codiert. Jedoch versagten als Klonierungsverfahren, die in einem
solchen Fall regelmäßig angewendet
werden, ein Verfahren zum Erhalten eines Gens, auf das abgezielt
wird, aus den DNA-Konsensus-Sequenzen
zwischen Aminotransferasen anderer Bakterien und ein Verfahren zum
Nutzen der Information, die aus dem Ergebnis der Aminosäuresequenzierung
eines gereinigten Proteins erhalten wurde, und dergleichen alle
bei ihren frühen
Untersuchungen.
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Unerwarteterweise
stellten sie jedoch fest, dass, wenn das schließlich durch den Erfinder gewählte Wirt-Vektor-System
verwendet wird, ein Gen, das zumindest befähigt ist, an der Produktion
von Homoglutaminsäure
beteiligt zu sein, spezieller ein Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen
P6C codiert, mittels Shotgun-Klonierung kloniert werden kann. Sie
stellten auch fest, dass ein Modifikator mit einer bestimmten Homologie
(oder Identität)
zu den Genen in ähnlicher
Weise funktioniert.
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Andererseits
offenbaren die oben (zitierten) Soda et al., Biochemistry 7 (1968),
4110–4119,
ein Verfahren zum Erhalten von kristallinem LAT mit einem Molekulargewicht
von 116.000 aus Achromobactor liquidum (= Flavobacterium lutescence)
und Yagi et al., J. Biochem. 87 (1980), 1395–1402, offenbaren, dass LAT
aus Flavobacterium lutescens aus vier nichtidentischen Untereinheiten,
A, B1, B2 und C, aufgebaut ist. Basierend auf diesen Beschreibungen
schlugen ihre frühen
Untersuchungen des Klonieren eines Gens, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert,
wobei die Information genutzt wird, die aus der Aminosäuresequenzierung
des gereinigten LAT-Proteins erhalten wurde, fehl. Unter Verwendung
eines Verfahrens jedoch, das sich vollständig von den Verfahren, die
in diesen Literaturverweisen aus dem Stand der Technik beschrieben
sind, unterscheidet, reinigten die Erfinder der vorliegenden Erfindung
Proteine mit LAT-Aktivität
aus Flavobacterium lutescens auf, sie bestimmten die Aminosäuresequenzen
der erhaltenen Proteine und klonierten die Zielgene („objective
genes") unter Verwendung
dieser Sequenzinformationen und als ein Ergebnis hatten sie Erfolg
beim Klonieren eines Gens, das LAT (lat) codiert. Die Erfindung
basiert auf den obigen Befunden.
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Somit
wird gemäß der Erfindung
eine isolierte reine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von
Homoglutaminsäure
beteiligt ist, wobei dieses Gen von einem Bakterium, das zum Genus
Flavobacterium lutescens gehört,
erhalten werden kann, oder ein Modifikator, welcher unter einer
stringenten Bedingung mit dem Gen hybridisiert und eine Funktion
aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit
zur Produktion von Homoglutaminsäure
einer Mutante, welcher die Fähigkeit
zur Produktion fehlt, befähigt
zu sein, bereit.
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Spezieller
ist das Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt
ist, eine DNA, die teilweise oder vollständig mindestens ein Protein,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein mit LAT-Aktivität und einem
Protein mit Dehydrogenase-Aktivität, codiert, oder ein Modifikator
davon.
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Insbesondere
stellt die Erfindung Folgendes bereit: eine isolierte reine DNA,
enthaltend ein Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt
ist, erhältlich
aus einem Bakterium, das zu Flavobacterium lutescens gehört, oder
einen Modifikator, welcher mit dem Gen unter einer stringenten Bedingung
hybridisiert und eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung
der Fähigkeit
zur L-Homoglutaminsäure-Produktion
einer Mutante von Flavobacterium lutescens, welcher die Fähigkeit
zur Produktion fehlt, befähigt
zu sein, wobei das Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt
ist, eine DNA ist, die teilweise oder vollständig mindestens ein Protein
codiert, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein mit L-Lysin : 2-Oxoglutarsäure-6-Aminotransferase-Aktivität und einem
Protein mit Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase-Aktivität, wobei
die letztere DNA eine DNA, die die fortlaufende bzw. ununterbrochene Basensequenz
von Base 801 bis Base 2276 von SEQ ID NO: 1 enthält, oder eine DNA ist, die
die fortlaufende Basensequenz von Base 2855 bis Base 4384 von SEQ
ID NO: 3 enthält.
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Die
Erfindung betrifft auch ein autonom replikatives oder Integrations-replikatives
(„integration
replicative") rekombinantes
Plasmid, das die DNA trägt,
und eine Transformante, erhalten durch Transformation mit dem rekombinanten
Plasmid und ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure unter
Verwendung der Transformante.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Zeichnung, die die Dünnschichtchromatographie-Analyseergebnisse
der Homoglutaminsäureproduktion
durch Mutanten von F. lutescens zeigt. St ist der Standard Homoglutaminsäure (HG),
Spuren 1 bis 4, Spuren 5 bis 7, Spuren 8 bis 10, Spur 11 und Spuren
12 und 13 zeigen die Analyseergebnisse der ersten Mutanten, der
zweiten Mutanten, der dritten Mutanten, des Wildtyp-Stamms bzw.
der ersten Mutanten mit dem Plasmid pCF704.
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2 ist
ein Graph, der die L-Lysin-6-Aminotransferase (LAT)-Aktivität von Mutanten
von F. lutescens zeigt. Wild, 1st, 2nd und 3rd zeigen die LAT-Aktivitäten des
Wildtyp-Stammes,
der ersten Mutante, der zweiten Mutante bzw. der dritten Mutante.
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3 zeigt
die Dünnschichtchromatographie-Analyseergebnisse,
die die Komplementarität
der Homoglutaminsäureproduktivität von Mutanten
mit fehlender Homoglutaminsäureproduktivität durch
Plasmid pCF213 zeigen.
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HG
und Lys zeigen die Wanderungsposition von Homoglutaminsäure und
die Wanderungsposition von L-Lysin, und St; 1st pCF213, 2nd pCF213
und 3rd pCF213; Wild pCF213 und Wild pCF704; 1st pCF704 und 2nd
pCF704; und 1st pCF111 sind die Ergebnisse der DC-Analysen der Homoglutaminsäure-Standardsubstanz;
der Kulturbrühen
der ersten, der zweiten bzw. der dritten Mutanten mit pCF313; der
Kulturbrühen
der Wildtyp-Stämme
mit pCF313 bzw. pCF704; der Kulturbrühen der ersten bzw. zweiten
Mutanten mit pCF704; und der Kulturbrühen der ersten Mutante mit
pCF111 entsprechend.
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4 ist
ein Graph, der die Homoglutaminsäure-Produktivität mit verstreichender
Zeit für
F. lutescens IFO 3084 (pCF213) (in der Zeichnung dargestellt durch
pCF213) und F. lutescens IFO 3084 (pCF704) (in der Zeichnung dargestellt
durch pCF704) zeigt.
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5 ist
ein Graph, der die Position des ORF, die basierend auf der Basensequenz
der pCF213-Insert-Region gefunden wurde, zeigt.
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6 ist
ein Graph, der die Beziehungen zwischen den Elutionsfraktionen der
MonoQ HR5/5-Säulenbehandlung
in 3(6) von Beispiel 2 und den relativen LAT-Aktivitäten zeigt.
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7 ist
eine Photographie anstelle einer Zeichnung, die die Ergebnisse der
nativen PAGE (A) und der SDS-PAGE (B) der LAT-aktiven Fraktionen
unter Verwendung von Multigel 4/20 und 10/20 in 3(7) von Beispiel
2 zeigt. In der Zeichnung ist M ein Molekulargewichtsmarker, C stellt
das in 3 (5) von Beispiel 2 erhaltene Ultrafiltrat dar und die Ziffern
stellen die entsprechenden Fraktionsnummern dar.
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8 ist
ein Graph, der die relativen LAT-Aktivitäten bei Mutanten, denen die
Homoglutaminsäure-Produktivität fehlt,
und Wildtyp-Stämme
durch verschiedene Plasmide zeigt.
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9 ist
ein Graph, der die Homoglutaminsäure-Produktivität mit Verstreichen
der Zeit von F. lutescens IFO 3084, transformiert mit verschiedenen
Plasmiden, zeigt.
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Spezielle Ausführungsformen der Erfindung
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Hinsichtlich
der Ursprünge
der Gene gemäß der Erfindung
(können)
beliebige Stämme
von Flavobacterium lutescens (hierin nachstehend auch als F. lutescens
bezeichnet), einschließlich
spontaner Mutanten, solange sie ein Gen bereitstellen können, das
an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, wobei dieses
Gen z. B. in F. lutescens als ein Wirt exprimiert werden kann (verwendet
werden). Jedoch wird als bevorzugt genannt der IFO 3084-Stamm, welcher
leicht zu erhalten ist und dessen geeignete Handhabungsbedingungen,
wie Kultur, etabliert sind.
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Das
Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, bedeutet
in der Erfindung jedes Gen, das befähigt ist, an dem zweistufigen
Umwandlungssystem von L-Lysin zu Homoglutaminsäure über P6C oder 2-Aminoadipinsäure-6-semialdehyd,
welches sich chemisch in einer Gleichgewichtsbeziehung mit P6C befindet,
beteiligt zu sein (die erstere Stufe: LAT-Aktivität, die letztere Stufe: Dehydrogenase-Aktivität). Zuerst können als
spezifische Beispiele von Genen, die ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codieren,
welches das letztere Umwandlungssystem ist, Gene genannt werden,
welche unter Verwendung des Wirt-Vektor-Systems, das durch die Erfinder der
vorliegenden Erfindung etabliert wurde, basierend auf der folgenden
Strategie, erhalten werden können.
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Die
Etablierung eines geeigneten Wirt-Vektor-Systems von F. lutescens
ist erforderlich zum Durchführen
der Genmanipulation von F. lutescens, aber dafür muss es die folgenden drei
Probleme lösen.
- (1) Erhalten eines Replikons, welches sich
autonom in F. lutescens replizieren kann.
- (2) Erhalten eines Wirkstoffresistenzmarkers, welcher in F.
lutescens exprimiert werden kann und funktionieren kann.
- (3) Etablieren eines Verfahrens zum Einführen einer DNA in F. lutescens.
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Glücklicherweise
konnten die obigen Probleme (1) und (2) durch die Entdeckung gelöst werden,
dass pBBR122, kürzlich
durch die Mo Bi Tee Corporation auf den Markt gebracht, welches
sich in einer langen Reihe von Gram-negativen Bakterien autonom
repliziert und eine Kanamycin- und eine Chloramphenicol-Resistenz aufweist,
verwendet werden kann. Zur Lösung
des obigen Problems (3) wird zuerst zu einer Vorbedingung, dass
ein Verfahren zum Einführen
des Plasmids pBBR122 in F. lutescens etabliert wird. Jedoch wurde
zuerst eine Untersuchung, basierend auf dem Verfahren der DNA-Einführung in
E. coli durch das Elektroporationsverfahren durchgeführt; als
ein Ergebnis wuchs eine Kolonie von F. lutescens auf einer L-Platte,
enthaltend 20 μg/ml
Kanamycin, und durch Kultivieren in Flüssigkeit dieser und Extrahieren
der Plasmide mittels des alkalischen SDS-Verfahrens wurde bestätigt, dass
pBBR122 stabil in F. lutescens gehalten wurde. Somit wurde das Problem
(3) ebenfalls gelöst.
Was dieses Wirt-Vektor-System
betrifft, so ist es selbst dafür
bekannt, dass bei Verwendung anderer Bakterien als Wirt (a) die
Transformationseffizienz sehr hoch ist und (b) ein DNA-Fragment
einer geeigneten Größe in pBBR122
inseriert werden kann (J. Bac. 178 (1996), 1053–1060), aber es wurde gezeigt,
dass die obigen (a) und (b) auch bei F. lutescens möglich sind
und es wurde weiterhin ermöglicht, das
erhaltene Gen in F. lutescens zu amplifizieren, und darüber hinaus
wurde es ermöglicht,
ein Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen
P6C codiert, durch Shotgun-Klonierung zu erhalten. Zur Erleichterung
bzw. Ermöglichung
des Vorgangs wurde pCF704, bei welchem die multiple Klonierungsstelle
von pUC19 anstelle des Chloramphenicolresistenzgens von pBBR122
eingeführt
wurde, hergestellt und dies wurde dann als Vektor verwendet.
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Anschließend wurde,
um ein System zum Evaluieren eines erhaltenen und amplifizierten
Gens zu etablieren, eine Mutation in F. lutescens IFO 3084 mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (NTG) eingeführt und ein
Screening wurde unter Verwendung einer MEM-Platte (pH 7,0), enthaltend
Eosin Y, durchgeführt.
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Somit
wurden die erste Mutante, die überhaupt
keine Homoglutaminsäure
produzierte, und die zweite und die dritte Mutante, die nur in geringem
Ausmaß Homoglutaminsäure produzierten,
erhalten. Bei der ersten Mutante, die überhaupt keine Homoglutaminsäure produzierte,
wurde bestätigt,
dass die lat-Aktivität
gleich derjenigen des Wildtyp-Stamms war, und bei der zweiten und
bei der dritten Mutante, die nur in geringem Ausmaß Homoglutaminsäure produzierten,
wurde nur eine schwache lat-Aktivität bestätigt. Namentlich besteht eine
Möglichkeit,
dass die erste Mutante an Schädigungen
an einem Gen/Genen außer
lat, das/die an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist/sind, leidet
und dass andererseits die zweite und die dritte Mutante an einigen
Schädigungen
mindestens an lat leiden.
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Anschließend wurde
die genomische DNA des Wildtyp-Stamms teilweise mit SauIIIAl verdaut
und die 6–8
kbp-Fragmente wurden entsprechend in die BamHI-Stelle von pCF704
inseriert, um eine DNA-Bibliothek herzustellen. Diese Plasmide wurden
in die erste, zweite bzw. dritte Mutante eingeführt und die Stämme, welche
die Fähigkeit
zur Produktion von Homoglutaminsäure
erlangten bzw. wiedererlangten, wurden einem Screening unterzogen.
Bei dieser Gelegenheit wurde ein Verfahren verwendet, welches das
Sammeln von Kolonien, die sich auf einer MEM-Platte (pH 7,0), enthaltend
Eosin Y, die zum Screening der Mutanten verwendet wurde, schwarz
färbten,
und Bestätigen
der Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
davon mittels DC umfasst. Als Repräsentanten dieser Mutanten wurde
die zweite Mutante (Flavobacterium lutescens, 2. Mutante) am 6.
Juli 1998 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und ihr
wurde die Eingangsnummer bzw. Zugangsnummer FERM P-16874 zugeordnet,
und wurde die erste Mutante (Flavobacterium lutescens, 1. Mutante)
am 10. Juni 1999 bei diesem Institut hinterlegt und ihr wurde die
Eingangsnummer FERM P-17419 zugeordnet, und diese Stämme wurden dort
gehalten. Dieser FERM P-16874-Stamm und dieser FERM P-17419-Stamm
wurden am 26. Juli 1999 zu ihrer Hinterlegung bei der Internationalen
Hinterlegungsbehörde
im Rahmen des Budapester Vertrags in dem Institut überführt und
es wurden ihnen die Zugangsnummern FERM BP-6798 bzw. FERM BP-6799
zugeordnet.
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Als
ein Ergebnis wurden ein Stamm mit einem Plasmid, das die Homoglutaminsäure-Produktivität der ersten
Mutante komplementiert („complementing"), und ein Stamm
mit einem Plasmid, das die Homoglutaminsäure-Produktivität der zweiten
Mutante teilweise komplementiert, erhalten. Jedoch neigten die Plasmide
dieser Stämme,
insbesondere das Plasmid des Stamms, das die zweite Mutante komplementiert,
dazu, deletiert zu werden, und ein weiteres Screening zum Erhalten
eines stabilen Plasmids war erforderlich. Als ein Ergebnis der DNA-Fragmentanalyse mit
Restriktionsenzymbehandlung wurde offenbart, dass das so erhaltene
Plasmid mit der Bezeichnung pCF111, welches die erste Mutante komplementiert
und die zweite Mutante teilweise komplementiert, und das Plasmid
mit der Bezeichnung pCF213 offenbar nahezu das gleiche Plasmid waren.
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Andererseits
wurden pCF111 und pCF213 in die erste, zweite bzw. dritte Mutante
retransformiert und es wurde bezüglich
der Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
geprüft.
Als ein Ergebnis komplementierten beide Plasmide die erste Mutante,
aber sie komplementierten die zweite und die dritte Mutante nur
teilweise.
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Basierend
auf dem Komplementationstest wurde offenbart, dass bei einem Plasmid,
das in ausreichender Weise die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
bei einer Mutante mit fehlender Homoglutaminsäure-Produktivität wiederherstellt,
ein Gen, das zumindest an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt
ist, spezieller ein bestimmtes Gen außer lat, vorhanden ist.
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Somit
kann ohne Einschränkung
darauf, aber als eines der „Gene,
die an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt sind" ein Gen genannt
werden, welches in dem Insert-Teil des Plasmids pCF213 enthalten
ist und ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert. Zum Beispiel ist
dieses Gen in der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Sequenz vorhanden.
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Andererseits
kann ein Gen, das an ersterer bzw. der früheren Umwandlung beteiligt
ist, das nämlich ein
Protein mit LAT-Aktivität
gemäß der Erfindung
codiert, wie folgt kloniert werden.
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F.
lutescens wird unter einer bestimmten Kulturbedingung kultiviert,
der erhaltene Stamm wird aufgebrochen, die Dispersion mit den aufgebrochenen
(Zellen) wird zentrifugiert, um die aufgebrochenen Zellen zu entfernen,
und aus dem so erhaltenen Zellextrakt wird das gewünschte Protein
isoliert und mittels Ultrazentrifugationsbehandlung, Ammoniumsulfatfällung, Entsalzen,
Ionenaustauscher-Säulenchromatographie,
Affinitäts-Säulenchromatographie,
Ultrafiltration, Elektrophorese etc. gereinigt.
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Aus
den Ergebnissen der Analyse der Aminosäuresequenz des N-Terminus des
gereinigten Proteins werden DNA-Primer konstruiert und eine PCR
wird mit der genomischen DNA des F. lutescens (IFO 3084)-Stamms
durchgeführt.
Basierend auf dem DNA-Fragment, das mittels PCR amplifiziert wurde,
wird eine weitere PCR durchgeführt
und dadurch wird die Nachbar schaftsregion der beiden äußeren Seiten
des DNA-Fragments erhalten. Somit wird eine DNA, die das gewünschte Protein
der Erfindung codiert, erhalten.
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Es
wird somit möglich,
eine DNA, die ein Protein mit LAT-Aktivität codiert, als ein anderes
Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, bereitzustellen.
Namentlich kann als anderes Gen der Erfindung z. B. eines genannt
werden, das eine Sequenz hat, die die codierende Region der Basensequenz von
SEQ ID NO: 1 bildet. Der N-Terminus des entsprechenden gereinigten
Proteins ist Ser, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, aber es wird
in Betracht gezogen, dass das N-terminale Met nach der Translation
prozessiert wird.
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Weiterhin
schließt
die DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt
ist, gemäß der vorliegenden
Erfindung eine DNA ein, enthaltend mindestens eines von jeweils
dem Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert,
und dem Gen, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert.
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Zusätzlich schließt das Gen,
auf das in der Erfindung Bezug genommen wird, auch einen Modifikator beider
der obigen Gene ein, welcher eine Basensequenz hat, die mit einem
der beiden Gene unter einer bestimmten Hybridisierungsbedingung,
z. B. unter einer stringenten Bedingung bei 60°C in 2XSSC (in Standard-Citronensäure-Salzlösung), vorzugsweise
bei 60°C
in 0,5XSSC, insbesondere bevorzugt bei 60°C in 0,2XSSC, hybridisiert und
eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
einer Mutante von F. lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt,
befähigt
zu sein.
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Spezieller
ist ein Modifikator eines Gens, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert,
einer der mindestens 70% Identität
mit der Basensequenz von Base 2855 bis Base 4387 in SEQ ID NO: 3
zeigt, und ein Modifikator eines Gens, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert,
ist einer, der mindestens 50%, vorzugsweise 70%, stärker bevorzugt
95%, Identität
mit der Basensequenz von Base 545 bis Base 2658 (codierende Region)
in SEQ ID NO: 1 zeigt.
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Derartige
Modifikatoren schließen
einen solchen ein, in welchem eine Base/n entfernt oder hinzugefügt wurde/n
oder ein Teil der Basen durch eine andere Base/n ersetzt wurde und
zwar am 5'-Terminus,
am 3'-Terminus oder
in der Mitte einer der beiden obigen Sequenzen. Der Modifikator,
in dem ein Teil der Basen durch eine andere Base/n ersetzt ist,
schließt
einen Modifikator ein, welcher das gleiche Protein codiert, aber eine
andere Basensequenz hat, die sich von denjenigen beider der obigen
Gene aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
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Es
wird empfohlen, die Basensubstitution außer einer Substitution, die
aus der Degeneration des genetischen Codes folgt, unter Berücksichtigung
der berechneten bzw. abgeschätzten
Aminosäuresequenzen, die
durch die beiden obigen Gene codiert werden, so durchzuführen, dass
eine ähnliche
bzw. gleiche Gestalt als Ganzes des Proteins, basierend auf Ähnlichkeit
der Seitenkette jeder Aminosäure,
z. B. Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe etc., erhalten wird. Somit
wird ein Modifikator, der eine Funktion, die der Funktion eines
der beiden der obigen Gene gleich ist, nämlich eine Funktion aufweist,
zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion
einer Mutante von F. lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt,
befähigt
zu sein, mit bemerkenswert hoher Wahrscheinlichkeit erhalten werden.
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Der
erfindungsgemäße Modifikator
kann unter Verwendung einer Nucleinsäure-Synthesevorrichtung („nucleic
acid synthesizer")
synthetisiert werden oder mittels per se bekannter Punktmutagenese
oder ortsspezifischer Mutagenese unter Berücksichtigung der Basensequenzen
beider der obigen Gene oder der berechneten bzw. abgeschätzten Aminosäuresequenzen,
die durch jene codiert werden, hergestellt werden.
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Gemäß der Erfindung
kann auch ein rekombinantes Plasmid, das das obige Gen oder den
Modifikator trägt,
bereitgestellt werden. Ein derartiges Plasmid kann ein autonom replikatives
sein, das neben dem obigen Gen oder Modifikator eine autonom replikative
bzw. replizierende Sequenz, eine Promotorsequenz, eine Terminatorsequenz,
ein Wirkstoffresistenzgen etc. enthält. Weiterhin kann das Plasmid
ein Plasmid vom Integrationstyp sein, das eine Sequenz enthält, die
zu einer bestimmten Region des Wirtsgenoms, die verwendet werden
soll, homolog ist. Als ein Beispiel des autonom replikativen rekombinanten
Plasmids, das eine DNA, enthaltend ein Gen, das ein Protein mit
Dehydrogenase-Aktivität
codiert, trägt,
kann ein Plasmid, pBBR122, genannt werden oder eines, welches das
Plasmid pBBR122 umfasst, das an einer bestimmten Stelle davon eine Insertion
einer multiplen Klonierungsstelle aufweist oder bei dem die bestimmte
Stelle oder Region durch eine multiple Klonierungsstelle substituiert
ist und bei dem das obige Gen oder der Modifikator unter Verwendung der
multiplen Klonierungsstelle inseriert ist. Als spezifische Beispiele
derartiger Plasmide können
diejenigen genannt werden, die in der Beschreibung als Plasmide
pCF111 und pCF213 bezeichnet werden. pCF213 kann durch ein per se
bekanntes Plasmidisolierungsverfahren auf Flavobacterium lutescens
IFO 3084 (pCF213), welches am 11. März 1998 beim National Institute
of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science
and Technology hinterlegt wurde und welchem die Eingangsnummer FERM
P-16699 zugeordnet wurde und welches anschließend zur internationalen Hinterlegung
(im Rahmen des) Budapester Vertrages überführt wurde und welchem die Eingangsnummer
FERM BP-6797 zugeordnet wurde. Ein rekombinantes Plasmid, das eine
DNA, enthaltend ein Gen, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert,
trägt und
ein rekombinantes Plasmid, das eine DNA, enthaltend beide Gene,
trägt,
können
ebenso in der gleichen Weise wie bei pCF213 konstruiert werden.
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Gemäß der Erfindung
kann weiterhin auch eine Transformante, erhalten durch Transformieren
eines Bakteriums, das zum Genus Flavobacterium gehört, als
ein Wirt mit dem obigen rekombinanten Plasmid, bereitgestellt werden.
Als das Wirtsbakterium, das zum Genus Flavobacterium gehört, kann
jeder beliebige Stamm jeder beliebigen Spezies verwendet werden,
solange er die Aufgabe der Erfindung erfüllt, jedoch können als
bevorzugte F. lutescens IFO 3084 und F. lutescens SP.7-1 (FERM BP-5457)
genannt werden.
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Somit
kann als ein spezielles Beispiel der obigen Transformante eine genannt
werden, die durch Transformieren von F. lutescens IFO 3084 oder
F. lutescens SP.7-1 mit pCF213 erhal ten wurde, und F. lutescens
IFO 3084 (pCF213) ist als FERM BP-6797 bei der internationalen Hinterlegungsbehörde des
National Institute of Bioscience and Human Technology hinterlegt.
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Gemäß der Erfindung
wird auch ein Verfahren zum Produzieren von Homoglutaminsäure unter
Verwendung der Transformante bereitgestellt. In dem Verfahren wird
die Transformante in einem Medium, gewachsen durch Kultur, mit L-Lysin
oder in einigen Fällen
P6C (oder 2-Aminoadipinsäure-6-semialdehyd)
als Ausgangsmaterial in Kontakt gebracht oder das Ausgangsmaterial
wird mit einer gewachsenen Transformante oder behandelten Zellen
davon (z. B. Zellen, die mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wurden,
ein Zellextrakt, immobilisierte behandelte Zellen) in Kontakt gebracht,
um das Ausgangsmaterial in Homoglutaminsäure umzuwandeln.
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Als
Kohlenstoffquellen des Mediums können
jegliche Kohlenstoffquellen verwendet werden, solange sie durch
die Transformante verwendbar sind, und wenn F. lutescens als ein
Wirt verwendet wird, können
zum Beispiel Saccharide, wie Glucose, Fructose, Saccharose und Dextrin,
Zuckeralkohole, wie Glycerin und Sorbit, und organische Säuren, wie
Fumarsäure
und Citronensäure,
verwendet werden und es ist wünschenswert, dass
die Zugabemenge dieser Kohlenstoffquellen gewöhnlich in der Größenordnung
von 0,1 bis 10 Gew.-% (hierin nachstehend als % abgekürzt) liegt.
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Als
Stickstoffquellen des Mediums können
zum Beispiel Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat, Ammoniumsalze von organischen
Säuren, wie
Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, und weitere natürliche Stickstoffquellen,
wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser („corn steep
liquor”)
und Caseinhydrolysat, verwendet werden und es ist wünschenswert,
dass die Zugabemenge dieser Stickstoffquellen gewöhnlich in
der Größenordnung
von 0,1 bis 10% liegt.
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Als
anorganische Salze können
zum Beispiel Alkalimetallsalze von Phosphorsäure, wie Kaliumphosphat und
Natriumphosphat, Alkalimetallchloride, wie Kaliumchlorid und Natriumchlorid,
und Metallsalze von Schwefelsäure,
wie Magnesiumsulfat und Eisen(II)-sulfat, verwendet werden und es
ist wünschenswert,
dass die Zugabemenge dieser anorganischen Salze gewöhnlich in
der Größenordnung
von 0,001 bis 1% liegt.
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Unter
diesen ist die Flüssigkultur
unter Verwendung eines gewöhnlichen
Wachstumsmediums für
Bakterien bevorzugt und Glucose, Maltose, Stärke etc. als Kohlenstoffquellen
und Ammoniumsulfat, Pepton, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl etc. als
Stickstoffquellen sind besonders effektiv. Zusätzlich werden Kaliumphosphat,
Magnesiumsulfat, Tafelsalz etc. gewöhnlich als anorganische Salze
verwendet.
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Es
wird empfohlen, dass die Kultur der Mikroorganismen in einem derartigen
Medium bei 20 bis 40°C, vorzugsweise
28 bis 37°C,
und bei einem pH von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, unter einer
aeroben Bedingung durchgeführt
wird.
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Der
Kontakt während
der Kultur der gewachsenen Transformante mit dem Ausgangsmaterial
wird durchgeführt,
indem zuvor das Ausgangsmaterial in das Medium zugegeben wird oder
das Ausgangsmaterial während
der Kultur in geeigneter Weise zugegeben wird. Der Kontakt kann
auch nach Beendigung der Kultur durch Rühren oder Schütteln der
gewonnenen bzw. abgenommenen Zellen oder behandelter Zellen und
des Ausgangsmaterials in einem Medium oder einem geeigneten Puffer,
falls erforderlich mit Zugabe geeigneter Coenzyme etc., in einem
Reaktor oder durch Fließenlassen
eines Ausgangsmaterials-enthaltenden Materials auf immobilisierte
Zellen durchgeführt
werden.
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Der
Fall, in die Transformante und L-Lysin während der Kultur in Kontakt
gebracht werden, wird als ein Beispiel genommen und wird unten stehend
spezifischer beschrieben. Ein Medium wird mit der Transformante inokuliert
und es wird zum Beispiel bei 20 bis 40°C 12 bis 120 Stunden kultiviert,
um eine Kulturbrühe
des Stamms zu erhalten, die 106 bis 1010 Mikroorganismen als die Transformante
pro ml enthält.
Das Ausgangsmaterial L-Lysin als eine Lösung in Wasser oder einem Hilfs-Lösungsmittel
oder L-Lysin als solches, ohne dass es gelöst wird, wird zugegeben, so
dass die Endkonzentration gewöhnlich
0,5 bis 30 mg/ml sein kann, und die Reaktion wird gewöhnlich bei
20 bis 40°C
18 Stunden bis 7 Tage, vorzugsweise 18 Stunden bis 5 Tage, durchgeführt. Anschließend kann
Homoglutaminsäure
durch gewöhnliche
Reinigungsverfahren, zum Beispiel verschiedene Ionenaustauscherchromatographien
unter Verwendung von Kationenaustauscherharzen, Anionenaustauscherharzen
etc., Adsorptionschromatographie unter Verwendung von HP20 etc.,
Präzipitation
oder Kristallisation unter Verwendung von Lösungsmitteln und Temperatur
und dergleichen, erhalten werden.
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Die
Beschaffenheit („shape") und die Zugabezeit
des zuzugebenden L-Lysins unterliegt keinen besonderen Beschränkungen,
aber L-Lysin wird im Hinblick auf die Löslichkeit vorzugsweise als
Monohydrochlorid verwendet, und es kann zu Beginn der Kultur oder
während
der Kultur, z. B. am 1. bis zum 5. Tag, zugegeben werden.
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Gemäß der Erfindung
wird eine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt
ist, bereitgestellt, wobei das Gen L-Lysin zu Homoglutaminsäure umwandelt.
Diese DNA ist zweckmäßig in einem
mikrobiologischen Produktionsverfahren für Homoglutaminsäure. Gemäß der Erfindung werden
auch ein Verfahren zum Produzieren von Homoglutaminsäure durch
eine Transformante, die zum effizienten Produzieren von Homoglutaminsäure befähigt ist,
und seine Verwendung bereitgestellt.
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Hierin
nachstehend wird die Erfindung durch spezifische Beispiele weiter
detailliert beschrieben. Diese spezifischen Beispiele werden zur
Erleichterung bzw. zum Ermöglichen
des Verständnisses
der Erfindung bereitgestellt und es ist nicht beabsichtigt, die
Erfindung auf diese zu beschränken.
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Beispiel 1
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Klonierung eines Gens, codierend ein Protein
mit Dehydrogenase-Aktivität
etc.
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1. Erhalten eines Stammes, der keine Homoglutaminsäure produziert
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3
ml L-Medium (1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1%
Glucose, pH 7,2) wurden mit dem Stamm F. lutescens IFO 3084 inokuliert
und bei 32°C
unter Schütteln über Nacht
inkubiert. 100 μl
Kulturbrühe
wurden als ein Inokulum in 50 ml L-Medium überimpft und bei 32°C für 4,5 Stunden
unter Schütteln
kultiviert. Die Zellen wurden aus dieser Kulturbrühe durch
Zentrifugation bei 5000 × g
für 10
Minuten abgenommen bzw. gesammelt, einmal mit 0,2 M Phosphatpuffer
(pH 6,0), gewaschen und in 6 ml 0,2 M Phoshatpuffer (pH 6,0) suspendiert.
50 μl 80
mg/ml NTG wurden zu dieser Zellsuspension zugegeben und eine Schüttelkultur wurde
bei 32°C
20 Minuten lang durchgeführt.
Die Zellen, die aus dieser Kulturbrühe gesammelt wurden, wurden
einmal mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und die gesamte
Menge wurde in 50 ml L-Medium überimpft
und es wurde unter Schütteln
bei 32°C über Nacht
kultiviert. 500 μl-Portionen
dieser Kulturbrühe
wurden dekantiert bzw. abpipettiert („poured”) und es wurden entsprechend
500 μl-Portionen
60%ige Glycerinlösung
zugegeben und die Mischungen wurden entsprechend gut gemischt und
anschließend
bei –70°C gefroren
gelagert. Die gefroren gelagerten Gemische werden als Mutantenlagerungssuspensionen
bezeichnet.
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Diese
Mutantenlagerungssuspension wurde 106fach
mit 0,85%iger NaCl(-Lösung)
verdünnt
und 100 μl-Portionen
der Verdünnung
wurden auf MEM-Agarmedien (0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 1,0%
Lysin-HCl, 0,006% Methylenblau, 0,04% Eosin Y und 1,5% Agar, pH
7,2) in 8 cm-Petrischalen ausgestrichen und die Kultur wurde bei
32°C 3 Tage
lang durchgeführt.
Weiße
Kolonien unter den gewachsenen Kolonien wurden in 1 ml-Portionen
eines Screening-Mediums (1,0% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 1,0%
Lysin-HCl, pH 7,2) überimpft
und 2 Tage lang bei 32°C
unter Schütteln
kultiviert. 3 μl
jeder Kultur wurden auf eine Silicagel-DC-Platte übertragen und getrocknet. Diese
Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem,
bestehend aus Butanol, Essigsäure
und Wasser (3:1:1), entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen
und dabei wurde jede Spur auf Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein
von Homoglutaminsäure
geprüft.
Somit wurden von den Mutanten die erste Mutante (FERM BP-6799),
die überhaupt
keine Homoglutaminsäure
produzierte, und die zweite Mutante (FERM BP-6798) und die dritte
Mutante, die nur eine geringe Menge Homoglutaminsäure produzierten,
abgetrennt. Die Ergebnisse, die mittels Prüfen dieser Mutanten auf die
Fähigkeit
zur Umwandlung von L-Lysin in Homoglutaminsäure (oder der Produktivität bezüglich Homoglutaminsäure) durch
DC-Analyse erhalten
wurden, sind in 1 gezeigt. In 1 wird
Homoglutaminsäure
durch HG dargestellt (dies ist auch bei den anderen Zeichnungen
der Fall). Die Ergebnisse des Assays der LAT-Aktivität bei diesen
Mutanten sind in 2 gezeigt.
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2. Konstruktion eines Wirt-Vektor-Systems
und eines Transformationssystems
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3
ml L-Medium wurden mit dem Stamm F. lutescens IFO 3084 inokuliert
und bei 32°C
unter Schütteln über Nacht
kultiviert. 100 μl
der Kulturbrühe
wurden als Inokulum in 50 ml L-Medium überimpft
und bei 32°C 4,5
Stunden lang unter Schütteln
kultiviert. Die Zellen wurden aus dieser Kulturbrühe mittels
Zentrifugation bei 5000 × g
für 10
Minuten gesammelt, einmal mit 10%iger Glycerinlösung gewaschen und in 3 ml
10%iger Glycerinlösung
suspendiert. 200 μl-Portionen
dieser Suspension wurden dekantiert bzw. abpipettiert und bei –70°C gefroren
gelagert. Die gefroren gelagerten Suspensionen werden als Electrocell-Lagerungssuspensionen bezeichnet.
Diese Lagerungssuspension wurde auf Eis aufgetaut und 1 μl einer Lösung von
200 μg/ml eines
Vektors mit breitem Wirtsspektrum („Broad Host Range Vector"), pBBR122 (Mo Bi
Tec Incorporation), in TE wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in
eine 0,2 cm-Elektroporationsküvette („Electrocuvette") (BIORAD Incorporation)
gegeben, ein elektrischer Impuls wurde unter einer Bedingung von
2,4 kV, 200 Ω und
25 μF unter
Verwendung eines Gene Pulser II (BIORAD Incorporation) aufgegeben.
Anschließend
wurden die Zellen in ein Falcon-Röhrchen gegeben, 1 ml eisgekühltes L-Medium
wurde zugegeben und es wurde eine Schüttelkultur bei 32°C 2 Stunden
lang durchgeführt.
Die Kulturbrühe
wurde auf L-Agarmedium
(1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Glucose, 1,5%
Agar, pH 7,2), enthaltend 20 μg/ml
Kanamycin, ausgestrichen und bei 32°C 3 Tage lang kultiviert. Eine
Transformante in einer Zahl von 2,4 × 105 wurde
erhalten.
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3. Konstruktion eines Plasmids pCF704
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Ein
Primer mit einer EcoRI-Stelle und ein Primer mit einer NcoI-Stelle
wurden synthetisiert (Pharmacia Incorporation) und die multiple
Klonierungsstelle und 95 bp ihrer Nachbarregion von pUC 18 wurden
unter Verwendung von Taq-Polymerase (Pharmacia Incorporation) und
dem Thermocycler PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Company) amplifiziert.
Dieses DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NcoI
verdaut und das verdaute Produkt wurde in die EcoRI- und NcoI-Stellen
von pBBR122 unter Verwendung des Ligationskits Ligation Kit Version
2 (Takara Company) ligiert. Kompetente Zellen von E. coli JM 109
(Takara Company) wurden mit diesem Reaktionsgemisch transformiert
und aus der resultierenden Transformante wurde ein Plasmid pCF704
unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi-Kits präpariert.
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4. Konstruktion eines Plasmids pCF213
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Die
genomische DNA des Stammes F. lutescens IFO 3084 wurde extrahiert
und gemäß dem QIAGEN Blood
and Cell Culture DNA-Kits aufgereinigt. Diese genomische DNA wurde
mit einem Restriktionsenzym, SauIIIAI, teilweise abgebaut und die
resultierenden 6- bis 8-kbp-Fragmente
wurden aus Agarosegel ausgeschnitten und DNA wurde gewonnen und
unter Verwendung einer Ultrafree C3-Einheit, 0,45 μm, (Millipore
Corporation) gereinigt und in TE-Lösung gelöst. Die
resultierende Lösung
wird als Insert-DNA-Lösung
bezeichnet. Andererseits wurde pCF704 mit einem Restriktionsenzym
BamHI verdaut und der Verdau wurde mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Der resultierende Verdau und die Insert-DNA-Lösung wurden einer Ligationsreaktion
unter Verwendung des Ligation Kit Version 2 (Takara Company) unterzogen
und das Reaktionsgemisch wurde als DNA-Bibliothek verwendet.
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Diese
DNA-Bibliothek wurde zu der Electrocell-Lagerungssuspension der
zweiten Mutante zugegeben und ein elektrischer Impuls wurde aufgegeben.
Die resultierenden Zellen wurden in ein Falcon-Röhrchen gegeben und 1 ml eisgekühltes L-Medium
wurde zugegeben und eine Schüttelkultur
wurde bei 32°C
2 Stunden lang durchgeführt.
Die gesamte Menge dieser Kulturbrühe wurde in 50 ml L-Medium,
enthaltend 20 μg/ml
Kanamycin, überimpft
und eine Schüttel kultur
wurde 2 Tage lang bei 32°C
durchgeführt.
500 μl-Portionen
der Kulturbrühe
wurden dekantiert bzw. abpipettiert und entsprechend wurden 500 μl-Portionen
einer 60%igen Glycerinlösung
zugegeben und entsprechend gut gemischt und die Gemische wurden
bei –70°C gefroren
gelagert. Die gefroren gelagerten Gemische werden als Komplementärstamm-Lagerungssuspensionen
bezeichnet.
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Diese
Komplementärstamm-Lagerungssuspension
wurde 103fach mit 0,85%iger NaCl(-Lösung) verdünnt und
100 μl-Portionen
der Verdünnung
wurden auf MEM-Agarmedien, pH 7,0, (0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt,
1,0% Lysin-HCl, 0,006% Methylenblau, 0,04% Eosin Y und 1,5% Agar,
pH 7,0) in 8 cm-Petrischalen ausgestrichen und die Kultur wurde
3 Tage lang bei 32°C
durchgeführt.
Die schwarzen Teile der Zellen, die auf den gesamten Oberflächen gewachsen
waren, werden als Komplementärstammgemischzellen
bezeichnet. Die entsprechenden Komplementärstammgemischzellen wurden
in 3 ml-Portionen des Screening-Mediums überimpft und 2 Tage lang bei
32°C unter
Schütteln
kultiviert. 3 μl-Portionen
jeder der Kulturbrühen
wurden tropfenweise auf jede Spur einer Silicagel-DC-Platte aufgegeben
und getrocknet. Diese Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem, bestehend
aus Butanol, Essigsäure
und Wasser (3:1:1) entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen
und dabei wurde jede Spur auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein
von Homoglutaminsäure
hin geprüft.
Somit wurden Komplementärstammgemischzellen,
die die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
wiedererlangten, ausgewählt
und in Einzelkolonien getrennt und Stämme, die die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
wiedererlangten, wurden ausgewählt
und sie wurden als Komplementärstämme bezeichnet.
Eines der Plasmide, das aus diesen Komplementärstämmen unter Verwendung des QIAGEN
Plasmid Midi-Kits präpariert
wurde, wurde pCF213 genannt. Etwa 6,5 kbp einer Insert-DNA wurden
in pCF213 inseriert. Zusammen mit der Komplementarität eines
separat erhaltenen Plasmids pCE111 bei jeder Mutante wurde die Komplementarität des obigen
pCF213 untersucht und die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
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5. Verbesserung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion
durch pCF213
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Ein
Stamm, der durch Transformieren eines Wildtyp-Stamms von F. lutescens
IFO 3084 mit pCF704 erhalten wurde, wurde als Wild pCF 704-Stamm
bezeichnet und ein Stamm, der durch Transformieren eines Wildtyp-Stammes
von F. lutescens IFO 3084 mit pCF213 erhalten wurde, wurde als Wild
pCF 213-Stamm bezeichnet. Jeder der beiden Stämme wurde durch Inokulieren
von 3 ml Screening-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, verwendet und über Nacht
unter Schütteln
bei 32°C
kultiviert. 100 μl-Portionen
jeder dieser Kulturbrühen
wurden als Innkuli in 25 ml-Portionen eines Produktionsmediums (1,5%
Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) überimpft
und es wurde unter Schütteln
bei 32°C
24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden lang kultiviert. Der Überstand
jeder der Kulturbrühen
wurde hinsichtlich der Homoglutaminsäuremenge mittels HPLC untersucht.
Und zwar wurde die Kulturbrühe
mit destilliertem Wasser so verdünnt,
dass die Gesamt-Aminosäurekonzentration
im Bereich von 1000 mg/l liegen musste, und 50 μl dieser Verdünnung wurden
in ein Test röhrchen überführt und
unter vermindertem Druck zur Trockene aufkonzentriert. 50 μl einer Lösung, die
durch Mischen von Phenylisothiocyanat, Triethylamin, Ethanol und
destilliertem Wasser im (Verhältnis)
1:1:7:2 erhalten worden war, wurde dazu gegeben und das Gemisch
wurde gerührt,
um den Rückstand
zu lösen,
und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und unter vermindertem
Druck zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 500 μl Lösung A als
der mobilen Phase der HPLC gelöst und
5 μl der
Lösung
wurden injiziert. Die HPLC-Bedingungen sind unten gezeigt.
Säule: TSK-GEL
super-ODS, 4,6ID × 50
mm
Mobile Phase:
Lösung
A: Gemisch aus einer Lösung,
erhalten durch Einstellen von 140 mM Natriumacetat/0,05% Triethylamin
auf pH 6,2 mit Eisessig: Acetonitril im (Verhältnis) 1000:40
Lösung B:
70%iges Acetonitril
Flussrate: 2,0 ml/min
Elutionsbedingung:
Gradient einer festgelegten Flussrate, linearer Gradient von 2%
bis 40% Lösung
B in von 0 bis 7 Minuten, 100% Lösung
B bei mehr als 7 Minuten
Detektion: UV 254 nm
Temperatur:
40°C
-
Unter
diesen Bedingungen betrug die Retentionszeit von Homoglutaminsäure 1,3
Minuten und diejenige von Lysin betrug 7,7 Minuten.
-
Wie
aus den in 4 gezeigten Ergebnissen ersichtlich
ist, weist der Wildtyp-pCF213-Stamm
eine Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
auf, die 1,5-mal höher
ist als jene des Wildtyp-pCF704-Stamms.
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6. Bestimmung der Genbasensequenz der
pCF213-Insert-Region
-
Die
Basensequenz der pCF213-Insert-Region wurde gemäß dem Primer-Walking-Verfahren unter Verwendung
der Sequenziervorrichtung ABIPRISM 377XL DNA-Sequencer (Perkin Elmer
Corporation) bestimmt. Diese Basensequenz ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
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Das
offene Leseraster (ORF) auf der bestimmten Basensequenz wurde unter
Verwendung des Verfahrens von Bibb et al. (Gene 30, 157 (1984))
bestimmt. Als ein Ergebnis wurde das in 5 gezeigte
ORF gefunden.
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7. Analyse der NotI-Stelle von etwa 2,5
kbp in der pCF213-Insert-Region
-
Es
wurde eine Analyse der NotI-Stelle von etwa 2,5 kbp (die Basensequenz
von 2077 bis 4578 in SEQ ID NO: 3) in der pCF213-Insert-Region durchgeführt. Diese
NotI-Stelle von etwa 2,5 kbp wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten
und die DNA wurde gewonnen und unter Verwendung einer Ultrafree
C3-Einheit, 0,45 μm
(Millipore Corporation) gereinigt und in TE-Lösung
gelöst
und die Enden wurden gemäß dem DNA-Blunting-Kit
(Takara Company) stumpf gemacht („blunted") und die resultierende Lösung wurde
als Insert-DNA-Lösung
bezeichnet.
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Andererseits
wurde pCF704 mit einem Restriktionsenzym, HincII, verdaut und anschließend mit
alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Dies und die Insert-DNA-Lösung wurden
einer Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligationskits Ligation
Kit Version 1 (Takara Company) unterzogen. Der Stamm F. lutescens IFO
3084 wurde mit diesem Reaktionsgemisch transformiert und ein Plasmid
pCF235 wurde aus der Transformante unter Verwendung des QUIAGEN
Plasmid Midi-Kits präpariert.
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Die
erste Mutante, transformiert mit pCF235, wurde als Inokulum in 3
ml des Screening-Mediums
verwendet und 2 Tage lang bei 32°C
unter Schütteln
kultiviert. 3 μl-Portionen
dieser Kulturbrühe
wurden tropfenweise auf jeweils eine Spur einer DC-Silicagel-Platte
aufgegeben und getrocknet. Diese Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem,
bestehend aus Butanol, Essigsäure
und Wasser (3:1:1) entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen
und jede Spur wurde auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein
von Homoglutaminsäure
hin geprüft.
Als ein Ergebnis wurde aufgezeigt, dass die erste Mutante, die mit
pCF235 transformiert ist, die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
wiedererlangt hatte.
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In
der DNA-Sequenz von etwa 2,5 kbp, integriert in pCF235, war ein
ORF vorhanden, codierend für 510
Aminosäuren
mit Beginn bei ATG der 2855. der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 und
Ende bei TAA der 4387. Diese Aminosäuresequenz wurde einer Homologiesuche
mittels BLAST unterzogen und als ein Ergebnis zeigt sich eine hohe
Homologie mit verschiedenen Aldehyddehydrogenasen und weiterhin
zeigte sich eine hohe Homologie mit der Aminosäuresequenz von Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase
von Streptomyces clavuligerus, welche kürzlich in der Datenbank registriert
wurde (J. Bac., Bd. 180, Nr. 17, 4753–4756 (1998)), und zwar über die
gesamte Aminosäuresequenz.
Unter Berücksichtigung,
dass die erste Mutante, die mit pCF235 transformiert ist, die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
wiedererlangte und dass die Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
des Wildtyp-pCF213-Stamms erhöht
wurde, kann das Protein, das durch dieses ORF codiert wird, als
eines mit Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase
angesehen werden.
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Beispiel 2
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Klonierung eines Gens, codierend ein Protein
mit LAT-Aktivität
etc.
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1. Assay der LAT-Aktivität
-
Lysin-HCl
(73 mg) und 59 mg 2-Ketoglutarsäure
wurden in 1 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 0,5 mM
Pyridoxalphosphat, gelöst
und die Lösung
wurde als Reaktionslösung
bezeichnet. Die Reaktionslösung
(28,75 μl)
wurde zu 260 μl
der Enzymlösung
zugegeben und das Gemisch wurde bei 32°C 1 Stunde lang stehengelassen.
151,8 μl
einer Lösung
von 5% Trichloressigsäure
in Ethanol wurden zugegeben, um die Reaktion zu unterbrechen, das
Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, 90 μl 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend
4 mM o-Aminobenzaldehyd,
wurden zu 60 μl
des Überstandes
zugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C 1 Stunde lang stehengelassen.
Das Gemisch wurde bezüglich
A465 untersucht und die Fraktionen mit relativ hoher A465 wurden
als LAT-aktive Fraktionen bezeichnet.
-
2. Kultivierung bzw. Kultur des Stamms
-
Der
Stamm F. lutescens IFO 3084 wurde bei 32°C über Nacht unter Schütteln kultiviert.
Die Kulturbrühe
(50 ml) wurde als Inokulum in 10 l Flavo M9-Medium (0,6% Na2HPO4, 0,3% KH2PO4, 0,1% NH4Cl, 0,2% NaCl, 1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt,
0,5% Lysin-HCl, 0,005% Silikon KM75, 0,025% MgSO4,
0,0015% CaCl2, pH 7,2) in einem 30 l-Fermentationsgefäß überimpft
und es wurde unter Rühren
mit Belüftung
17 Stunden lang kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe (5 1)
wurde zentrifugiert (1000 × g,
10 Minuten) um die Zellen zu sammeln, und die Zellen wurden zweimal
mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden
in dem gleichen Puffer suspendiert und einem Aufbrechen mittels
Ultraschall unterzogen. Die aufgebrochenen Zellen wurden mittels
Zentrifugation entfernt (1000 × g,
10 Minuten), um einen Zellextrakt zu erhalten. Der Zellextrakt wurde
ultrazentrifugiert (16.000 × g,
90 Minuten) und die Überstandsfraktion
wurde den folgenden Aufreinigungsvorgängen unterzogen.
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3. Aufreinigung des Enzyms
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Alle
folgenden Aufreinigungsvorgänge
wurden bei 4°C
durchgeführt,
soweit nichts anderes angegeben ist.
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(1) Ammoniumsulfat-Fraktionierung
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Die Überstandsfraktion
(600 ml), die in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation
gereinigt. Die in den Fraktionen von 30% Sättigung bis 80% Sättigung
gebildeten Präzipitate wurden
mittels Zentrifugation (1000 × g,
30 Minuten) gesammelt und in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst und die
Lösung
wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert.
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(2) Entsalzen
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Die
dialysierte Enzymlösung
(10 ml) wurde auf 4 PD10-Säulen
(Amersham Pharmacia) gegossen und eluiert und entsalzt mit 0,1 M
Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat.
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(3) QAE-TOYOPEAL550C-Säulenchromatographie
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Die
entsalzte Enzymlösung
wurde auf eine QAE-TOYOPEAL550C (TOSOH)-Säule (4) 5,5 × 6,0 cm), die
zuvor mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat, äquilibriert
worden war, gegossen, mit dem gleichen Puffer gewaschen und durch
2 1 eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0 bis 1,0 M) unter
Verwendung des gleichen Puffers eluiert, und die LAT-aktiven Fraktionen
wurden gesammelt.
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(4) Phenyl-TOYOPERL650S-Säulenchromatographie
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1
M Ammoniumsulfat wurde zu den LAT-aktiven Fraktionen zugegeben und
das Gemisch wurde auf eine Phenyl-TOYOPERL650S (TOSOH)-Säule (4)
5,5 × 3,0
cm), die zuvor mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,5
mM Pyridoxalphosphat und 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war, gegossen
und mit 1200 ml eines Ammoniumsulfatgradienten (0,8 bis 0 M) unter
Verwendung des gleichen Puffers eluiert und die LAT-aktiven Fraktionen
wurden gesammelt.
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(5) Ultrafiltration
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Die
LAT-aktiven Fraktionen (150 ml) wurden mit ADVANTEC UP-20 ultrafiltriert,
um das Volumen auf 15 ml einzustellen. Dieses Konzentrat (2,5 ml)
wurde auf PD10-Säulen
(Amersham Pharmacia) gegossen und eluiert und entsalzt mit 0,1 M
Tris-HCl-Puffer (pH 7,4).
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(6) AKTA MonoQ HR5/5-Säulenchromatographie
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Die
entsalzte Enzymlösung
(3,5 ml) wurde auf eine MonoQ HR5/5-Säule eines AK-TAexplorer 10S-Systems
(Amersham Pharmacia), die zuvor mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) äquilibriert
worden war, gegossen, mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit
40 ml eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0 bis 0,4 M) unter
Verwendung des gleichen Puffers eluiert und die LAT-aktiven Fraktionen
wurden gesammelt. Die LAT-aktiven Fraktionen (5 ml) wurden mittels
einer PD10-Säule
entsalzt und (einer Chromatographie mittels) MonoQ HR5/5-Säule eines
AKTAexplorer 10S-Systems unterzogen und die LAT-aktiven Fraktionen
wurden gesammelt. Die Beziehungen zwischen jeder Fraktion und der
relativen LAT-Aktivität
sind in 6 gezeigt.
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(7) Elektrophorese
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Die
LAT-aktiven Fraktionen wurden (einer Elektrophorese mittels) Multigel
4/20 und 10/20 (Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Ltd.) unterzogen und
Native-PAGE und SDS-PAGE wurden durchgeführt und die Ergebnisse sind
in 7 gezeigt. Was die LAT-aktiven Fraktionen betrifft,
so wurde eine Bande bei einem Molekulargewicht von etwa 100.000
bei der Native-PAGE
beobachtet und es wurde eine Bande bei einem Molekulargewicht von
etwa 55.000 bei SDS-PAGE beobachtet. Eine PVDF-Membran wurde mit
der Bande mit dem Molekulargewicht von etwa 55.000 bei der SDS-PAGE
unter Verwendung von PhastTransfer (Amersham Pharmacia) geblottet.
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4. Analyse des N-Terminus der Aminosäuresequenz
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Die
Analyse des N-Terminus der Aminosäuresequenz der Bande, die dem
Blotting unterzogen worden war, wurde mittels des Verfahrens des
Edman-Abbaus unter Verwendung eines HP G1005A Protein Sequencing
System (HEWLETT PACKARD) durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde
aufgezeigt, dass der N-Terminus der Aminosäuresequenz wie folgt lautete:
-
Basierend
darauf wurden die DNA-Primer (N = I)
konstruiert
und es wurde eine PCR bei der genomischen DNA des Stammes F. lutescens
IFO 3084 unter Verwendung des LA PCR in vitro Cloning KIT (Takara
Company) durchgeführt.
Die PCR-Reaktionsbedingungen lauteten wie folgt: 30 Zyklen bei 94°C, 30 Sekunden → 55°C, 2 Minuten → 72°C, 1 Minute.
Als ein Ergebnis wurde ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 400
bp, das den obigen Terminus und seine stromaufwärts gelegene Region enthielt,
erhalten. Basierend auf dieser Sequenz wurde eine Nachbarregion
unter Verwendung von PCR erhalten.
-
Und
zwar wurde die genomische DNA des Stammes F. lutescens IFO 3084
mit den Restriktionsenzymen PstI bzw. SalI verdaut und die Verdau(produkte)
wurden entsprechend einer Selbst-Ligationsreaktion
unter Verwendung des Ligation Kit Version 2 (Takara Company) unterzogen
und die resultierenden DNAs wurden als Matrizen-DNAs verwendet.
-
Basierend
auf diesen Matrizen-DNAs wurden die DNA-Primer
konstruiert
und es wurde eine PCR unter Verwendung von LA Taq (Takara Company)
durchgeführt.
Die PCR-Reaktionsbedingungen lauteten wie folgt: 30 Zyklen bei 98°C, 20 Sekunden → 68°C, 6 Minuten.
Als ein Ergebnis wurde ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 2
kbp von der PstI-Matrize erhalten und es wurde ein PCR-Amplifikationsfragment
von etwa 8 kbp von der SalI-Matrize erhalten. Die Basensequenz wurde
durch das Primer-Walking-Verfahren unter Verwendung des ABIPRISM
377XL DNA Sequencer (Perkin Elmer Corporation) bei diesen PCR-Amplifikationsfragmenten
bestimmt. Diese Basensequenz ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
-
5. Konstruktion der Plasmide pCF301 und
pCF335
-
Die
folgenden DNA-Primer, worin die PstI-Stellen von Base 545 und Base
2658 von SEQ ID NO: 1 zu KpnI- und SacI-Stellen umgewandelt wurden
wurden hergestellt und eine
PCR-Reaktion wurde unter Verwendung dieser Primer durchgeführt, um
die lat-Genregion zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment von
etwa 2,1 kbp wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI verdaut
und die resultierende Lösung
wurde als Insert-DNA-Lösung
bezeichnet. Andererseits wurde pCF704 mit den Restriktionsenzymen
KpnI und SacI verdaut und der Verdau und die Insert-DNA-Lösung wurden
einer Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligation Kit Version
2 (Takara Company) unterzogen und das resultierende Plasmid wurde
als pCF301 bezeichnet. Weiterhin wurde pCF301 mit den Restriktionsenzymen
KpnI und SacI verdaut und das 2,1 kbp-Fragment wurde aus dem Agarosegel
ausgeschnitten und dies und der Verdau von pCF235 mit den Restriktionsenzymen
KpnI und SacI wurden einer Ligationsreaktion unterzogen und das
resultierende Plasmid wurde als pCF335 bezeichnet.
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6. Komplementation der LAT-Aktivität durch
Plasmid pCF301
-
Eine
Mutante, erhalten durch Transformieren der zweiten Mutante mit pCF704,
wurde als 2nd pCF704-Stamm bezeichnet und eine Mutante, erhalten
durch Transformieren der zweiten Mutante mit pCF301, wurde als 2nd
pCF301-Stamm bezeichnet. Diese Stämme wurden bei 32°C über Nacht
unter Schütteln
kultiviert. Jede der Kulturbrühen
(30 μl)
wurde als Inokulum in 3 ml eines Produktionsmediums (1,5% Polypepton,
0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) in einem
Zentrifugationsröhrchen überimpft und
es wurde 17 Stunden lang unter Rühren
mit Belüftung
kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe (1 ml) wurde zentrifugiert (1000 × g, 10
Minuten), um die Zellen zu sammeln, und die Zellen wurden mit 10
ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat,
gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml des gleichen Puffers suspendiert
und mittels Ultraschall aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen
wurden mittels Zentrifugation (1000 × g, 10 Minuten) entfernt,
um einen Zellextrakt zu erhalten. Dieser Zellextrakt wurde auf LAT-Aktivität hin untersucht.
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. pCF301 komplementierte
die LAT-Mutation in der zweiten Mutante.
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7. Erhöhung
der Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
durch pCF335
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Eine
Transformante, erhalten durch Transformieren des Wildtyp-Stammes
von F. lutescens IFO 3084 mit pCF704, wurde als Wildtyp pCF 704-Stamm
bezeichnet und Transformanten, erhalten durch Transformieren des
IFO 3084-Stammes mit den Plasmiden pCF301 und pCF335, wurden als
Wildtyp-pCF301-Stamm bzw. Wildtyp-pCF335-Stamm bezeichnet. Diese
Stämme
wurden in 3 ml-Portionen des Screening-Mediums, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin,
entsprechend überimpft
und über
Nacht bei 32°C
unter Schütteln
kultiviert. 100 μl-Portionen
jeder der Kulturbrühen
wurden als Inokulum in 25 ml-Portionen eines Produktionsmediums
(1,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) überimpft
und bei 32°C
24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden lang unter Schütteln kultiviert.
Die Homoglutaminsäuremenge
im Überstand
jeder dieser Kulturbrühen
wurde mittels HPLC gemessen. Und zwar wurde jede dieser Kulturbrühen mit
destilliertem Wasser so verdünnt,
dass die Gesamt-Aminosäurekonzentration
im Bereich von 1000 mg/l liegen konnte, und 50 μl der Verdünnung wurden in ein Teströhrchen überfuhrt
und zur Trockene aufkonzentriert. Zu diesem Rückstand wurden 50 μl einer gemischten
Lösung
von Phenylisothiocyanat, Triethylamin, Ethanol und destilliertem Wasser
(1:1:7:2) zugegeben und das Gemisch wurde zur Herstellung einer
Lösung
gerührt,
bei Raumtemperatur 10 Minuten stehengelassen und unter vermindertem
Druck zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 500 μl Lösung A als
einer mobilen Phase der HPLC gelöst
und 5 μl
davon wurden injiziert. Die HPLC-Bedingungen sind wie unter 5 in
Beispiel 1 beschrieben.
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Als
ein Ergebnis, wie in 9 gezeigt, wies der Wildtyp-pCF335-Stamm
eine Fähigkeit
zur Homoglutaminsäure-Produktion
auf, die etwa zweimal höher
war als diejenige des Wildtyp-pCF704-Stammes.
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