CN112341533A - 无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用，涉及蛋白质制备领域。本发明首先获得人半乳糖凝集素13的基因，并构建过表达质粒，诱导人半乳糖凝集素13在大肠杆菌中表达，蛋白质通过硫酸铵沉淀法纯化、离子交换柱纯化和凝胶过滤纯化，获得无标签的人半乳糖凝集素13。本发明所制备的人半乳糖凝集素13高纯度、无标签，且自然存在于人体内，对于人体具有一定的安全性。另外。本发明通过动物试验证实所制备的无标签人半乳糖凝集素13具有降低母大鼠和母恒河猴血压的功能，因此本发明的无标签人半乳糖凝集素13可作为治疗孕期高血压、子痫前期和HELLP综合征的有效成分。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质制备技术领域，具体涉及一种无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用。
背景技术
人半乳糖凝集素13(uniport编号为Q9UHV8)主要在胎盘合体滋养层细胞中表达，并从其中分泌出来。在怀孕早期，人半乳糖凝集素13表达的上调对于正常妊娠是必须的。如果人半乳糖凝集素13的表达受到抑制，或者人半乳糖凝集素13的基因发生突变，那么就会引起子痫前期或者HELLP综合征。
目前，已报道的研究所使用的半乳糖凝集素13的来源主要有两种：1、纯化于人的胎盘组织；2、纯化于大肠杆菌(带有标签或者遗留有额外的几个氨基酸)。第一种方法不够经济，存在成本高的问题。第二种方法较为简单，也节省物力财力，成本低。但是，目前已报道的使用大肠杆菌发酵方法获得的人半乳糖凝集素13都会带有标签，或者经过蛋白酶切以后会遗留有额外的几个氨基酸。标签和额外的几个氨基酸在人体内可能会引起不必要的反应，降低人半乳糖凝集素13作为药物的安全性。
截至目前，还没有关于使用大肠杆菌过表达无标签人半乳糖凝集素13并纯化该蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用，以克服现有技术存在的不足。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将人半乳糖凝集素13的基因插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
步骤二、将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中；
步骤三、挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为150-220rpm；待OD600至0.2-4，加入0.1-10mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为2-24h；4000-6000g离心收集细菌；
步骤四、加入细菌裂解液，超声裂解2-30min；
步骤五、8000-100000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为0-42℃；
步骤六、向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤七、5000-100000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为0-42℃；
步骤八、向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤九、5000-100000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为0-42℃；
步骤十、将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH7.0、10-100mMHepes溶解；
步骤十一、将所得样品置于透析袋中，并置于透析液中透析，透析温度为4-25℃；所述透析袋中的cut off为3-10kDa，所述透析液为10mM Hepes，pH7.0；
步骤十二、透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于阴离子交换柱上，操作温度为4-42℃；
步骤十三、利用梯度洗脱方法，采用梯度缓冲液将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为0.1-10ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为4-42℃；
步骤十四、收集所有人半乳糖凝集素13上样于凝胶过滤层析柱上进行凝胶过滤层析；
步骤十五、将所有样品置于透析袋中，并置于透析液中透析，换液两次，透析温度为4-25℃；所述透析袋中的cut off为3-10kDa；
步骤十六、使用蛋白质浓缩管将人半乳糖凝集素13浓缩至1-10mg/ml，所述蛋白质浓缩管中的cut off为3-10kDa，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
作为优选的实施方式，步骤一中，所述人半乳糖凝集素13的基因来源于人或来源于基因合成。
作为优选的实施方式，步骤一中，所述人半乳糖凝集素13的基因为cDNA或合成基因。
作为优选的实施方式，步骤四中，所述细菌裂解液为10-100mM Hepes，pH7.0。
作为优选的实施方式，步骤十二中，所述阴离子交换柱采用离子交换预装柱或自行制备离子交换柱；所述离子交换预装柱选自HiTrap Q HP、HiTrap Q FF、HiTrap Q XL、HiPrep 16/10 Q FF、HiPrep 16/10 Q XL、HiPrep Q HP、RESOURCE Q、MonoQ、SOURCE 15Q、HiTrap Capto Q和Hitrap Capto Q ImpRes中的一种；
所述自行制备离子交换柱的填料选自SOURCE 15Q、SOURCE 30Q、Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose 4 FF和Capto Q中的一种。
作为优选的实施方式，步骤十三中，所述梯度缓冲液包括A液和B液，A液：10mMHepes，pH 7.0；B液：10mM Hepes，pH 7.0，1M NaCl。
作为优选的实施方式，步骤十四中，所述凝胶过滤层析的缓冲液为10-100mMHepes，pH 7.0，50-300mM NaCl。
作为优选的实施方式，步骤十四中，所述凝胶过滤层析柱采用凝胶过滤预装柱或自行制备凝胶过滤层析柱；
所述凝胶过滤预装柱选自Superdex Peptide 10/300 GL、Superdex 75 10/300GL、Superdex 755/150 GL、Superdex 200 Increase 10/300 GL、Superdex200Increase 5/150 GL、HiLoad 16/600 Superdex 30 pg、HiLoad 26/600 Superdex 30pg、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg、HiLoad 26/600 Superdex 75 pg、HiLoad 16/600Superdex 200 pg和HiLoad 26/600 Superdex 200 pg中的一种；
所述自行制备凝胶过滤层析柱的填料选自Superdex 75 pg、Superdex 200 pg、Superose 6 pg、Superose 12 pg、Sephacryl S-100 HR、Sephacryl S-200 HR、SephacrylS-300 HR、Sepharose 6B和Sepharose 6 FF中的一种。
作为优选的实施方式，步骤十五、所述透析液为去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠。
通过本发明的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法所制备的无标签人半乳糖凝集素13，能够应用在制备用于治疗孕期高血压、子痫前期或HELLP综合征药物中。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种使用大肠杆菌发酵技术制备无标签人半乳糖凝集素13的方法，能够获得高纯度、无标签的人半乳糖凝集素13。首先获得人半乳糖凝集素13的基因，并构建过表达质粒，诱导人半乳糖凝集素13在大肠杆菌中表达，蛋白质通过硫酸铵沉淀法纯化、离子交换柱纯化和凝胶过滤纯化，获得无标签的人半乳糖凝集素13。相比于带有标签和额外的几个氨基酸的人半乳糖凝集素13来说，本发明所制备的人半乳糖凝集素13高纯度、无标签，且自然存在于人体内，对于人体具有一定的安全性。另外。本发明通过动物试验证实所制备的无标签人半乳糖凝集素13具有降低母大鼠和母恒河猴血压的功能，因此本发明的无标签人半乳糖凝集素13可作为治疗子痫前期和HELLP综合征的有效成分。
附图说明
图1为本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13的SDS-PAGE分析结果。图1中，1为无标签人半乳糖凝集素13的条带；2为蛋白质标准品的条带。
图2为本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13降低母大鼠血压的结果。
具体实施方式
本发明的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一、将人半乳糖凝集素13的基因插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
其中，人半乳糖凝集素13的基因来源于人(Homo sapiens)或来源于基因合成。
其中，人半乳糖凝集素13的基因为cDNA或合成基因。
步骤二、将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中；
步骤三、挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为150-220rpm；待OD600至0.2-4，加入0.1-10mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为2-24h；4000-6000g离心收集细菌；
步骤四、加入细菌裂解液(10-100mM Hepes，pH7.0)，超声裂解2-30min；
步骤五、8000-100000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为0-42℃；
步骤六、向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤七、5000-100000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为0-42℃；
步骤八、向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤九、5000-100000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为0-42℃；
步骤十、将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH7.0、10-100mM Hepes溶解；
步骤十一、将所得样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(10mMHepes，pH7.0)中透析，透析温度为4-25℃；
步骤十二、透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于阴离子交换柱上，操作温度为4-42℃；
其中，阴离子交换柱采用离子交换预装柱或自行制备离子交换柱；
其中，离子交换预装柱选自HiTrap Q HP、HiTrap Q FF、HiTrap Q XL、HiPrep 16/10 Q FF、HiPrep 16/10 Q XL、HiPrep Q HP、RESOURCE Q、MonoQ、SOURCE15Q、HiTrap CaptoQ和Hitrap Capto Q ImpRes中的一种；
其中，自行制备离子交换柱的填料选自SOURCE 15Q、SOURCE 30Q、Q SepharoseHP、Q Sepharose FF、Q Sepharose 4 FF和Capto Q中的一种；
步骤十三、利用梯度洗脱方法，采用梯度缓冲液(A液：10mM Hepes，pH 7.0；B液：10mM Hepes，pH 7.0，1M NaCl)将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为0.1-10ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为4-42℃；
步骤十四、收集所有人半乳糖凝集素13上样于凝胶过滤层析柱上进行凝胶过滤层析，凝胶过滤层析的缓冲液10-100mM Hepes，pH 7.0，50-300mM NaCl。
其中，凝胶过滤层析柱采用凝胶过滤预装柱或自行制备凝胶过滤层析柱；
其中，凝胶过滤预装柱选自Superdex Peptide 10/300 GL、Superdex 75 10/300GL、Superdex 75 5/150 GL、Superdex 200 Increase 10/300 GL、Superdex 200Increase5/150 GL、HiLoad 16/600 Superdex 30 pg、HiLoad 26/600 Superdex 30 pg、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg、HiLoad 26/600 Superdex 75 pg、HiLoad 16/600Superdex 200 pg和HiLoad 26/600 Superdex 200 pg中的一种；
其中，自行制备凝胶过滤层析柱的填料选自Superdex 75 pg、Superdex 200pg、Superose 6 pg、Superose 12 pg、Sephacryl S-100 HR、Sephacryl S-200 HR、SephacrylS-300 HR、Sepharose 6B和Sepharose 6 FF中的一种；
步骤十五、将所有样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠)中透析，换液两次，透析温度为4-25℃；
步骤十六、使用蛋白质浓缩管(cut off为3-10kDa)将人半乳糖凝集素13浓缩至1-10mg/ml，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
本发明使用大肠杆菌发酵技术获得大量高纯度无标签人半乳糖凝集素13蛋白，首先获得人半乳糖凝集素13的基因，并构建过表达质粒，诱导人半乳糖凝集素13在大肠杆菌中表达，蛋白质通过硫酸铵沉淀法纯化、离子交换柱纯化和凝胶过滤纯化，获得无标签的人半乳糖凝集素13；其中，硫酸铵沉淀法中，采用30％饱和度的硫酸铵去除部分杂蛋白，采用50％饱和度的硫酸铵富集无标签人半乳糖凝集素13。
本发明的无标签人半乳糖凝集素13，可以作为有效成分制备溶液或冻干粉。
通过本发明的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法所制备的无标签人半乳糖凝集素13，能够应用在制备用于治疗孕期高血压、子痫前期或HELLP综合征药物中。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料来源：
质粒pET15b购自Novagen公司。
大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3)pLysS均购自天根生化科技(北京)有限公司和Novagen公司。
离子交换预装柱、自行制备离子交换柱的填料、凝胶过滤预装柱、自行制备凝胶过滤层析柱的填料均购自GE公司。
实施例1无标签人半乳糖凝集素13的制备
(1)将人半乳糖凝集素13的cDNA插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
(2)将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21中；
(3)挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为150rpm；待OD600至0.2-4，加入10mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为24h；6000g离心收集细菌；
(4)加入细菌裂解液(10mM Hepes，pH7.0)，超声裂解30min；
(5)12000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为25℃；
(6)向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为25℃；
(7)12000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为25℃；
(8)向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为25℃；
(9)12000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为25℃；
(10)将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH7.0、10mM Hepes溶解；
(11)将所得样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(10mM Hepes，pH 7.0)中透析，透析温度为25℃；
(12)透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于离子交换预装柱HiTrap Q HP上，操作温度为25℃；
(13)使用梯度洗脱方法将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为2ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为25℃；
(14)收集所有人半乳糖凝集素13上样于凝胶过滤预装柱HiLoad 16/600Superdex75pg上进行凝胶过滤层析，凝胶过滤层析的缓冲液为10mM Hepes，pH7.0，150mM NaCl；
(15)将所有样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠)中透析，换液两次，透析温度为25℃；
(16)使用蛋白质浓缩管(cut off为3-10kDa)将人半乳糖凝集素13浓缩至10mg/ml，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
实施例2无标签人半乳糖凝集素13的制备
(1)将人半乳糖凝集素13的cDNA插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
(2)将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；
(3)挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为220rpm；待OD600至0.2-4，加入0.1mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为2h；5000g离心收集细菌；
(4)加入细菌裂解液(100mM Hepes，pH7.0)，超声裂解2min；
(5)8000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为4℃；
(6)向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为4℃；
(7)5000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为4℃；
(8)向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为4℃；
(9)5000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为4℃；
(10)将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH7.0、100mM Hepes溶解；
(11)将所得样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(10mM Hepes，pH7.0)中透析，透析温度为4℃；
(12)透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于离子交换预装柱HiPrep 16/10 Q FF上，操作温度为4℃；
(13)使用梯度洗脱方法将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为0.1ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为4℃；
(14)收集所有人半乳糖凝集素13上样于自行制备凝胶过滤层析柱(填料为Superdex 200 pg)上进行凝胶过滤层析，凝胶过滤层析的缓冲液为10mM Hepes，pH 7.0，300mM NaCl；
(15)将所有样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠)中透析，换液两次，透析温度为4℃；
(16)使用蛋白质浓缩管(cut off为3-10kDa)将人半乳糖凝集素13浓缩至1mg/ml，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
实施例3无标签人半乳糖凝集素13的制备
(1)将人半乳糖凝集素13的cDNA插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
(2)将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中；
(3)挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为180rpm；待OD600至0.2-4，加入6mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为20h；5000g离心收集细菌；
(4)加入细菌裂解液(60mM Hepes，pH7.0)，超声裂解20min；
(5)60000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为37℃；
(6)向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为37℃；
(7)50000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为37℃；
(8)向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为37℃；
(9)50000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为37℃；
(10)将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH7.0、50mM Hepes溶解；
(11)将所得样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(10mM Hepes，pH 7.0)中透析，透析温度为37℃；
(12)透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于自行制备离子交换柱(填料为Q Sepharose4 FF)上，操作温度为37℃；
(13)使用梯度洗脱方法将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为6ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为37℃；
(14)收集所有人半乳糖凝集素13上样于自行制备凝胶过滤层析柱(填料为Sepharose6FF)上进行凝胶过滤层析，凝胶过滤层析的缓冲液为50mM Hepes，pH 7.0，180mMNaCl；
(15)将所有样品置于透析袋(cut off为3-10kDa)中，并置于透析液(去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠)中透析，换液两次，透析温度为15℃；
(16)使用蛋白质浓缩管(cut off为3-10kDa)将人半乳糖凝集素13浓缩至5mg/ml，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
试验例1SDS-PAGE分析
对实施例1至实施例3获得的无标签人半乳糖凝集素13进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，1为本发明的无标签人半乳糖凝集素13的条带，2为蛋白质标准品的条带。经过对比分析可知，本发明所制备的无标签人半乳糖凝集素13的条带分子量大小是：16.12kDa，结果与结果与预期条带相符，纯度高于99％。
试验例2本发明的无标签人半乳糖凝集素13对母大鼠血压的调节功能
取交配完成第7天的母大鼠，将装有150ng本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13的微量灌流泵皮下植入在大鼠的肩胛部位；微量灌流泵每小时释放0.7ng无标签人半乳糖凝集素13；对照组的微量灌流泵仅装入了缓冲液；每天测量母大鼠平均动脉压一次。
结果如图2所示，本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13具有明显降低母大鼠血压的功能。
试验例3本发明的无标签人半乳糖凝集素13对母恒河猴血压的调节功能
将80ng本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13静脉注射至母恒河猴体内，对照组仅注射了缓冲液；连续注射8天，每天测量母恒河猴血压一次。
结果如表1所示，本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13具有明显降低母恒河猴血压的功能。
表1
| 时间点 | 实验组血压 | 对照组血压 |
| 第1天 | 115/90 | 115/90 |
| 第2天 | 110/84 | 121/92 |
| 第3天 | 105/82 | 118/89 |
| 第4天 | 103/80 | 116/90 |
| 第5天 | 104/81 | 117/88 |
| 第6天 | 105/84 | 112/86 |
| 第7天 | 108/86 | 115/89 |
| 第8天 | 104/82 | 111/88 |
子痫前期和HELLP综合征的典型症状是高血压，而本发明中的前期动物实验表明所制备的无标签人半乳糖凝集素13可以降低母大鼠以及母恒河猴血压。由此可以证明，本发明制备的无标签人半乳糖凝集素13可以作为有效成分制备成药物，用于治疗孕期高血压、子痫前期和HELLP综合征。
本发明公开了一种无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
Claims (10)
1.无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将人半乳糖凝集素13的基因插入到质粒pET15b中，限制性内切酶的位点为NcoI和XhoI或BamHI，人半乳糖凝集素13的cDNA的末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET15b_Galectin-13；
步骤二、将质粒pET15b_Galectin-13转化至大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中；
步骤三、挑取若干大肠杆菌菌落置于LB培养基中，置于摇床中培养，摇床中的温度为37℃，转速为150-220rpm；待OD600至0.2-4，加入0.1-10mM的IPTG诱导蛋白质表达，诱导时间为2-24h；4000-6000g离心收集细菌；
步骤四、加入细菌裂解液，超声裂解2-30min；
步骤五、8000-100000g离心去沉淀，收集上清，上清中含有无标签人半乳糖凝集素13，操作温度为0-42℃；
步骤六、向上清中加入饱和度30％的硫酸铵，使上清中的部分杂蛋白形成沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤七、5000-100000g离心，抛弃沉淀，收集上清，操作温度为0-42℃；
步骤八、向上清中添加硫酸铵，使其饱和度达到50％，其中的人半乳糖凝集素13会形成白色沉淀，操作温度为0-42℃；
步骤九、5000-100000g离心，收集沉淀，抛弃上清，操作温度为0-42℃；
步骤十、将人半乳糖凝集素13的白色沉淀使用pH 7.0、10-100mM Hepes溶解；
步骤十一、将所得样品置于透析袋中，并置于透析液中透析，透析温度为4-25℃；所述透析袋中的cutoff为3-10kDa，所述透析液为10mM Hepes，pH 7.0；
步骤十二、透析完成后，收集所有含有人半乳糖凝集素13的溶液上样于阴离子交换柱上，操作温度为4-42℃；
步骤十三、利用梯度洗脱方法，采用梯度缓冲液将人半乳糖凝集素13从阴离子交换柱上洗脱下来，洗脱速度为0.1-10ml/min；收集人半乳糖凝集素13所对应的洗脱峰，获得无标签的人半乳糖凝集素13，操作温度为4-42℃；
步骤十四、收集所有人半乳糖凝集素13上样于凝胶过滤层析柱上进行凝胶过滤层析；
步骤十五、将所有样品置于透析袋中，并置于透析液中透析，换液两次，透析温度为4-25℃；所述透析袋中的cut off为3-10kDa；
步骤十六、使用蛋白质浓缩管将人半乳糖凝集素13浓缩至1-10mg/ml，所述蛋白质浓缩管中的cut off为3-10kDa，或者对人半乳糖凝集素13溶液进行冻干，保存于0-80℃。
2.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述人半乳糖凝集素13的基因来源于人或来源于基因合成。
3.根据权利要求2所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述人半乳糖凝集素13的基因为cDNA或合成基因。
4.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述细菌裂解液为10-100mM Hepes，pH 7.0。
5.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤十二中，所述阴离子交换柱采用离子交换预装柱或自行制备离子交换柱；所述离子交换预装柱选自HiTrap Q HP、HiTrap Q FF、HiTrap Q XL、HiPrep 16/10Q FF、HiPrep 16/10Q XL、HiPrep Q HP、RESOURCE Q、MonoQ、SOURCE 15Q、HiTrap Capto Q和Hitrap Capto Q ImpRes中的一种；
所述自行制备离子交换柱的填料选自SOURCE 15Q、SOURCE 30Q、Q Sepharose HP、QSepharose FF、Q Sepharose 4FF和Capto Q中的一种。
6.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤十三中，所述梯度缓冲液包括A液和B液，A液：10mM Hepes，pH 7.0；B液：10mM Hepes，pH 7.0，1MNaCl；
步骤十四中，所述凝胶过滤层析的缓冲液为10-100mM Hepes，pH 7.0，50-300mM NaCl。
7.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤十四中，所述凝胶过滤层析柱采用凝胶过滤预装柱或自行制备凝胶过滤层析柱；
所述凝胶过滤预装柱选自Superdex Peptide 10/300GL、Superdex 7510/300GL、Superdex 755/150GL、Superdex 200Increase 10/300GL、Superdex 200Increase 5/150GL、HiLoad 16/600Superdex 30pg、HiLoad 26/600Superdex 30pg、HiLoad 16/600Superdex 75pg、HiLoad 26/600Superdex 75pg、HiLoad 16/600Superdex 200pg和HiLoad 26/600Superdex 200pg中的一种；
所述自行制备凝胶过滤层析柱的填料选自Superdex 75pg、Superdex 200pg、Superose6pg、Superose 12pg、Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-300HR、Sepharose 6B和Sepharose 6FF中的一种。
8.根据权利要求1所述的无标签人半乳糖凝集素13的制备方法，其特征在于，步骤十五、所述透析液为去离子水、蒸馏水、1-30％(v/v)乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、0-50％(m/v)葡萄糖或0.1-5％(m/v)氯化钠。
9.如权利要求1至8中任意一项所述的制备方法制备的无标签人半乳糖凝集素13。
10.如权利要求9所述的无标签人半乳糖凝集素13在制备用于治疗孕期高血压、子痫前期或HELLP综合征药物中的应用。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL123098A0 (en) * | 1998-01-29 | 1998-09-24 | Diagnostic Technologies Ltd | Placental protein 13 |
| WO2004021012A2 (en) * | 2002-08-29 | 2004-03-11 | Diagnostic Technologies Ltd. | Method of diagnosis of pregnancy-related complications |
| CN101497909A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-05 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法 |
| CN102021173A (zh) * | 2010-07-30 | 2011-04-20 | 湖北大学 | 可溶性截短的人trail活性蛋白的制备方法 |
| CN102174112A (zh) * | 2011-01-26 | 2011-09-07 | 兰州大学 | 一种无标签结核融合蛋白TB10-Ag85B |
| CN104342415A (zh) * | 2014-07-08 | 2015-02-11 | 吉林省金梓源生物科技有限公司 | 一种重组尿酸酶的制备方法 |
| CN106699875A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-24 | 青岛古高生物科技有限公司 | 一种人重组组织因子及其基因、表达载体、宿主菌和表达方法 |
| CN111278852A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 菲尼克斯公司 | 重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的生产方法 |
| CN111662917A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-09-15 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法 |
-
2020
- 2020-11-20 CN CN202011306882.6A patent/CN112341533A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL123098A0 (en) * | 1998-01-29 | 1998-09-24 | Diagnostic Technologies Ltd | Placental protein 13 |
| WO2004021012A2 (en) * | 2002-08-29 | 2004-03-11 | Diagnostic Technologies Ltd. | Method of diagnosis of pregnancy-related complications |
| CN101497909A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-05 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 制备抗a型肉毒毒素免疫球蛋白抗体的方法 |
| CN102021173A (zh) * | 2010-07-30 | 2011-04-20 | 湖北大学 | 可溶性截短的人trail活性蛋白的制备方法 |
| CN102174112A (zh) * | 2011-01-26 | 2011-09-07 | 兰州大学 | 一种无标签结核融合蛋白TB10-Ag85B |
| CN104342415A (zh) * | 2014-07-08 | 2015-02-11 | 吉林省金梓源生物科技有限公司 | 一种重组尿酸酶的制备方法 |
| CN106699875A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-24 | 青岛古高生物科技有限公司 | 一种人重组组织因子及其基因、表达载体、宿主菌和表达方法 |
| CN111278852A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-06-12 | 菲尼克斯公司 | 重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的生产方法 |
| CN111662917A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-09-15 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GZIURARSON等: "Placental Protein 13 Administration to Pregnant Rats Lowers Blood Pressure and Augments Fetal Growth and Venous Remodeling", 《FETAL DIAGNOSIS AND THERAPY》 * |
| JIYONG SU等: "Galectin-13, a different prototype galectin, does not bind β-galacto-sides and forms dimers via intermolecular disulfide bridges between Cys-136 and Cys-138", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| XUEYAN XI等: "Expression, purification and characterization of active untagged recombinant human leukemia inhibitory factor from E.coli", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 * |
| 张立剑 等: "无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测", 《生物技术通讯》 * |
| 王悦: "半乳糖凝集素-13晶体结构与生物活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）》 * |
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