KR100320038B1

KR100320038B1 - 로도코커스 로도크로스(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ) Ｍ33 ＶＫＭＡｃ-1515Ｄ로부터유래된 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자 및 이유전자를 함유한 형질전환체

Info

Publication number: KR100320038B1
Application number: KR19990051474A
Authority: KR
Inventors: 이현환; 현형환
Original assignee: 이상현; 동서석유화학주식회사
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2002-02-01
Also published as: KR20010047310A

Abstract

본 발명은 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) M33 VKM Ac-1515D로부터 유래된 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 신규한 유전자 단편, 이것을 포함하는 재조합벡터, 재조합벡터에 의하여 제작된 대장균 형질전환체와 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) 형질전환체 및 이들 형질전환체를 이용하여 아미드류를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

로도코커스 로도크로스(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ) Ｍ33 ＶＫＭＡｃ-1515Ｄ로부터 유래된 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자 및 이 유전자를 함유한 형질전환체{Gene coding for nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous M33 VKM Ac-1515D and transformant containing the same}

본 발명은 신규한 유전자에 관한 것이며, 보다 상세하게는 니트릴 히드라타제 효소를 코딩하는 신규한 유전자, 이를 함유하는 형질전환체 및 이 형질전환체를 이용하여 니트릴로부터 아미드류를 제조하는 방법에 관한 것이다.

니트릴 히드라타제 효소는 니트릴에서 아미드로의 전환을 촉진시키는 효소로서 기존의 구리를 촉매로 사용하는 화학공정과 비교하여 니트릴 히드라타제를 이용한 생물학적 제조공정은 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드의 전환율이 높아서(99.9%) 미반응 아크릴로니트릴을 분리하는 공정이 요구되지 않으며 고온, 고압이나 불활성 분위기를 요구하지 않으므로 장치가 간단하고 조작운전의 안정성이 높은 장점이 있다.

니트릴 히드라타제의 활성을 갖는 미생물은 다양하며, 바실러스속(Bacillus), 박테리디움속(Bacteridium), 미크로코쿠스속(Micrococcus) 및 브레비박테리움속(Brevibacterium)(미국특허 4,001,081호; 한국특허 공고 91-7850호), 코리네박테리움속(Corynebacterium) 또는 노카르디아속(Norcardia) (미국특허 4,248,968호), 로도코커스속(Rhodococcus)(미국특허 5,334,519호), 슈도모나스속(Pseudomonas) (미국특허 4,880,739) 등이 대표적으로 사용되고 있다.

상기의 니트릴 히드라타제를 이용한 아미드류의 제조법에 있어서 중요한 점은 니트릴 히드라타제의 활성과 안정성으로, 이는 공정의 경제성을 결정하는 중요한 요소이다. 따라서, 경제성 있는 효소공정의 개발을 위해서는 니트릴 히드라타제의 활성이 높은 균주를 개발하는 것이 중요하다.

최근에 니트릴 히드라타제의 활성이 증가된 균주를 얻기 위하여 유전공학 기술을 이용하여 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자를 분리하고 재조합벡터를 제작한 후, 니트릴 히드라타제의 활성이 증가된 형질전환체를 제작하여 니트릴로부터 아미드를 제조하는 방법에 대한 많은 연구가 진행되었다.

지금까지 니트릴 히드라타제의 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 이것을 코딩하는 유전자의 염기서열이 밝혀진 미생물로는 로도코커스속(Rhodococcus) N774(미국특허 5,130,235), 슈도모나스속(Pseudomonas) B23 (유럽특허 444,639), 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) J1(유럽특허 445,646), 라이조비움속(Rhizobium)(유럽특허 579,907) 등이 있다.

얻은 결과 및 기술적 본점에서, 본 발명에 가장 근접한 니트릴 히드라타제의 활성을 갖는 폴리펩티드와 이것을 코딩하는 유전자 단편은 로도코커스 로도크로스 J1(유럽특허 445,646) 균주가 함유하는 니트릴 히드라타제로서 본 발명에 사용한 로도코커스 로도크로스 M33의 니트릴 히드라타제의 아미노산 서열과 염기서열 사이에 유사성이 93% 이상이다. 그러나 J1 균주의 니트릴 히드라타제의 경우 유도물질에 의하여 효소가 발현되는 유도 효소인 반면, M33 균주의 니트릴 히드라타제의 경우에는 유도물질이 없는 상태에서도 효소가 발현되는 구조 효소이고 이러한 차이는 각각의 균주에서 효소를 코딩하는 유전자의 차이에서 기인하는 것으로 사료된다(한국특허 공고 131,276). 또한 유럽특허 445,646 에서는 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자를 대장균에 클로닝하였으며 효소의 활성도 매우 낮은 관계로 실제로는 산업에 이용할 수 없는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 안정적이고 니트릴 히드라타제의 활성이 높은 형질전환체를 개발하고 이에 의해 니트릴로부터 아미드를 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 광범위하게 연구한 결과, 로도코커스 로도크로스 M33으로부터 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자를 분리하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 니트릴 히드라타제의 발현활성이 높은 재조합벡터를 제작하고 이를 우선 대장균에 클로닝하여 발현을 확인하고, 이 재조합벡터를 다시 본래의 로도코커스 로도크로스 M33에 도입하여 니트릴 히드라타제의 활성이 증가된 형질전환체를 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

도 1은 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) M33으로부터 분리한 니트릴 히드라타제의 SDS-전기영동 사진.

도 2는 중합효소연쇄반응으로 증폭한 0.7kb β-서브유니트 유전자의 전기영동 사진.

도 3은 0.7kb β-서브유니트 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pSH-1의 제한효소지도.

도 4는 2.0kb 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pSH-4의 제한효소지도.

도 5는 1.6kb 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pGEX-1의 제한효소지도.

도 6은 1.6kb 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pREX-1의 제한효소지도.

도 7은 5.8kb 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 p8-47의 제한효소지도.

도 8은 재조합 플라스미드 pREX-1를 도입하여 제작된 재조합 대장균의 생육배지에 IPTG를 첨가하여 니트릴 히드라타제를 발현시킨 후에 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)으로 분석한 사진.

1, 2 선 : 재조합 플라스미드 pREX-1를 함유한 대장균.

3 선 : 플라스미드 pRSET-C를 함유한 대장균.

4 선 : 플라스미드를 함유하지 않은 대장균.

M 선 : 사이즈 마커.

도 9는 2.0Kb의 니트릴 히드라타제 유전자를 대장균-로도코커스 (Rhodococcus)셔틀 벡터 pEK-SH에 삽입하여 제작한 재조합 플라스미드 pEK-NH의 제한효소지도.

도 10은 5.8Kb의 니트릴 히드라타제 유전자를 대장균-로도코커스 (Rhodococcus)셔틀 벡터 pEK-SH에 삽입하여 제작한 재조합 플라스미드 pEK-5.8의 제한효소지도.

도 11은 재조합 플라스미드 pEK-NH를 니트릴 히드라타제의 활성이 전혀 없는 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 12674에 도입하여 제작된 형질전환체들의 니트릴 히드라타제의 비활성을 비교한 결과.

도 12는 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) M33 균주와 재조합 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) pEK-5.8 균주의 니트릴 히드라타제의 비활성(specific activity)을 비교한 결과.

도 13는 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 니트릴 히드라타제의 활성이 전혀 없는 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 12674에 도입하여 제작된 형질전환체들의 니트릴 히드라타제의 비활성을 비교한 결과.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 니트릴 히드라타제의 활성이 높은 형질전환체를 개발하고 이를 통하여 아미드를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로도코커스 로도크로스 M33으로부터 유래된 신규한 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 유전자 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 형질전환체를 이용하여 니트릴로부터 아미드를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서는 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자를 분리하기 위하여, 로도코커스 로도크로스 M33을 배양 후 세포를 수확하여 파쇄한 후, 고형물을 원심분리하여 제거한 무세포 조효소액을 SDS-전기영동법으로 분석하여 니트릴 히드라타제의 β-서브유니트를 분리하고 N-터미널 아미노산 서열을 분석한 결과 로도코커스 로도크로스 M33의 모균주인 로도코커스 로도크로스 M8 VKPM S-926과 정확하게 일치함을 확인하였고, N-터미널 아미노산 서열을 바탕으로 중합효소연쇄반응을 통하여 니트릴 히드라타제-코딩 유전자를 증폭하기 위한 여러 프라이머를 먼저 제작하였다.

다음으로 로도코커스 로도크로스 M33으로부터 분리한 염색체 DNA와 상기에서 제작한 프라이머로 중합효소연쇄반응을 수행하여 니트릴 히드라타제를 코딩하는 전체 유전자를 증폭하고 이를 제한효소로 잘라서 유전자 운반체인 벡터에 재조합하여pSH1, pSH4, pGEX-1, pREX-1, p8-47 등의 재조합 플라스미드를 제작하였고 이를 대장균에 클로닝하였다.

상기의 방법에 있어서, 유전자 운반체인 벡터와 숙주세포로 사용된 대장균은 당업계에서 공지된 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

제작된 pREX-1 재조합 플라스미드를 먼저 대장균에 클로닝하여 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 분석을 통하여 니트릴 히드라타제의 발현을 확인하였다. 대장균에서 니트릴 히드라타제의 발현 수준은 매우 낮고 니트릴 히드라타제가 세포 내에 응집되어 불활성인 상태로 존재하는 문제점이 있다. 따라서 상기에서 제작된 재조합 플라스미드를 본래의 로도코커스 로도크로스 M33에 도입하는 것을 시도하였으며, 그 결과 로도코커스 로도크로스 M33과 같은 니트릴 히드라타제-발현 로도코커스 로도크로스 균주에 본 발명의 유전자-함유 재조합 플라스미드를 도입하는 경우 숙주세포의 유전자 발현 체계를 이용하여 니트릴 히드라타제를 대량으로 생산할 수 있으며, 대장균과 비교하여 로도코커스 로도크로스 M33을 배양할 때는 값 싼 배지를 사용할 수 있어 경제적인 장점이 있는 것을 확인할 수 있었다.

이에 본 발명자는 상기의 재조합 플라스미드 pSH4와 p8-47로부터 니트릴 히드라타제 유전자를 분리하고 이것을 대장균-로도코커스 셔틀 벡터 pEK-SH에 각각 삽입하여 재조합 플라스미드 pEK-NH와 pEK-5.8을 제작하였고 (도 9 내지 도 10) 이것을 로도코커스 로도크로스 M33에 도입하였다. 이렇게 하여 제작된 재조합 로도코커스 로도크로스 pEK-5.8은 기존의 로도코커스 로도크로스 M33과 비교하여 비활성이 약 2배 증가되었다(도 12).이와 같은 활성의 증가가 재조합 플라스미드 pEK-5.8에 의해 유도됨을 증명하기 위해 상기의 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 니트릴 히드라타제의 활성이 없는 공지의 로도코커스 로도크로스 ATCC 12674에 클로닝하여 형질전환체 T-4, T-7, T-12, T-23, T-27을 제작하였고, 이들 형질전환체가 니트릴 히드라타제의 활성을 보유함을 확인하였다(도 12).

유전자 재조합 기술을 이용하여 개발된 로도코커스 로도크로스 pEK-5.8을 이용하여 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드를 제조하기 위하여, 본 발명에 앞서 개발된 아크릴아미드의 제조방법 (한국특허 제169213호)에서와 동일한 방법으로 수화반응을 실시하여 9시간만에 41% 아크릴아미드를 수득하였다 (실시예 9). 니트릴류의 수화반응에 의해 아미드류를 제조하는데 있어서, 균주를 배양하면서 수화반응을 수행하는 경우 배양액중의 아미드류의 농도가 높아지면 균의 성장이억제될 것이며 또한 배양에 사용되는 배지성분이 불순물로작용하기 때문에 현실적으로 아미드류를 생산하기 곤란하다. 따라서 균을 배양한 후 균체 또는 효소를 분리하고 이를 이용하여 수화반응을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 유전자 단편을 함유하는 형질전환주를 이용하여 아크릴로니트틸로부터 아크릴아미드를 제조하는 방법은 위에서 설명한 한국특허 제 169213호에 기재된 방법뿐만 아니라, 균주 배양을 이용하여 진행하는 통상의 생물반응 분야에 주지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 형질전환주는 통상의 방법으로 담체에 고정시킨 후 이용할 수도 있다.

한편, 본 발명의 유전자 단편을 함유하는 형질전환된 균주를 적절한 배양배지에서 배양하여 균체내와 배양액내에 니트릴 히드라타제를 생산 및 축적시키고,균체와 배양액으로부터 이 효소를 회수함으로써, 니트릴 히드라타제를 제조할 수 있다. 이 경우 적절한 형질전환 숙주세포로는 대장균을 예시할 수 있다. 이때 배양배지와 배양조건, 효소의 분리회수 등은 당업자에게 주지된 기술범위내에서 적의 선정될 수 있다.

이하 본 발명을 각종 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 니트릴 히드라타제의 분리, 정제 및 β-서브유니트의 아미노산 서열 분석.

로도코커스 로도크로스 M33을 하기 표 1의 조성으로 이루어진 배지를 이용하여 30℃에서 배양한 후에 균체를 회수하여 파쇄하였다. 이 파쇄액를 원심분리(4,000rpm)한 후에 상등액을 시료로 준비하였다. 시료를 완충액(6M 요소, 2.5% 소디움 도데실 설페이트, 5%(w/v) β-머캅토에탄올, 0.01M 트리스-염산(pH 6.8), 10%(w/v) 글리세롤, 0.002% 브로모페놀 블루)과 동량으로 섞고 끓는 물에서 15분 동안 중탕한 후, 전기영동하였다. 전기영동한 젤을 염색약(0.05% 쿠마스시에 브릴리언트 블루 R-250)으로 염색하고 탈색약(50% 메탄올, 10% 초산)으로 탈색하였다. SDS-전기영동법으로 분석한 결과를 도 1에 나타내었으며 약 29KDa와 34KDa의 위치에서 니트릴 히드라타제 효소의 α-서브유니트와 β-서브유니트 밴드가 확인되었다.

조성	양(g/L)
인산제일칼륨(KH₂PO₄)인산제이칼륨(K₂HPO₄)염화코발트(CoCl₂6H₂O)황산제일철(FeSO₄7H₂O)글루코스(glucose)요소(urea)황산마그네슘(MgSO₄7H₂O)	0.50.40.0180.005207.51.2

전기영동한 β-서브유니트 밴드를 Hoefer사의 TE Series Transphor Electrophoresis Unit를 사용하여 Hybond-PVDF 막으로 옮긴 후에 β-서브유니트의 N-터미널 아미노산 서열을 분석한 결과 Glu - His - Val - Asn - Lys - Tyr - Thr - Glu - Tyr - Glu - Ala - Arg - Thr(SEQ. ID. NO. 1)로 확인되었다.

[실시예 2] 니트릴 히드라타제 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 제작.

실시예 1에서 분석한 β-서브유니트의 N-터미널 아미노산 서열을 바탕으로 DR-F1, DR-B, NH 5, NH 3의 4개의 프라이머, NHB1과 NHB2의 혼합 프라이며(mixed primer)를 제작하였다. 각각의 염기서열과 프라이머의 제한효소에 의한 절단부위의 위치는 다음과 같다.

DR-F1 : 5' ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACC 3'(SEQ. ID. NO. 2)

DR-B : 5' TTATCATACGATCACTTCCTGCGGTGTGAGCGC 3'(SEQ. ID. NO. 3)

NH 5 : 5'CTGCAGCTCGAACATCGAAGGGTGGGAGCCGAG 3'(SEQ. ID. NO. 4)

PstⅠ

NH 3 : 5'GTCGACCACGCTGGCCTCGAGCGCCTTTGTCCAG 3'(SEQ. ID. NO. 5)

SalⅠ

NHB1 : 5' ATGGATGGTGTACATGATCTGCCGGA 3'(SEQ. ID. NO. 6)

5' ATGGACGGCGTGCACGACCTCCAGGC 3'(SEQ. ID. NO. 7)

5' ATGGATGGAGTCCATGATCTTCCGGT 3'(SEQ. ID. NO. 8)

5' ATGGATGGGGTACATGATCTGCCGGA 3'(SEQ. ID. NO. 9)

NHB2 : 5' TCACGCAGGCTCCAGGTACGGTTCGAAGAGATCGAC 3'(SEQ. ID. NO. 10)

5' TCAGGCGGGTTCGAGGTAGGGCTCGAACAGGTCTAC 3'(SEQ. ID. NO. 11)

5' TCACGCCGGCTCAAGGTAAGGTTCGAAAAGATCCAC 3'(SEQ. ID. NO. 12)

[실시예 3] 중합효소연쇄반응에 의한 니트릴 히드라타제 유전자의 증폭 및 플라스미드 제작.

니트릴 히드라타제 효소의 β-서브유니트(0,7kb) 및 α- 및 β-서브유니트를 코딩하는 유전자(1.6kb)를 증폭하기 위해 6개의 프라이머 중 NHB1과 NHB2, DR-F1은 0.7kb의 β-서브유니트를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 사용하였고, 3' 플랭킹 부분과 α- 및 β-서브유니트를 코딩하는 유전자(1.6kb)를 특이적으로 증폭하기 위해 DR-F1과 NH3를 사용하였다. 처음 β-서브유니트를 증폭하기 위하여 β-서브유니트의 N-터미날 아미노산 서열 분석을 바탕으로 혼합 프라이머(mixed primer)인 NHB1과 NHB2를 사용하여 0.7kb의 β-서브유니트의 증폭을 확인하였다. 증폭을 확인한 후 DR-F1과 NH3를 사용하여 β-서브유니트의 시작부분부터 3' 플랭킹 부분을 함유하는 1.6kb의 유전자를 증폭하였다. 증폭한 결과 유전자의 제한효소 지도가 공지의 로도코커스 로도크로스 J1의 유전자 구조와 유사함을 확인하고 이로부터 프라이머 NH3과 NH5를 이용하여 α, β-서브유니트와 5'과 3'의 플랭킹 부분을 코딩하는 2.0kb의 전체 유전자 단편을 특이적으로 증폭하였다. 프로모터를 함유하는 5' 플랭킹 부분을 함께 증폭함으로써 후에 로도코커스 로도크로스 M33으로 형질도입시 발현이 가능하게 하였다.

1. 0.7Kb β-서브유니트 유전자의 증폭 및 플라스미드 제작.

니트릴 히드라타제의 β-서브유니트의 N-터미널 아미노산 서열을 바탕으로 β-서브유니트를 코딩하는 유전자만을 특이적으로 증폭하도록 제작된 DR-F1(SEQ. ID. NO. 2)과 DR-B(SEQ. ID. NO. 3) 프라이머 20 pmole, 염화마그네슘 25mM , dNTP's mix 2.5 mM, 니트릴 히드라타제의 유전자를 함유한 DNA 주형 등으로 구성된 반응액 10㎕에 5units/㎕의 Taq DNA 중합효소를 첨가하여 DNA 열 사이클러(Thermal Cycler)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응으로 증폭된 0.7Kb β-서브유니트 유전자를 1% 아가로스 젤에서 전기영동한 결과를 도 2에 나타내었다.

증폭된 0.7Kb의 니트릴 히드라타제 β-서브유니트 유전자와 pGEM-T Easy 플라스미드(Promega Co.)를 T/A 클로닝 키트를 사용하여 20mM 트리스-염산(pH7.6), 5mM 염화마그네슘, 5mM 디티오트레이톨, 50㎍/㎖ 보바인 세럼 알부민, 0.5mM ATP로 구성된 완충액에 녹인 후 증류수로 최종 부피를 20㎕로 맞추고 T4 DNA 리가제를 첨가하여 16℃에서 12시간 동안 반응시켜 재조합 플라스미드를 제작하였고 이것을 pSH1으로 명명하였다. 이를 제한효소PstⅠ과EcoRⅠ을 사용하여 가수분해한 후에 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 작성한 제한효소지도를 도 3에 나타내었다.

2. 2.0Kb 니트릴 히드라타제 유전자의 증폭 및 플라스미드 제작.

니트릴 히드라타제의 1.2kb의 α-, β-서브유니트와 5'과 3'의 플랭킹 부분을 코딩하는 2.0kb 전체 유전자 단편을 특이적으로 증폭하기 위하여 프라이머 NH 3(SEQ. ID. NO. 5)과 NH 5(SEQ. ID. NO. 4)를 사용한 점을 제외하고 상기 1의 방법과 동일한 중합효소연쇄반응 조건으로 유전자를 증폭하였다.

증폭된 2.0Kb의 니트릴 히드라타제 전체 유전자를 앞서 기술한 방법과 동일하게 pGEM-T Easy 플라스미드(Promega Co.)에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였고 이것을 pSH4로 명명하였다. 이를 제한효소PstⅠ,SalⅠ,XhoⅠ과EcoRⅠ을 사용하여 가수분해한 후에 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 작성한 제한효소지도를 도 4에 나타내었다.

3. 1.6Kb 니트릴 히드라타제 유전자의 증폭 및 플라스미드 제작.

니트릴 히드라타제의 2.0kb 전체 유전자 중에서 5' 플랭킹 부분을 제거한 1.6kb 유전자 단편을 특이적으로 증폭하기 위해 프라이머 DR-F1(SEQ. ID. NO. 2)과 NH 3(SEQ. ID. NO. 5)을 사용하여 상기 1의 방법과 동일한 중합효소연쇄반응 조건으로 유전자를 증폭하였다.

증폭된 1.6Kb의 니트릴 히드라타제 유전자를 앞서 기술한 방법과 동일하게 pGEM-T Easy 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였고 이것을 pGEX-1로 명명하였다. 이를 제한효소SalⅠ과EcoRⅠ을 사용하여 가수분해한 후에 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 작성한 제한효소지도를 도 5에 나타내었다.

재조합 플라스미드 pGEX-1에서 1.6Kb의 니트릴 히드라타제 유전자를 제한효소인EcoRⅠ으로 가수분해한 후, 전기용리(electroelution)를 이용하여 회수하였다. 이를 대장균에서의 발현 플라스미드인 pRSET-C(Invitrogen Co.)에 삽입하여 재조합 플라스미드 pREX-1을 제작하였다. pREX-1은 T7 프로모터의 조절 하에 발현되며, 이 재조합 플라스미드가 니트릴 히드라타제 유전자를 함유하고 있음을 제한효소EcoRⅠ,PvuⅠ,SacⅠ,XhoⅠ을 사용하여 확인하였고, 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 작성한 제한효소지도를 도 6에 나타내었다.

4. 5.8Kb 니트릴 히드라타제 유전자의 분리 및 플라스미드 제작.

니트릴 히드라타제의 발현을 조절하는 조절유전자를 포함하는 전체 니트릴 히드라타제 유전자군을 분리하기 위하여 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) M33의 염색체 DNA를 제한효소KpnⅠ과SacⅠ을 사용하여 가수분해한 후에 각각의 DNA 단편을 pBluescript KS(+) 플라스미드에 삽입하고 이 플라스미드를 대장균 TOP10F'(Invitrogen Co.)에 도입하여 형질전환체를 제작하였다. 이들 형질전환체 중 니트릴 히드라타제의 유전자를 가지고 있는 재조합 플라스미드를 함유한 형질전환체를 선별하기 위해 니트릴 히드라타제의 0.7kb β-서브유니트 유전자를 프로브로 이용하여 서던 블롯(Southern blot)분석을 수행하였다. 서던 블롯팅은 DIG DNA 라벨링 및 검출 키트(Boehringer Mannheim Co.)를 사용하였으며, DIG-표지화 DNA 프로브는 재조합 플라스미드 pSH1의 0.7Kb 유전자와 pSH4의 2.0Kb 유전자를 사용하였고, 랜덤 프라임드 라벨링(random primed labelling) 방법에 따라 크레노우 단편을 첨가하여 사용하였다. 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) M33의 염색체 DNA를 몇 종류의 제한효소로 가수분해한 후, 아가로스 젤에서 전기영동을 수행하고 변성과 중화과정을 거친 후, DNA를 나일론 막에 전달하였다. DNA가 부착된 나일론 막을 80℃에서 고정시킨 후, DIG-표지화 DNA 프로브를 넣고 58℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 나일론 막에 anti-DIG-AP 접합체(conjugate)를 첨가하여 반응시킨 후, 발색 용액으로 발색시켜 재조합 플라스미드를 함유한 형질전환체를 선별하였다.

선별된 재조합 플라스미드를 p8-47이라 명명하였고, 이 재조합 플라스미드를 여러 제한효소를 사용하여 가수분해한 후에 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 니트릴 히드라타제 α,β-서브유니트를 포함하는 5.8kb의 유전자를 함유하고 있는 것을 확인하였으며, 제한효소지도를 도 6에 나타내었다.

[실시예 4] 대장균에서의 형질전환

실시예 3의 1.6kb의 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pREX-1을 대장균에 도입하기 위하여 대장균 GJ1158를 LB-배지에서 배양한 후에 균체를 회수한 후 100mM 염화칼슘을 첨가하여 0℃에서 15분간 방치한 후 다시 원심분리하여 균체를 회수하였다. 균체를 다시 100mM 염화칼슘 용액으로 현탁한 후에 0℃에서 5분간 방치한 후 pREX-1 플라스미드를 넣고 0℃에서 1시간 방치하고 42℃에서 90초간 열 충격을 가한 후, 다시 0℃에 5분간 방치하고 LB 배지 1㎖을 넣은 후에 암피실린(50㎍/㎖)이 포함된 LB 배지에 도말하여 37℃에서 배양하였다.

[실시예 5] 대장균에서 니트릴 히드라타제 발현 및 확인

대장균에서 니트릴 히드라타제 유전자의 발현을 알아보기 위하여, 재조합 플라스미드 pREX-1을 포함하는 대장균 BL21을 암피실린(100㎍/㎖)이 포함된 LB-배지에서 배양하면서 1mM IPTG를 첨가하여 니트릴 히드라타제의 발현을 유도하였다. 배양후 원심분리로 균체를 회수한 후에 Express blot-system kit(Promega Co.)를 사용하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 분석을 수행하였다. 첫 번째 항체는 쥐의 Anti-Xpress 항체를 사용하였으며, 두 번째 항체는 알카라인 포스파타제가 결합되어 있는 Anti-mouse IgG를 사용하였다. 전기영동한 SDS-PAGE 상의 단백질을 폴리비닐이덴 디풀오리드(PVDF) 막에 옮긴 후 이 막을 1% 보바인 시럼 알부민이 포함된 TBST(20mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)용액에서 30분 동안 방치한 후, 첫 번째 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응 시켰다. 그 후 TBST 용액으로 3번 세척을 한 후, 다시 1% 보바인 시럼 알부민이 포함된 TBST 용액에 두 번째 항체를 첨가한 후 1시간 동안 반응시키고, 다시 TBST 용액으로 3번 세척 한 후, 알카라인 포스파타제에 대한 기질용액으로 발색시켰다. 그 결과 재조합 플라스미드 pREX-1을 포함하는 대장균으로부터 약 40KDa의 융합된 니트릴 히드라타제 β-서브유니트를 확인할 수 있었으며 그 결과를 도 8에 나타내었다.

[실시예 6] 니트릴 히드라타제 유전자의 염기서열 분석

재조합 플라스미드 pSH-4의 2.0Kb 니트릴 히드라타제 유전자로부터 4개의 서브클론 pSQ0.3, pSQ0.4, pSQ0.7, pSQ4.3을 제작하였고 이들 플라스미드를 분리하여 디데옥시카인 터미네이션(Dideoxychain Termination) 방법으로 염기서열을 분석하였고 여러 제한효소를 사용하여 가수분해하였다. 로도코커스 로도크로스 M33으로부터 유래된 니트릴 히드라타제의 2.0kb 유전자의 염기서열 및 그의 추정 아미노산 서열을 서열번호 6으로 나타내었으며, α- 및 β-서브유니트의 아미노산 서열을 각각 서열번호 7 및 8로 나타내었다.

[실시예 7] 로도코커스 로도크로스에서의 형질전환.

니트릴 히드라타제 유전자를 로도코커스 로도크로스 M33으로 도입하기 위해 재조합 플라스미드 pSH4를 제한효소EcoRⅠ으로 절단하여 얻은 2.0Kb의 유전자 단편을 대장균-로도코커스 셔틀 벡터 pEK-SH에 삽입하여 재조합 플라스미드 pEK-NH를 제작하였고 그 제한효소지도를 제 9도에 나타내었다. 또한 재조합 플라스미드 p8-47을 제한효소KpnⅠ과SacⅠ으로 절단하여 얻은 약 5.8Kb의 유전자 단편을 상기와 동일한 pEK-SH에 삽입하여 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 제작하였고 그 제한효소지도를 도 10에 나타내었다.

두 재조합 플라스미드 pEK-NH와 pEK-5.8을 각각 로도코커스 로도크로스 M33에 일렉트로포레이션(Electroporation) 방법으로 형질전환시켰다. M33 균주를 LB 배지에서 배양한 후 균체를 원심분리로 회수(4000rpm, 10min, 4℃)한 뒤 동량의 1mM HEPES 용액으로 현탁시킨 후, 다시 동일 조건으로 원심분리하고 멸균된 증류수로 2회 세척하였다. 이를 동일 조건으로 원심분리하고 10% 글리세롤에 재현탁한 후, 원심분리하여 최종적으로 원래 부피의 1/50 부피의 10% 글리세롤에 현탁하였다. 이것을 100㎕씩 분주하고 재조합 플라스미드를 첨가한 뒤 0.2㎝ 큐벳에 넣어서GENE PULSER Ⅱ(Bio-Rad Co.)를 사용하여 2,500V, 50㎌, 200Ω에서 전기충격을 준 후에 LB-배지 1㎖를 첨가하여 30℃에서 배양한 뒤 50㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 한천배지에서 선별하였다.

또한 재조합 플라스미드 pEK-5.8과 pEK-NH를 니트릴 히드라타제의 활성이 전혀 없는 로도코커스 로도크로스 ATCC12674에 도입하였고 카나마이신 300㎍/㎖이 첨가된 한천배지를 이용하여 형질전환체를 선별하였다.

[실시예 8] 로도코커스 로도크로스 형질전환체에서 니트릴 히드라타제 발현

재조합 플라스미드 pEK-NH와 pEK-5.8로 형질전환된 로도코커스 형질전환체를 선별하고 선별된 형질전환체로부터 이들 재조합 플라스미드를 분리한 뒤 여러 제한효소로 가수분해한 후에 1% 아가로스 젤에서 전기영동한 결과 로도코커스 형질전환체로부터 분리한 재조합 플라스미드와 대장균으로부터 분리한 재조합 플라스미드가 동일한 양상으로 제한효소에 의하여 가수분해되는 것을 확인할 수 있었다.

재조합 플라스미드 pEK-NH로 형질전환된 재조합 로도코커스 형질전환체를 배양하여 니트릴 히드라타제의 비활성을 측정하였다. 니트릴 히드라타제의 비활성 측정방법은 다음과 같다. 즉, pH 7.6의 10mM 포스페이트 완충용액과 2%(w/v) 아크릴로니트릴로 구성된 용액 1㎖을 건조중량 0.04㎎으로 구성된 미생물 세포 현탁액 1㎖과 혼합시킨 후 20℃에서 10분간 교반하고, 농축 HCl 30㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 형성된 아크릴아미드의 농도는 가스 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

니트릴 하이드라타제 활성은 다음의 units로 표현된다. 1 unit은 전술한 조건에서 1 M/min의 속도로 아크릴로니트릴에서 아크릴아미드를 생성시키는데 요구되는 효소의 양으로 정의되고, 비활성은 μM 아크릴아미드/min/세포 건조중량 (㎎ cells) 또는 units/㎎ cells로 표현된다.

재조합 플라스미드 pEK-NH로 형질전환된 재조합 로도코커스 로도크로스 M33의 형질전환체는 로도코커스 로도크로스 M33 균주와 비교하여 니트릴 히드라타제의 비활성은 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 적은 양의 생산 증가로 그 효과를 보이지 않았기 때문이다. 위 실험을 통해 pEK-NH에 따른 니트릴 히드라타제의 활성증가 여부를 확인할 수 없다. 따라서 2.0kb의 니트릴 히드라타제의 비활성을 증명하고자 하였다. 니트릴 히드라타제의 활성이 전혀 없는 로도코커스 로도크로스 ATCC 2674에 재조합 플라스미드 pEK-NH를 도입한 결과 형질전환된 형질전환체가 니트릴 히드라타제의 활성을 나타내었으며 최대 비활성은 약 13 units/㎎ cells이었다. 그 결과를 도 11에 도시하였다. 이 재조합 플라스미드 pEK-NH를 함유하는 로도코커스 로도크로스 ATCC 12674의 형질전환체를 로도코커스 로도크로스 Tn-4로 명명하였다.

위의 결과로부터, 니트릴 히드라타제를 발현할 수 있는 최소 단위의 유전자는 2.0kb 유전자인 것으로 추정된다.

재조합 플라스미드 pEK-5.8로 형질전환된 재조합 로도코커스 형질전환체를 배양하여 니트릴 히드라타제의 비활성을 조사하였다.

재조합 플라스미드 pEK-5.8로 형질전환된 재조합 로도코커스 로도크로스 M33의 형질전환체는 로도코커스 로도크로스 M33 균주와 비교하여 니트릴 히드라타제의 비활성이 약 2배 증가하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

이 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 함유하는 로도코커스 로도크로스 M33의 형질전환체를 로도코커스 로도크로스 pEK-5.8이라 명명하였다.

한편 이러한 효소활성의 증가가 플라스미드 pEK-5.8에 의해 유도되었음을 증명하기 위해 니트릴 히드라타제의 활성이 전혀 없는 로도코커스 로도크로스 ATCC 12674에 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 도입한 결과, 형질전환된 형질전환체가 니트릴 히드라타제의 활성을 나타내었으며, 최대 비활성이 약 30 units/㎎ cells이었다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

이 재조합 플라스미드 pEK-5.8을 함유하는 로도코커스 로도크로스 ATCC 12674의 형질전환체를 각각 로도코커스 로도크로스 T-4, T-7, T-12, T-23, T-27이라 명명하였다.

[실시예 9] 형질전환체에 의한 니트릴 히드라타제의 생산과 니트릴 히드라타제를 이용한 니트릴로부터 아미드로의 전환.

상기 표 1의 조성으로 이루어진 배지 100㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 넣고 멸균하여 식힌 후 가나마이신 50 ㎍/㎖를 첨가한 후 로도코커스 로도크로스 pEK-5.8을 접종하여 30℃, 500rpm인 쉐이커(shaker)에서 30시간 배양한 후, 표 1의 조성을 갖는 배지 3ℓ를 포함하는 발효조에 접종하여 pH 7.2, 30℃에서 40 시간 배양하였다. 배양후 원심분리한 다음 상등액을 버리고 증류수로 두 번 수세한 후 균체를 증류수에 적당히 현탁하여 균체효소(whole cell enzyme)원으로 사용하였다.

증류수 800㎖을 1.5L의 반응기에 넣고 교반하면서 온도는 20-25℃로 조절하고 상기에서 배양된 로도코커스 로도크로스 pEK-5.8 균주의 건조중량 0.4g을 반응기에 투입하여 재현탁시켰다. 반응용액의 아크릴로니트릴 농도가 0.2%를 초과하지 않도록 순수 아크릴로니트릴의 주입속도를 조절하면서 반응혼합물에 첨가하였다. 총 370g의 아크릴로니트릴이 반응기에 7시간만에 모두 첨가되었으며, 9시간 후에 40%의 아크릴아미드 용액이 수득되었다. 이 경우 미반응 아크릴로니트릴은 100ppm 이하로 감지되고, 부산물인 아크릴산이 약 50ppm 감지되었다.

본 발명의 방법에 따라 제공되는 니트릴 히드라타제-코딩 유전자는 유도 유전자인 종래의 니트릴 히드라타제-코딩 유전자와 달리 구조 유전자로서 유도물질의 존재없이도 일정하게 높은 수준의 발현을 나타내므로, 이 유전자를 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 균주, 특히 니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 것으로서 본 발명의 유전자를 함유하는 로도코커스 로도크로스 형질전환주는 니트릴류를 아미드류로 전환시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

서열 번호 13(SEQ. ID. NO. 13)으로 나타낸 염기서열을 포함하는 유전자 단편.
제 1항의 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터.
제 2항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주세포.
제 3항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포는 대장균 또는로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous)임을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
제 3항의 형질전환된 숙주세포를 준비하는 단계;

상기 숙주세포를 배양배지에서 배양하여 균체내와 베앵엑 중에 니트릴 히드라타제를 생산 및 축적시키는 단계; 및

상기 균체와 배양액으로부터 니트릴 히드라타제를 분리 및 회수하는 단계

를 포함함을 특징으로 하는 니트릴 히드라타제의 생산방법.
제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균임을 특징으로 하는 방법.
니트릴류를 아미드류로 전환시키는 능력을 갖는 균주를 이용하여 니트릴류를 아미드류로 전환시키는 방법에 있어서, 상기 균주로서 제3항의 형질전환된 숙주세포를 이용하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 숙주세포가로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous)임을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기로도코커스 로도크로스는 형질전환되기 전에도 니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 균주임을 특징으로 하는 방법.