JP2013529064A - 組み換え型毒素タンパク質の高レベルの発現 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、EFS−WebによってASCIIフォーマットで提出され、その全体における引用によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ASCIIのコピーが、2011年3月16日に作られ、38194201.txtと命名され、大きさは156,975バイトである。
Menjugate(Novartis Vaccines)、髄膜炎菌のグループC結合ワクチン;及びPrevnar(登録商標)(Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)、肺炎連鎖球菌の7つの血清型を標的とする小児期肺炎ワクチン、及びHibTITER(登録商標)(Wyeth)、インフルエンザ菌b型ワクチンを含む。加えて、CRM197は、ジフテリア菌ワクチン接種用の追加免疫抗原(boosting antigen)としての潜在的な使用を有し、他のワクチンで使用される担体タンパク質として調べられている。
この明細書で言及されるすべての公報、特許、及び特許出願は、個々の公報、特許、又は特許出願が、それぞれ、明確且つ個々に引用によって組み込まれると示されるように、同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
〈ADPリボシル化毒素〉
ADPリボシル化毒素(ADPRT)は、ニコチンアミドとNADのN−リボースの間のN−グリコシル結合の切断を促進し、標的タンパク質にADPリボース部分を移動する。ADPRTはそれぞれの標的に基づいて4つのファミリーに分類される。I型ADPRTはヘテロマーのGTP結合タンパク質を標的とする。それらは、コレラ毒素(CTX)、百日咳毒素(PTX)及び大腸菌易熱性毒素(LT)を含む。II型ADPRT(ジフテリア毒素及びシュードモナス菌外毒素Aは伸長因子2(EF2)を修正する。III型ADPRT(ボツリヌス菌C3細胞外酵素)は、小さなGTP結合タンパク質をADPリボシル化する。IV型ADPRT ADP−リボシル化アクチン。これらのアクチンに特異的なADPRTは、クロストリジウムボツリヌス菌C2毒素、ウェルシュ菌ι−毒素、クロストリジウムディフィシレ毒素(引用により本明細書に組み込まれた、「Popoff, et al., 1988, ”Actin−specific ADP−ribosyltransferase produced by a Clostridium difficile strain,” Infection and Immunity 56(9):2299−2306」に記載される、TcdAとTcdBとは異なる毒素)、C.spiroforme毒素、及びセレウス菌の成長力のある殺虫のタンパク質(VIP)を含む、二成分の毒素のファミリーを含む。
他の実施形態において、IV型ADPRTを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、IV型ADPRTはTcdBである。
交差反応性物質197(CRM197)は、ミスセンス突然変異を有するDT遺伝子から生成されたジフテリア毒素(DT)変異体である。DTはADPリボシル化毒素である;CRM197は、DTのADPリボース転移酵素(ADPRT)活性を欠き、したがって無毒である。CRM197のための遺伝子は、単独ベース置換を有し、残留物52にてグリシンの代わりにグルタミン酸の取り込みをもたらす。(例えば、全てが引用によって本明細書に組み込まれる、「Bishai, et al., 1987, ”High−Level Expression of a Proteolytically Sensitive Diphtheria toxin Fragment in Escherichia coli,” J. Bact. 169(11):5140−51」、「Giannini, et al., 1984, ”The Amino−Acid Sequence of Two Non−Toxic Mutants of Diphtheria toxin: CRM45 and CRM197,” Nucleic Acids Research 12(10): 4063−9」、及び「GenBank Acc. No. 1007216A」を参照。)
コレラ菌によって産出されたコレラ毒素(CTX)はまた、ADPリボシル化毒素である。コレラ毒素(CTX)は、6つのサブユニットタンパク質から構成されたオリゴマーの複合体である:コレラ毒素Aサブユニット(CTA)の単一のコピー、及びコレラ毒素Bサブユニット(CTB)の5つのコピー。各々12kDaの重量を有する5つのBサブユニットは五員環を形成する。Aサブユニットは、A1部分、CTA1、Gタンパク質をADP−リボシル化する球状の酵素、及びA2鎖、CTA2を有し、それは、Bサブユニット環の中央のポアにきっちり位置する拡張したα螺旋体を形成する。この環は、宿主細胞表面上のGM1ガングリオシド受容体に結合し、全複合体の内部移行をもたらす。一旦内部移行されると、CTA1鎖はジスルフィド架橋の減少によって放出される。その後、CTA1は活性化され、アデニル酸シクラーゼのADPリボシル化を触媒する。アデニル酸シクラーゼ活性において結果として生じる増加は、環状AMP合成を増加させ、それは大量の液体及び電解質流出を引き起こし、下痢をもたらす。
百日咳毒素は、百日咳菌によって生成された菌体外毒素と病原性の因子、疾患百日咳を引き起こすヒト気道の病原菌である。百日咳ホロトキシンは、AB5構造とのマルチサブユニットの複合体である。酵素学的に活性なAサブユニット(S1)は、哺乳動物細胞において幾つかのヘテロ三量体のGタンパク質(主としてGiタンパク質)のアルファサブユニットを修正するADPリボース転移酵素であり、Bオリゴマー(S2、S3、S4の2つのコピー、及びS5)は、細胞上の複合糖質受容体を結合する。S1は、細胞エントリーの後にタンパク分解性に処理される。引用により本明細書に組み込まれる、「Carbonetti, et al., 2005, ”Proteolytic Cleavage of Pertussis Toxin S1 Subunit is Not Essential for Its Activity in Mammalian Cells,” BMC Microbiology 5:7」は、S1の処理が哺乳動物細胞におけるその細胞毒性活性に不可欠ではないと報告した。
破傷風菌によって産出された破傷風毒素は、150kDaの分子量を有する神経毒である。それは2つの部分から構成される:100kDaの重鎖又はB鎖及び50kDaの軽鎖又はA鎖。鎖は、ジスルフィド結合によって連結される。B鎖は、神経細胞の細胞膜上のジシアロガングリオシド(GD2及びGD1b)に結合する。A鎖、亜鉛エンドペプチダーゼは、小胞に関連する膜タンパク質(VAMP)を攻撃する。
クロストリジウムディフィシル毒素B(TcdB)は、クロストリジウムディフィシルによって生成された病原性因子であり、それは院内での下痢及び偽膜性大腸炎を引き起こす。TcdB、及び第2の大きなクロストリジウム毒素、TcdAは、偽膜性大腸炎の進行に関係する。
緑膿菌外毒素A(ETA又はPE)は、II型ADPRTである。それは、触媒ドメインを哺乳動物細胞へと移動させることができ、細胞の伸長因子2のADPリボシル化によってタンパク質合成を阻害することができる、分泌された細菌毒素のファミリーの1つのメンバーである。タンパク質はモノマーとして存在し、613のアミノ酸(66Kd)の単一のポリペプチド鎖から成る。3.0−A分割(resolution)に決定される、外毒素AのX線結晶構造は、主として逆平行ベータ構造からなり、分子のおよそ半分;α−ヘリックスからなる中間のドメイン;及び分子のおよそ3分の1を含むカルボキシル末端ドメインを含む、アミノ末端ドメインを示す。カルボキシル末端ドメインは、毒素のADPリボース転移酵素である。他の2つのドメインは、細胞受容体結合及び膜転位に恐らく関係する。
異種の発現系において、最適化工程は、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善し得る。タンパク質発現は、転写、mRNAの処理、及び翻訳の安定性及びその開始に影響を与えるものを含む、多数の因子によって管理される。ポリヌクレオチド最適化工程は、研究者が発現構築物を効率的に設計するのを援助するための工程と同様、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善するための工程を含み得る。最適化のストラテジーは、例えば、翻訳開始領域の修正、mRNAの構造要素の変化、及び異なるコドンバイアスの使用を含み得る。細菌の宿主における異種のタンパク質の発現を改善するための、核酸配列を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主菌株における発現に関するコドンの最適化は、例えば、その全体において引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第2007/0292918号「Codon Optimization Method」に記載される。
本発明の方法に役立つ宿主細胞と同様に、シュードモナス菌宿主細胞において、有用な調節配列(例えば、プロモータ、分泌リーダー、及びリボソーム結合部位)を含む異種のタンパク質を発現する方法は、例えば、その全体において引用により全てが本明細書に組み込まれる、米国特許公報第2008/0269070号及び米国特許出願番号第12/610,207号、両方の表題「Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins」、米国特許公報第2006/0040352号、「Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens」、及び米国特許公報第2006/0110747号、「Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering」に記載される。これら公報はまた、フォールディングモジュレータを過剰発現するために設計され、又は異種のタンパク質発現を増加させるために、欠失を含むプロテアーゼ変異が導入された、本発明の方法を実行するのに役立つ細菌の宿主菌株を記載する。
配列リーダーは、その全体において全てが引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第2008/0193974号及び第2010/0048864号、両方の表題「Bacterial Leader Sequences for Increased Expression」、及び米国特許出願公報第2006/0008877号、「Expression systems with Sec−secretion」、同様に米国特許出願公報第2008/0269070号及び米国特許出願第12/610,207号に詳しく記載される。
本発明に従って使用されるプロモータは、構成的なプロモータ又は調節されたプロモータであり得る。有用な調節されたプロモータの一般の例は、lacプロモータ(すなわち、lacZプロモータ)、特にDeBoerによる米国特許第4,551,433号に記載のtac及びtrcプロモータ、更にPtac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、及びT7lacプロモータ由来のファミリーのものを含む。1つの実施形態において、プロモータは宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモータは大腸菌生物体に由来する。
実施形態において、可溶性タンパク質は、生成中に、細胞の細胞質又はペリプラズムのいずれかに存在する。タンパク質を標的とするのに役立つ分泌リーダーは、本明細書に別記され、及び米国特許出願公報第2008/0193974号、米国特許出願公報第2006/0008877号、及び米国特許出願第12/610,207号に記載される。
シュードモナスを含む細菌の宿主、及び密接に関連した細菌の生物体は、本発明の方法の実行における使用のために熟慮される。特定の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。宿主細胞はまた、大腸菌細胞であり得る。
この公報は、ヌクレイン酸構築物を、染色体のlacI遺伝子挿入を含む栄養要求性のシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞に導入することによる、組み換え型ポリペプチドの生成を記載する。ヌクレイン酸構築物は、宿主細胞におけるヌクレイン酸の発現を方向付けることができるプロモータに操作しやすく結合された、組み換え型ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、また、栄養要求性の選択マーカーをコード化するヌクレオチド配列を含む。栄養要求性の選択マーカーは、原栄養性を栄養要求性の宿主細胞に回復させるポリペプチドである。実施形態において、細胞は、プロリン、ウラシル又はそれらの組み合わせのために栄養要求性である。実施形態において、宿主細胞はMB101(ATCCデポジットPTA−7841)に由来する。その全体において両方とも引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第2009/0325230号、「Protein Expression Systems」、及び「Schneider, et al., 2005, “Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high−cell−density Pseudomonas fluorescens fermentation,” Biotechnol. Progress 21(2): 343−8」は、菌株MB101におけるpyrF遺伝子を消すことにより構築されたウラシルのための、生成宿主菌株の栄養要求性を記載する。原栄養性(prototropy)を回復するためにpyrF欠失を補足することができるプラスミドを発生させるため、pyrF遺伝子は、菌株MB214(ATCCデポジットPTA−7840)からクローン化された。特定の実施形態において、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における二重pyrF−proC二重栄養要求性(dual pyrF−proC dual auxotrophic)の選択マーカーシステムが使用される。記載されるようなPyrF生成宿主菌株(production host strain)は、本発明の方法を実行するのに役立つものとして本明細書に記載のものを含む、他の所望のゲノムの変化を導入するためのバックグラウンドとして使用され得る。
幾つかの実施形態において、高スループットスクリーンは、可溶性の組み換え型毒素タンパク質を発現するための最適条件を決定するために行われ得る。スクリーンにおいて変えられる条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景(例えば、異なるプロテアーゼの欠失)、発現構築物におけるプロモータのタイプ、組換え型タンパク質をコード化する配列に融合される分泌リーダー、成長温度、誘導可能なプロモータが使用される際の誘発時のOD、lacZプロモータが使用される時の誘発に使用されたIPTGの濃度、タンパク質誘発の持続時間、培養への誘発剤の追加後の成長温度、培養の撹拌の割合、プラスミド維持のための選択法、血管における培養の量、及び細胞を溶解する方法を含む。
本発明による発現系は、任意の発酵様式(fermentation format)において培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。
提供される本発明の方法に役立つ増殖条件は、約4℃乃至約42℃の温度、及び約5.7乃至約8.8のpHを含み得る。lacZプロモータを有する発現構築物が使用されるとき、発現は、約0.01mM乃至約1.0mMの終末濃度で培養にIPTGを加えることにより誘発され得る。
本明細書に別記されるように、誘導可能なプロモータは、組み換え型毒素タンパク質、例えばlacプロモータの発現を制御するため発現構築物において使用され得る。lacプロモータ誘導体又はファミリーメンバー、例えばtacプロモータの場合、エフェクター化合物は、IPTGのような無償性誘導物質(「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)などの、誘発因子である。実施形態において、lacプロモータ誘導体が使用され、細胞密度が約80乃至約160のOD575によって同定されたレベルに達したとき、組換え型タンパク質発現は、約0.01mM乃至約1.0mMの終末濃度にIPTGを加えることによって誘発される。実施形態において、組換え型タンパク質のための培養誘発の時間でのOD575は、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180であり得る。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約100、約100乃至約120、約120乃至約140、約140乃至約160である。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約120、約100乃至約140、又は約120乃至約160である。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約140、又は約100乃至160である。細胞密度は、他の方法によって測定され得、他の単位、例えば1つの単位体積当たりの細胞において発現され得る。例えば、シュードモナスフルオレッセンス培養の約80乃至約160のOD575は、mL当たりおよそ8×1010乃至約1.6×1011のコロニー形成単位又は35乃至70g/lの乾燥菌体重量に等しい。実施形態において、培養誘発の時間での細胞密度は、細胞密度又は測定の単位を決定するために使用される方法にかかわらず、OD575での吸光度によって本明細書に特定されるような細胞密度に等しい。当業者の1人は、任意の細胞培養のために適切な転換を行う方法を知っているだろう。
多数のアッセイ方法は、タンパク質を特徴づけるための当該技術分野において既知である。組み換え型毒素タンパク質の収量又は品質を特徴づけるための任意の適切な方法の使用は、本明細書で熟慮される。
本明細書に記載のような任意の精製画分におけるタンパク質の収量は、当業者に既知の方法、例えば、毛細管のゲル電気泳動法(CGE)及びウェスタンブロット解析によって決定され得る。本明細書に記載され、当該技術分野で既知の活性アッセイはまた、タンパク質の収量に関する情報を提供し得る。実施形態において、これらの方法又は当該技術分野で既知の他の方法は、タンパク質の適切な処理、例えば、適切な分泌リーダー開裂を評価するために使用される。
CRM197発現菌株を構築し、菌株において生成された可溶性のCRM197タンパク質の量を毛細管のゲル電気泳動法(SDS−CGE)を使用して分析した。結果として生じるデータに基づき、菌株を大規模な発現に使用するために選択した。
CRM197コード配列を、CRM197アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:1は、発現された合成の最適化されたCRM197遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:2は、発現された合成の最適化されたCRM197遺伝子のDNA配列を示す。
可溶性及び不溶性の細胞の画分を、標準化された培養の音波処理によって、その後遠心分離によって調製した。冷凍されて標準化された培養液(400μL)を溶かし、3.5分間超音波で処理した。溶解産物を、20分間20,800×g(4℃)で遠心分離し、上清を、手動又は自動化液体処理を使用して取り除いた(可溶性画分)。ペレット(不溶性の画分)を冷凍し、その後、4℃で20分間20,080xgで再び遠心分離して、残りの上清を取り除いた。その後、ペレットを、400μLの1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4において再懸濁した。SDS−CGE分析のための可溶性及び不溶性のサンプルの更なる希釈を、1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4において行なった。可溶性及び不溶性のサンプルを、ジチオトレイトール(DTT)の存在下で、SDS毛細管ゲル電気泳動法(CGE)(Caliper Life Sciences, Protein Express LabChip Kit, Part 760301)のために調製した。
組み換え型CRM197タンパク質を、2リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株PS538−772、PS538−776、及びPS538−782において生成した。培養は、本明細書に、及び例えばRiesenberg, D., et al., 1991によっても記載されるような無機塩培地を含む、2リットルの発酵槽において成長し、アンモニアの追加により32℃及びpH6.5に維持された。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の撹拌及び流量の増加によって過剰に維持した。過剰レベルに維持するため、グリセロールを発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの状態を、誘発のための標的培養細胞濁度(575nm(A575)での光学濁度)が達するまで、すなわちCRM197生成を開始するためにIPTGが加えられる時点で、維持する。誘発の細胞密度を、A575の40から200までの吸光度単位(AU)で変えることができる。IPTG濃度を0.02から0.4mMまでの範囲で変えることができる。pH6から7.5、温度20乃至35℃。16−24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、及び細胞ペレットを80℃で冷凍した。サンプルを、生成物形成用のSDS−CGEによって分析した。
〈コレラ毒素B発現菌株の構築及び成長〉
コレラ毒素Bコード配列を、コレラ毒素Bアミノ酸配列をコード化するため、シュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:22は、発現された合成のコレラ毒素B遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:23は、発現された合成の最適化されたコレラ毒素B遺伝子のDNA配列を示す。
組み換え型コレラ毒素Bタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株PS538−088及びPS538−091において生成した。選択された菌株を、本明細書に、及び例えばRiesenberg, D., et al., 1991にも記載されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽で成長させ、アンモニアを付えることにより、32℃及びpH6.5に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度(575nm(A575)での光学濁度)が達するまで、すなわち標的タンパク質生成を開始するためにIPTGが加えられた時点で、維持した。CTB生成を開始するためにIPTGを加えた。16−24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−80℃で冷凍した。
〈百日咳トキソイドS1 E129A R9K発現菌株の構築及び成長〉
S1変異E129A及びR9Kにより、サブユニットS1、S2、S3、S4、及びS5をコード化する百日咳トキソイドオペロンの配列を、組み換え型百日咳毒素の発現に使用した。図3は、オペロンのマップを示す。図4は、翻訳を伴う、オペロンのDNA配列を示す(配列番号:24)。図5は、S1、S2、S3、S4、及びS5の個々のアミノ酸配列を示す。
上述された8つの培養からの可溶性画分を、百日咳トキソイド発現を評価するためにウェスタンブロットによって分析した。20マイクロリットルの可溶性画分(2倍希釈され、減少され、及び減少されなかった)を、1X Bio_Rad MESランニングバッファー中のBio−Rad 12% Bis−Tris Gel上で実行した。減少されたウェスタン分析のため、1XのXT還元剤を加えた。タンパク質を、20%のメタノールを有する1X NuPAGE転移バッファ(NuPAGE Transfer Buffer)(Invitrogen, NP0006−1)を使用して、60分間100Vで、SDS−PAGEから0.2μmのニトロセルロース膜(Biorad, 162 0232)上に伝送した。細胞膜を、PBS(Pierce, 37528)におけるBlocker(商標)の1%のカゼインにおいて、室温で1時間遮断した。検出のため、希釈剤を捨て、百日咳菌毒素S4及びS1に対する各々のモノクローナル抗体の1:1000希釈の組み合わせを含んで、多くの物を加えた(Abcam, cat# ab37686 and #37547)。ブロットを4℃で一晩振ることによりインキュベートした。ブロットを、5分間各々PBS−Tweenにより3回洗浄し、その後、1時間室温で、ヤギ由来の抗マウスIgGペルオキシダーゼの1:5,000の希釈(Sigma, Cat#A4416)を含む、より多くの希釈剤においてインキュベートした。
Immunopure Metal Enhanced DAB substrate(Pierce, 34065)を使用する発色現象の前に、ブロットを、5分間各々PBS−Tween(Sigma, P3563)により3回洗浄した。複数のサブユニットを、減少する及び減少しない条件下で、抗S1及び抗S4抗体によって検出した(図6)。観察された、発現されたトキソイドの減少した及び減少しないサンプルの横縞模様は、Sekura, et al. (J. Biological Chemistry 258: 14647, 1983)によって報告されるような、菌株165から精製された百日咳毒素に関して観察されたものと一致した。
組み換え型百日咳毒素タンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株PS538−321、PS538−324、PS538−325、PS538−326、及びPS538−328において生成する。CTB大規模発現について上述されるように、選択された菌株を2リットルの発酵槽で成長させ、IPTGにより誘発し、サンプルを分析のために調製した。サンプルを、生成物形成のため、SDS−CGEによって分析し、それらの活性をウェスタンブロットによって分析した。
〈百日咳トキソイド発現菌株の構築及び成長〉
S1を有する、サブユニットS1、S2、S3、S4、及びS5をコード化する野生型の百日咳毒素オペロンの配列を、組み換え型百日咳トキソイドの発現に使用する。図13は、翻訳を伴う、野生型のオペロンのDNA配列を示す(配列番号:35)。
〈破傷風毒素C発現菌株の構築及び成長〉
破傷風毒素Cコード配列を、破傷風毒素Cアミノ酸配列順序をコード化するためにシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:30は、発現された合成の破傷風毒素C遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、及び配列番号:31は、発現されたた合成の最適化された破傷風毒素C遺伝子のDNA配列を示す。
組み換え型破傷風毒素Cタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株PS538−529、PS538−538、PS538−544、PS538−546、PS538−547、PS538−548、PS538−558、PS538−565及びPS538−568において生成した。選択された菌株を、CRM197について上述されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽において成長させた。
〈TcdB発現菌株の構築及び成長〉
TcdBコード配列を、TcdBアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:32は、発現された合成のTcdB遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:33は、発現された合成の最適化されたTcdB遺伝子のDNA配列を示す。
組み換え型クロストリジウムディフィシレ毒素Bタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株PS538−654、PS538−659、PS538−669、PS538−671、及びPS538−674において生成した。選択された菌株を2リットルの発酵槽で成長させ、IPTGにより誘発し、CTB大規模発現について上述されるように、サンプルを分析して調製した。
〈緑膿菌外毒素A発現菌株の構築及び成長〉
緑膿菌外毒素A突然変異体rEPAコード配列を、rEPAアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。図13は、発現した合成のrEPA遺伝子のアミノ酸及びDNA配列を示す。
組み換え型緑膿菌外毒素Aタンパク質(rEPA)を、2リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株PS538−1633、PS538−1640及びPS538−1670において生成した。培養を、本明細書に、また例えばRiesenberg, D., et al., 1991に記載されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽において成長させ、アンモニアを追加することにより32℃及びpH6.5に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達する。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度(575nm(A575)での光学濁度)が達するまで、すなわちrEPA生成を開始するためにIPTGが加えられた時点で、維持した。誘発時の細胞密度は、A575の40から200までの吸光度単位(AU)で変えることができる。IPTG濃度を、0.02乃至0.4mMの範囲で変えることができる。pH6乃至7.5及び温度20乃至35℃。16−24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−80℃で冷凍した。サンプルを生成物形成用のSDS−CGEによって分析した。
〈野生型ジフテリア毒素発現菌株の構築及び成長〉
ジフテリア毒素コード配列を、野生型ジフテリア毒素アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。配列番号:36は、発現された合成のジフテリア毒素遺伝子のアミノ酸配列を示し、配列番号:37は、発現された合成の最適化されたジフテリア毒素遺伝子のDNA配列を示す。
組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株において生成する。選択された菌株を、2リットルの発酵槽において成長させ、IPTGにより誘発し、CRM197大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをSDS−CGEによって分析する。
〈CTX発現菌株の構築及び成長〉
CTXコード配列を、CTXアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。コード配列は、図14に示されるCTX遺伝子のアミノ酸及びDNA配列に基づく。
組み換え型コレラホロトキシンタンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術(Pfenex Expression Technology)(商標)菌株において生成する。選択された菌株を、2リットルの発酵槽において成長させ、IPTGにより誘発し、CRM197大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをSDS−CGEによって分析する。
Claims (36)
- シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法であって、前記方法は:
発現ベクターへ、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を連結する工程;
発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程;及び
組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み;
前記組み換え型毒素タンパク質は、CRM197、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、及び緑膿菌外毒素Aから選択され、又は
前記組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、及び緑膿菌外毒素Aから選択され、又は
前記組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、及びクロストリジウムディフィシレ毒素Bから選択される、ことを特徴とする方法。 - 前記組換え型タンパク質は、1リットル当たり0.2グラム乃至1リットル当たり約12グラムの可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量にて生成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 1リットル当たり約0.2グラム乃至1リットル当たり約12グラムである可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量は、約0.2g/L、約0.3g/L、約0.4g/L、約0.5g/L、約0.6g/L、約0.7g/L、約0.8g/L、約0.9g/L、約1g/L、約1.5g/L、約2g/L、約2.5g/L、約3g/L、約3.5g/L、約4g/L、約4.5g/L、約5g/L、約5.5g/L、約6g/L、約6.5g/L、約7g/L、約7.5g/L、約8g/L、約8.5g/L、約9g/L、約9.5g/L、約10g/L、約10.5g/L、約11g/L、約12g/L、約0.2g/L乃至約0.5g/L、約0.2g/L乃至約1g/L、約0.2乃至約2g/L、約0.3g/L乃至約0.6g/L、約0.3g/L乃至約1g/L、約0.3乃至約2g/L、約0.4乃至約0.7g/L、約0.4乃至約1g/L、約0.4乃至約2g/L、約0.4乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約1g/L、約0.5g/L乃至約2g/L、約0.5g/L乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約4g/L、約0.5g/L乃至約5g/L、約0.5g/L乃至約6g/L、約0.5g/L乃至約7g/L、約0.5g/L乃至約8g/L、約0.5g/L乃至約9g/L、約0.5g/L乃至約10g/L、約0.5g/L乃至約11g/L、約0.5g/L乃至約12g/L、約1g/L乃至約2g/L、約1g/L乃至約3g/L、約1g/L乃至約4g/L、約1g/L乃至約5g/L、約1g/L乃至約6g/L、約1g/L乃至約7g/L、約1g/L乃至約8g/L、約1g/L乃至約9g/L、約1g/L乃至約10g/L、約1g/L乃至約11g/L、約1g/L乃至約12g/L、約2g/L乃至約3g/L、約2g/L乃至約4g/L、約2g/L乃至約5g/L、約2g/L乃至約6g/L、約2g/L乃至約7g/L、約2g/L乃至約8g/L、約2g/L乃至約9g/L、約2g/L乃至約10g/L、約2g/L乃至約11g/L、約2g/L乃至約12g/L、約3g/L乃至約4g/L、約3g/L乃至約5g/L、約3g/L乃至約6g/L、約3g/L乃至約7g/L、約3g/L乃至約8g/L、約3g/L乃至約9g/L、約3g/L乃至約10g/L、約3g/L乃至約11g/L、約3g/L乃至約12g/L、約4g/L乃至約5g/L、約4g/L乃至約6g/L、約4g/L乃至約7g/L、約4g/L乃至約8g/L、約4g/L乃至約9g/L、約4g/L乃至約10g/L、約4g/L乃至約11g/L、約4g/L乃至約12g/L、約5g/L乃至約6g/L、約5g/L乃至約7g/L、約5g/L乃至約8g/L、約5g/L乃至約9g/L、約5g/L乃至約10g/L、約5g/L乃至約11g/L、約5g/L乃至約12g/L、約6g/L乃至約7g/L、約6g/L乃至約8g/L、約6g/L乃至約9g/L、約6g/L乃至約10g/L、約6g/L乃至約11g/L、約6g/L乃至約12g/L、約7g/L乃至約8g/L、約7g/L乃至約9g/L、約7g/L乃至約10g/L、約7g/L乃至約11g/L、約7g/L乃至約12g/L、約8g/L乃至約9g/L、約8g/L乃至約10g/L、約8g/L乃至約11g/L、約8g/L乃至約12g/L、約9g/L乃至約10g/L、約9g/L乃至約11g/L、約9g/L乃至約12g/L、約10g/L乃至約11g/L、約10g/L乃至約12g/L、又は約11g/L乃至約12g/Lであることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記毒素タンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列が、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合されることを特徴とする、請求項1乃至3の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞は、少なくとも1つのプロテアーゼの発現を欠き、又は前記宿主細胞は、少なくとも1つのフォールディングモジュレータ、又はその組み合わせを過剰発現させることを特徴とする、請求項1乃至4の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、前記宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が、Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V、又はPbpである分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至6の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、宿主細胞が、セラリシン、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、AprA、又はそれらの任意の組み合わせの発現を欠き、又は宿主細胞が、DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現し、及び更に、前記組み換え型毒素タンパク質がAzu、Pbp、又は自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至6の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞がDsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞がセラリシンの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞がHslU及びHslVの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、前記宿主細胞が野生型であり、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至4の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、前記組み換え型毒素タンパク質が、分泌リーダーAzu、Pbp、IbpS31A、CupA2、又はPbpA20Vに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がコレラ毒素Bであり、前記宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠き、又はHslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、DegP2 S219Aを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Lon、la、及びAprAの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp A20Vに融合され、又はHslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、DegP2 S219Aを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーDsbAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は14の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が、百日咳毒素S1 E129A R9Kであり、宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠き、GrpE、DnaK、及びDnaJを過剰発現し、HtpXの発現を欠き、RXF01590の発現を欠き、又はppiB(RXF05345)の発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がその自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は16の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞が、Lon、la及びAprAの発現を欠き、又は前記宿主細胞が、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、又は前記宿主細胞がdsbABCDを過剰発現し、又は前記宿主細胞がGrpE、DnaK、及びDnaJを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が、分泌リーダーTolB、DsbA、DsbC、Pbp A20V、NikA、又はCupA2に融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は18の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーDsbAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5、18、又は20の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞がGrpE、DnaK、及びDnaJの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーNikAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5、18、20、又は22の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質がクロストリジウムディフィシレ毒素Bであり、前記宿主細胞がHtpXの発現を欠き、DegP1の発現を欠き、HslU、HslV、Prc1及びPrc2の発現を欠き、Lon、la、及びDegP2の発現を欠き、又は;前記宿主細胞が、Lon、Prc1、DegP2、AprAの発現を欠き、DegP2 S219Aを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。
- 活性アッセイにおける前記組み換え型毒素タンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、生成された水溶性毒素タンパク質の約40%乃至約100%が活性であると決定されることを特徴とする、請求項1乃至24の何れか1つに記載の方法。
- 前記活性アッセイが、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、タンパク質コード配列に効果的に連結されたlac誘導体プロモータを含み、前記培養が、約0.02乃至約1.0mMの濃度でIPTGを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度が、約40乃至約200の吸光度単位(AU)の光電密度であり、培養のpHが約6乃至約7.5であり、成長温度が約20乃至約35℃であることを特徴とする、請求項1乃至26の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞が、緑膿菌細胞であることを特徴とする、請求項1乃至27の何れか1つに記載の方法。
- 前記宿主細胞がシュードモナスフルオレッセンスであることを特徴とする、請求項1乃至28の何れか1つに記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列がシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項1乃至29の何れか1つに記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列がシュードモナス宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列がシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項29に記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が百日咳毒素であり、前記百日咳毒素が野生型又はS1 E129A R9Kであることを特徴とする、請求項1乃至4又は25乃至32の何れか1つに記載の方法。
- 前記組み換え型毒素タンパク質が緑膿菌外毒素Aであり、前記緑膿菌外毒素Aが野生型、CRM66、又はrEPAであることを特徴とする、請求項1乃至4又は25乃至32の何れか1つに記載の方法。
- 前記発現ベクターが分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項4乃至34の何れか1つに記載の方法。
- 前記発現ベクターが、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1乃至35の何れか1つに記載の方法。
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