CN1415015B - L-六氢吡啶羧酸的生物学制备方法 - Google Patents

L-六氢吡啶羧酸的生物学制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供包括利用吡咯啉-5-羧酸还原酶还原Δ1-哌啶烯-6-羧酸的步骤的L-六氢吡啶羧酸制备方法，也提供该制备过程中所用的重组细菌，以及提供L-六氢吡啶羧酸(或2-哌啶羧酸)的有效生物学制备方法。

Description

L-六氢吡啶羧酸的生物学制备方法
技术领域
本发明涉及L-六氢吡啶羧酸(或2-哌啶羧酸或L-同型脯氨酸)的制备方法以及非常适用于该制备方法的重组大肠杆菌或棒状杆菌。
背景技术
L-六氢吡啶羧酸作为药品的合成原料很重要。目前，L-六氢吡啶羧酸是通过光学拆分L-赖氨酸合成法(J.Chem.Soc.Chem.Commun.1985，633～635)或吡啶甲酸合成法制备的DL-六氢吡啶羧酸来制备(Method of Enzymol.17B，174～188，1971)。作为光学拆分方法，已知有使用D-酒石酸的非对映异构体盐法和利用猪肝D-氨基酸氧化酶分解D型异构体并保留L型异构体的酶学方法。
另一方面，已知L-六氢吡啶羧酸生成在动物(J.Biol.Chem.Vol.211，851，1954)、植物(J.Amer.Chem.Soc.Vol.74，2949，1952)或微生物(Biochemistry，Vol.1，606～612，1926；特开平6-38781号)体内，但因蓄积量少，所以利用这些生物生产L-六氢吡啶羧酸的生产方法还没有达到实用化的程度。由迄今为止对L-赖氨酸的代谢研究可知，利用赖氨酸-6-氨基转移酶(以下，也称为LAT)作用下的氨基转移反应(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)或利用L-赖氨酸-6-脱氢酶(J.Biochem.Vol.105，1002～1008，1989)，可以从L-赖氨酸生成Δ1-哌啶烯-6-羧酸(以下，也称为P6C)。
虽有报道称可以由利用氧化铂的催化加氢方法将P6C化学转化为L-六氢吡啶羧酸(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)，但还没有有关利用P6C的生物学或酶还原生成L-六氢吡啶羧酸的报道。另外，已推断恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)存在从D-赖氨酸开始经由Δ1-哌啶烯-6-羧酸生成L-六氢吡啶羧酸的代谢途径(J.Bacteriology，Vol.149，864～871，1982)。但这种生物学途径难以用在L-六氢吡啶羧酸的大规模生产中。
将上述由化学合成法制备的DL-六氢吡啶羧酸进行光学拆分的方法，使用的光学拆分剂价格高且操作繁琐，另外，在光学拆分中使用酶的方法由于需使用纯化酶，也将导致成本升高。两种方法均由于这些缺点导致工业制备方法效率低，且无法低成本制备L-六氢吡啶羧酸。
此外，以往利用微生物制备L-六氢吡啶羧酸的方法，由于蓄积量低，也难以进行实用化。
发明的公开
本发明人等这次发现，下述将Δ1-吡咯啉-6-羧酸还原为L-脯氨酸的吡咯啉-5-羧酸还原酶[EC 1.5.1.2]，
Figure S00817982419960326D000021
也可将下述P6C有效地还原为相应的L-六氢吡啶羧酸。
Figure S00817982419960326D000022
另外，还发现这种还原体系非常适合与其它生物学P6C生产体系组合使用。
本发明正是基于这些认识，通过利用吡咯啉-5-羧酸还原酶的作用，提供有效制备L-六氢吡啶羧酸的方法。
进而，本发明涉及L-六氢吡啶羧酸的制备方法，该方法包括使用吡咯啉-5-羧酸还原酶进行Δ1-哌啶烯-6-羧酸(P6C)的还原的步骤。
在本发明的优选方案中，P6C的还原步骤可与使用赖氨酸-6-氨基转移酶(LAT)将L-赖氨酸转换为P6C的转换步骤组合。
另外，本发明也涉及含有可表达状态的LAT编码基因的重组大肠杆菌或棒状杆菌。
附图的简单说明
图1是用于在大肠杆菌中由L-赖氨酸生产L-六氢吡啶羧酸的本发明相关质粒的概略图。
图2是用于在棒状杆菌中生产L-六氢吡啶羧酸的本发明相关质粒的概略图。
实施发明的最佳方案
在本发明中，称为“外来的…基因”时，不管对所提及的细胞或微生物是否为异源或同源，都是指与提及到的细胞本身不同的细胞来源的基因。
本发明中所说的吡咯啉-5-羧酸还原酶(EC 1.5.1.2；以下，也称为P5C还原酶)已知是参与由精氨酸、谷氨酸合成脯氨酸的代谢途径的酶，该酶在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的协助下，如上所示，具有将Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原成脯氨酸的活性。已知P5C还原酶广泛分布于各种细菌、植物和动物中。
可用于本发明的P5C还原酶，只要具有将P6C还原为L-六氢吡啶羧酸的活性，则对其来源没有限制。P5C还原酶的存在形式可以选自纯化物、类似细胞裂解物的调制物以及活细胞中任意一种。而使用调制物时，为了按照本发明进行还原，根据需要可使NADH或NADPH共存。
可是按照本发明，需用P5C还原酶还原的Δ1-哌啶烯-6-羧酸(P6C)，相当于在赖氨酸-6-氨基转移酶(LAT)作用下由L-赖氨酸生成的2-氨基己二酸6-半醛经非酶脱水闭环后的形式。通常，该半醛被看作是在水溶液中作为P6C的平衡混合物而存在的化合物，所以在本发明的反应体系中，P6C和该半醛可以理解为等价的化合物。因此，在本发明的反应体系中，P6C能够以P6C本身、或P6C与该半醛的混合物、或该半醛本身的形式添加，这些形式均包括在本发明中。
P6C(或2-氨基己二酸6-半醛)可以使用通过化学合成方法或生物学方法等任一方法制备的P6C，但从制备特定光学异构体L-六氢吡啶羧酸的经济角度出发，优选使用具有与L-六氢吡啶羧酸相对应立体构型(具体来说，第2位碳是不对称碳)的P6C。
按照本发明还原P6C的步骤，由在通常进行酶反应的条件下使P5C还原酶作用于P6C来实施。如上所述，P5C还原酶可以采取纯化物、类似细胞裂解物的提取物以及活细胞中任一形式作用于P6C。然而，考虑到诸如NADH或NADPH等辅酶参与该酶反应，因此优选使用细胞裂解物或活细胞本身。而作为细胞，在表现出具有将P6C转换为L-六氢吡啶羧酸(即，还原)能力的P5C还原酶活性的微生物中，可特别优选使用大肠杆菌或棒状杆菌。已知在大肠杆菌中存在着编码P5C还原酶的基因proC，而且对于proC的序列和其表达情况也已有报道(参照A.H.Deutch et al.，Nucleic Acids Research，Vol.10，1982，7701-7714)。
因此，根据本发明的优选方案，对具有P5C还原酶活性的大肠杆菌或含有可表达状态的上述基因proC的大肠杆菌或其它微生物和P6C，通过在这些微生物可生存且可产生P5C还原酶活性条件下进行温育，可以将P6C还原为L-六氢吡啶羧酸。在本说明书中，含有或整合可表达状态的特定基因是指，该基因根据需要以与启动子、调节因子相伴的形式整合在宿主细胞的染色体中，或该基因以与适当的启动子相伴整合在表达载体中的形式含在宿主细胞中。上述产生P5C还原酶活性的条件是指各个微生物能够生存的条件，优选的是处于可以增殖的培养条件下。这些条件是业内人士众所周知的条件，并且业内人士以下述实施例为参照，可以容易地进行设定。
可以将P6C直接添加到上述微生物的悬浮液或培养物中进行目的反应，但根据本发明，优选利用赖氨酸-6-氨基转移酶(LAT)，通过将容易入手的L-赖氨酸转换为P6C的转换步骤与利用上述P5C还原酶的还原步骤组合，将P6C供给到还原步骤。在这种组合中，使用大肠杆菌作为P5C还原酶源时，通常由于大肠杆菌中不存在催化L-赖氨酸转换为P6C过程的酶系，或即使存在其活性也很低，所以需将异源细胞的LAT酶系与该大肠杆菌的酶系组合。可用于这种组合中的LAT，只要具有将L-赖氨酸转换为P6C的活性，则对其来源没有限制，例如优选泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)的LAT。作为该微生物的典型代表，例如已知IFO 3084株通常可用于L-赖氨酸的生物分析，并具有LAT活性(Soda et al.，Biochemistry Vol.7，4102-4109，1968；同4110-4119)。此外，一定的泥色黄杆菌因其本身具有的Δ1-哌啶烯-6-羧酸脱氢酶作用，具有将P6C氧化至α-氨基己二酸的能力(Biochem J.Vol.327，59-64，1977)。再者，在P5C还原酶或P6C还原酶活性作用下由P6C生成的L-六氢吡啶羧酸，还有可能通过某些代谢途径转换为其它化合物。因此，通常使用该细菌的酶系时，不能将L-赖氨酸转换为L-六氢吡啶羧酸，而即使发生转换，有时也不蓄积L-六氢吡啶羧酸。所以，为了达到本发明的目的，优选象上述那样对异源细胞(或微生物)间的酶系进行组合。作为这种酶系组合的微生物没有限定，如在上述大肠杆菌中以可表达的形式整合编码泥色黄杆菌LAT的lat基因，反之，将大肠杆菌的proC基因整合到泥色黄杆菌，另外，为了本发明的其它目的，还可同时将lat和proC以可表达形式整合到可适用的宿主微生物中。各个基因向宿主的整合可以通过重组质粒导入，或者是以可直接表达的方式整合到宿主的染色体中。而以泥色黄杆菌作为宿主时，由于该微生物可通过代谢途径将生成的L-六氢吡啶羧酸进一步代谢，所以根据需要也可以使用将有关代谢途径封闭的变异株。按照本发明，从酶系的稳定性、处理的容易程度、转换效率高等观点出发，适于将L-赖氨酸转换为L-六氢吡啶羧酸的酶系使用大肠杆菌(根据情况，也可成为proC的供给源)作宿主，适于使用的是在该宿主中至少整合了泥色黄杆菌的lat而构建的重组子。另外，使用大肠杆菌作为宿主时，除了lat以外也可以整合外来的proC基因，特别是为了使作为起始原料的L-赖氨酸容易被吸收进菌体内，优选整合编码外来大肠杆菌的赖氨酸特异摄入(或透过)酶的基因(也称为与赖氨酸的吸收有关的基因)。作为这种基因的代表性例子没有限定，如编码赖氨酸特异性通透酶的基因(lysP)和构成参与赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸摄入的LAO系统的蛋白质的编码基因(argT、hisP及hisQ)。例如J.Bacteriol.，Vol.174，3242-3249，1992中报道通过多拷贝质粒导入lysP的大肠杆菌，其赖氨酸的摄入速度上升了20多倍。
如上所述，可应用在本发明中的酶系或基因的组合体系，其本身可依据业内人士常用的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA相关技术进行构建或制作。这样的技术例如可参照Sambrook，Fritsch和Maniatis编著的《分子克隆实验指南》第二版(冷泉港实验室出版，1989)；《DNA克隆》卷I和II(D.N.Glover编著，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编著，1984)；Mullis等的美国专利第4683195号，《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编著，1984)等。
关于本发明中特别优选使用的酶系或微生物的构建乃至制作，以及关于使用大肠杆菌(以下，略作E.coli)作为宿主的内容，在以下进行具体的说明，但本发明并不限定于此。
宿主和载体系统
可以适当使用各种市售的宿主和载体，这里，例如作为宿主可以使用大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL21或大肠杆菌C600株，作为载体可以使用pET系列或pUC系列。除此之外的载体，优选使用通商产业省“重组DNA技术工业化指南”指南第二章第三2.(2)中所述的相应载体。
Lat基因的克隆和表达
利用疏水色谱、离子交换色谱、凝胶排阻色谱从泥色黄杆菌IFO3084株的培养上清纯化出LAT。通过使用邻氨基苯甲醛的生色法(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)测定LAT的酶活性。纯化LAT的N末端氨基酸序列测定为KLLAPLAPLRAHAGTRLTQGL，根据该氨基酸序列设计混合引物，通过PCR从泥色黄杆菌IFO 3084株的基因组DNA中扩增lat的DNA片段，再以得到的DNA片段作为基础，通过反PCR法获得由大约1.6kb构成的lat全长基因。lat的DNA序列和LAT的氨基酸序列如序列号1所示。另外，如有必要的话，有关lat基因克隆的详细情况可以参照与本申请同时申请的国际申请PCT/J99/04197。
根据确定的lat基因碱基序列，制作将lat基因的N末端ATG附近改变为NdeI位点的正向DNA引物(序列号2)以及终止密码下游改变为BamHI的反向DNA引物(序列号3)，
ETlaNdeF：TCCATATGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGCCC
ETlaBamR：GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG
利用这些引物进行PCR反应，扩增出lat基因区的约1.6kbp片段。将该扩增片段用限制性酶NdeI和BamHI进行消化，得到的产物作为插入DNA溶液。另外，用限制性酶NdeI和BamHI对表达载体pET11a(Novagen公司生产)进行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生产)将消化的载体与插入DNA溶液连接构建质粒，该质粒命名为pET1at。pET1at是按可表达天然LAT蛋白质而进行设计的质粒。用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化的菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)pET1at株。
用pUC19替代表达载体pET11a，并且使用宿主大肠杆菌BL21株时，根据上述lat基因的碱基序列，制作将lat基因的N末端ATG附近改变为HindIII位点的正向DNA引物(序列号4)以及终止密码下游改变为BamHI的反向DNA引物(序列号3)，
lathiF19：ATAAGCTTGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGC
ETlaBamR：GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG
利用这些引物进行PCR反应，扩增lat基因区的约1.6kbp的片段。将该扩增片段用限制性酶HindIII和BamHI进行消化，得到的产物作为插入DNA溶液。另外，用HindIII和BamHI对载体pUC19进行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生产)将消化的载体与插入DNA溶液连接构建质粒，该质粒命名为pUC1at(参照图1)。
pUC1at是按可表达LacZ-LAT融合蛋白而进行设计的质粒。用该质粒转化大肠杆菌BL21，转化的菌株命名为大肠杆菌BL21 pUC1at株。
用添加了L-赖氨酸的培养基(细菌用胰化蛋白胨1.5％，酵母提取物3.0％，甘油0.5％，pH7.0)分别对大肠杆菌BL21(DE3)pET1at株和大肠杆菌BL21pUC1at株进行培养时，在各自培养基中可以看到有L-六氢吡啶羧酸的蓄积。这意味着在作为宿主的大肠杆菌中存在着还原通过LAT的氨基转移反应由L-赖氨酸生成的P6C的酶。
对该P6C还原酶进行了研究。从大肠杆菌总基因组的基因信息推测P5C还原酶也可使P6C还原，进而利用作为proC缺失株的proC32变异株大肠杆菌RK4904株(从耶鲁大学的E.coli Genetic Stock Center获得)，对proC在L-六氢吡啶羧酸生产中的作用进行了研究。首先，为了研究proC(参照序列号5)的效果，尝试了将proC导入到pUClat中。制作可扩增末端附加KpnI位点且含有proC的约1.5kbp片段的DNA引物(序列号6和7)，
procKpnF：AGGGTACCATAAAATCGCGCATCGTCAGGC
procKpnR：CCGGTACCGCCACAGGTAACTTTACGGATT
利用引物进行PCR反应。约1.5kbp的该扩增片段经限制性酶KpnI消化的产物作为插入DNA溶液。另外，用限制性酶KpnI对pUClat进行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生产)对消化的载体与插入DNA溶液进行连接反应。Lat和proC相互正向连接的质粒命名为pUClatproC。
用该质粒对大肠杆菌RK4904进行转化，转化的菌株命名为大肠杆菌RK4904pUClatproC菌株。再制作只负载proC的质粒。即，用限制性酶BamHI和HindIII对pUClatproC进行消化，然后用Blunting Kit(TaKaRa生产)进行平末端化，将自身连接的质粒命名为pUCproC。用该质粒对大肠杆菌RK4904进行转化，转化的菌株命名为大肠杆菌RK4904pUCproC株。利用由此构建的大肠杆菌RK4904pUC19株、大肠杆菌RK4904pUClat株、大肠杆菌RK4904pUCproC株、以及大肠杆菌RK4904pUClatproC株进行L-六氢吡啶羧酸的生产实验，结果只在大肠杆菌RK4904pUClatproC株中发现有L-六氢吡啶羧酸的蓄积，而在其它菌株中没有发现L-六氢吡啶羧酸的生产。
该结果表明，lat和proC两者在大肠杆菌内进行表达时才能促使L-六氢吡啶羧酸的生产，而且作为proC编码的蛋白质P5C还原酶也可使P6C还原。据本发明人等的了解，迄今为止的文献中还未报道过还原P6C的酶，而本说明书是第一次对此进行报道。
lysP基因的克隆以及与lat基因同时整合
根据上述J.Bacteriol.，vol.174，3242-3249，1992的文献，赖氨酸向大肠杆菌内的掺入速度有可能成为利用大肠杆菌生产L-六氢吡啶羧酸时生产速度的限速步骤。因此，以下尝试了将赖氨酸特异性通透酶的编码基因lysP导入到质粒pETlat中。根据大肠杆菌lysP的基因序列信息(参照序列号8)，制作可扩增末端附加Bg1II、BamHI位点且含有lysP的约2.2kbp片段的DNA引物(序列号9和10)，
lysPBgBmF：TGAGATCTGGATCCTGCGTGAACGCGGTTC
lysPBgBmR：GCAGATCTGGATCCCAGAAAGCCGGAACAG
利用上述引物进行PCR反应并克隆lysP。约2.2kbp的该扩增片段经限制性酶Bg1II消化的产物作为插入DNA溶液。另外，用限制性酶Bg1II对pETlat进行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生产)对消化的载体与插入DNA溶液进行连接反应。这样构建的Lat和lysP相互反向连接的质粒命名为pETlatlysP，用该质粒对大肠杆菌BL21(DE3)进行转化，转化后的菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP株。用该大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP株和其他用预先制作的pETlat转化的大肠杆菌BL21(DE3)pETlat株进行L-六氢吡啶羧酸的生产试验，结果可以确认大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP株生产的L-六氢吡啶羧酸比大肠杆菌BL21(DE3)pETlat株多3倍。
约2.2kbp的上述扩增片段经限制性酶BamHI消化的产物作为插入DNA溶液。另外，用限制性酶BamHI对pUClat进行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生产)对消化的载体与插入DNA溶液进行连接反应。这样构建的Lat和lysP相互正向连接的质粒命名为pUClatlysP(参照图1)，用该质粒对大肠杆菌BL21进行转化，转化后的菌株命名为大肠杆菌BL21pUClatlysP株。用该大肠杆菌BL21pUClatlysP株和大肠杆菌BL21pUClat株进行L-六氢吡啶羧酸的生产试验，结果可以确认大肠杆菌BL21pUClatlysP株生产的L-六氢吡啶羧酸比大肠杆菌BL21pUClat株多3倍。所以，用大肠杆菌作为宿主时，有希望增强lysP基因的表达。本发明的大肠杆菌BL21pUClatlysP于1999年12月20日委托日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号的通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所进行保藏，保藏号为FERM P-17681，随后根据布达佩斯条约的规定，上述保藏移交到该研究所的国际保藏单位，保藏号为FERM BP-7326。
yeiE基因的导入
为了提高BL21pUClatlysP株的L-六氢吡啶羧酸生产能力，尝试了进一步提高lysP活性。通过大肠杆菌基因组计划，已明确了lysP周围区域的DNA序列。根据该DNA序列，可知在lysP的上游存在着与lysP串联排列的基因yeiE(参照序列号11)。由yeiE的氨基酸序列可知yeiE是细菌中较为保守的lysR型转录调节序列。可以推测该yeiE调控lysP的转录，所以通过将yeiE和lysP一起搭载到质粒上，预计可使lysP的转录量增大，L-赖氨酸的摄入能力上升，L-六氢吡啶羧酸的生产能力提高。
该质粒pUClatlysPL构建过程如下。利用末端附加Bg1II位点的正向DNA引物(序列号12)以及末端附加kpnI位点的反向DNA引物(序列号13)进行PCR反应，
ATAGATCTCTTGTTGCCTAAAACCATCCCCAA
GTGGTACCCCCCAGAAAGCCGGAACAGCCTC
扩增含有yeiE和lysP的约1.5kbp片段。该扩增片段经限制性酶Bg1II和kpnI消化的产物作为插入DNA。另外，用限制性酶BamHI和kpnI对pUClatlysP进行消化，然后使用Ligation Kitversion2(TaKaRa公司生产)对消化的载体与插入DNA进行连接反应，连接后的质粒命名为pUClatlysPL(参照图1)。用该质粒转化大肠杆菌BL21，转化后的菌株命名为大肠杆菌BL21pUClatlysPL株。
argT基因的克隆和导入
已知lysP在赖氨酸浓度高时其表达被抑制，而赖氨酸浓度低时受到诱导(J.Bacteriol.Vol.178，5522-5528，1996)。所以，谋划了导入参与赖氨酸向细胞内掺入的基因。目前，已知在大肠杆菌中存在着使赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸进入菌体内的系统(LAO系统)(Jounal ofBiological Chemistry，Vol.265，p1783-1786，1990)。而通过基因组计划阐明的大肠杆菌的基因argT，由于与已明确在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中参与LAO系统(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.78，p6038-6042，1981)的argT有很高的同源性，所以可以预料大肠杆菌的argT参与赖氨酸摄入过程的可能性很高。
因此为了研究argT的效果，如下所述，构建了搭载lat和argT的质粒pUClatargT。
argTkpnF：TCGGTACCTCGACATTTTGTTTCTGCC
argTkpnR：ATGGTACCATAAAATTGACCATCAAGG
使用以上两个引物(序列号14和15)，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增argT。PCR反应条件是将98℃20秒、60℃30秒、68℃1分钟作为一个循环，共进行25个循环。约1.5kbp的该扩增片段用限制性酶KpnI消化，导入到pUClatlysPL的KpnI位点。在所得质粒的ScaI位点导入四环素抗性基因。即，以pBR322为模板，用末端附加了ScaI位点的引物(序列号16和17)，通过PCR反应扩增四环素抗性基因。
TetF：TTAGTACTCTTATCATCGATAAGCTTTAAT
TetR：GCAGTACTACAGTTCTCCGCAAGAATTGAT
扩增片段导入存在于pUClatlysPL的氨苄青霉素抗性基因内的ScaI位点，将该质粒命名为pUClatlysPLargT-tet。而导入该质粒的大肠杆菌BL21株命名为大肠杆菌BL21pUClatlysPLargT-tet。argT的DNA序列和氨基酸序列如序列号18所示。
棒状杆菌中的lat转化株的构建和表达
如上所述，利用表达lat的大肠杆菌，并通过由L-赖氨酸向L-六氢吡啶羧酸的转换反应，可以确立L-六氢吡啶羧酸的生产体系。已知在该重组大肠杆菌体系中，赖氨酸向菌体内的掺入过程有时可能是六氢吡啶羧酸生产的限速步骤，所以希望提供不向培养液中添加L-赖氨酸，而是由细菌自身生产L-赖氨酸后，再转换为六氢吡啶羧酸的六氢吡啶羧酸直接生产菌。这种愿望可以按照如下所述的策略来实施。L-赖氨酸可以通过谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)大量发酵生产。因此，如果可将lat插入到已确立为谷氨酸棒杆菌载体体系的pC2质粒(PLASMID，Vol.36，62-66，1996)，并导入谷氨酸棒杆菌ATCC31831后表达lat，则可以将在菌体内生物合成的L-赖氨酸转换为P6C，进而通过谷氨酸棒杆菌基因组中编码的proC表达生产的吡咯啉-5-羧酸还原酶，就可将P6C转换为六氢吡啶羧酸。这种策略的有效性例如可以通过以下的实验进行确认。
使用上述pC2质粒，如下所述，构建了lat表达质粒pClat。
ClatBamF：GGGGTACCCATGTCCCTTCTTGCCCCGCT
ClatBamR：GGGGATCCCGCGGCCTGTTGCCGCTGGT
使用以上两个引物(序列号19和20)，以泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增lat。PCR反应条件是将98℃20秒、68℃2分钟作为一个循环，共进行25个循环。约1.5kbp的该扩增片段用kpnI和BamHI消化，然后与pC2的kpnI、BamHI位点连接(图2)。利用在大肠杆菌JM109中导入了该质粒pClat的菌株，进行由L-赖氨酸向六氢吡啶羧酸的转换反应，即可确认具有LAT活性。
接下来用pClat对谷氨酸棒杆菌进行转化。例如，将谷氨酸棒杆菌接种在3ml的L培养基上，于32℃振荡培养17小时。将该培养液30μl接种到3ml的L培养基上，于32℃振荡培养2.5小时。向培养液中加入1.5μl青霉素G钾溶液(2mg/ml)，再振荡培养1.5小时。从全部培养液中收集菌体，用10％甘油溶液5ml洗涤后，悬浮于10％甘油溶液700μl中，该悬浮液作为电穿孔液。向200μl电穿孔液中加入0.5μl溶解在TE溶液中的质粒(200μg/ml)，于12.5kV/cm、25uF、200Ω条件下进行电穿孔。加入1ml L培养基，于32℃振荡培养2小时后，涂在含有卡那霉素(10μg/ml)的平板上，于32℃培养3天，通过筛选出现的菌落可以得到目的转化株。
在本说明书中，棒状(coryneform)杆菌典型的是属于棒状杆菌属(Corynebacterium)并生产L-赖氨酸的细菌，但只要符合本发明目的，无论属于哪一种均可在本发明中加以应用。
上述各基因或DNA序列的改变体
根据本发明，对于编码上述各个酶的基因或DNA，只要是在严格条件下分别与这些序列(例如参照序列号1、序列号5、序列号8、序列号11和序列号18)杂交，并通过它们的表达而生产的多肽具有各自目的酶活性的话，任意一种改变体均可包含在本发明中所提到的赖氨酸-6-氨基转移酶编码基因、吡咯啉-5-羧酸还原酶编码基因、赖氨酸特异性摄入酶编码基因以及lysP转录调节基因中。
对于严格条件业内人士众所周知，例如上述Sambrook等的9.31～9.62页中所述的条件。这些改变体以缺失或附加一个或一个以上的被认为对各种目的酶活性非必需的或者不会带来坏影响的氨基酸残基，或者在具有类似侧链的氨基酸残基之间相互进行置换，例如在具有碱性侧链(赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸等)、中性侧链(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等)、非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸等)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸等)的氨基酸残基之间进行置换作为指标，通过其本身已知的点突变、部位特异性诱变法等或化学合成法等制备。另外，将这种基因导入宿主细胞或进行转化，可以按照上述操作或业内人士众所周知的方法进行。
另外，生成的六氢吡啶羧酸是否是L型的确认，可以通过使用手性柱的HPLC法(Agric.Biol.Chem.，Vol.52，1113～1116，1988)进行。柱子用DAICEL CHIRAL PAK WH(4.6×250mm，DAICEL生产)，流动相用0.25mM硫酸铜水溶液，柱温为50℃、流速为1.0ml/分钟、检测在UV243nm进行。在该HPLC条件下，D型六氢吡啶羧酸的保留时间为11.5分钟，L型六氢吡啶羧酸的保留时间为15分钟。对通过本发明的重组大肠杆菌生产的六氢吡啶羧酸进行分析，结果表明生产的六氢吡啶羧酸的上述保留时间为15分钟。
实施例
以下，结合实施例更具体地说明本发明。
实施例中的L-六氢吡啶羧酸的定量是在进行丹磺酰化后，以脯氨酸作为内标，通过高速液相色谱(以下，略为HPLC)进行定量。即，用蒸馏水将培养上清稀释100倍，将其中的10μl移到eppendorf管中，然后向其中加入200μl含有5μg/ml脯氨酸的40mM碳酸锂缓冲液(pH9.5)和100μl溶解在乙腈中的3.0mg/ml的丹磺酰氯，搅拌并于室温、暗处反应2小时。加10μl的2％甲胺盐酸盐后进行搅拌，其上清作为分析样品。HPLC分析条件如下：柱子用YMC-Pack ODS-AA-303(4.6×250mm，YMC生产)，流动相用含有0.003M L-脯氨酸、0.0015M硫酸铜、0.0039M乙酸铵的33.2％乙腈溶液(用氨水将pH调至7)，流速为0.8ml/分钟，室温，检测用激发波长366nm、荧光510nm进行。在这种条件下，L-六氢吡啶羧酸的保留时间为13分钟。
实施例1
对大肠杆菌BL21pUClatlysP(FERM BP-7326)株、大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP株、大肠杆菌C600pUClatlysP株和大肠杆菌BL21pUClatlysPL株进行L-六氢吡啶羧酸的生产试验。将各个菌株分别接种于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素钠的L培养基(聚胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.2)中，于32℃振荡培养过夜。将这些作为种菌，各取275μl接种于27.5ml含有氨苄青霉素钠100μg/ml的TB培养基(甘油0.44％，细菌用胰化蛋白胨1.33％，细菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)中，分别于32℃振荡培养4.5小时。另外，对于使用大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP等pET型载体的微生物的培养，为了诱导lat，加入100mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)275μl，再于32℃振荡培养4小时。相对于此，使用pUC型载体时不用添加IPTG。向上述培养液中分别加入50％L-赖氨酸盐酸盐500μl和溶解在磷酸缓冲液(pH6.8)中的50％甘油250μl，继续于32℃振荡培养。于添加L-赖氨酸盐酸盐后的15小时、39小时、63小时、87小时、120小时、159小时再添加50％L-赖氨酸盐酸盐500μl和溶解在磷酸缓冲液(pH6.8)中的50％甘油250μl。于15小时、39小时、63小时、87小时、120小时、159小时、207小时取100μl样品，用HPLC对L-六氢吡啶羧酸进行定量。定量结果表明，各菌株在培养液中蓄积的L-六氢吡啶羧酸的浓度如下：
大肠杆菌BL21pUClatlysP         10g/l
大肠杆菌BL21(DE3)pETlatlysP    26g/l
大肠杆菌C600pUClatlysP         0.8g/l
大肠杆菌BL21pUClatlysPL        15g/l
实施例2
为了阐明P5C还原酶在L-六氢吡啶羧酸生产中的作用，对以proC缺失株大肠杆菌RK4904株作为宿主的重组菌株大肠杆菌RK4904pUC19株、大肠杆菌RK4904pUClat株、大肠杆菌RK4904pUCproC株、以及大肠杆菌RK4904pUClatproC株进行了L-六氢吡啶羧酸生产性能的研究。将各个菌株分别接种于3ml含有氨苄青霉素钠50μg/ml的L培养基(聚胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.2)中，于32℃振荡培养过夜。将这些作为种菌，各取275μl接种于27.5ml含有氨苄青霉素钠50μg/ml的TB培养基(甘油0.44％，细菌用胰化蛋白胨1.33％，细菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)中，分别于32℃振荡培养8小时。向上述培养液中分别加入50％L-赖氨酸盐酸盐500μl和溶解在磷酸缓冲液(pH6.8)中的50％甘油500μl，继续于32℃振荡培养。于40小时时取100μl样品，用HPLC对L-六氢吡啶羧酸进行定量。定量结果表明，只有大肠杆菌RK4904pUClatproC菌株蓄积了0.765g/l的L-六氢吡啶羧酸，而在其它菌株中没有看到六氢吡啶羧酸蓄积。
实施例3
使用大肠杆菌C600pUClatlysP株对培养基的碳源进行研究。使用培养基组成中用各种碳源替换TB培养基(甘油0.44％，细菌用胰化蛋白胨1.33％，细菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)的甘油的培养基。对于作为碳源的甘油、丙酮酸钠、柠檬酸、丙酸、马来酸、乳酸、DL-苹果酸进行了研究。向250ml体积的三角烧瓶中加入25ml的培养基，于32℃进行振荡培养。培养24小时时的L-六氢吡啶羧酸的蓄积量分别为4.8g/l、3.3g/l、2.8g/l、2.6g/l、3.5g/l、4.7g/l、4.7g/l。表明在本发明中作为碳源也可以使用有机酸。
实施例4由菌体破碎物生产L-六氢吡啶羧酸
将大肠杆菌RK4904pUC19株、大肠杆菌RK4904pUClat株、大肠杆菌RK4904pUCproC株、以及大肠杆菌RK4904pUClatproC株分别接种于3ml含有氨苄青霉素钠50μg/ml的L培养基中，于32℃振荡培养过夜。将这些作为种菌，各取275μl接种于50ml的含有氨苄青霉素钠50μg/ml的L培养基中，于32℃振荡培养8小时。对该培养液进行离心，用0.85％NaCl洗涤菌体，将加了2ml BugBuster(Novagen)的上清作为菌体破碎液。向这些菌体破碎液100μl中加入1ml含有L-赖氨酸-HCl 20μmol、2-酮戊二酸20μmol、磷酸吡哆醇0.075μmol、以及β-NAD+200μmol的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2)，于32℃放置15小时。将这些反应液5μl点到TLC板上(Merck Art.13143)，用展开液(1-丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1)展开后，进行茚三酮显色。结果可以确认，只有在大肠杆菌RK4904pUClatproC株菌体破碎液中出现了L-六氢吡啶羧酸斑点。这表明通过在质粒上编码的lat基因生成的LAT和由proC生成的吡咯啉-5-羧酸还原酶，即使在试管反应中也能够生产L-六氢吡啶羧酸。
实施例5
与pUClatlysPLargT-tet同样，构建在pUClatlysPL的ScaI位点导入了四环素抗性基因的质粒pUClatlysPL-tet，并进行如下的转换反应。
将大肠杆菌BL21pUClatlysPLargT-tet株和大肠杆菌BL21pUClatlysPL-tet株的冷冻种菌接种于含有25μg/ml四环素的L培养基(3ml/离心沉淀管)中，于32℃在旋转振荡器上培养18小时。将500μl这些种菌接种于含有25μg/ml四环素的TB培养基(27.5ml/离心沉淀管)中，于32℃在旋转振荡器上培养24小时，培养结束时660nm处的OD值分别为3.98和9.38。从各培养液分别取4.71ml和2.00ml，通过离心分离回收菌体，向回收的菌体中加入25mM磷酸缓冲液(pH6.8)1ml，再添加20％L-赖氨酸溶液20μl、20％甘油20μl，于32℃开始转换反应。并于反应开始2小时后、7小时后、24小时后分别取100μl样品，用HPLC对六氢吡啶羧酸和赖氨酸的量进行定量。
转换反应2小时后、7小时、24小时时的六氢吡啶羧酸的蓄积量，大肠杆菌BL21pUClatlysPLargT-tet株分别为0.36g/l、0.73g/l、2.0g/l，相对于此，大肠杆菌BL21pUClatlysPL-tet株则分别为0.88g/l、1.3g/l、1.4g/l。可以看出，大肠杆菌BL21pUClatlysPL-tet株的六氢吡啶羧酸生产速度渐渐变得缓慢，与此相对，大肠杆菌BL21pUClatlysPLargT-tet株的六氢吡啶羧酸生产速度虽然在起始时不太好，但能维持大致一定的六氢吡啶羧酸生产速度。该六氢吡啶羧酸生产速度完全对应于赖氨酸的减少速度。由该实验结果可以确认argT基因在六氢吡啶羧酸生产中的效果。
实施例6
进行棒状杆菌的lat转化株谷氨酸棒杆菌ATCC31831pClat株的培养试验。作为对照，对携有没有插入lat的质粒的谷氨酸棒杆菌ATCC31831pC2株也进行同样的试验。将两个菌株的琼脂平板上的菌落分别接种到装有3ml含有20μg/ml卡那霉素的L培养基的试管中，于32℃在旋转振荡器上培养18小时。将275μl所得培养液分别接种于装有27.5ml含有20μg/ml卡那霉素的TB培养基的250ml体积的三角烧瓶中，于32℃在旋转振荡器上进行正式培养，并于培养开始后5、15、39、63小时分别添加550μl溶解于磷酸缓冲液(pH6.8)的50％甘油。在添加甘油开始起135小时后终止培养，用HPLC对培养上清中的六氢吡啶羧酸进行定量。结果表明，谷氨酸棒杆菌ATCC31831pClat株在添加最初的甘油后135小时蓄积了大约0.7g/l的六氢吡啶羧酸。另外，对照谷氨酸棒杆菌ATCC31831pC2株中没有看到有六氢吡啶羧酸的生产。这表明即使在棒状杆菌中通过质粒导入的lat基因也可进行表达，以及棒状杆菌的吡咯啉-5-羧酸还原酶(基因proC)可以将通过LAT并由赖氨酸转换的P6C还原为六氢吡啶羧酸。
Figure IYZ000004141370700021
Figure IYZ000004141370700031
Figure IYZ000004141370700041
Figure IYZ000004141370700051
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Figure IYZ000004141370700071
Figure IYZ000004141370700081
Figure IYZ000004141370700091
Figure IYZ000004141370700101
Figure IYZ000004141370700111
Figure IYZ000004141370700131
Figure IYZ000004141370700151
Figure IYZ000004141370700161
Figure IYZ000004141370700171
Figure IYZ000004141370700181
Figure IYZ000004141370700191
Figure IYZ000004141370700211
Figure IYZ000004141370700221
Figure IYZ000004141370700231

Claims (5)

1.一种重组大肠杆菌或棒状杆菌，其特征在于，含有可表达状态的、赖氨酸-6-氨基转移酶编码基因和吡咯啉-5-羧酸还原酶编码基因，其中，所述的大肠杆菌不包括大肠杆菌RK4904。
2.权利要求1所述的重组大肠杆菌或棒状杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌或棒状杆菌至少含有一种可表达状态的、选自外来的吡咯啉-5-羧酸还原酶编码基因和外来的参与赖氨酸摄入的基因中的基因。
3.权利要求2所述的重组大肠杆菌或棒状杆菌，其特征在于，所述的参与赖氨酸摄入的基因是赖氨酸特异性通透酶编码基因。
4.权利要求2所述的重组大肠杆菌或棒状杆菌，其特征在于，所述的参与赖氨酸摄入的基因是赖氨酸特异性通透酶编码基因，并且在其上游还含有串联排列的转录调节因子的编码序列。
5.一种制备L-六氢吡啶羧酸的方法，该方法包括在含有L-赖氨酸的培养基中培养权利要求1～4任一项所述的重组大肠杆菌或棒状杆菌，然后提取蓄积在培养物中的L-六氢吡啶羧酸的步骤。
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