JP2021500896A - 組み換えerwiniaアスパラギナーゼの製造のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、参照により本願明細書中に組み込まれる2017年10月27日に提出された米国仮出願番号62/578,305の利益を主張する。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2018年10月16日に作成された該ASCIIコピーの名前は38194-749_601_SL.txtで、サイズは71,228バイトである。
クリサンタスパーゼとも呼ばれる細菌Erwinia chrysanthemiからのL−アスパラギナーゼII型は、E.coli由来のネイティブまたはペグ化アスパラギナーゼに対して過敏症または無症状の不活性化を発症している急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者の処置のための他の化学治療の薬剤と組み合わせて示される。それは、他の腫瘍性状態の処置にも使用できる。クリサンタスパーゼはErwinia chrysanthemiの発酵により生成され、一連のクロマトグラフィーおよび他の方法により薬物物質を生じる酵素調製物を生じるように処理される細胞ペーストを製造する。Erwinia中で発現された場合、クリサンタスパーゼプレタンパク質は、N末端に存在するネイティブ分泌シグナル配列を使用して、細胞のペリプラズム空間への分泌を行う。ペリプラズムの空間内に局所化されると、該シグナル配列は開裂されて、四量体または活性なクリサンタスパーゼの形態に自然に融合することができる成熟した単量体を生じる。いくつかの場合において、組み換えクリサンタスパーゼは、異種ソースからの種々の分泌シグナルペプチドとの融合を使用して、E.coli中で発現される。
本願明細書中で言及されているすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが特異的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本願明細書中に組み込まれる。
概要
Pseudomonas宿主細胞中で、クリサンタスパーゼとしても知られているErwinia chrysanthemiからの可溶性組み換えL−アスパラギナーゼII型を製造する方法が、本願明細書中で開示される。全細胞タンパク質のパーセンテージとしてのクリサンタスパーゼ製造の高いレベル、例えば40%までのTCPクリサンタスパーゼ、例えば、検出可能な分解なく活性な四量体を形成することができるクリサンタスパーゼ単量体が本願明細書中で記載される。クリサンタスパーゼ製造の高い力価、例えば、クリサンタスパーゼ1リットルあたり20グラムまで、例えば、検出可能な分解なく活性な四量体を形成することができるクリサンタスパーゼ単量体が、本願発明の方法を用いて得られる。クリサンタスパーゼを製造するための宿主細胞は、Pseudomonas、例えばPseudomonas fluorescensを含むが、これらに限定されない。クリサンタスパーゼ発現構築物は、選択した宿主株に応じてコドン最適化されることができる。
II型L−アスパラギナーゼを含むアスパラギナーゼは、L−アスパラギンのL−アスパラギン酸およびアンモニアへの加水分解を触媒する酵素である(L−アスパラギン+H2O=L−アスパラギン酸+NH3)。II型L−アスパラギナーゼは、ALLおよびいくつかの他の癌を処置するためのマルチ薬剤化学治療のレジメンの一部として使用される。正常細胞はアスパラギンを合成することができるが、特定の癌細胞はアスパラギン合成酵素の欠如のためにアスパラギンを合成することができない。したがって、アスパラギナーゼの患者への投与は、可溶性アスパラギンの加水分解および循環アスパラギンを結果として生じる。これは、正常細胞に対するより少ない効果効果を有する癌細胞の死につながることができる。アスパラギナーゼは、例えば、参照により本願明細書中で組み込まれる、「Drug Discovery and Design: Medical Aspects」、IOS Press, Matsoukas, J.、およびMavromoustakos, T., 編における、PritsaおよびKyriakidis, 2002、「L-Asparaginase: Structure, Properties, and Anti-Tumor Activity」中に記載される。
いくつかの場合において、本願明細書中の方法は、発現構築物からの組み換えクリサンタスパーゼをPseudomonas宿主細胞中で発現させることを含む。いくつかの場合において、発現構築物はプラスミドである。いくつかの実施形態において、クリサンタスパーゼ配列をコードするプラスミドは選択マーカーを含む、プラスミドを維持する宿主細胞は選択的な状態で成長する。いくつかの実施形態において、プラスミドは選択マーカーを含まない。いくつかの実施形態において、発現構築物は宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、発現構築物は、クリサンタスパーゼをペリプラズムに誘導する分泌シグナルに融合したクリサンタスパーゼをコードする。いくつかの実施形態において、分泌シグナルは宿主細胞中で開裂される。いくつかの実施形態において、発現構築物は分泌シグナルをコードせず、クリサンタスパーゼは細胞質に向けられる。
本願明細書中の方法に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーターまたは制御されたプロモーターであることができる。有用な制御されたプロモーターの共通の例は、lacプロモーター(すなわち、lacZプロモーター)、特に米国特許番号4,551,433において記載されるtacおよびtrcプロモーターからDeBoer並びにPtac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5およびT7lacプロモーターに由来するファミリーのものを含む。1つの実施形態において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターはE.coli生物由来である。
実施形態において、可溶性組み換えクリクリススパーゼは、製造中に細胞の細胞質またはペリプラズムのいずれかに存在する。タンパク質、例えばクリサンタスパーゼの標的化に有用な分泌リーダーは、本願明細書中の他の場所で、および上記で参照される米国特許出願公開番号2008/0193974、米国特許出願公開番号2006/0008877および米国特許出願Ser.No.12/610,207に記載される。いくつかの実施形態において、クリサンタスパーゼをPseudomonadまたはPseudomonas細胞のペリプラズムに輸送する分泌リーダーに融合したクリサンタスパーゼをコードする発現構築物が提供される。いくつかの実施形態において、分泌リーダー分泌リーダーはクリサンタスパーゼタンパク質から開裂される。いくつかの実施形態において、分泌リーダーは、可溶性クリサンタスパーゼの製造を容易にする。
Pseudomonadsを含む細菌宿主、および密接に関連する細菌生物は、本願明細書中の方法の実践における使用のために検討される。特定の実施形態において、Pseudomonad宿主細胞はPseudomonas fluorescensである。いくつかの場合において、宿主細胞はE.coli細胞である。
他のPseudomonas生物も有用であってもよい。Pseudomonadsおよび密接に関連する種は、Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria(オンライン公開、2015)に記載されるファミリーおよび/または属に属するプロテオバクテリアの群を含むグラム陰性プロテオバクテリア亜群1を含む。表3は、生物のこれらのファミリーおよび属を示す。
1つの実施形態において、本願明細書中で提供される方法は、1以上のプロテアーゼ遺伝子中の1以上の突然変異(例えば、部分的または完全な欠失)を含むPseudomonas宿主細胞を使用して、組み換えクリサンタスパーゼタンパク質を製造することを含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ遺伝子中の突然変異は、組み換えクリサンタスパーゼタンパク質の生成を促進する。
1つの実施形態において、本願明細書中の方法は、目的の株におけるコドンの使用のために最適化された構築物からの組み換えクリサンタスパーゼの発現を含む。実施形態において、株は、Pseudomonas宿主細胞、例えば、Pseudomonas fluorescensである。細菌宿主中での発現を改善するためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載される。例えば、Pseudomonas宿主株中での発現のためのコドンの最適化は、参照によりその全体が本願明細書中で組み込まれる米国特許出願公開番号2007/0292918、「Codon Optimization Method」に記載される。
いくつかの実施形態において、高いスループットスクリーンは、可溶性組み換えクリサンタスパーゼを発現するための最適な状態を決定するためにしばしば行われる。スクリーンにおいて変化する状態は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景(例えば、異なるプロテアーゼの欠失)、発現構築物中のプロモーターのタイプ、コードされたクリサンタスパーゼに融合した分泌リーダーのタイプ、成長の温度、誘導性プロモーターを使用した場合の誘導のOD、追加されたインデューサーの量(例えば、lacZプロモーターまたはその誘導体を使用した場合の誘導に使用されるIPTGの量)、タンパク質誘導の持続時間、培養物への誘導剤の添加に続く成長の温度、培養の攪拌速度、プラスミド維持のための選択の方法、容器内の培養の体積、および細胞溶解の方法を含む。
本願明細書中の方法において有用な成長状態は、約4°Cから約42°Cの温度および約5.7から約8.8のpHをしばしば含む。lacZプロモーターまたはその誘導体を有する発現構築物を使用する場合、培養物に終濃度約0.01mMから約1.0mMでIPTGを加えることにより発現がしばしば誘導される。
本願明細書中で他に記載されるように、誘導性プロモーターは、組み換えクリサンタスパーゼ、例えば、lacプロモーターの発現をコントロールするために発現構築物中でしばしば使用される。lacプロモーター誘導体またはファミリーメンバー、例えばtacプロモーターの場合、エフェクター化合物は、PTG様無償性インデューサー(「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれるイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド)などのインデューサーである。実施形態において、lacプロモーター誘導体が使用され、細胞密度が約25から約160のOD575により同定されるレベルに達したときに、IPTGの約0.01mMから約1.0mMの終濃度への添加により、クリサンタスパーゼ発現が誘導される。実施形態において、クリサンタスパーゼの培養誘導時のOD575は、約25、約50、約55、約60、約65、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180である。他の実施形態において、OD575は、約80から約100、約100から約120、約120から約140、約140から約160である。他の実施形態において、OD575は約80から約120、約100から約140、または約120から約160である。他の実施形態において、OD575は約80から約140、または約100から160である。細胞密度は他の方法でしばしば測定され、他の単位で、例えば単位体積あたりの細胞数で表される。例えば、Pseudomonas fluorescens培養物の約25から約160のOD25は、1mLあたりおよそ2.5x1010から約1.6x1011のコロニー形成単位または11から70g/L乾燥細胞重量、または約0.05g/gから約0.4g/g湿潤細胞重量と同等である。実施形態において、OD575の細胞密度の測定値は、1x109に等しい1のOD575の変換でCFUの測定値に変換される;0.002g/gに等しい1のOD575の変換で湿潤細胞重量の測定値に変換される;0.44g/Lに等しい1のOD575の変換で乾燥細胞重量の測定値に変換される。実施形態において、クリサンタスパーゼ発現は、細胞密度が約0.05g/gから約0.4g/gの湿潤重量に達したときに、IPTGの約0.01mMから約1.0mMの終濃度への添加により誘導される。実施形態において、湿潤細胞重量は、約0.05g/g、約0.1g/g、約0.15g/g、約0.2g/g、約0.25g/g、約0.30g/g、約0.35g/g、約0.40g/g、約0.05g/gから約0.1g/g、約0.05g/gから約0.15g/g、約0.05g/gから約0.20g/g、約0.05g/gから約0.25g/g、約0.05g/gから約0.30g/g、約0.05g/gから約0.35g/g、約0.1g/gから約0.40g/g、約0.15g/gから約0.40g/g、約0.20g/gから約0.40g/g、約0.25g/gから約0.40g/g、約0.30g/gから約0.40g/g、または約0.35g/gから約0.40g/gである。実施形態において、湿潤細胞重量は約0.1g/gから約0.5g/gである。実施形態において、培養誘導時の細胞密度は、細胞密度または測定の単位の決定のために使用される方法にかかわらず、OD575での吸光度により本願明細書中で特定された細胞密度と同等である。当業者は、任意の細胞培養に適する変換を行う方法を知っているであろう。
1つの実施形態において、発酵は組み換えクリサンタスパーゼの製造方法において使用される。本開示による発現系は、任意の発酵形式において培養される。例えば、バッチ、フェッドバッチ、半連続、および連続発酵モードは、本願明細書中で採用されてもよい。
実施形態において、本願明細書中で提供される方法により製造される組み換えクリサンタスパーゼタンパク質が分析される。組み換えクリサンタスパーゼは時に、例えばバイオレイヤー干渉法、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、ファーウェスタンブロット、ELISA、吸光度、またはマススぺクトロメトリー(例えばタンデムマススぺクトロメトリー)により分析される。
タンパク質の「溶解性」および「活性」は、関連する性質であるが、一般に異なる手段により決定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の溶解性は、疎水性アミノ酸残基がフォールディングされたタンパク質の外側に不適切に配置されていることを示す。例えば以下に記載されるような異なる方法を使用してしばしば評価されるタンパク質活性は、適切なタンパク質コンフォメーションの別の指標である。本明細書中で使用される「可溶性、活性な、または両方」は、当業者に既知の方法により、可溶性、活性な、または可溶性および活性両方であると決定されるタンパク質を指す。
クリサンタスパーゼ活性を評価するためのアッセイは、当該技術分野において既知であり、蛍光測定法、比色分析、化学発光法、分光光度法、および当業者に入手可能な他の酵素アッセイを含むが、これらに限定されない。これらのアッセイは、クリサンタスパーゼ調製物の活性または有効性を商業的なまたは他のクリサンタスパーゼ調製物と比較するために使用できる。
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を説明する目的のために与えられ、いかなる形でも本開示を限定することは意図されない。本実施例は、本願明細書中に記載され方法とともに、現在代表的な実施形態であり、例示的であり、範囲を制限することは意図されない。そこでの変化および特許請求の範囲により定義される開示の精神の範囲内に包含される他の使用は、当業者に発生するだろう。
プロジェクトを、発現株を構築することにより開始した。クリサンタスパーゼタンパク質をコードする遺伝子を、P.fluorescens中での発現のために最適化し、40の発現ベクターのそれぞれに合成してライゲートし、1の細胞質および39のペリプラズムクリサンタスパーゼタンパク質発現戦略を促進した。プラスミドを、結果として240の固有の発現株を生じる24のP.fluorescens宿主株(プロテアーゼ欠失(PD)株、フォールディングモジュレーター過剰発現(FMO)株、プロテアーゼ欠失プラスフォールディングモジュレーター過剰発現(PD/FMO)株、および野生型(WT)株からなる)に形質転換した。
最適な発現のための合成クリサンタスパーゼ遺伝子の設計
クリサンタスパーゼペプチド配列(図2、配列番号2)をコードするDNAを、P.fluorescensのための適するコドン使用を反映するように設計した。固有の制限酵素部位(SapIまたはLguI)を含有するDNA領域を、発現ベクター中に存在する分泌リーダーコード配列を有するフレーム中での直接融合のために設計されるクリサンタスパーゼコード配列の上流に加えた。3のストップコドンおよび固有の制限酵素部位(SapI)を含有するDNA領域を、コード配列の下流に加えた。pJ201:226734と呼ばれる合成遺伝子は、DNA2.0 Inc.により製造された。
HTPティア1発現戦略(またはプラスミド)スクリーンに使用される発現プラスミドの構築に、標準的なクローニング方法を使用した。最適化されたクリサンタスパーゼタンパク質コード配列を含有するプラスミドpJ201-226734を、DNA2.0から得た。pJ201-226734プラスミドを、制限酵素SapIで消化し、最適化されたクリサンタスパーゼ遺伝子を含有する993bp断片を40の総発現ベクター中にサブクローニングして、1つの細胞質および39のペリプラズム発現戦略を促進した。ペリプラズム発現パラメーターは、37の異なるペリプラズムリーダーおよび2のリボソーム結合部位(RBS)親和性を含んだ。インサートおよびベクターを、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、M0202S)で一晩ライゲートし、96ウェル形式でコンピテントP.fluorescens宿主株中に電気穿孔した。結果として生じるプラスミドを、表5に記載されるようにp743-001からp743-040と名付けた。2の追加のプラスミド、p743-041およびp743-042が、宿主株スクリーニングに含まれた。p743-042プラスミドを、p743-001プラスミドと同様に、細胞質クリサンタスパーゼタンパク質の発現のために設計した。しかしながら、p743-042プラスミドを、PCRベースの方法を使用して後で構築し、プラスミドp743-001のクリサンタスパーゼコード配列中のイニシエーターメチオニンコドンにすぐに続いて存在する余分なアラニンコドンを除去した。
発現プラスミドスクリーニング(HTPティア1)について、クリサンタスパーゼ発現プラスミド(表5)のそれぞれのライゲーション混合物を、P.fluorescens宿主株DC454(PyrF欠損、野生型プロテアーゼ(WT))およびDC441(pyrF、Lon、およびHslUV欠損(PD))細胞に形質転換した。コンピテント細胞の25マイクロリットルを解凍し、96マルチウェルNucleovette(登録商標)プレート(LonzaVHNP-1001)に移し、各ウェルにライゲーション混合物を加えた。NucleofectorTM96ウェルShuttleTMシステム(Lonza AG)を使用して、細胞を電気穿孔した。次いで、細胞を、400μlのM9塩1%グルコース培地および微量元素(Teknova)を有する96ウェルディープウェルプレートに移した。96ウェルプレート(シードプレート)を、30°Cで48時間振とうしながらインキュベートした。10マイクロリットルのシード培養を、96ウェルディープウェルプレート中に二重で移し、各ウェルは、500μlのHTP培地(Teknova)を含有し、微量元素および5%グリセロールを補足され、以前のように24時間インキュベートされた。イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を24時間の時点で各ウェルに0.3mMの終濃度で添加して、標的タンパク質の発現を誘導した。マンニトール(Sigma、M1902)を、各ウェルに1%の終濃度で添加して、フォールディングモジュレーター過剰発現株中でフォールディングモジュレーターの発現を誘導した。細胞密度を、誘導後24時間で、600nm(OD600)での光学密度により測定し、成長をモニターした。誘導後24時間で、細胞を採取し、400μlの最終体積に1XPBS中で1:3に希釈し、次いで凍結した。
クリサンタスパーゼタンパク質アミノ酸配列(図2)をインプットとして使用したP.fluorescensMB214ゲノム配列のBLAST検索は、以下の有意なアラインメントを示す2のタンパク質コード遺伝子(ペグ)のアウトプットを結果として生じた:ペグ.3886(L-アスパラギナーゼEC3.5.1.1 II型、配列番号62); E値5e-85およびペグ.5048(L-アスパラギナーゼEC 3.5.1.1、配列番号61); E値3e-05。各ネイティブL-アスパラギナーゼ遺伝子についてのクローン化された欠失構築物を、欠失について標的化された遺伝子のスタートおよびストップコドンのみを残す各遺伝子についての上流および下流隣接領域の融合を含有するDNA配列断片を合成することによって開始した。Genewiz Inc. (South Plainfield, NJ)は、それぞれ欠失プラスミドpFNX3970およびpFNX3969を製造するために、ベクターpDOW1261-24のSrI部位中にその後平滑末端ライゲートされる配列断片delPEG3886(1,107bp)およびdelPEG5048(801bp)の合成を完了した。
以下の方法を使用して、選択された宿主株中で、各遺伝子の染色体欠失を順次実施した:欠失プラスミドを、ウラシル(ピリミジン)生合成に関与するpyrF遺伝子中に染色体欠失を含有するP.fluorescens宿主株中に電気穿孔した。欠失プラスミドは、PyrFコード配列を含有するが、P.fluorescens細胞中では複製できない。電気穿孔した細胞を、1%グルコースおよび250ug/mLプロリン(宿主株がプロリン栄養要求性の場合)を補足したM9塩寒天プレート上に播種した。結果として生じるクローンは、欠失プラスミド全体をゲノム内の2つの相同な領域の1つにある染色体中に組み換えさせる組み込み事象により、ウラシルを合成することができる。組み込まれたプラスミドおよび染色体の間で第2の相同な組み換えを実行し、それにより欠失を残す細胞を選択するために、プラスミド統合株を、250ug/mLウラシルおよび250ug/mLプロリン(宿主株がプロリン栄養要求性の場合)を補足した3mLLB培地中で定常期まで成長させた。次いで、細胞を、500ug/mLの5-フルオロオロチン酸(5-FOA)(Zymo Research)をも含有するLBウラシル(250ug/mL)プラス250ug/mLプロリン(宿主株がプロリン栄養要求株の場合)寒天培地上に播種した。組み換えによって組み込まれたプラスミドを失う細胞はまた、pyrF遺伝子も失い、したがって細胞成長を妨げる毒性化合物に他の方法で変換される5-FOAに耐性があると予想される。次いで、5-FOA(500ug/mL)の存在下で良好な成長を示す単一コロニーを採取し、250μg/mLウラシルおよび250μg/mLプロリン(宿主株がプロリン栄養要求性の場合)を補足した1%グルコースを含有する3mL液体M9最少培地中で成長させ、グリセロールストックとしておよび診断用PCRおよびシーケンシング反応のためのテンプレートとしての保存のための培養を生成した。
診断用PCR反応を使用して、ノックアウトプラスミドにクローン化された合成された遺伝子欠失配列の外側の染色体領域にアニールしているプライマーを利用して、所望のネイティブL-アスパラギナーゼ遺伝子染色体欠失をスクリーンした。生成されたPCR産物のDNAシーケンシングを使用して、所望のネイティブL-アスパラギナーゼ遺伝子欠失が、不所望の突然変異またはDNA再構成なく予想されるように発生したことを決定した。
3のクリサンタスパーゼ発現株および2のヌル株(P.fluorescens野生型株DC454ヌルおよびP.fluorescensネイティブL−アスパラギナーゼ1および2型欠損株PF1433ヌル)を、振とうフラスコ発現スケールアップ実験のために選択した。ヌル株は、タンパク質クリサンタスパーゼコード配列を欠いている発現ベクターを保有した。PF1433(PyrF、AspG1、およびAspG2欠損)を、宿主株DC454(PyrF欠損)中のaspG2およびaspG1遺伝子の順次欠失により構築した。
2L規模の発酵(およそ1Lの最終発酵体積)のための接種材料を、酵母抽出物およびグリセロールを補足した化学的に定義された培地の600mLを含有する振とうフラスコを選択された株の凍結培養ストックで接種することにより生成した。30°Cで振とうしながら16から24時間インキュベートした後、次いで、振とうフラスコ培養の各等しい部分を、高いバイオマスを支持するように設計された化学的に定義された培地を含有する8ユニットのマルチプレックス発酵システムのそれぞれに移した。2L発酵槽において、培養物を、グリセロールフェッドバッチモードで、pH、温度、および溶存酸素についてコントロールされた状態で操作した。ファッドバッチ高細胞密度発酵プロセスは、培養が標的バイオマス(湿潤細胞重量)に達するとIPTGの添加によって開始される、誘導期がその後に続く成長期で構成された。誘導期中の状態は、実験設計に従って変化した。発酵の誘導期はおよそ24時間進行させた。分析試料を、発酵槽から回収し、細胞密度(575nmでの光学密度)を決定し、次いで、その後の分析のために凍結され、標的遺伝子の発現レベルを決定した。誘導後24時間の最終時点で、各容器の全発酵ブロスを、15,900xgで60から90分間、遠心分離により採取した。細胞ペーストおよび上澄みを分離し、ペーストを保持して-80°Cで凍結した。
遠心分離がその後に続く超音波処理により、可溶性画分を調製した。培養ブロス試料(400μL)を、以下の設定下で24プローブチップホーンを有するCell Lysis Automated Sonication System(CLASS、Scinomix)で超音波処理した:パルスあたり10秒でウェルあたり20パルス、および各パルス間10秒で60%パワー(Sonics Ultra-Cell)。ライセートを5,500xgで15分間(4°C)遠心分離し、上清を回収した(可溶性画分)。
タンパク質試料を、HTプロテインエクスプレスチップおよび対応する試薬(それぞれ部品番号760528およびCLS760675、PerkinElmer)を有するLabChip GXII機器(PerkinElmer)を使用して、マイクロチップSDSキャピラリーゲル電気泳動によって分析した。試料を、製造者のプロトコル(Protein User Guide Document No. 450589, Rev. 3)に従って調製した。簡単に言えば、96ウェルポリプロピレンコニカルウェルPCRプレートにおいて、4μLの試料を14μLのサンプルバッファー、70mMDTT還元剤と混合し、95°Cで5分間加熱し、そして70μLDI水を添加して希釈した。ヌル-株ライセートを、テスト試料と並行して泳動した。LabChip GX v.4.0.1425.0を使用して、データを分析し、ゲル様画像を生成した。
SDS−PAGE分析を使用して、アスパラギナーゼの同一性および純度を決定した。70℃で10分間加熱する前に、テスト試料を、PBSおよびローディングバッファープラス25mM DTTで希釈した。試料を2または4μg/ウェルで12%Bis-Trisゲルにロードした。染料の前線がゲルの長さを下って移動するまで(およそ1時間)、試料を200Vの定電圧下、1xMOPSランニングバッファーで分離した。電気泳動後、1または2μg/ウェルを有するゲルをOriole蛍光ゲル染色(Bio-Rad)で1時間染色し、4μg/ウェルロードを有するゲルをGelCodeBlue(ThermoFisher)で一晩染色した。染色後、蛍光染色したゲルを水中に移し、次いでGelDocEZシステム(Bio-Rad)を使用して画像化した。青色に染色されたゲルを、脱染のためにおよそ1.5から2時間水中に移し、次いでGelDoc EZを使用して画像化した。
ウェスタンブロットを使用して、アスパラギナーゼの同一性を決定した。70°Cで10分間加熱する前に、テスト試料をPBSおよび還元剤DTTを有するローディングバッファーで希釈した。次いで、試料を1μg/ウェルでロードし、SDS-PAGE実行状態と同じように、12%Bis-Trisゲル上で分離した。電気泳動に続き、25V、125mAで90分間、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。Blocker Casein(Thermo)を使用して2から8°Cで一晩ブロックし、その後PBST(Sigma)で3回洗浄した。次いで、膜を室温で50rpmで1時間、PBST9部およびBlockerCasein1部で1:5000に希釈したウサギ抗クリサンタスパーゼポリクローナル抗体とインキュベートした。3回のPBST洗浄に続き、HorseradichPeroxidase(HRP)に結合したヤギ抗ウサギIgGを、9:1のPBST:カゼイン溶液で1:5000に希釈し、室温で50rpmで1時間インキュベートした。3回のさらなる洗浄に続き、DAB基質(Thermofisher)の添加により抗原抗体複合体を明らかにした。バンドがはっきりと見えた後、膜を水中に移すことにより反応を停止し、GelDocEZイメージングシステム(Bio-Rad)を使用して膜を画像化した。
試料のためのSE−HPLCを、DAD UV検出器を備えたAgilent Technologies 1100 HPLCシステム上で実施した。移動相は、50mMリン酸ナトリウム、200mMNaClpH7.0であった。ストック薬物製品の1xPBSでの1mg/mLへの希釈は、50μgの各試料を、Phenomenex BioSep SEC s4000HPLCガードカートリッジを有するPhenomenexSEC-s4000(7.8mmIDx300mm、5μm)HPLC分析カラム上にロードするのを可能にした。UV吸光度を、流速1.0mL/minで215nmでモニターした。カラムおよび試料の温度を、18分の総ラン時間ではコントロールしなかった。OpenLabソフトウェアを使用して、面積%の純度を計算した。ピーク組み込みを、標準接線スキムモードおよびすべてのスキム組み込み事象についてのゼロ値で実施した。ベースライン補正を、ピークの谷に対する比500でNo Penetrationに設定した。最初の組み込み事象は、勾配感度1、ピーク幅0.25、面積排除1、高さ排除10、およびDROPに設定された肩組み込みを含む。組み込みを、0から7分、および11.15分からラン終了まで禁止した。ベースラインも9分でBaseline Holdに設定した。
可溶性ライセート試料を、マススぺクトロメトリー(LC-MS)に連結された液体クロマトグラフィーによるインタクトな質量分析の前に、PBS中に濾過/脱塩した。1または2のカラム工程により精製された試料を、きれいにランした。
発現プラスミドスクリーニングのために、実施例2(図2)に記載されるように、P.fluorescensにおける発現のために最適化されたクリサンタスパーゼタンパク質コード配列を設計して合成した。プラスミドを、37の異なるP.fluorescens分泌リーダーおよび2つのリボソーム結合部位(RBS)親和性(表5)に融合した最適化されたクリサンタスパーゼ遺伝子を保有して構築した。クリサンタスパーゼタンパク質を細胞細胞質内に局所化するために、追加のプラスミドを構築して、ペリプラズムリーダーなしでクリサンタスパーゼタンパク質を発現させた。代表的なプラスミドマップ(p743-042)を図3に示す。標的の発現をPtacプロモーターから駆動し、翻訳は高活性リボソーム結合部位(RBS)から開始した。結果として生じる40のプラスミドを、2のP.fluorescens宿主株DC454(WT)およびDC441(PD)に形質転換し、ティア1(発現戦略)スクリーニングのための80の発現株を製造した。発現戦略のランキングは、クリサンタスパーゼ単量体のSDS-CGE推定力価に基づいた。
ティア1発現戦略スクリーニングにおいて同定された10の選択されたクリサンタスパーゼ発現戦略、またはプラスミドを、11のプロテアーゼ欠失PD)株、8のプロテアーゼ欠失プラスフォールディングモジュレーターオーバーエクスプレッサー(PD/FMO)株、4のFMO株および1の野生型株を含む240のP.fluorescens宿主株(表7)にそれぞれ形質転換した。フォールディングモジュレーターは存在する場合、第2のプラスミド上にコードされ、発現をP.fluorescens-ネイティブマンニトール誘導性プロモーターによって駆動した。24の宿主株の回収を選択して、タンパク質分解性を低減した、および/またはタンパク質の溶解性を促進した。発現戦略スクリーニングにおいて2の宿主株として使用されたDC454(WT)およびDC441(PD)株も、24の宿主株スクリーンに含まれた。
振とうフラスコ発現(200mL)を、選択した発現プラスミドp743-042、p743-033およびp743-038をアスパラギナーゼ欠損宿主株PF1433に形質転換した後に実施し、それぞれ発現株STR55978、STR55979およびSTR55980を生成した。観察可能な成長ペナルティーを製造した内因性アスパラギナーゼ遺伝子をP.fluorescens染色体から欠失させるかどうかを評価するために、振とうフラスコ発現作業を、アスパラギナーゼ欠損クリサンタスパーゼ発現宿主株の構築(実施例4を参照)と並行して完了した。さらに、振とうフラスコ試料から生成されたライセートを、最初の活性分析およびLC-MS分析によるインタクトな質量の確認のために使用した。表10は、振とうフラスコ発現分析からの製造された還元された可溶性および不溶性ソニケートのSDS-CGE分析からの結果を示す。
内因性アスパラギナーゼ欠損株である細胞質発現株STR55978を、実験の設計(DOE)形式で8の異なる発酵誘導状態の下で評価した。変化した状態は、誘導でのWCW(g/g)、IPTG濃度、pHおよび温度を含んだ。この画分的要因DOEにおいて標的とされる誘導設定値は、0.2〜0.4g/gの湿潤細胞重量の細胞密度、0.08〜0.2mMIPTG、6.5〜7.2の誘導後pH、および25〜32℃の誘導後培養温度を含んだ。各状態についての湿潤細胞重量によって測定された成長を図5に示す。可溶性クリサンタスパーゼの力価は、10〜24g/Lまたは20〜40%総細胞タンパク質の範囲であった(表13)。還元された可溶性SDS-CGEにより測定された組み換えクリサンタスパーゼ発現を図6に示す。
Claims (25)
- 培養培地中でPseudomonadales宿主細胞を培養すること、および組み換えII型アスパラギナーゼをコードする核酸を含む発現構築物からのPseudomonadales宿主細胞の細胞質中で組み換えII型アスパラギナーゼを発現させることを含み、ここで組み換えアスパラギナーゼが、約20%から約40%TCP可溶性II型アスパラギナーゼの収量で細胞質中で製造される、組み換えII型アスパラギナーゼを製造する方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼが、約10g/Lから約25g/Lの収量で細胞質中で製造される、請求項1に記載の方法。
- 製造される可溶性組み換えII型アスパラギナーゼの量の活性を、活性アッセイを使用して測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼがErwinia chrysanthemi L−アスパラギナーゼII型(クリサンタスパーゼ)である、請求項1に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼをコードする核酸が、配列番号1と少なくとも85%相同な配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼが、配列番号2と少なくとも85%相同なアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- Pseudomonadales宿主細胞がPseudomonas fluorescens細胞である、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が、1以上のネイティブアスパラギナーゼの発現が欠損する、請求項1に記載の方法。
- 1以上の不完全に発現されたネイティブアスパラギナーゼが、I型アスパラギナーゼ;II型アスパラギナーゼおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項8に記載の方法。
- 宿主細胞が、1以上のプロテアーゼの発現が欠損する;1以上のフォールディングモジュレーターを過剰発現する;またはその両方である、請求項1に記載の方法。
- 培養培地中でPseudomonadales宿主細胞を培養すること、および組み換えII型アスパラギナーゼをコードする核酸を含む発現構築物からの宿主細胞のペリプラズム中で組み換えII型アスパラギナーゼを発現させることを含み、ここで組み換えII型アスパラギナーゼが、約20%から約40%TCP可溶性アスパラギナーゼの収量でペリプラズム中で製造される、組み換えII型アスパラギナーゼを製造する方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼが、約5g/Lから約30g/Lの収量でペリプラズム中で製造される、請求項11に記載の方法。
- 製造される組み換えII型アスパラギナーゼの量の活性を、活性アッセイを使用して測定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼがErwinia chrysanthemi L−アスパラギナーゼII型(クリサンタスパーゼ)である、請求項11に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼをコードする核酸が、配列番号1と少なくとも85%相同な配列を含む、請求項11に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼが、配列番号2と少なくとも85%相同なアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の方法。
- Pseudomonadales宿主細胞がPseudomonas fluorescens細胞である、請求項11に記載の方法。
- 宿主細胞が、1以上のアスパラギナーゼの発現が欠損する、請求項11に記載の方法。
- 不完全に発現されたアスパラギナーゼが、I型アスパラギナーゼ、II型アスパラギナーゼ、またはその両方から選択される、請求項18に記載の方法。
- 発現構築物が、製造される組み換えII型アスパラギナーゼの宿主細胞のペリプラズムへの転移を誘導する分泌リーダーを含む、請求項11に記載の方法。
- 分泌リーダーが、FlgI、Ibps31A、PbpA20V、DsbC、8484、および5193を含む群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 製造される組み換えII型アスパラギナーゼの測定された活性を対照II型アスパラギナーゼの同じ量の測定された活性と同じ活性アッセイを使用して比較することをさらに含み、ここで製造される組み換えII型アスパラギナーゼの測定された活性は対照II型アスパラギナーゼの活性と比較可能である、請求項3または13に記載の方法。
- 組み換えII型アスパラギナーゼは、患者における半減期を増加させるように修飾される、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が、1以上のプロテアーゼの発現が欠損する;1以上のフォールディングモジュレーターを過剰発現する;またはその両方である、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が、HslUVプロテアーゼが欠損する;PrtBプロテアーゼが欠損する;Prcプロテアーゼが欠損する;DegPプロテアーゼが欠損する;AprAプロテアーゼが欠損する;Lonプロテアーゼが欠損する;Laプロテアーゼが欠損する;DegP1が欠損する;DegP2が欠損する;DegPS219Aを過剰発現する;またはそれらの組み合わせである、請求項24に記載の方法。
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