WO2000008170A1

WO2000008170A1 - Gene participant a la production d'acide homoglutamique, et utilisation associee

Info

Publication number: WO2000008170A1
Application number: PCT/JP1999/004197
Authority: WO
Inventors: Tadashi Fujii; Takao Narita; Kuniho Nakata; Hitosi Agematu; Hiroshi Tsunekawa; Kunio Isshiki; Takeo Yoshioka
Original assignee: Mercian Corporation
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2000-02-17
Also published as: AU5064299A; US6890746B1; CN1311821A; JP4162383B2; CA2337981C; US20040214295A1; EP1103612A1; ATE390484T1; US7235388B2; DE69938427D1; EP1103612A4; CN1229497C; ES2300150T3; CA2337981A1; EP1103612B1; DE69938427T2

Description

明細書

ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子およびその使用

技術分野

本発明は、遺伝子操作に関し、より具体的には、 L一ホモグルタミン酸（または L— 2—ァミノアジピン酸もしくは L一 α—アミノアジピン酸とも称されている）の生産に関与する遺伝子を含む D N A、ならびにそれらを使用する L一ホモグルタミン酸（以下、単にホモグルタミン酸という）の生産系に関する。

背景技術

ホモグルタミン酸は、細菌であるコレラビブリォ（Cholera vibrio)、トウモロコシ（Zea mays) をはじめとする植物体、力エルの胚など、生物界に広く見いだされている。真菌類などにおいてはリジン生合成の中間体として、そして /9ーラクタム系抗生物質の生合成においては前駆体としての位置を占めている。また、ホモグルタミン酸は、メトトレキセート誘導体（W O 9 2 Z 0 9 4 3 6 ) を始めとする各種医薬品の合成中間体としても有用である。

ところで、ホモグルタミン酸の化学合成による製造は光学分割や多段階反応を必要とすることから、コスト的に有効な手段とはなっていない。一方、ァグロパクテリゥム（Agrobacterium) 、クレブシエラ（Klebsie Ha) 、アルカリゲネス（Alcaligens) 、ブレビパクテリゥム（Breviba cterium) 、バチルス (Bacillus) 属に属する微生物を用いて、 Lーリジンから製造する方法（特開平 6— 1 8 1 7 8 7号公報）が知られている。また本発明者らの一部も、フラボバクテリゥム（Flavobacterium) 属に属する微生物を用いて、 Lーリジンからホモグルタミン酸を製造する方法を提案した（WO 96 3 1616) 。しかしながら、これらの微生物を用いる方法においても、さらに効率よくホモグルタミン酸を製造できる方法が切望されている。

そこで、本発明者らは、上記いずれかの微生物におけるホモグルタミン酸の生産系を、例えば遺伝子操作により増強することを目差した。かような操作に際し、参考にしうる情報について概観すると、例えば、セファマィシン Cの生合成経路の研究の一端として、セファマイシン C生産菌であるストレプトマイセスクラブリゲルス（ reptomyces clavul igerus) の L—リジンから α—アミノアジピン酸（または、ホモグルタミン酸）への変換に関与するリジン一 6—ァミノトランスフヱラーゼゃ、 Δ- 1 -ピぺリジン一 6—カルボン酸デヒドロゲナーゼの存在、また、前者については、該酵素をコードする遺伝子の存在位置等が確認されている（Fuente et al.， Biochem. J. (1997) 327, 59— 64) 。また、 L—リジンのバイオアツセィに用いられているフラボパクテリゥムリュテセンス（Flavobacterium fuscum から再同定された） I F

0 3084について、下記のような経路を触媒する 2—ォキソグルタール酸 6—ァミノ卜ランスフェラーゼ [またはリジン 6—ァミノトランスフヱラーゼ（以下、 LATともいう） ] が存在することが知られて

1、る（Soda et al.， Biochemistry 7 (1968) , 4102 - 410 9，同 41 10— 41 19) 。 H-

し-リジン 2-ォキソ 2-ァミノアジ L-グルタし-△'-ビベリジンホモグルタン g ク' タレー -卜 6-セメート -6-カルボキシレ

ミアルデヒドート（P 6 C) 上記バイオアツセィでは、ピぺリジン— 6—力ルボン酸（以下、 P 6 Cともいう）を o—アミノベンズアルデヒドと反応させて得られる生成物の吸光度が測定されている。また、 L—リジンの別のバイオアツセィでは、ァグロノくクテリウムッメファシエンス (Agrobacteriuni tumefac iens) の L一リジン 6—デヒドロゲナ一ゼ活性が利用されている（Miso no et al. J. Biochem. (Tokyo) 105 (1989) , 1002— 1

008) a 上記 I F 0 3084株は、上記のごとく L—リジンのバイオアッセィに常用されており、使用方法も確立されている。したがって、該 I F 〇 3084株が L ATに加えて、 P 6 C (または、生体内では量的に平衡状態にあるといわれる 2—アミノアジピン酸セミアルデヒド）のデヒドロゲナーゼ（以下、単にデヒドロゲナーゼともいう）活性タンパク質をコードする遺伝子を有するなら、本発明の目的、すなわち、ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を提供するとの目的に沿った遺伝子クローニング用の候補菌となり得るであろう。

発明の開示

本発明者らは、フラボパクテリゥムリュテセンスのリジン一 6—ァミノトランスフヱラーゼ（LAT) 遺伝子（lat) および、場合によつて、 P 6 Cに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを試みてきた。しかし、かようなクローニング方法として、常用されている他の細菌のァミノトランスフヱラーゼとの D N Aコンセンサス配列から目的の遺伝子を取得する方法や精製されたタンパク質のァミノ酸配列を決定した結果から得られる情報を利用する方法などは、初期の研究では、いずれも失敗に帰した。

ところが、意外なことに、本発明者が、最終的に選択した宿主一べクター系を使用すれば、ショットガンクローニングにより、少なくともホモグルタミン酸の生産に関与しうる遺伝子、より具体的には P 6 Cに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子がクローニングできることを見い出した。また、かような遺伝子と一定の相同性（または同一性）を有する改変体も同様に機能することも見い出した。

一方、上記 Soda et al.， Biochemistry. 7 ( 1 9 6 8 ) 、 4 1 1 0— 4 1 1 9には、ァクロモバクターリクウダム（Achromobactor liquidum ( = Flavobacterium lutescence) カヽら分子量 1 1 6， 0 0 0の結晶 L A Tの取得方法が記載されており、そして Yagi et al.， J. Biochem. 8 7 ( 1 9 8 0 ) 、 1 3 9 5— 1 4 0 2にはフラボパクテリゥムリュテセンスからの L A Tが A、 B 1 , B ₂および Cの 4つの非同一性サブユニットから構成されていることも記載されている。これらの記述に基づき、精製された L A Tタンパク質のァミノ酸配列決定から得られた情報を利用して、 L A T活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする初期の研究は失敗に帰した。しかし、これらの先行技術文献に記載されている方法とは全く異なる方法を用い、フ 0 J ラボバクテリゥムリュテセンスから L A T活性を有するタンパク質を精製し、得られたタンパク質のアミノ酸配列決定を行い、それらの配列情報を利用して目的の遺伝子のクローニングを行ったところ、 L A Tをコ一ドする遺伝子（ 1 a t ) をクローニングすることに成功した。本発明は上記の知見に基づくものである。

したがって、本発明によれば、フラボパクテリゥムリュテセンス（ lavobacterium lutescens) に属する細菌から得ることのできるホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつホモグルタミン酸の生産能を欠損した突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体を含んでなる単離された純粋な D N Aが提供される。

より具体的には、上記ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子は、 L A T活性を有するタンパク質およびデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも 1種のタンパク質を一部にまたは全体としてコードする D N Aあるいは、それらの改変体である。本発明は、上記 D N Aを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド、さらには、該組換えプラスミドで形質転換した形質転換体、さらには該形質転換体を使用するホモグルタミン酸の生産方法にも関する。

図面の簡単な説明

図 1は、 F . J_u t e _s c e n _s の変異株によるホモグルタミン酸生産の薄層クロマトグラフィ一による分析結果を示す図である。 S tは、標準のホモグルタミン酸（H G ) であり、レーン 1〜4は第一変異株、レーン 5〜7は第二変異株、レーン 8〜 1 0は第三変異株、レーン 1 1 W

は野生型株、レーン 12および 13はブラスミド p C F 704を有する第一変異株の分析結果を、それぞれ示す。

図 2は、 . l u t e s c e n s の変異株のリジン 6—ァミノトランスフヱラーゼ（LAT) 活性のグラフ表示である。 W i 1 dは野生型株、 1 s tは第一変異株、 2 n dは第二変異株、 3 r dは第三変異株の L AT活性を示す。

図 3は、プラスミド p C F 213によるホモグルタミン酸生産性欠損変異株のホモグルタミン酸生産性の相補性を示す薄層ク口マトグラフィ一による分析の結果を示す。

H Gはホモグルタミン酸の移動位置を、 L y sは L—リジンの移動位置を示し、そして S tはホモグルタミン酸標準物質の、 1 s t p C F 2 1 3、 2 n d p C F 2 13および 3 r d p C F 2 13は、それぞれ p C F 2 13を有する第一、第二および第三変異株の培養物の、 W i I d p C F 213および W i 1 d p C F 704は、それぞれ p C F 213および p C F 704を有する野生型株の培養物の、 1 s t p C F 704および 2 n d p C F 704は、それぞれ p C F 704を有する第一および第二変異株の培養物の、ならびに 1 s t p C F 1 1 1は P C F 1 1 1を有する第一変異株の培養物の TL C分析結果である。図 4は、！：· 1 u t e s c e_n s I F 0 3084 (p C F 213) (図中、 P C F 2 1 3と表示）および . 1 u t e s c e n s I F 0 3084 (p C F 704) (図中、 p C F 704と表示）の経時的なホモグルタミン酸の生産性を示すグラフである。

図 5は、 p C F 2 13インサート領域の塩基配列に基づき見い出された OR Fの存在位置を示す図である。図 6は、実施例 2の 3 (6) における Mo n oQ HR5ノ 5カラム処理による溶出画分と相対的 L A T活性の関係を示すグラフである。図 7は、実施例 2の 3 (7) における、 L AT活性画分をマルチゲル 4/20および 10/20に対し、 Na t i v e PAGE (A) および SDS— PAGE (B) を行った結果を示す図に代わる写真である。図中、 Mは分子量マーカーであり、 Cは、実施例 2の 3 (5) で得られた限外ろ過液、数字はそれぞれ画分番号を示す。

図 8は、各種プラスミドによるホモグルタミン酸生産性欠損変異株および野生型株における相対的 L AT活性を示すグラフである。

図 9は、各種プラスミドで形質転換した . 1 u t e s c e n s I F O 3084株の経時的なホモグルタミン酸の生産性を示すグラフでめる。

発明の具体的な態様

本発明に従う遺伝子の起源としては、例えば、フラボパクテリゥムリュテセンス（以下、 ^ lutescens ともいう）を宿主として発現しうるホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を提供しうるものであれば、自然突然変異株を包含する lutescens の如何なる菌株であってもよし、。しかし、入手容易であり、培養等の好適な取り扱い条件が確立されている、上記 I F O 3084株を好ましいものとして挙げることができる。

本発明にいう、ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子とは、 L_ リジンから P 6 C (LAT活性）または P 6 Cと化学的に平衡関係にある 2—ァミノアジピン酸一 6—セミアルデヒドを経てホモグルタミン酸に至る（デヒドロゲナーゼ活性） 2段階の変換系に関与しうるいずれかの遺伝子を意味する。まず最初に、後者の変換系であるデヒドロゲナーゼ活性を有する夕ンパク質をコードする遺伝子の具体的なものとしては、本発明者らが以下のような戦略に基づいて確立した宿主一ベクター系を使用して得ることのできるものが挙げられる。

F. lutescens の遺伝子操作を行うためには、 lutescens の適当な宿主一ベクター系の確立が必要であるが、これには次の 3つの課題を解決する必要がある。

( 1) F. lutescens 内で自律複製するレプリコンを得る。

(2) F. lutescens 内で発現し、かつ機能する薬剤耐性マーカーを得る。

(3) F. lutescens 内への D N A導入法を確立する。

上記（ 1) および（2) の課題は、幸運なことに、最近 Mo Bi Tec 社より発売された、広範囲のグラム陰性細菌で自律複製し、カナマイシン、クロラムフヱニコール耐性を有する p B B R 1 22が使用できることを見い出して解決できた。上記（3) の課題解決には、まず、上記プラスミド p B B R 1 22の^;. lutescens 内への導入法が確立されることが前提になる。ところが、エレクト口ポーレーシヨン法による CO li への DNA導入法をもとに検討した結果、カナマイシン 20〃 gZ m 1を含む Lプレートに F, lutescens のコロニーが生え、これを液体培養してアル力リ S D S法によってプラスミドを抽出したところ p B B R 122は安定に ^ lutescens に保持されていることを確認できた。こうして、上記（3) の課題も解決できた。この宿主一ベクタ一系は、他のバクテリアを宿主にした場合には、（ a) 形質転換効率が非常に高く、（b) 適当な大きさの DNA断片を p B B R 122に挿入できることそれ自体は知られていたが（J. Bac. 178 ( 1996) , 1053 - 1060 ) . F. lutescensでも前述の (a) 、 (b) が可能なことを明らかにし、さらに取得した遺伝子の lutescens 内での増幅を可能にしたばかりでなく、 P 6 Cに対するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をショットガンクローニングによって取得することも可能にした。さらに操作を容易にすべく P BBR 122のク口ラムフヱニコール耐性遺伝子の代わりに pUC 19のマルチクロー二ングサイトを導入した p C F 704を作成し、これを以後べクタ一として用いた。

次に、取得または増幅した遺伝子を評価する系を確立するため、 1 utescens I F 0 3084に N—メチル一 N' —二トロ一 N—二トロソグァニジン（NTG) により突然変異を誘発させ、ェォジン Yを含む M EMプレート（pH7. 0) を用いてスクリーニングした。

こうして取得した、ホモグルタミン酸を全く生産しない第一変異株とわずかしか生産しない第二および第三変異株を取得した。このホモグルタミン酸を全く生産しない第一変異株には野生型株と同等の lat 活性が確認され、わずかしか生産しない第二および第三変異株には lat 活性がわずかしか確認されなかった。すなわち、第一変異株は lat 以外のホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子に何等かの傷害を受けており、一方第二および第三変異株には少なくとも lat に何等かの傷害を受けている可能性がある。

次に、野生型株のゲノム DN Aを SauIIIAI で部分消化し、その 6— 8Kb p断片を p CF 704の B amH I部位に挿入した D N Aライブラリーを作成した。これらを上記第一、第二および第三変異株にそれぞれ導入し、ホモグルタミン酸生産能を回復する株をスクリ一二ングした。この際、変異株のスクリ一二ングに使用したェォジン Yを含む MEMプレート（p H 7.0) で黒くなるコロニーを拾い、 TL Cでホモグルタミン酸生産能を確認するという方法を用いた。なお、これらの変異株の代表的なものとし、第二変異株 (Flavobacterium lutescens 2nd mutan t) は、平成 10年 7月 6日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号 F ERM P— 16874が付され、そして第一変異株 (Flavobacterium lutescens 1st mutant) はヽ平成 1 1年 6月 1 0日付で同研究所に寄託され、受託番号 F ERM P— 1 7419が付されて、それぞれ保管されている。これらの F E RM P - 16874 株および F ERM P— 17419株は、その後、平成 1 1年 7月 26 曰付で同研究所のブ夕ぺスト条約上の国際寄託当局に寄託が移管され、それぞれ F ERM B P— 6798および F ERM B P— 6799の受託番号で国際寄託されている。

この結果、第一変異株のホモグルタミン酸の生産性を相補するプラスミドを有する株および第二変異株のホモグルタミン酸の生産性を部分的に相補するプラスミドを有する株がそれぞれ得られた。しかし、これらの株、特に第二変異株を相補する株のプラスミドは欠失が起きやすいらしく、安定なプラスミドを取得するためのさらなるスクリ一ニングが必要であった。制限酵素処理による DNAフラグメント解析の結果、こうして得られた第一変異株を相補し、第二変異株を部分的に相補する p C F i l lと命名したプラスミドと p C F 213と命名したプラスミドは見かけ上全く同一のプラスミドであった。

一方、 p C F l l lおよび p C F 213を第一、第二および第三変異株にそれぞれ再形質転換し、ホモグルタミン酸生産能を T L Cで調べた。この結果両プラスミドとも第一変異株を相補したが、第二および第三変異株は部分的に相補しただけであった。

かような相補試験に基づき、ホモグルタミン酸の生産性が欠損した変異株のホモグルタミン酸生産能を十分に回復するプラスミドには、本発明に従う少なくともホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、より具体的には lat 以外のいずれかの遺伝子が存在することになる。

したがって、限定されるものでないが、本発明にいう「L一ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子の一つとしては、プラスミド P C F 2 1 3のインサート部分に含まれており、デヒドロゲナ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。例えば、この遺伝子は配列番号： 2に示される配列中に存在する。

一方、前者の変換に関与する、すなわち本発明に従う L A T活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子は、次のようにしてクローニングできる。

一定の培養条件下にて lutescens を培養して取得した菌体を破砕した後、破砕液を遠心分離して菌体破砕物を除去し、こうして得られる細胞抽出液から、超遠心処理、硫酸アンモニゥム沈殿、脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィ一、限外濾過、電気泳動、等を経て、目的のタンパク質を単離精製する。精製されたタンパク質の N末端ァミノ酸配列の解析結果から、 D N A プライマーを設計し、 F. lutescens ( I F 0 3 0 8 4 ) 株のゲノム D N Aに対して P C Rを行う。 P C Rで増幅された D N A断片をもとにさらに P C Rを行い、該 D N A断片の両外側の周辺領域を取得する。こうして、本発明の目的とするタンパク質をコードする DN Aが得られる。したがって、 L一ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子のもう一つとして、 LAT活性を有するタンパク質をコ一ドする DNAが提供可能になる。すなわち、本発明のもう一つの遺伝子としては、例えば、配列番号： 1に示される塩基配列のコーティング領域を構成する配列を有するものを挙げることができる。なお、対応する精製されたタンパク質の N末端は、配列番号： 1に記載されるとおり Serであるが、その上流の遺伝子にコードされる Metまでのァミノ酸配列は、翻訳後にプロセッシングを受けて除かれるものと考えられる。

さらに、本発明にいうホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を含んでなる DN Aには、上記のデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と LAT活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ 1個以上含まれている DN Aも包含される。

加えて、本発明にいう遺伝子には、上記両遺伝子の改変体であって、それぞれ両遺伝子に対して、一定のハイブリダィゼ一シヨン条件下、例えば、 60°Cで 2 X S S C (標準クェン酸食塩水）中、好ましくは 60 °Cで 0. 5 X S S C中、特に好ましくは 60°Cで 0. 2 X S S C中のストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、かつホモグルタミン酸の生産能が欠損した。 ^；. lutescens の突然異変体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体も包含される。

より具体的には、デヒドロゲナ一ゼ活性を有する夕ンパク質をコードする遺伝子の改変体は、配列番号： 2における塩基 2855〜塩基 43 87の塩基配列と少なくとも 70%の同一性を示すものであり、また、 L AT活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の改変体は、配列番号： 1における塩基 5 4 5〜塩基 2 6 5 8の塩基配列（コーディング領域）と少なくとも 5 0 %、好ましくは 7 0 %、さらに好ましくは 9 5 % の同一性を示すものである。

このような改変体は、上記両配列の、それぞれ、 5 ' 末端もしくは 3 ' 末端または途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものを含む。この塩基の一部が他の塩基により置換されている改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、上記両遺伝子と異なる塩基配列を有するものも含まれる。

遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、それぞれ、上記両遺伝子がコードする推定ァミノ酸配列を参照し、各ァミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、タンパク質全体として類似の形状を有するように、行うのがよい。こうして、改変体は、上記両遺伝子と同等の機能、すなわち、ホモグルタミン酸の生産能が欠損した lutescens の突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有するものが、相当高い確率で得られるであろう。

本発明に従う改変体は、上記両遺伝子の塩基配列またはそれらによつてコードされる推定ァミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。

本発明によれば、上記のような遺伝子または改変体を担持する、組換えプラスミドも提供することができる。かようなプラスミドは、上記遺伝子または改変体以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネ —ター配列、薬剤耐性遺伝子等を含む自律複製性であることができる。さらに、プラスミドは、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列を含め、組込み型プラスミドであることもできる。例示として、デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む D NAを担持する自律複製性の組換えプラスミドとしては、プラスミド p B BR 122や、 P B BR 122の特定の部位にマルチクローニング部位を挿入するかまたは該部位もしくは領域をマルチクローニング部位で置換し、そのマルチクローニング部位を介して上記遺伝子や改変体を挿入したものが挙げられる。このようなプラスミドの具体的なものとしては、本明細書でプラスミド p CF l l lおよび p C F 2 13と称するものを挙げることができる。 P C F 213は、平成 10年 3月 1 1日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号 F ERM P - 16699が付され、その後、上述のようにブタぺスト上の国際寄託へ移管され、 F ERM B P— 6797が付された Flavobacterium lu tescens I F 0 3084 (p C F 213) から、それ自体既知のブラスミド単離法により得ることができる。 L AT活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む DN Aを担持する組換えプラスミド、および両遺伝子を含む DN Aを担持する組換えプラスミドも、上記 p C F 21 3と同様に作成することができる。

本発明によれば、さらに、宿主としてフラボパクテリゥム属に属する細菌を、上記組換えプラスミドで形質転換して得られる形質転換体も提供される。フラボパクテリゥム属に属する宿主細菌は、本発明の目的に沿う限り、如何なる種の如何なる株であってもよいが、好ましいものとしては、 ^;. lutescens I F 0 3084および F. lutescens S P. 7 — 1 (FERM B P— 5457) を挙げることができる。したがって、上記形質転換体の具体的な一例としては、 lutescens I F 0 3084および . lutescens S P.7— 1を p C F 21 3で形質転換したものを挙げることができ、 lutescens I F 0 3084 (P CF 2 1 3) は、上記 F ERM B P— 6797で生命工学工業技術研究所の国際寄託当局に寄託されている。

本発明によれば、また、上記形質転換体を用いるホモグルタミン酸の生産方法が提供される。かような方法では、培地で培養中に増殖した形質転換体を、出発原料、 L—リジンまたは場合により、 P 6 C (もしくは 2—アミノアジピン酸一 6—セミアルデヒド）と接触させるか、あるいは増殖した形質転換体またはその処理菌体（例えば、有機溶媒処理物、菌体抽出物、固定化処理物）と接触させ、出発原料をホモグルタミン酸に変換する。

培地の炭素源としては、形質転換体の利用可能なものであれば如何なるものも使用でき、宿主として、 lutescens を用いた場合には、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、フマル酸、クェン酸等の有機酸を使用でき、これらの炭素源の培地への添加量は、通常、 0. 1〜 10重量％ (以下、％と略称する）程度とすることが望ましい。

培地の窒素源としては、例えば、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、リン酸ァンモニゥム等の無機酸ァンモニゥム塩ゃフマル酸ァンモニゥム、クェン酸アンモニゥム等の有機酸アンモニゥム塩ないし、肉ェキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼイン加水分解物等の天然窒素源を使用でき、これらの窒素源の培地への添加量は、通常、 0. 1〜 1 0 %程度とすることが望ましい。

また、無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アル力リ金属塩や塩化力リゥム、塩化ナトリウム、等の塩化アルカリ金属塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩を使用でき、これらの無機塩類の培地への添加量は、通常、 0 . 0 0 1〜 1

%程度とすることが望ましい。

これらのうち、通常の細菌用の増殖培地を用いた液体培養が好ましく、炭素源としてはグルコース、マルトース、澱粉などが、窒素源としては硫酸アンモニゥム、ペプトン、酵母エキス、大豆粉などが特に有効である。その他に、無機塩としてリン酸カリウム、硫酸マグネシゥム、食塩などが通常用いられる。

微生物の培養は、上記の培地で 2 0〜4 0 °C、好ましくは 2 8〜3 7 で p Hは 5〜9、好ましくは 6〜8で好気的条件下で実施すればよい。培養中に、上記により増殖した形質転換体と出発原料の接触は、予め培地に出発原料を加えておく力、、または培養中に出発原料を適宜加えることにより行う。また、培養終了後に、集菌した菌体または処理菌体と出発原料を培地または適当な緩衝液中で、必要により適当な補酵素等を加え、反応器中で撹拌または振盪するか、固定された菌体上に出発原料含有物を流動させることにより、上記接触を行うことができる。

培養中に形質転換体と L一リジンを接触させる場合を例に、さらに具体的に説明すると次のとおりである。培地に形質転換体を接種した後、例えば、 2 0〜4 0 °Cで 1 2〜 1 2 0時間培養することにより、形質転換体である微生物を l m 1 中に 1 0 ⁶〜 1 0 ^{1 β}個含む菌株培養液を得、その培養液に原料化合物である Lーリジンを通常、最終濃度が 0 . 5〜 3 0 m g/m 1 になるように水または補助溶剤に溶解して加えるか、または溶解せずにそのまま添加し、通常、 2 0〜4 0°Cで 1 8時間〜 7曰、好ましくは 1 8時間〜 5曰反応させ、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を用いた各種イオン交換ク口マトグラフィ一、 H P 2 0などの吸着クロマトグラフィー、溶媒や温度を利用しての沈殿化や結晶化等の通常の精製手段によりホモグルタミン酸を得ることができる。

添加する Lーリジンの形状及び添加時期については特に制限されるものではないが、溶解性などの点から一塩酸塩として用いるのが好ましく、培養開始時の添加でもよく培養途中 1〜 5曰目にも添加してもよい。本発明によれば、 L— リジンをホモグルタミン酸に変換するホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子を含む DN Aが提供される。この D N Aは、ホモグルタミン酸の微生物学的な生産方法において有用である。また、本発明によれば、ホモグルタミン酸を効率よく生産しうる形質転換体およびその使用によるホモグルタミン酸の生産方法も提供される。以下、具体例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの具体例は本発明の理解を容易にするために提供するものであって、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。

実施例 1 ：デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクロ一ニング等

1. ホモグルタミン酸非生産株の取得

F. lutescens I F 0 3 0 8 4株を L培地（ポリぺプトン 1. 0 %、酵母エキス 0. 5 %、 N a C l 0. 5 %、グルコース 0. 1 %、 p H 7. 2) 3 m l に植菌し、 3 2°Cで一晩振盪培養した。これを種菌としてその 1 0 0 1 を L培地 5 0 m 1 に植菌し、 3 2°Cで 4. 5時間振盪培養した。この培養液から菌体を 5000 x g、 10分間の遠心分離で集菌し、 0.2Mリン酸バッファ一（ρ Η6.0) で一回洗浄し、 0.2Μリン酸バッファ一（Ρ Η6.0) 6m lに懸濁した。この菌体懸濁液に 8 Omg/m 1 NTGを 50 1加え、 32 °Cで 20分間振盪培養した。この培養液から集菌した菌体を 0.2Mリン酸バッファー（P H6.0) で一回洗浄し、全量を L培地 50m 1に植菌し、 32 °Cで一晩振盪培養した。この培養液を 500 1ずつ分注し、これに 60%グリセロール溶液 500 1を加えてよく混合し、一 70°Cで凍結保存したものを変異株保存液とした。

この変異株保存液を 0.85%N a C 1で 10⁶倍希釈し、 8 c mシャ -レの MEM寒天培地 p H 7.2 (ポリぺプトン 0.5 %、酵母エキス 0. 2%、リジン一HC 1 1.0%、メチレンブルー 0.006 %、ェォジン Y0.04%、寒天 1.5%、 p H 7.2) に 100〃 1ずつ塗布し、 32 °Cで三日間培養した。生えてきたコロニーのうち白色を呈しているコロニーをスクリ一二ング培地（ポリペプトン 1.0%、酵母エキス 0. 2%、リジン一 HC 1 1.0%、 p H 7.2) 1 m 1に植菌し、 32。C で二日間振盪培養した。この培養液 3 1をシリカゲル TL Cプレートの各レーンに滴下し乾燥させた。このプレートをブタノール：酢酸：水 (3 : 1 : 1) からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色して各クレ —ン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。このようにして変異株の中から全くホモグルタミン酸を生産しない第一変異株（F ERM B P— 6799) と、ほんのわずかだけホモグルタミン酸を生産する第二変異株（F ERM B P— 6798) 、第三変異株を分離した。 L一リジンからホモグルタミン酸への変換能（またはホモグルタミン酸の生産性） O 0

を T L C分析により調べた結果を図 1に示す。なお図 1中ホモグルタミン酸は HGと表示されている（他の図においても同様）。また、これらの変換株における lat 活性の測定結果を図 2に示す。

2. 宿主一ベクター系、形質転換系の構築

F. lutescens I F 0 3084株を L培地 3 m 1に植菌し、 32てで一晩振盪培養した。これを種菌としてその 100 z lを L培地 50m l に植菌し、 32 °Cで 4.5時間振盪培養した。この培養液から菌体を 5 000 X g 10分間の遠心分離で集菌し、 10%グリセロール溶液で一回洗浄し、 10%グリセロール溶液 3 m 1に懸濁した。この懸濁液を 200 1ずつ分注し、一 70°Cで凍結保存したものをエレクトロセル保存液とした。この保存液を氷上で融解し、 Broad Host Range Vector p B B R 122 (Mo Bi Tec 社） 200〃 g /m 1 T E溶液 1 / 1を加えた。これを 0.2 cmのエレクトロキュベット（Electrocuvette) (BI0RAD 社）に入れ、ジーンパルサー（Gene Pulser) I I (BI0RAD 社）を用い 2.4KV、 200 Ω、 25 Fの条件で一回電気パルスをかけた。このセルをファルコン（Falcon) チューブに入れ、氷冷した L 培地 l m lを加え、 32°Cで 2時間振盪培養した。この培養液をカナマイシン 20 / gZm 1を含む L寒天培地（ポリペプトン 1.0 %、酵母エキス 0.5%、 N a C 1 0.5%、グルコース 0. 1 %、寒天 1.5%、 P H 7.2) に塗布し、 32°Cで三日間培養した。 2.4 x 10⁵個の形質転換株を得た。

3. プラスミド p C F 704の構築

末端に E c o R Iサイ卜と N c o Iサイトを付着したプライマーを合成（フアルマシア社）し、 Taq ポリメラーゼ（Taq polymerase) (ファルマシア社）と P C Rサ一マルサイクラ一（Thermal Cycler) PERSONAL (TaKaRa社）を用い、 p U C 18のマルチクローニングサイトとその周辺領域 95 b pを増幅した。この DN A断片を制限酵素 E c o R I と N c o Iで消化し、 P B BR 122の E c o R I、 N c o lサイトに Lig ation Kit version 2 (TaKaRa 社）を用いて連結反応した。この反応液で . coli コンビテント細胞 J M l 09 (TaKaRa 社）を形質転換して得た形質転換株から QIAGEN Plasmid Midi Kit を用いてプラスミド p C F 704を調製した。

4. プラスミド P C F 213の構築

F. lutescens I F 0 3084株のゲノム D N Aを QIAGEN Blood an d Cell Culture DNA Kit に従って抽出精製した。このゲノム DNAを制限酵素 SauIIIAIで部分分解し、その 6〜8 Kb p断片をァガロースゲルから切り出し、ウルトラフリー C 3ユニット 0.45〃 m (ミリポァ社）を用いて DN Aを回収精製し TE溶液に溶解したものをィンサート DN A溶液とした。一方、 p C F 704を制限酵素 B amH Iで消化し、アルカリ性ホスファタ一ゼで脱リン酸化した。これとインサート D N A溶液とを Ligation Kit version 2 (TaKaRa 社）を用いて連結反応したものを DN Aライブラリーとした。

この DN Aライブラリ一を第二変異株のエレクトロセル保存液に加え、電気パルスをかけた。このセルを Falcon チューブに入れ、氷冷した L 培地 l m lを加え、 32 °Cで 2時間振盪培養した。この培養液全量を力ナマイシン 20〃 gZm lを含む 50m l L培地に植菌し 32。Cで二日間振盪培養した。この培養液を 500 1ずつ分注し、これに 60%グリセロール溶液 500 ^ 1を加えてよく混合し、一 70°Cで凍結保存したものを相補株保存液とした。

この相補株保存液を 0.85%N a C 1で 10³倍希釈し、 8 cmシャ —レの MEM寒天培地 p H 7.0 (ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.

2 %、リジン一H C 1 1.0 %、メチレンブルー 0.006%、ェォジン Y0.04%、寒天 1.5%、 p H 7.0) に 100 1ずつ塗布し、

32°Cで三日間培養した。一面に生えてきた菌体のうち黒色を呈している部分を相補株混合菌体とした。この相補株混合菌体をスクリ一二ング培地 3 m lに植菌し、 32 °Cで二日間振盪培養した。この培養液 3〃 1 をシリカゲル TL Cプレー卜の各レーンに滴下し乾燥させた。このプレ一トをブタノール：酢酸：水（3 ： 1 ： 1) からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色により各レーン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。このようにしてホモグルタミン酸生産能を回復している相補株混合菌体を選び、さらにシングルコロニーに分離し、ホモグルタミン酸生産能を回復している株を選び、これらを相補株とした。これらの相補株をから QIAGEN Plasmid Midi Kit を用いて調製した一つのプラスミドを p C F 2 13とした。 p C F 2 1 3には約 6.5 Kb pのインサート DNA が挿入されていた。なお、別途得られたプラスミド p C E 1 1 1の各変異株に対する相補性と共に、上記 p CF 213の相補性を調べた結果を、図 3に示す。

5. p C F 213によるホモグルタミン酸生産能の向上

p C F 704で野生型 ^ lutescens I F 0 3084株を形質転換した株を Wild p C F 704株、 P C F 21 3で形質転換した株を Wil d p C F 2 1 3株とした。両者をカナマイシン 20〃 gZm lを含むスクリーニング培地 3m 1に植菌し、 32°Cで一晩振盪培養した。これを O 0

種菌としてその 100 1を生産培地（ポリペプトン 1.5%、酵母ェキス 0.5%、リジン— HC 1 2.0%、 pH無調整） 25m lに植菌し、 32 °Cで 24時間、 48時間、 72時間それぞれ振盪培養した。この培養液の上清中のホモグルタミン酸量を H P L Cで測定した。すなわち培養液をァミノ酸総濃度で 100 OmgZL程度になるよう蒸留水で希釈し、 50〃 1を試験管に移し減圧乾固した。ここにフヱニルイソチオシァネートとトリェチルアミンとエタノールと蒸留水を 1対 1対 7対 2で混合した溶液を 50 1加え、撹拌溶解、 10分間室温においた後減圧乾固した。これ H P L Cの移動相 Α溶液 500 1に溶解、 5 1 をインジヱクトした。 H P L C条件を下記に示した。

カラム： TSK— GEL super- 0 D S 4.6 I D x 50 mm 移動相： A溶液 140mM 酢酸ナトリウム一 0.05% トリェチルアミンを氷酢酸で pHを 6.2に調整した溶液 1000対ァセトニトリル 40

B溶液 70%ァセ卜二トリル

流速： 2.0 m 1 /m i n

溶出条件：流速一定のグラジェント、 0分から 7分まで B溶液 2 %から 40%へのリニアグラジェント、 7分以降 B溶液 100% 検出： UV254 nm

温度： 40 °C

この条件でホモグルタミン酸の保持時間は 1.3 m i n、リジンは 7. 7 m i nであった。

この結果図 4に示したように野生型 p CF 213株は野生型 p CF 7 04株の 1.5培のホモグルタミン酸生産能を有する。 W 00/0817 T/JP

6. p C F 213インサート領域の遺伝子塩基配列の決定

p C F 2 13インサート領域について ABIPRISM 377 X L D N A Sequencer (Perkin Elmer 社）を用いプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号： 2に示した。

決定された塩基配列をもとに Bibb らの方法（Gene, 30， 1 57 (1 984) ) に従ってオープンリーディングフレーム（ORF) を調べた。その結果図 5に示した OR Fを見いだした。

7. p C F 2 13インサート領域の N o t I部位約 2.5 K b pの解析 P C F 2 13インサート領域のうち制限酵素 N o t I部位約 2.5 K b p (配列番号： 2の塩基配列 2077— 4578位）について解析を行った。この No t I部位約 2. 5Kb pをァガロースゲルから切り出し、ウルトラフリー C 3ユニット 0.45 m (ミリポア社）を用いて DNAを回収精製し TE溶液に溶解し、 DNA Blunting Kit (TaKaRa 社）に従って末端を平滑化たものをィンサート DNA溶液とした。一方、 p C F 704を制限酵素 H i n c I Iで消化し、アル力リ性ホスファタ一ゼで脱リン酸化した。これとインサート DN A溶液とを Ligation Kit version 1 (TaKaRa 社）を用いて連結反応した。この反応液で ^；. lute scens I F◦ 3084株を形質転換して得た形質転換株から、 QIAGEN Plasmid Midi Kit を用いてプラスミド p C F 235を調製した。

p C F 235で形質転換した第一変異株をスクリ一ニング培地 3 m 1 に植菌し、 32°Cで二日間振盪培養した。この培養液 3 / 1をシリカゲル TL Cプレー卜の各レーンに滴下し乾燥させた。このプレートをブタノール：酢酸：水（3 ： 1 ： 1) からなる溶媒系で展開し、ニンヒドリン発色して各レーン毎にホモグルタミン酸の有無を調べた。この結果 p C F 235で形質転換した第一変異株はホモグルタミン酸生産能を回復した。

なお、 p C F 235に組み込んだ DN A配列約 2. 5 K b pには、配列番号： 2の塩基配列 28 55番目の ATGから始まり 43 8 7番目の TA Aで終わる 5 1 0アミノ酸をコードする OR Fが存在した。このァミノ酸配列を BLAST によるホモロジ一サーチにかけた結果、種々のァルデヒドデヒドロゲナーゼと高い相同性を示し、さらに最近データべ一スに登録された Streptomvces dlavuligerusのピペリジン一 6—カルボン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（J. Bac. , Vol. 180， No.17， 47 53-4756 (1998) ) と全域にわたり高い相同性を示した。 P C F 235 で形質転換した第一変異株がホモグルタミン酸生産能を回復したこと、および野生型 P C F 2 1 3株のホモグルタミン酸生産能が向上したことを考え合わせると、この OR Fがコードする蛋白質はピペリジン一 6— カルボン酸デヒドロゲナ一ゼ活性を有するものとみなせる。

実施例 2 ： L AT活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のクロ一ニング等

1. L AT活性測定

リジン一 H C 1 73mg、 2—ケトグルダール酸 59 mを、 0. 5 mMピリドキサルリン酸を含む 0. 2M リン酸緩衝液（p H 7. 3) 1 m l に溶かし、これを反応溶液とした。酵素溶液 260 β I に反応溶液 2 8. 75 1を加え、 3 2 °Cに 1時間匱いた。エタノールに溶かした 5 %トリクロロ酢酸 1 5 1. 8 1 を加えて反応を止め、それを遠心した上清 60〃 1 に 4mM 0—ァミノべンズアルデヒドを含む 0. 2 M リン酸緩衝液（p H 7. 3) 90 ^ 1 を加え 3 7°Cに 1時間置いた。これの A 465を測定し、相対的に A 465が高いフラクションを LA T活性画分とした。

2. 菌株の培養

F. lutescens I F 03084株を 32 °Cで一晩振盪培養した。これを種菌としてその 50m lを 30 1 ジャーの f 1 a v o— M9培地（N a ₂H P 0₄ 0. 6 %、 KH₂P 0₄ 0. 3 %, NH₄C 1 0. 1 %、 N a C 1 0. 2%、ポリペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 5 %、リジン一 HC 1 0. 5%、シリコーン KM75 0. 005%、 MgS 0₄ 0. 025 %^ C a C l ₂ 0. 0015 %^ pH7. 2) 10 L に植菌し、 17時間通気撹拌培養した。得られた培養液 5 Lを遠心分離 (1000 X g . 10分間）して菌体を集め、 0. 01Mリン酸緩衝液 (p H 7. 2) で 2回洗浄した。これを同緩衝液に懸濁し、菌体を超音波破砕した。遠心分離（1000 X g、 10分間）により菌体破砕物を除き、細胞抽出液を得た。これを超遠心処理（16， 000 g 90 分間）してその上清画分を以下に述べる精製操作に供した。

3. 酵素の精製

以下に示す精製操作は、特に断らない限り、全て 4°Cにて行った。

(1) 硫酸アンモニゥム分画

実施例 1で得た上清画分 600m lを硫酸アンモニゥム沈殿により精製した。 30%飽和から 80%飽和の画分にて生じた沈殿を遠心分離（1 , 000 X g、 30分間）して集め、 0. 01 Mリン酸緩衝液（p H 7. 2) に溶解し、同緩衝液に対して透析した。

(2) 脱塩

透析した酵素溶液 10m lを PD 10カラム（Araasham Pharmacia) 4本に付し 0. 5 mMピリドキサルリン酸を含む 0. 1 M T r i s _HC 1緩衝液（pH 7. 4) で溶出し、脱塩した。

(3) QAE— TOYOPEAL550Cカラムク口マトグラフィー

脱塩した酵素溶液を予め 0. 5mMピリドキサルリン酸を含む 0. 1 M T r i s— HC 1緩衝液（p H 7. 4 ) で平衡化した QAE— T0Y0P EAL550C (T0S0H) カラム（05. 5 x 6. 0 cm) に付した。同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液を用いた 2 1の塩化ナトリウムリニアグラジェント（0〜1. 0M) で溶出し、 L AT活性画分を集めた。

( 4 ) Phenyl - TOYOPERL650S力ラムクロマトグラフィー

L AT活性画分に 1 M硫酸アンモニゥムを加え、これを予め 0. 5m Mピリドキサルリン酸と 1 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 01Mリン酸緩衝液（pH 7. 2 ) で平衡化した Phenyl_TOYOPERL650S (T0S0H) カラム（05. 5 x 3. 0 c m) に付した。同緩衝液を用いた 1200 m 1の硫酸アンモニゥムグラジェント（0. 8〜0M) で溶出し、 LA T活性画分を集めた。

(5) 限外ろ過

150m lの L AT活性画分を ADVANTEC UP— 20で限外ろ過し、 15 m 1 とした。この濃縮液 2. 5m 1を PD 10カラム（Amasham P harmacia) に付し 0. 1M T r i s— H C 1緩衝液（ p H 7. 4) で溶出、脱塩した。

(6) AKTA MonoQ HR5/5カラムクロマトグラフィー

脱塩した酵素溶液 3. 5m lを予め 0. 1M T r i s _HC l緩衝液（pH 7. 4) で平衡化した AKTAexplorer 10Sシステムの MonoQ HR 5/5カラム（Amasham Pharmacia) に付した。同緩衝液で洗浄した後、 P T 同緩衝液を用いた 40m lの塩化ナトリゥムリニアグラジェント（0〜 0. 4M) で溶出し、 L AT活性画分を集めた。さらにこの L AT活性画分 5 m 1を PD10カラムで脱塩し、再度 AKTAexplorer 10Sシステムの M onoQ HR5/5カラムに付し、 LAT活性画分を集めた。各各画分と相対的 L AT活性の関係を図 6に示す。

(7) 電気泳動

L AT活性画分をマルチゲル 4 Z 20および 10Z20第一化学薬品 (株）に付し、 Native— PAGEおよび SDS— PAGEを行った結果を図 7に示した。 L AT活性画分には Native— PAGEで分子量 100000付近、 SD S— PAGEで分子量 55000付近のバンドが確認された。この SDS— PAGE で分子量 55000付近のバンドを PhastTransfer (Amasham Pharmaci a) により PVDF膜にブロッテイングした。

4. N末端ァミノ酸配列解析

プロッティングしたバンドの N末端ァミノ酸配列解析を HP G1005A Protein Sequencing System (HEWLETT PACKARD) を用いエドマン分解法により行った。この結果 N末端アミノ酸配列は

SLLAPLAPLRAHAGTRLTQG

であることが明らかになった。これに基ついて

NniaRout CCYTGIGTIARICKIGTICCIGCRTGIGCICG

NmaRin CCIGCRTGIGCICGIARIGGIGCIARIGGIGC

という DNAプライマ一をデザインし、 LA PCR in vitro cloning KIT (TaKaRa) を用いて、 lutescens I F 03084株のゲノム D N Aに対して P CRを行った。 P CR反応条件は 94°C30秒→55°C 2分→72°C 1分の 30サイクルとした。この結果、上記末端とその上流領域を含む約 400 b pの P C R増幅断片が得られた。このシークェンスをもとにその周辺領域をさらに P CRを用いて取得した。すなわち F. lutescens I F 03084株のゲノム D N Aを制限酵素 P s t Iと S a 1 Iでそれぞれ消化し、 Ligation Kit version 2 (TaKaRa 社）を用いてそれぞれ自己連結反応したものをテンプレー卜 DNAとした。このテンプレート DN Aに対し、

NIFout ttgatttgag cagattcgca ctgccattt (ac歹幡号： 3 )

NIRout aaggttttcg acaaagtgac catttccca (配歹 'J番号： 4 )

という DNAプライマーをデザインし、 LA Taq (TaKaRa) を用いて P CRを行った。 P C R反応条件は 98°C 20秒— 68°C 6分の 30サイクルとした。この結果 P s t Iテンプレートから約 2Kb p、 S a 1 I テンプレートから約 8Kb pの PC R増幅断片が得られた。これらの P C R増幅断片について ABIPRISM 377 X L DNA Sequencer (Per kin Elmer社）を用いプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号： 1に示す。

5. プラスミド p CF301、 C F 335の構築

配列表： 1の 545塩基と 2658塩基の P s t I部位をそれぞれ K ρ n I、 S a c Iに改変した D N Aプライマー

ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt (配歹 'J番号： 5 )

ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt (配列番号： 6 )

を作成し、これを用いて PCR反応を行い 1 a t遺伝子領域を増幅した。この増幅断片約 2. 1 Kb pを制限酵素 K p n I、 S a c Iで消化したものをインサート DNA溶液とした。一方、 p C F 704を制限酵素 K ρ n I、 S a c Iで消化し、これとィンサー卜 DN A溶液とを Ligatio n Kit version 2 (TaKaRa 社）を用いて連結反応したプラスミドを P C F 30 1とした。さらに p C F 301を制限酵素 K p n I、 S a c Iで消化し、その約 2. 1 Kb p断片をァガロースゲルから切り出し、これと P C F 235を制限酵素 Kp η I、 S a c Iで消化したものとを連結反応したプラスミドを p C F 335とした。

6. プラスミド P CF 301による 1 a t活性の相補

p C F 704で第二変異株を形質転換した株を 2 n d p C F 704 株、 p C F 301で第二変異株を形質転換した株を 2 n d p C F 3 0 1株とした。これらの株を 32°Cで一晩振盪培養した。これを種菌としてその 30 1を遠沈管の生産培地（ポリペプトン 1. 5%、酵母ェキス 0. 5%、リジン— HC 1 2. 0%、 pH無調整） 3m lに植菌し、 1 7時間通気撹拌培養した。得られた培養液 l m 1を遠心分離（ 1 000 > 10分間）して菌体を集め、 0. 5mMピリドキサルリン酸を含む 0. 2M リン酸緩衝液（p H 7. 3) 10m lで洗浄した。これを同緩衝液 l m 1に懸濁し、菌体を超音波破砕した。遠心分離（1 000 X g、 10分間）により菌体破砕物を除き、細胞抽出液を得た。この抽出液の 1 a t活性を測定した。この結果を図 8に示す。 p C F 3 01は第二変異株の 1 a t変異を相補した。

7. p C F 335によるホモグルタミン酸生産能の向上

p C F 704で野生型 lutescens I FO 3084株を形質転換した株を野生型 P C F 704株、プラスミド p C F 301、 p C F 33 5で形質転換した株を野生型 p C F 301株、野生型 p C F 335株とした。これらの株ををカナマイシン 20〃 g/m lを含むスクリ一ニング培地 3 m lに植菌し、 32 °Cで一晩振盪培養した。これを種菌としてその 1 00 1 を生産培地（ポリペプトン 1. 5%、酵母エキス 0. 5 %、リジン一 HC 1 2. 0%、 p H無調整） 25m l に植菌し、 32 てで24時間、 48時間、 72時間それぞれ振盪培養した。この培養液の上清中のホモグルタミン酸量を H P L Cで測定した。すなわち培養液をァミノ酸総濃度で 1 00 Omgノ L程度になるよう蒸留水で希釈し、 5 0 β \ を試験管に移し減圧乾固した。ここにフエ二ルイソチオシァネ一トとトリエチルァミンとエタノールと蒸留水を 1対 1対 7対 2で混合した溶液を 50 1加え、攪拌溶解、 1 0分間室温においた後減圧乾固した。これ H P L Cの移動相 Α溶液 500〃 1 に溶解、 5〃 1をインジヱクトした。 H P L C条件は、実施例 1の 5に記載したとおりである。この結果、図 9に示すように野生型 p C F 3 35株は野生型 p C F 7 04株の約 2倍のホモグルタミン酸生産能を有していた。

Claims

請求の範囲

1. フラボパクテリゥムリュテセンス（Flavobacteriura lutescens) に属する細菌から得ることのできる L一ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、かつ L一ホモグルタミン酸の生産能が欠損したフラボバクテリウムリュテセンスの突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体を含んでなる単離された純粋な DNA。

2. L一ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子が、 L—リジン： 2—ォキソグルタール酸 6—ァミノトランスフヱラーゼ活性を有するタンパク質およびピぺリジン一 6—力ルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも 1種のタンパク質を一部にまたは全体としてコードする DN Aである請求項 1記載の D NA。

3. L—リジン： 2—ォキソグルタレート 6—アミノトランスフヱラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAが配列番号： 1の塩基 801〜塩基 2276までの連続する塩基配列を含んでなる請求項 2 記載の DN A。

4. 配列番号： 1の塩基配列または配列番号： 1の塩基 545〜塩基

2658までの連続する塩基配列を有する請求項 3記載の DNA。

5. ピぺリジン一 6—力ルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAが、配列番号： 2の塩基 2855〜塩基 4

387まで連続する塩基配列を含んでなる請求項 2記載の DNA。

6. 配列番号： 2の塩基配列または配列番号： 2の塩基 2077〜塩基 4578までの連続する塩基配列を有する請求項 5記載の DNA。

7. 請求項 1記載の D N Aを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド。

8. 前記 DN Aが配列番号： 1の塩基 545〜塩基 2658までの連続する塩基配列およびまたは配列番号： 2の塩基 2077〜塩基 45 78までの連続する塩基配列を有する請求項 7記載の組換えプラスミド。

9. フラボパクテリゥムリュテセンス I FO 3084 (p C F 2 13) (F ERM B P— 6797) から得ることのできる請求項 7記載の組換えプラスミド。

10. 宿主としてフラボパクテリゥム属に属する細菌を請求項 7記載の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体。

1 1. フラボバクテリゥムリュテセンス（Flavobacterium lutescen s) に属する細菌から得ることのできる L _ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ L—ホモグルタミン酸の生産能が欠損したフラボバクテリゥムリュテセンスの突然変異体の該生産能を回復しうる機能を有する改変体を含んでなる単離された純粋な DN Aを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体を培地で培養し、培養中または培養後に、増殖した形質転換体を L一リジンまたは 1—ピペリジン一 6 _カルボン酸と接触させ、 L—ホモグルタミン酸に変換し、こうして生産された L—ホモグルタミン酸を回収することを特徴とする L_ホモグルタミン酸の生産方法。

12. L—ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子が、 L一リジン： 2—ォキソグルタール酸 6—ァミノトランスフヱラーゼ活性を有するタンパク質およびピぺリジン一 6 _力ルポン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも 1種のタンパク質を一部にまたは全体としてコードする DN Aである請求項 11記載の L一ホモグルタミン酸の生産方法。

13. L—リジン： 2—ォキソグルタレ一ト 6—アミノトランスフヱラ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする DN Aが配列番号： 1の塩基 801〜塩基 2276までの連続する塩基配列を含んでなる請求項 1

2記載の L一ホモグルタミン酸の生産方法。

14. ピぺリジン一 6—力ルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAが、配列番号： 2の塩基 2855〜塩基 4387まで連続する塩基配列を含んでなる請求項 12記載の L一ホモグルタミン酸の生産方法。

15. 形質転換体がフラボパクテリゥムリュテセンス I FO 30 84 (p CF 213) (F ERM BP— 6797) から得ることのできる組換えプラスミドで宿主フラボパクテリゥム属に属する細菌を形質転換したものである請求項 11記載の L一ホモグルタミン酸の生産方法。