JPS63169995A - β−インターフェロンの回収及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学工学の分野に関する。さらに詳しくは
、この発明は組換β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）
を精製するための逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ）法、及びこのＲＰ−ＨＰＬＣ法を組み込
んだ、組換ＩＰＮ−βの改良された精製方法に関する。

これらの方法は生成物の上昇した純度及び低下した不均
一性をもたらす。

〔従来の技術〕

天然インターフェロン類（ＩＦＮ）は、ウィルス、二本
鎖Ｄ　Ｎ　Ａ、他のポリヌクレオチド、抗原又はマイト
ジェンによる誘導の後に種々の細胞により生産される種
特異的蛋白質であり、しばしば糖蛋白質である。インタ
ーフェロンは抗ウイルス機能、抗増殖機能、免疫調節機
能及び抗細胞機能のごとき多くの生物学的機能を有する
。少なくとも３つのタイプのヒトインターフェロンが同
定され、そして抗ウィルス活性、抗増殖活性及びナチュ
ラルキラー細胞（ＮＫ）活性化活性の観点から特徴付け
られている。これらは白血球、リンパ球、繊維芽細胞及
び免疫系により生産され、そしてインターフェロン−α
、−β、及び−γとして分類される。これらは、異る構
造遺伝子によりコードされた異る蛋白質であると報告さ
れている。

天然ヒトβ−インターフェロンは一触に、ポリ−ＩＣ（
ポリ−リボイノシン酸及びポリリボシチジル酸によりヒ
ト繊維芽細胞培養物を超′誘導し、そしてこうして生産
された天然ヒト−インターフェロンをクロマトグラフ技
法及び電気泳動技法により単離しそして精製することに
よって製造される。天然β−インターフェロン様性質を
示す蛋白質又はポリペプチドはまた、種々の誘導された
ヒト細胞からポリーＡ−冨化１２ＳメツセンジャーＲＮ
Ａを抽出し、このｍ−ＲＮＡを鋳型として使用して二本
鎖ｃ−ＤＮＡを合成し、このｃ−ＤＮＡを適切なりロー
ニングベクターに導入し、このベクターにより適当な微
生物を形質転換し、この細菌を集め、そしてそれからＩ
ＦＮ−βを抽出することによっても製造することができ
る。Ｎａｇｏｌａ＋Ｓ、等、Ｎａｔｕｒｅ。

２８４　：　３１６（１９８０）　；Ｇｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、Ｖ、等、Ｎａｔｕｒｅ。

２８７　：　４１１（１９８０）　；Ｙｅｌｖｅｒｔｏ
ｎ、Ｅｏ等、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄＲｅｓ、＋　　９　ニア
３Ｈ１９８１）　　；５ｔｒｅｕｌｉ、Ｍｏ等、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔ’ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、）、７
８　：　２８４８（１９８１）　；　１９８１年５月６
日に公開されたヨーロッパ特許出願阻２８０３３　ｉ　
１９８１年６月１５日に公開されたヨーロッパ特許出願
隘３２１１３４　；　１９８１年８月２６日に公開され
たヨーロッパ特許出願Ｔｈ　３４３０７　、及び１９８
１年７月１日に与えられたベルギー特許１１ｈ　８３７
３９７は、組換ＤＮＡ技法を用いるβ−インターフェロ
ンの製造のための存在使用されている種々の方法を開示
している。発現された蛋白質又はポリペプチドが精製さ
れそして試験され、そして天然ＩＦＮの性質に類似する
性質を示すことが見出された。従って、細菌により生産
されたＩＦＮは抗ウィルス剤及び抗腫瘍剤としての療法
的使用の可能性を有する様であり、そしてこのような細
菌発酵によるＩＦＮの製造は、比較的低コストで臨床試
験用ＩＦＮを十分多量に提供すると期待される。

さらに、ＩＦＮ−β蛋白質、例えば１９８６年５月１３
日に与えられたＭａｒｋ等の米国特許ｍ　’４，５８８
，５８５に開示されているヒト組換システィン除去又は
システィン置換インターフェロン−β類似体（シューテ
ィン）を製造するために、例えばオリゴヌクレオチド指
令変異誘発によりヒｌ−ＩＦＮ−β遺伝子が変形されて
いる。この特許には特に、１７位のシスティンが中性ア
ミノ酸セリンにより置き換えられている組換ＩＦＮ−β
が開示されている。このＩＦＮ−β類似体はＩＦＮ−β
、。、１．である。

細菌により生産されたＩＦＮの回収及び精製方法が、米
国特許１１ｍ　４，４５０，１０３、隘４，３１５，８
５２、患４．３４３，７３５、及びｌｈ　４，３４３，
７３６、並びにＰｅｒｙｎｃｋ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９
８０）２８７　　：　　１９３　１９７　、並びに５ｃ
ａｎｄｅｌ　Ｉａ及びＫｏｒｎｂｅｒｇ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒ　１１０　：４４４７　（１９７１）に記
載されている。一般に、これらの方法によってはＩＦＮ
が臨床的又は療法的目的のために十分に多量に且つ十分
に純粋な形で製造されず、そして組換ＤＮＡ技法により
生産された得られるＩＦＮ調製物は残留量の化学物質及
びかなりの不均一性を有する。

沈澱した異種蛋白質の精製及び活性確認はまた米国特許
Ｎ［１４，５１１，５０２、隘４，５１１，５０３、階
４．５１２，９２２及び隘４，５１８，５２６、並びに
ヨーロッパ特許１１ｈ　１１４，５０６によっても記載
されている。

１９８６年３月２５日に公開されたヨーロッパ特許出願
公開Ｉ’ｍ　８４３．９９７は生化学的分離又は回収方
法を開示しており、この方法においては微生物により生
産されたＩＦＮ−βを含有する屈折体が微生物宿主から
分離又は回収され、そして前記出願公開はさらに屈折体
をさらに精製するための方法を開示している。

米国特許階４．＋＋２．９４０はまた、組換ＩＦＮ−β
の精製及び製剤化の方法を開示している。

Ｍｅｎｇｅ等の米国特許１１ｈ　４，３４３，７３５は
、インターフェロンを水性多相系中で、該系中に可溶性
でありそしてポリエーテルの誘導体であるイオン交換体
の存在下で分配することによりインターフェロンを精製
する方法を開示している。

Ｐｅｓ　ｔｋａ等の米国特許Ｔｈ　４，２８９，６９０
は、溶剤としてｎ−プロパツールのごときアルカノール
を用いるｌ又は複数の高速液体クロマトグラフィ一段階
により天然ヒト白血球インターフェロンのごとき蛋白質
を精製する方法を開示している。さらに、Ｐｅｓ　ｔｋ
ａ等、Ｐｈａｒｍａｃ、Ｔｈｅｒ、、　２９　：　２９
９−３１９（１９８５）　：Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ、Ｉｎ
ｖｅｓｔ土、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、　８３（１）　　：
　１２８５−１３６５（１９８４）　；及びＰｅ５ｔｋ
ａ＋Ｓ、＾ｒｃｈ　ｉ　ｖｅｓ旧ＯＣｈｅｍ。

且匹髄ム、　２２１　（１）　　：　ｌ　　３７　（１
９８３年２月１５日）を参照のこと。

Ｆｒ１ｅｓｅｎ等の米国特許Ｎ１４，２８９，６８９は
、アフィニティークロマトグラフィー及び高圧液体クロ
マトグラフィーによりヒト天然β−インターフェロンを
回収しそして精製する方法を開示している。

組換ＩＦＮ−βのごとき生物学的に活性な蛋白質の取り
扱いにおいては、蛋白質の取り扱いに関する一般的考慮
が適用され、これには生物質的活性を保存するための蛋
白質の微妙な三次構造の保存の必要性が含まれ、このた
めには変性ｐＨ条件を回避することが必要である。Ｅ、
コリにより発現された組換ＩＦＮ−β及びその類似体は
６〜９のｐＨ範囲の溶液に不溶である。従って、これら
の蛋白質を可溶化するために種々の方法及び添加剤が考
案されている。

ヒト又は動物に医療的に投与されるべきＩＦＮ−βのご
とき組換蛋白質の製造においては、最終生成物の純度及
び均一性の考慮が最重要事項である。

微量ＩＦＮ−β種の減少又は除去、並びに非−ＩＦＮ−
β蛋白質及び細菌性エンドトキシンの両者の除去が第一
に重要である。第二に、療法的組換蛋白質の精製方法を
確立し又は改良する場合に、その方法の効率及び単純さ
が考慮される。

多様な蛋白質精製法が５０年以上にわたって探索されて
いる。この課題に対する文献は広範であり、そして多数
の技法が実施者にとって利用可能である。これには、イ
オン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
、ゲル電気泳動、硫酸アンモニウム沈澱、及びゲル濾過
が含まれる。

長年にわたり、前′記の多くの方法を行うための技法に
おいて実質的な改良がなされ、そして特に、カラムクロ
マトグラフィー及び電気泳動ゲルの展開に関する方法の
自動化及びスピードアップが可能であった。これらの技
術的な発展にもかかわらず、そしてこれらの方法にかけ
られる蛋白質が多数であるにもかかわらず、特定の環境
下に見出される特定の蛋白質について、好結果をもたら
す方法の選択、又はさらに普通には複数の方法の組合わ
せの選択は予想不可能のままであり、そして各特定の場
合においてかなりの実験が必要である。

この発明は、組換ＩＦＮ−βの精製のために特に適合さ
れたＲＰ−ＨＰＬＣ法を、１９８６年３月２５日に公開
されたヨーロッパ特許出願公開ｍ　８４３，９９７に本
質的に概略記載されている精製方法に４人するものであ
る。

１２Ｐ−ＨＰＬＣをさらに用いる組換蛋白質のための精
製法の参照文献をさらに挙げる。

Ｔａｎ等の米国特許１１ｈ　４，４８５，０１７は天然
インターフェロンの単離及び精製方法を開示しており、
この方法においては天然インターフェロンの部分的に精
製された調製物が抗体アフィニティーカラム及びＩ？Ｐ
−１１ＰＬｃカラムに次々に通される。

Ｋｏｔｈｓ等の米国特許１１ｈ　４，５６９，７９０は
微生物により生産されたＩＬ−２の回収方法を開示して
おり、この方法においては酸化されたＩＬ−２がＲＰ−
＋１ＰＬｃにより精製される。酢酸又はトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）のごとき有機酸とプロパツール又はアセト
ニトリルのごとき有機溶剤とを含んで成るグラジェント
溶剤系を用いて逆相カラムからＩＬ−２が溶出される。

Ｔａｒｒ等、　　八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１
３１　　　：９９−１０７（１９８３）は、ＲＰ−１１
ＰＬＣ分離、並びにアセトニトリル、ｎ−プロパツール
及びこの両者の混合物を包含する三元溶剤を用いるチト
クロームＰ〜４５０及びウシロドプシンの回収を記載し
ている。

Ｒｅｎｎｅｔｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　２０．４５３
０　４５３８（１９８１）は、疎水性反対イオンとして
ＴＦＡ又はヘプタフルオロ醋酸（ＩＩＦＲＡ）のいずれ
かを含有する溶剤系を用いるＩ？Ｐ−１１ＰＬＣによる
、ラソトコルチコトロビン（ＡＣＴＩＩ）の２種類の主
要形態の見かけ上均−な状態への精製を記載している。

Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１９７　　：
　３９１−４００（１９８１）は、ヒトパラチリンの単
離及び分析を記載しており、この方法においては疎水性
イオン対合剤としてＴＦＡ又はＨＦＢＡを含有する水性
アセトニトリルから成る溶剤系を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ
が使用される。

Ｓｍｉ　ｔｈ−Ｊｏｈａｎｎｓｅｎ等、Ｊ、ＩＦＮ、Ｒ
ｅｓ、、　　３　（４）　　：４７３−４７７　（１９
８３年１１月４日）は、抗体アフィニティーカラム上で
の天然ヒトＩＦＮ−βのクロマトグラフィー及びそれに
続＜　ＲＰ−ＨＰＬＣを用いる方法を開示している。Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣが行われ、この方法においては溶出剤は０
〜１００％の直線グラジェントでｎ　−プロパツールを
含有し、そして１００ｍＭ蟻酸で平衡化されたＣ１８カ
ラムが使用きれた。さらに、Ｃｏ　ｌ　ｂｙ等、Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、　１３３　（６）　　：３０９１−３
０９５　（１９８４年１２月）の方法があり、この方法
においては組換ＩＦＮ−βがＳｍｉ　ｔｈ−Ｊｏｈａｎ
ｎｓｅｎ等の方法に従って精製される。

Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ等、Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　
ｈｉａ、■＝９５−１００　（１９８５）は種々のウィ
ルス蛋白質及び他の疎水性蛋白質のためのＲＰ−１１Ｐ
Ｌｃを開示しており、この方法においては全溶剤中６０
％蟻酸が使用され、そして２−プロパツール又はアセト
ニトリルがグラジェント溶出のための有機変性剤である
。

Ｂｒｇｅｓｓ等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、７９　：　５７
５３−５７５７　（１９８２年１０月）はＲＰ−ＨＰＬ
Ｃを使用することによるネズミ上皮増殖因子の２つの形
態の分離を開示しており、０．２％トリフルオロ酢酸又
は０．２％へブタフルオロ酪酸と２０％又は５０％アセ
トニトリルを含有する溶剤系を用いる結果を比較してい
る。

Ｆｒ１ｅｓｅｎ等、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
　ｈ　Ｓ、＋　２０６　（２）：４３２−４５０　（１
９８１年２月）はアフィニティークロマトラフイー及び
ＲＰ−１１ＰＬｃの組合わせによる天然ヒトＩＦＮ−β
の精製を開示しており、この方法においては逆相カラム
がイソプロパツール及び／又はｎ−ブタノールを含有す
るピリジン−蟻酸により平衡化される。

Ｍｏ１ｎａｒ　ＣｋｌＡ集）　、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
Ａｓ　ｅｃｔｓ　ｏｆ　ＭＯ（桓印ＨＰＩ、Ｃ（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｄｅｃ、７−８＋１９８１１西ベル
リン）：Ｆｒｅｉｓｅｎ、　Ｈ，ＨＰＬＣｏｆ　Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　ｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰｈａｓｅＥｘｅｍ
ｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｌ＋　ｔｌｕｍａｎ　１ｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒＰｒｏｔｅｉｎｓ
：Ｒｅｖｉｅｗ　ａｎｄ　５ｃｏｐｅ　ｏｆ　ａ　Ｍｅ
ｔｈｏｄ”（７７−１０７頁）は、インターフェロンを
包含する蛋白質の逆相クロマトグラフィーについての総
説文献を記載している。

以下余白 〔発明が解決しようとする問題点〕 この発明は、組換β−インターフェロンのために特異的
なＲＰ−ＨＰＲＣ法を含む、改良された精製方法を捉供
する。この方法は、微量ＩＦＮ−β種、細菌性エンドト
キシン及び非−ＩＦＮ−β蛋白質のレベルが非常に低い
、高度に純粋なＩＦＮ−β生成物をもたらす。この方法
は、組換ＩＦＮ−βの精製を単純化しその効率を改良し
、そしてさらに生成物の純度及び均一性を増加させるた
めの柔軟な選択を捉供する。

〔問題点を解決するための手段〕

従ってこの発明は組換β−インターフェロン（ＩＦＮ−
β）の精製方法に関し、この方法はＩＦＮ−βを生産す
るために形質転換された宿主からＩＰｌｌ−βを単離し
、そしてそしてこの単離されたＩＦＮ−βを、ヘプタフ
ルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）及びトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ
　Ａ）から成る群から選択された有機酸とアセトニトリ
ルとを含んで成る有機変性剤を含有する溶剤系を用いて
少なくとも１６Ｌシリ力ゲル逆相高速液体クロマトグラ
フィーカラムに通すことを含んで成る。

この発明はさらに、微生物により生産されたＩＦＮ−β
を回収しそして精製する方法を提供し、この方法は、 （ａ＞前記ＩＦＮ−βを生産するために形質転換された
宿主微生物の培養細胞の細胞壁及び細胞膜を破砕し； （ｂ）前記破砕物から９９重量％より多くの塩を除去し
； （ｃ）前記脱塩された破砕物を再破砕し；（ｄ）前記破
砕物中の液体の密度又は粘度を上昇させあるいは該液体
中に密度又は粘度の勾配を生じさせるための物質を該破
砕物に添加し；（ｅ）ＩＦＮ−βを含有する屈折体を高
速遠心分離により回収しり （「）前記屈折体中のＩＦＮ−βを、該組換体ＩＦＮ−
βと共に水溶性複合体を形成することができる可溶化剤
の水溶液により可溶化し、ここで該水溶液は還元剤を含
有しており； （ｇ）段階Ｃｆ）の生成物を酸化し； （ｈ）へブタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）又はトリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）のいずれか及びアセトニトリルを含ん
で成る溶剤系を用いて、結合した広孔シリカゲル逆相高
速液体クロマトグラフィーカラムに、段階（ｇ）の酸化
された生成物を通し；（ｉ）段階（ｈ）の生成物から溶
剤系を除去し、それからＩＦＮ−β蛋白質を回収し、そ
して該ＩＦＮ−β蛋白質を適当な緩衝液中に再溶解し；
そして、（ｊ）段階（ｉ）の生成物をさらに精製する；
ことを含んで成る。

この発明の他の観点は、この発明のＲＰ−１１ＰＬｃ法
により精製された組換ＩＦＮ−β、及び前記ＲＰ−ＨＰ
１．Ｃ法を含む方法により回収されそして／又は精製さ
れたＩＦＮ−βに関する。

〔具体的な説明〕

組換生産されたＩＦＮ−βを回収するだめの多くの方法
が存在する。この発明のＲＰ−１１ＰＬＣ法をそれらに
組み入れることができる。

この発明のＲＰ−ＨＰＬＣ法が組み込まれるこの発明の
好ましい精製方法には１９８６年３月２５日に公開され
たヨーロッパ特許出願公開１１ｍ　８４３．９９７中に
記載されている方法が含まれる。下記のプロトコール１
〜３は、該ＲＰ−ＨＰＬＣ法を組み込むことができる好
ましい方法を例示する。これらのプロトコールは、微生
物により生産されたＩＦＮ−βを回収し、精製しそして
配合又は製剤化するための好ましい方法を模式的に示す
。

プ旦上旦ニル上 発酵 細胞濃縮 細胞壁及び細胞膜の　　ホモシネ−ジョン破砕 ダイアフィルトレー　　５＋ｗＭ　ＥＤＴＡジョン 再破砕　　　　　　　　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　１％（
Ｖ／Ｖ）オクタツール；ホモシネ 一ジョン シュークロース懸濁　　１５〜２３％（Ｗ／Ｗ）シュー
クロース 遠心分離　　　　　　　１０．０００〜１５．０００Ｘ
　ｇペーストの可溶化　　　２％ＳＯＳ　、リン酸緩衝
化塩溶液、 逆匹　　　　１０ｍＭ　ＤＴＴ　；　２％ＳＤＳ；２ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ；ｐＨ９；窒素のも とて５０℃に１０分間別熟熱 ；２５℃に冷却；氷酢酸に よりｐＨを７．４に調整 有機抽出　　　　　　　２−ブタノール／懸濁液（Ｖ／
Ｖ） 酸沈澱　　　　　　　　ｐＨ６，２；　２ｍＭ　ＤＴＴ
　：　０．１％ＳＯ５ 遠心分離　　　　　　　ｔｏ、ｏｏｏ〜１５．０ＯＯｘ
　ｇ酸沈澱物の可溶化　　　２％ＳＤＳ　Ｈ５ｄ　ＥＤ
ＴＡ；５０１リン酸緩衝液 還　元　　　　　　　　２０＋ｗＭ　ＤＴＴ　；　ｐＨ
８，５：窒素のもとて５０℃に１０分分間 熱；約２５℃に冷却 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００５０ｍＭアセテート；
ｐＨ５，５；カラム　　　　　　　　１％ＳＤＳ　；　
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ酸　化　　　　　　　　ヨードソ安
息香酸（ＩＢＭ）　Ｓ等モルの蛋白質：ＩＢＡ； ０．１％ＳＤＳ；２ｍＭピロリ ン酸ナトリウム；ｐＨ９； １ｍＭＥＤＴ＾ 濃縮　　　　ｐＨ５，５ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００５０ｍＭ酢酸塩；ｐＨ
５，５；カラム　　　　　　　　０．１％ＳＤＳ　；　
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ濃縮 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５５０ｍＭ酢酸塩；ｐＨ５，
５；カラム　　　　　　　　０．１％；　ＳＤＳ：　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５１ｍＭ　
Ｎａ０１１カラム 安定化　　　　　　　　１．２５〜５．００％；正常血
清アルブミン（ヒト）；ｐｕｌｌ →１２．０→７．５ 配　合　　　　　　　　１．２５％デキストロース前−
濾過　　　　　　　０．４５禮 無菌濾過　　　　　　　０．２２堵 凍結乾燥 最終容器製品 １旦上ユニ土叢 発酵 細胞濃縮 細胞壁及び細胞膜破　　ホモシネ−ジョン砕 ダイアフィルトレー　　５ｍＭ　ＥＤＴＡジョン 再破砕　　　　　　　　２＠ＩＭ　ＥＤＴＡ；　１％（
ｖ／ｖ）オクタツール；ホモシネ 一ジョン シェークロース懸濁　　１５〜２３％（ｗ　／　ｗ　）
シュークロース 遠心分離　　　　　　　１０．０００〜１５．０００Ｘ
　ｇペーストの可溶化　　　１〜２％ラウリン酸ナトリ
ウム；　２０ｍＭリン酸緩衝 液；５抛？ｌ　Ｉ）ＴＴ　；　ｐＨ９〜１０（音波処理
による） 還　元　　　　　　　　１０ｍＭ　ＤＴＴ　；　１〜２
％ラウリン酸ナトリウム；２１ＩＩＭ ＥＤＴＡ　；　ｐＨ９；窒素のもと て５０℃にて１０分間加熱； 約２５℃に冷却 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１１ｃ７！　；　ｐＨ９，２；カラム　　　　　　　　
　１〜２％ラウリン酸ナトリウム；　１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ 酸　化　　　　　　　　ヨードソ安息香酸（ｒＢＡ）　
；等モルの蛋白質：■ＢＢ１ １〜２％ラウリン酸ナト リウム；２１１１Ｍビロリン酸 ナトリウム；ｐＨ９；１ｍＭ ＥＤＴＡ 濃縮　　　　ｐＨ９ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ　；　ｐＨ７，２；カラム　　　　　　　　０．
１〜０．５％ラウリン酸ナトリウム；　１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ 濃縮　　　　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　；　ｐＨ９
，２：０．１〜０．５％ラウリン酸 ナトリウム；　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１
Ｃｊ！　　；　ｐＨ９，２；カラム　　　　　　　　　
０．１〜０．５％ラウリン酸ナトリウム；　１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５０，１％ラウリン酸ナトリ
カラム　　　　　　　　ラム；　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１ｔ（Ｊ　；ｐＨ９，２ ｐＨ調整　　　　　　　　溶出液のｐ＋＋を１．　ＯＮ
　ＩＣ７！により迅速に３に低下； ラウリン酸ナトリウム沈 澱 遠心分離及び濾過　　　沈澱したラウリン酸ナトリウム
を除去するため 安定化　　　　　　　　０．１５％Ｔｒｙｃｏｌ　ＬＡ
ｌ、−１２を添加 中　和　　　　　　　　ｐｌ＋を６．０〜７．２に上昇
ポリオール添加　　　　５％デキストロース前−濾過　
　　　　　　０．４５戸 無菌濾過　　　　　　　０．２２団 凍結乾燥（即時） 最終容器製品 プロトコール３ 発酵 細胞濃縮 細胞壁及び細胞膜波　　ホモシネ−ジョン砕 ダイアフィルトレー　　５ｍＭＥＤＴ＾ジョン 再破砕　　　　　　　　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　１％（
Ｖ／Ｖ）オクタツール；ホモシネ 一ジョン シュークロース懸濁　　１５〜２３％（Ｗ／Ｗ）シュー
クロース 遠心分離　　　　　　　１０，０００〜１５．０００Ｘ
　ｇペーストの可溶化　　　２％ＳＯ３、リン酸緩衝化
塩溶液 還元　　　　１０Ｉｌ１０ｌ１１；２％ＳＤＳ；２ｍＭ
　ＥＤＴＡ；ｐＨ９；窒素のも とで５０℃にて１０分間加熱； 約２５°Ｃに冷却；氷酢酸に よりｐＨを７．４に調整 有機抽出　　　　　　　２−ブタノール／懸濁液（Ｖ／
Ｖ） 酸沈澱　　　　　　　　ｐＨ６，２；　２ｍＭ　ＤＴＴ
　；　０．１％ＳＤＳ 遠心分離　　　　　　　１０．ＯＱＯ〜１５，０ＯＯＸ
　ｇ酸沈澱物の可溶化　　　２％ＳＤＳ　；　５ｍＭ　
ＥＤＴＡ；５０ｍＭリン酸緩衝液 還　元　　　　　　　　２０ｍＭ　ＤＴＴ　；　ｐＨ８
，５；窒素のもとて５０℃にて１０分間 加熱；約２５℃に冷却 ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００５０ｍＭ酢酸塩；　ｐ
ｌ＋５．５　；　１カラム　　　　　　　　　％ＳＤＳ
　；　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ酸　化　　　　　　　　ヨー
ドソ安息香酸（ＩＦＩＡ）；等モルの蛋白質：ＩＢＡ； ０．１％ＳＯ５；２ｍＭピロリ ン酸；ナトリウム；　ｐＨ９： １　ｍＭ　ＥＤＴＡ 濃縮　　　　ｐｌ＋５．５ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００５０ｍＭ酢酸塩；ｐＨ
５，５；カラム　　　　　　　　０．１％ＳＤＳ　；　
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ濃縮 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５５０ｍＭ酢酸塩、　ｐＨ５
，５；カラム　　　　　　　　０．１％５１１Ｓ；　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ９，２）カラム　　　　
　　　　　中０．１％ラウリン酸ナトリウム（移行成分
） ｐＨ調整　　　　　　　　溶出液のｐＨを１．０ＮＨ（
Ｊにより迅速にｐ１１３に低下： ラウリン酸ナトリウム沈 澱 遠心分離及び濾過　　　沈澱したラウリン酸ナトリウム
を除去するため 安定化　　　　　　　　０．１％Ｐｌｕｒａｆａｃ　Ｃ
−１７添加　　　　。

中　和　　　　　　　　ｐＨを６．０〜７．２に上昇ポ
リオール添加　　　　５％デキストロース前−濾過　　
　　　　　０．４５声 無菌濾過　　　　　　　０．２２ｍ 凍結乾燥（即時） 最終容器製品 ｐ　′１　１　ロセスと称して下記するものは、この発
明のＲＰ−１１ＰＬｃ法を組み込む８つの好ましい下流
代替プロセスである。

色　２．′ｊプロセス １旦立久上 １、再可溶化された酸沈澱物（ＲＳＡＰ）２０．ゲル濾
過：好ましくはＳ−２００による３、制御された酸化；
好ましくはＩＢＡによる４、　　ＲＰ−ＨＰＬＣ ５、ｆ機溶剤の除去（好ましくはＩＦＮ−β蛋白質を沈
澱せしめることによる）、及びＩＦＮ−βの回収（好ま
しくはこれを適当な緩衝液に再溶解することによる） ６、　ゲル濾過；好ましくはＳ−２００による７、配合
、及び場合によっては凍結乾燥以下余白 プロセス■ 制御された酸化の段階が段階５の後で行われる点を除き
、プロセス■と同じである。

プロセス■ １、　　ＲＳＡＰ ２、　　ＲＰ−ＨＰＬＣ ３、有機溶剤の除去及びＩＦＮ−β蛋白質の回収４、制
御された酸化 ５、　ゲル濾過；好ましくはＳ−２００による６、配合
、及び場合によっては凍結乾燥プロセス■ 制御された酸化の段階を段階２の前に行う、すなわち酸
化がＲＰ−ＨＰＬＣに先行する点を除き、プロセス■と
同じである。

プロセス■ １、　　ＲＳＡＰ ２、　　ＲＰ−１１ＰＬｃ ３、有機溶剤の除去及びＩＦＮ−β蛋白質の回収４、制
御された酸化 ５、　イムノアフィニティー精製段階 ６、配合、及び場合によっては凍結乾燥プロセス■ １、　省略されたフロント−エンドプロセスからの粒子
ペーストの可溶化物 ２、　ゲル濾過；好ましくはＳ−２００による３、　　
ＲＰ−ＨＰＬＣ ４、有機溶剤の除去、及びＩＦＮ−β蛋白質の回収５、
制御された酸化 ６、　ゲル濾過；好ましくはＳ−２００による７、配合
、及び場合によっては凍結乾燥プロセス■ １、　　ＲＳＡＰ ２、　ゲル濾過；好ましくはＳ−２００３、制御された
酸化 ４、ゲル濾過；好ましくはＳ−２００ ５、ＲＰ−１（ＰＬＣ ６、有機溶剤の除去及びＩＦＮ−β蛋白質の回収７、　
ゲル濾過；好ましくはＧ−７５ ８、配合、及び場合によっては凍結乾燥以下余白 プロセス■ １．　　Ｒ５ＡＰ ２、　ゲル濾過、好ましくはＳ−２００３、制御された
酸化 ４、　ゲル濾過、好ましくはＳ−２００５、ゲル濾過、
好ましくはＧ−７５ ６、ＲＰ−ＨＰＬＣ ７、有機溶剤の除去、及びＩＦＮ−β蛋白質の回収８、
配合、及び場合によっては凍結乾燥この発明を実施する
ためには、好ましい微生物宿主は細菌であり、Ｅ、コリ
　（Ｅ、ｃｏｌｉ）が最も好ましい。

−Ｊｌに、この発明の回収、精製及び製剤化プロセスは
、ＩＦＮ−βを発現するために形質転換された宿主微生
物の発酵を行い、該宿主微生物の細胞壁及び細胞膜を破
砕し、組換ＩＦＮ−βを含有する屈折体を細胞破片の残
りから分離し、還元条件下水性緩衝液中で屈折体を可溶
化し、２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール
によりＩＦＮ−βを抽。

出し、抽出されたＩＦＮ−βをクロマトグラフ精製にか
け、そして次にＩＦＮ−βをダイアフィルトレージョン
又は脱塩、好ましくは脱塩して可溶化剤を除去し、場合
によっては適当な移行成分（ｔ、ｒａｎｓｆｅｒｃｏｍ
ｐｏｎｅｎ　ｔ）を用い、そしてヒト血清アルブミンと
共に、又はデキストロースもしくはヒト血禁蛋白質画分
（Ｐ　Ｐ　Ｐ）を伴ってもしくは伴わないで、又は非イ
オン性生物分解性ポリマー洗剤と共に、前記の精製され
たＩＦＮ−βを製剤化する、ことを含んで成る。

プロトコール１〜３は、適当な発酵培地中でＩＦＮ−β
蛋白質を生産するために形質転換された微生物を培養す
ることから、精製されたＩＦＮ−β蛋白質が安定化され
そして臨床医により再溶解され得る療法用製剤に凍結乾
燥される最終段階までのプロセスであって、その中にＲ
Ｐ−１１ＰＬＣ法を組み込むことができるものを示す。

組換ＩＦＮ−βを回収しそして精製するための好ましい
方法は、 （ａ）（１）宿主微生物の培養細胞の細胞壁及び細胞膜
を破砕し； （２）前記破砕物から９９重量％より多くの塩を除去し
； （３）前記脱塩された破砕物を再破砕し；（４）前記破
砕物中の液体の密度又は粘度を上昇させあるいは該液体
中に密度又は粘度の勾配を生じさせるための物質を該破
砕物に添加し；（５）ＩＦＮ−βを含有する屈折体を高
速遠心分離により回収することによって、前記蛋白質を
生産するために形質転換された宿主微生物細胞培養物か
ら、該微生物により生産されたＩＦＮ−βを含有する屈
折体を回収し； （ｂ）前記屈折体中のＩＦＮ−βを、該組換体ＩＦＮ−
βと共に水溶性複合体を形成することができる可溶化剤
の水溶液により可溶化し、ここで該水溶液は還元剤を含
有しており； （Ｃ）得られた溶液から組換ＩＦＮ−βを前記還元剤の
存在下でゲル濾過により分離し； （ｄ）段階（ｆ）の生成物を酸化し； （ｅ）へブタフルオロ醋酸（１１Ｆ　Ｂ＾）又はトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）のいずれか及びアセトニトリルを
含んで成る溶剤系を用いて、結合した床孔シリカゲル逆
相高速液体クロマトグラフィーカラムに、段階（ｄ）の
酸化された生成物を通し；（ｆ）段階（ｈ）の生成物か
ら溶剤系を除去し、それからＩＦＮ−β蛋白質を回収し
、そして該ＩＦＮ−β蛋白質を適当な緩衝液中に再溶解
し；そして、（ｇ）段階（ｉ）の生成物をさらに精製す
る；ことを含んで成る。

前記の方法はさらに、段階（ｇ）の生成物を配合し、そ
して場合によっては凍結乾燥する段階を含むことができ
る。

好ましくは、有機溶剤の除去及び段階（ｒ＞のＩＦＮ−
βの回収は、ＩＦＮ−β蛋白質を沈澱せしめそして次に
該蛋白質を再溶解することにより達成される。好ましく
は、この様な沈澱はｐＨを上げそして塩濃度を上昇せし
めることにより達成される。塩濃度及びｐＨは好ましく
は、３Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６）を逆相ブールに、
重い沈澱が生ずるまで添加することにより上昇せしめる
。

この発明の他の好ましい方法の１つにおいては、前記の
方法の酸化段階（ｄ）が、５ｈａｋｃｄ等の米国特許Ｔ
ｈ　４，５３０．７８７に記載されている方法に従って
ヨードソ安息香酸を用いることにより、又はＫｏｔｈｓ
等の米国特許阻４，５７２，７９８に記載されているＣ
ｕＣｌ　ｚのごときＣｕ″″９陽イオンを含有する酸化
促進剤を用いることにより行われる制御された酸化段階
である。好ましくは、この制御された酸化段階はヨード
ソ安息香酸を用いることにより行われる。

段階（ｃ）及び（ｇ）のゲル濾過は好ましくはＳ−２０
０カラム上で行われる。

プロセス■ この明細書に開示されているＲＰ−ＨＰＬＣを組み込む
他の好ましい精製プロセスは、すぐ上に記載したプロセ
ス段階に加えて、屈折体を回収するための（ａ）段階の
もとに他の段階を含む。これらの段階は次の通りである
： ６、還元条件下での屈折体の可溶化； ７、可溶化された屈折体の有機抽出５及び８、抽出物か
らの前核屈折体の単離。

段階８は好ましくは、酸沈澱段階及びそれに続く遠心分
離を用いることにより行われる。この様な段階を含むプ
ロセスをこの明細書においてプロセス■と称する。

プロセス■ 組換ＩＦＮ−βを精製するためのこの発明の他の好まし
い代替プロセスは、プロセス■と称する方法の上記の段
階をそれぞれ含むが、但し、それぞれＲＰ−ＨＰＬＣ段
階及び有機溶剤除去段階である段階（ｅ）及び＜ｒ＞を
制御された酸化段階である段階（ｄ） の前に行う。

プロセス■ 他の好ましい代替プロセスはプロセス■の順序ですべて
の段階を含むが、但し段階（Ｃ）（第一ゲル濾過段階）
が省略される。

プロセス■ 他の好ましい代替プロセスはプロセス■に類似するが、
但し制御された酸化段階をＲＰ−ＨＰＬＣ及び有機溶剤
の除去の前に行う。

以下余白 プロセスＶ 他の好ましい代替プロセスはプ旦−ｔｒｘｍに類似する
が、但しゲル濾過段階（ｇ）の代りにイムノアフィニテ
ィー精製段階を用いる。

プロセス■ この発明の他の好ましい代替プロセスはプロセスエの段
階に類似するが、但しプ旦立入ｌの段階６．７、及び８
が省略される。

プロセス■ この発明の他の代表的なプロセスはプロセス■に類似す
るが、但し、１）制御された酸化段階（ｄ）とＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ段階（ｅ）との間に、好ましくはＳ−２００カラ
ム上での追加のゲル濾過段階が存在し； そして２）最後のゲル濾過段階（ｇ）が好ましくはＧ−
７５カラム上で行われる点において異る。

プロセス■ この発明の他の好ましい代替プロセスはプロセＸＶ［に
類似するが、但し好ましくはＧ−７５カラム上での第三
のゲル濾過段階を、プロセス■におけるようにＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ及び有機溶剤除去段階の後ではなく、その前に行
う。

プロセス■及び類推によるプロセスＩＩ−ＶＩの段階は
好ましくは次のようにして行うことができる。

（ａ）形質転換された細菌宿主を適当な発酵培地中で増
殖せしめ； （ｂ）発酵培地中の細菌をクロス−フロー濾過、遠心分
離又は他の常法により濃縮し； （Ｃ）細菌の細胞壁及び細胞膜を破砕し；（ｄ）該破砕
物から９９重量％より多くの塩をダイアフィルトレーシ
ラン又は遠心分離により除去し； （＜３）脱塩された破砕物を再破砕し；（ｆ）前記破砕
物に、該破砕物中の液の密度又は粘度を上昇せしめ、あ
るいは該液中に密度又は粘度の勾配を生じさせるために
物質を加え；（ｇ）ＩＰＮ−βを含有する屈折体を高速
遠心分離により細胞破片から分離し； （ｈ）還元条件下で水性緩衝液中に屈折体を可溶化し； （ｉ）可溶化された屈折体を好ましくは２−ブタノール
又は２−メチル−２−ブタノールにより有機抽出し； （ｊ）前記屈折体を抽出物から、好ましくは酸沈澱段階
及びこれに続く遠心分離により単離し；（ｋ）得られる
ＩＦＮ−β粒子ペレットを蒸留水により、又はＳＤＳの
水溶液によりＩＦＮ−β対５ＤＳＯ比約ｌ：３において
可溶化し； （１）溶液のｐＨを約９．５に調整し、そして可溶化さ
れたＩＦＮ−βを還元し； （ｍ）還元されたＩＦＮ−βをゲルクロマトグラフィー
により精製し； （ｎ）精製されたＩＦＮ−βの溶出された両分を集め； （０）ヨードソ安息香酸を用いる制御された酸化方法に
より溶出液を酸化し； （ｐ）段階（ｏ）の酸化された生成物を、結合相（ｂｏ
ｎｄｅｄ−ｐｈａｓｅ）床孔（ｗｉｄｅ−ｐｏｒｅ）シ
リカゲルカラム、並びに有機変性剤としてのアセトニト
リル及びＨＦＢＡ又はＴＦＡのいずれかの有機酸を含有
する溶剤系を用いるＲＰ−ＬＩＰＬｃにより精製し；（
ｑ）蛋白質を沈澱せしめ、そして次に適当な緩衝液に再
溶解することにより、段階（ｐ）の生成物から有機溶剤
を除去し； （ｒ）ゲルクロマトグラフィーによりＩＦＮ−βをさら
に精製しそして精製されたＩＦＮ−βを含有する溶出物
を集め； （３）精製されたＩＦＮ−β溶出物を、Ｔｒｉｓ−ＩＣ
７！（ｐＨ９，２）中０．１％ラウリン酸ナトリウム中
で平衡化されそして溶出される脱塩カラム中で脱塩し；
（ｔ’）溶出物のｐＨを適当な酸性剤によりｐｔ＋３．
。

に迅速に低下せしめ； （ｕ）ＩＦＮ−βブールを遠心分離及び濾過し；（Ｖ）
有効量の非イオン性生物分解性ポリマー洗剤含有可溶化
剤／安定剤を添加し； （Ｗ）溶液のｐＨをおよそ生理的ｐＨに調整し：（ｘ）
約０．２５％〜約１０％の濃度で適当なポリオール増Ｎ
／安定剤を添加し； （ｙ）溶液を濾過し；そして、 （Ｚ）すぐにＩＦＮ−βサンプルを凍結乾燥する。

場合によっては１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
を最初の可溶化段階に含め、そして混合物を５０℃に約
１０分間にわたって加熱することができる。好ましくは
、５０ｍＭＤＴＴを前記最初の可溶化に含め、そしてそ
の混合物を約５０℃にて約２０分間にわたり加熱するこ
とができる。

好ましくはＩＦＮ−βは段階（０）において、５ｈａｋ
ｅｄ等の米国特許１ｍ　４，５３０，７８７に記載され
ているように０−ヨードソ安息香酸溶液を用いて、又は
Ｋｏ　ｔｈｓ等の米国特許Ｎ１１４，５７２，７９８に
記載されているように塩化銅を用いて、そのシスティン
残基が架橋されてシスチンを形成するように酸化される
。好ましくは、この様な制御された酸化段階のために０
−ヨードソ安息香酸が使用される。

１９８６年３月２５日に公開されたヨーロッパ出願公開
Ｎｕ　８４３，９９７は、ＩＰＮ−βを生産するために
微生物宿主を培養し、そして組換蛋白質を抽出し、精製
しそして製剤化する方法を詳細に記載している。

この精製方法は、本発明のＲＰ−１１ＰＬｃ法が組み込
まれる方法の例である。この方法の概要は次の通りであ
る。

形質転換された微生物を適当な培地中で、６８０ｎｌ１
１において典型的には約３０以上の光学濃度（ＯＤ）に
、そして好ましくは６８０ｎｍにおいて約２０〜４０の
光学濃度に増殖せしめる。増殖培地の組成は関与する特
定の微生物に依存するであろう。

培地は、微生物の栄養要求を満たす成分を含有する水性
媒体である。増殖培地は典型的には資化性の炭素源、及
び窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カリウム及び
ナトリウムの各イオン、並びに場合によってはアミノ酸
、及びプリン及びピリミジン塩基を含有するであろう（
Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏ　　＋
　Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ。

第１４版、８０−８５頁（１９８０）を参照のこと）。

ｔｒｐプロモーターを含有する発現ベクターにおいては
、培地中のトリプトファン濃度は、ＩＦＮ−βの発現が
望まれる時点において制限されるように注意深（制御さ
れる。Ｅ、コリのための増殖培地は当業界においてよく
知られている。

細胞が培養物から収穫された後、これらはクロス−フロ
ー濾過、遠心分離又は他の常法に従って必要であれば約
２０〜１５０■／−１好ましくは８０〜１００　ｔｒｙ
　／　ｍｌ−（６８０ｎｍにおけるＯＤが４０〜３００
、好ましくは１６０〜２００）に濃縮される。好ましく
は、密封が、破られる前に生存組換微生物が残っていな
いことを保証するために、細胞の濃縮前又は濃縮中に発
酵槽中に、ヒトに対して非毒性の化合物、例えば１−オ
クタツールを全量に対して約１重量％の量で添加する。

収穫された培養物の濃縮の後、微生物の細胞膜を破砕す
る。工程のこの段階において常用の細胞破砕技法、例え
ばホモシネ−ジョン、音波処理、又は加圧サイクルを用
いることができる。好ましい方法は音波処理、又はホモ
ジナイザーを用いるホモシネ−ジョンである。破砕段階
の終点は、典型的には細胞溶解と共に増加する２６０ｎ
ｍにおける吸光を用いて光学濃度をモニターすることに
より決定することができる。ともかく、無傷の細胞が可
溶化段階に実質上全く運ばれない様に、破砕段階は実質
上すべての細胞を破砕すべきである。必要により、破砕
の前に濃縮物の液相のｐＨを、次の段階において異種性
蛋白質を細胞破片中に不溶性複合体として残しなからＥ
、コリ蛋白質の除去を促進するレベルに調整する。

細胞が破砕された後、好ましくは破砕物に脱イオン水を
添加し、そして９９重量％より多くの塩をそれから除去
する。破砕物のイオン強度を低下せしめるためのこれら
の塩の除去は、脱イオン水を用いるダイアフィルトレー
ジョンによるイオンのクラッシュアウトにより、又は遠
心分離して細胞破片及び屈折体をペレット化しそして次
に脱イオン水中に再懸濁することにより達成することが
できる。

塩が実質的に除去された後、１−オクタ−ノールのごと
き化合物が前に添加されていない場合には場合によって
はそれを脱塩された破砕物に加えて、生存組換微生物が
残らないことを保証する。

最初の破砕について前記したようにして、脱塩された破
砕物を再度破砕する。

再破砕の後、破砕物に物質を加えることによって破砕物
中の液体の密度もしくは粘度を上昇せしめ、そして／又
は該液中に遠心中の勾配を形成する。この目的を達成す
るための１つの手段は、糖もしくは糖の混合物のごとき
物質、又は二相系例えばグリセリン／糖混合物を添加し
て液の密度を約１．１〜１．３ｇ／ｍｆｆ、好ましくは
１．１３〜１．１７ｇ／ｍｌのρに上昇せしめることで
ある。さらに、適当な手段により、例えば粘性化合物、
例えばシェークロース、又はグリセリンを添加すること
により液相の粘度を５〜ｌＯセンチボイズに増加せしめ
ることができる。

省略された“フロント−エンド”法の最終段階において
屈折体を回収するため、目的の蛋白質を含有する屈折体
を高速遠心分離により細胞破片から分離する。“高速遠
心分離”は、懸濁液を遠心分離機中で約１０．０００〜
４０．０００　ｘ　Ｇ　、好ましくは約１０．０００〜
２０．０００ＸＧにおいて、体積に依存する適当な時間
、一般には約１０分間〜７２時間回転せしめることを意
味する。この遠心分離により得られるベレットを“粒子
ベレット”又は“粒子ペースト”と称する。省略された
フロント−エンド法は、ラウリン酸ナトリウムが主たる
可溶化剤である場合に最もしばしば使用される。

屈折体を回収するための拡大された“フロント−エンド
”法においては、省略されたフロント−エンド法の最後
の遠心分離段階から得られる粒子ペレットが可溶化され
、還元され、そして次に２−ブタノール又は２−メチル
−２−ブタノールにより水性媒体から抽出される。次に
抽出物相を酸により沈澱せしめ、そして遠心して“最終
ベレット”又は“最後ペースト”を生じさせ、これを次
にさらに精製する。

拡大された“フロント−エンド”法は省略されたフロン
ト−エンド法から次の点で区別される。

すなわち、前者は幾つかの追加の段階、すなわち還元条
件下での屈折体の可溶化；可溶化された屈折体の有機抽
出；及び抽出物からの該屈折体の単離を含む。本質的に
、粒子ペレットに対して最終ベレットの増強された純度
が下流工程の精製負荷を軽減する。最終生成物の所望の
純度レベルを達成するため、フロントエンド法及びそれ
より後の精製段階の選択の間には相互依存が存在する。

屈折体の特定のフロント−エンド回収法の選択が行われ
れば、当業者は最終生成物の所望の純度レベルを達成す
るために、下記の精製段階を取捨選択することができる
。

省略されたフロント−エンド法又は拡大されたフロント
−エンド法のいずれかを用いてＩＦＮ−β含有屈折体を
回収した後、精製の次の段階において屈折体を含有する
粒子ベレット又は最終ベレットを可溶化する。次の可溶
化剤、すなわちドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラ
ウリン酸ナトリウム、尿素、ドデシルスルホン酸ナトリ
ウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリ
ウム、トリデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルＮ−
ナルコシン酸ナトリウム、テトラデシルＮ−サルコシン
酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、
及びグアニジン塩酸塩を使用することができる。好まし
い可溶化剤はＳＤＳ、ラウリン酸ナトリウム、又はグラ
ニシン塩酸塩である。

可溶化剤は水性緩衝液中で、好ましくはリン酸緩衝化塩
溶液中で使用される。可溶化剤の好ましい％は１〜５重
量／容量％の範囲内にある。好ましい可溶他剤溶液は、
１〜２％ラウリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝化塩溶
液（２０ｍＭ　ＮａＰＯ４）（ｐＨ９〜ｉ０）及び５０
ｍＭβ〜メルカプトエタノール中１〜５％ＳＤＳである
。可溶化を促進するために可溶化剤としてラウリン酸ナ
トリウムを使用する場合、好ましくは音波処理を用いる
。

可溶化段階において使用することができる還元剤にはβ
−メルカプトエタノール（β−ｍａｒ）　、グルタチオ
ン、システィン及びジチオスレイト−ル（ＤＴＴ）が含
まれる。ＤＴＴ及びβ−ｍｅｒが最も好ましい還元剤で
ある。主たる還元剤としてラウリン酸すｌ・リウム又は
グアニジン塩酸塩が使用される場合、還元剤を使用する
のが好ましい。

可溶化は典型的には２０℃〜２５℃の温度において、固
相と可溶化媒体との間の接触を促進するために混合を伴
って行われる。場合によっては、この時点で還元段階を
行うことができる。必要により、ｐＨを８．５〜１０の
範囲に、最も好ましくは約９に調製することができる。

懸濁液を窒素のもとて５〜１５分間５０±５℃に加熱す
ることができる。

次に反応混合物を約２５℃に冷却することができる。

サンプルを５分間おいた時、又は溶液が透明になった時
、可溶化が完了したと考えられる。場合によっては、こ
の時点で、可溶化が完了した後に遠心分離又は濾過によ
り不溶物を分離することができる。

蛋白質が可溶化した後、生ずる懸濁液を場合によっては
１０，０００〜４０，０ＯＯＸＧ、好ましくはｉｏ、ｏ
ｏ。

〜１５，０ＯＯＸＧで遠心して、目的の蛋白質の分子量
と非常に近い分子量を有する幾つかの蛋白質を包含する
、特に追加の宿主（例えばＥ、コリ）蛋白質を含有する
ベレットを得ることができる。遠心分離の正確な速度は
臨界的ではなく、低速においてさえ不溶物のほとんどが
除去されるであろう。

ベレットが廃棄され、そして目的の蛋白質を含有する上
清が残され、そして目的の蛋白質を回収するために処理
される。

可溶化中に還元段階が行われなかった場合、この方法の
次の段階は可溶化された屈折体蛋白質の還元であろう。

好ましい還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である
。還元段階はまた、キレート化剤、例えばエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加を含むことができる。

この方法における次の段階は、遠心分離又は濾過の後に
残留する宿主汚染物から、及び場合によっては可溶化剤
から、上清中の蛋白質を分離することである。この発明
に従えば、前に記載したこの発明の好ましい態様により
示されるように、ゲル濾過、ＲＰ−ＨＰＬＣ，及び／又
はイムノアフィニティークロマトグラフィーの組み合わ
せを用いることができる〔イムノアフィニティークロマ
トグラフィーはＰｅｓ　ｔｋａ等、Ｐｈａｒｍａｃ、Ｔ
ｈｅｒ、、　２９　：　２９９−３１９（１９８５）に
記載されている〕。これらの汚染物から蛋白質を分離す
ることを可能にするように溶液を分画することができる
ゲルは商業的に入手可能である。５ｅｐｈａｃｒｙｌ　
Ｓ−２００が高分子成分を除去するために好ましいゲル
であり、そして５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０＋Ｇ−７５
又はＧ−１００が低分子量汚染物を除去するために好ま
しい。ゲル濾過は典型的には、約０．１％〜１．５％の
可溶化剤及び約０．５〜１０ｍＭ還元剤を含有する緩衝
化溶液（ｐＨ５，５〜７．０）中で行われる。

カラムの大きさは目的の成分の適当な分離が可能なよう
にされる。

ＲＰ−ＨＰＬＣは、目的の蛋白質の分子量に近い分子量
を有しそしてそれ故にゲル濾過によっては完全に除去す
ることができない分子を溶液から分離することができる
。従って、ＲＰ−ＨＰＬＣはまたゲル濾過後の最終精製
段階として使用することができる。

製剤の安定化の前の精製の最終段階が約８．５〜約１０
のｐＨ範囲においてラウリン酸ナトリウムのごとき移行
成分（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｃｏｍｐｏｎｅ’ｎｔ）を用
いる脱塩段階であることが、この発明の実施において好
ましい。クロマトグラフィ一段階の後の蛋白質の純度は
９５％以上であり、そして通常約９８％以上である。こ
の高度に純粋な物質のエンドトキシン含量はｉｏｏ、ｏ
ｏｏユニットの蛋白質生物活性当り約２ｎｇ未満、通常
約０．０１ｎｇ未満である。

蛋白質の製剤化は、精製され選択的に酸化された蛋白質
を用いて別の操作として行うことができ、又は選択的に
酸化された蛋白質の精製と一体化された操作で行うこと
ができる。゛ 医薬錠剤の製剤化において使用される常用の固体非蛋白
質増量／安定化剤をキュリヤーとして使用することがで
きる。これらの材料は水溶性であり、ＩＦＮ−β蛋白質
と反応せず、そしてそれ自体安定である。これらはさら
に、好ましくは水に対して非−感受性、すなわち非−吸
湿性である。キュリヤーの候補の特定の例にはポリオー
ル；小麦、トウモロコシ、米及びポテトからの澱粉又は
澱粉加水分解物；並びにマイクロクリスタリン−セルロ
ースが含まれる。

組換β−インターフェロン約０．１２５〜２■、好まし
くは０．２５〜１■である単位投与量を容器に分配し、
この容器にスロットホッパーによりキャップを付し、そ
して常用の凍結乾燥条件及び装置を用いて内容物を凍結
乾燥する。

凍結乾燥された無菌生成物は、（１）組換β−インター
フェロン；　（２）キャリヤー、好ましくはポリオール
、そして特に好ましくはデキストロース又はマンニトー
ル；　（３）安定剤、好ましくはＩＳＡ、又は非イオン
性生物分解性ポリマー洗剤、好ましくはＴｒｙｃｏｌ　
ＬＡＬ−１２又はＰｌｕｒａｆａｃ　Ｃ−１７；並びに
（４）混合物が再溶解された場合に生理的ｐＨを与える
少量の緩衝液、の混合物から成る。

生成物はまた、化学的安定性を増強するために微量の防
腐剤を含有することができる。

凍結乾燥された混合物は、常用の非経口水性注射剤、例
えば注射用蒸留水、リンゲル注射液、バンク注射液、デ
キストロース注射液、デキストロース及び塩注射液、生
理的塩注射液等をバイアルに注入することにより再溶解
することができる。

過剰の発泡を防止するため、注射液はバイアルの側部に
対して加えるべきである。バイアルに添加される注射液
の量は典型的には１〜５−１好ましくは１〜２ｄの範囲
である。

上記の再溶解された製剤はヒト又は他の動物に治療を提
供するために有効な量（すなわち、患者の病的状態を除
去し又は軽減するＭ）において、それらに非経口投与す
るために適当である。ＩＦＮ−β療法は抗癌治療、抗ウ
イルス治療及び抗乾廚治療のために適当である。

組換ＩＦＮ−βは“親脂性蛋白質”であり、この用語は
、この明細書においては、室温、大気圧及び約６．５〜
７．８の１１１から成る周囲条件のもとて水性媒体に不
溶であるか又は容易には溶解しない蛋白質であることを
意味する。“組換蛋白質”なる用語は、組換ＤＮＡ技法
により生産される蛋白質を意味し、この方法においては
一般にＤＮＡが適当な発現プラスミドに挿入され、この
プラスミドが宿主生物に導入され異種蛋白質が生産され
る。このＤＮＡは宿主生物に対して本来的なものではな
い。宿主はＤＮＡに対して異種性の任意の生物、例えば
細菌、酵母、ウィルス、哺乳類等である。

好ましくは宿主は微生物であり、そして最も好ましくは
細菌である・ この明細書において使用する場合、“ＩＦＮ−β”なる
用語は、組換ＤＮＡ技法により生産されるβ−インター
フェロン又はβ−インターフェロン様ポリペプチドであ
って、そのアミノ酸配列がグリコジル化されていないか
又はグリコジル化された天然β−インターフェロンのア
ミノ酸配列と同一であるか、類似しているか、又は実質
的に相同であるものを意味する。

ＩＦＮ−βの正確な化学構造は多くの因子に依存するで
あろう。イオン化され得るアミノ基及びカルボキシル基
が分子中に存在するので、特定のＩＦＮ−β蛋白質は酸
性塩もしくは中性塩、又は中性の形態で得ることができ
る。適当な環境条件に置かれた場合にその活性を維持す
るこの様な調製物はいずれもこの発明のＩＦＮ−βの定
義内に包まれる。さらに、この蛋白質の一次アミノ酸配
列は、糖成分を用いる誘導体化（グリコジル化）、又は
他の補完分子、例えば脂質、ホスフェート、アセチル基
等により、さらに一般的にはサツカライドとの接合によ
り増加され得る。この様な増加の幾つかの観点は生産宿
主の翻訳後プロセシング系を介して達成され、他の修飾
はインビトロで導入される。

ともかく、前記のような蛋白質の活性が破壊されない限
り、この様な修飾はこの発明のＩＦＮ−β蛋白質の定義
に含まれる。言うまでもなく、この様な修飾は、種々の
アッセイにおいて蛋白質の活性を増強し又は低下せしめ
ることによって活性に量的又は質的に影響を与えること
が予想される。

さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基を酸化、還元又は他
の誘導体化によって変形することができ、そして蛋白質
を開裂せしめることにより活性を保持した断片を得るこ
とができる。活性を破壊しないこのような変化は、その
蛋白質を定義から逸脱させるものではない。

最も好ましくは、ＩＦＮ−β蛋白質は、ＩＦＮ−β遺伝
子により、又は（ａ）天然ＩＦＮ−βのアミノ酸配列と
少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列及び（ｂ）天然
ＩＦＮ−βと共通の生物学的活性を有する蛋白質をコー
ドするＩＦＮ−β遺伝子の変形体により形質転換された
微生物により生産される非ゴリコシル化ＩＦＮ−βであ
る。アミノ酸配列の実質的同一とは、合成蛋白質と天然
ＩＦＮ−βとの間で配列が同一であるか、あるいは不都
合な機能的非類似性を生じさせない１個又は複数個のア
ミノ酸変化（欠失、付加、置換）により異ることを意味
する。この様な蛋白質の例として、米国特許Ｎａ　４，
５１８，５８４及びＮｕ　４，５８８，５８５に記載さ
れているＩＦＮ−β蛋白質が挙げられる。最も好ましく
は、ＩＦＮ−βは、アミノ酸位置１７のシスティン残基
がセリン残基により置き換えられているＩＦＮ−βｓ１
．□７である。

五 次に、例によりこの発明のＲＰ−１（ＰＬＣ法及び組換
ＩＦＮ−β精製法を説明するが、これによりこの発明の
範囲を限定するものではない。これらの例において、す
べての温度は、特にことわらない限り℃で示す。

この例は、微生物により生産されたＩＦＮ−βを回収し
、精製しそして製剤化するための、この発明のＩ？Ｐ−
ＨＰＬＣ法を用いない代表的な方法を示す。この方法は
ＩＦＮ−β蛋白質を含有する屈折体を回収すＩＦＮ−β
ｌ１ｌｒｌ？と称するＩＦＮ−β類似体をＥ、コリから
回収した。この組換ＩＦＮ−βのアミノ酸配列は、１７
位のシスティンがセリンに変えられている点において天
然ヒトＩＦＮ−βのそれと異る。この例において使用さ
れる、プラスミドｐｓＹ２５０１を担持するＩＦＮ−β
５ａｒｌ？生産性Ｅ、コリ（Ｋ１２／ＭＭ　２９４−１
）の株は１９８３年１１月１８日にアメリカン・タイプ
・カルチエア・コレクションに、１ｌｈ３９．５１７と
して寄託されている。前記類似体は米国特許Ｎ１１４，
５１８．５８４及びＩｌｈ　４．５８８，５８５に記載
されている。

形質転換されたＥ、コリを３７℃にてｔｏｏｏ　ｘの発
酵槽中で増殖せしめた。必要に応じて（１）撹拌を増強
し、（２）空気を添加し、そして（３）酸素を添加する
ことにより、溶存酸素を約４０％に維持した。

発酵槽に運転容量にまで水を加えた後、下記の微量要素
を添加した。

ＺｎＳＯ４・７１１２０　　　　　　　　　　７２ｍＭ
ＭｎＳＯ４・４１１２０　　　　　　　　　　３０ｉ１
ＭＣｕＳＯ１・５Ｈ２０３声 Ｎａ３サイドレー）　・２１１．０　　　　　１．５ｍ
ＭＫＩＩｚＰ０４２１ｍＭ （ＮＨ４）　２Ｓ０４　　　　　　　　　　　７２ｍＭ
次に、発酵槽フィード及び添加容器を作業標準に従って
殺菌した。次に、下記の無菌添加物を調製した。

Ｍｇ５Ｏａ　・７１１２０　　　　　　　　　　．２０
ｍＭＦｅ１ｏ４・７ＨｚＯ’　　　　　　　　　ｉｏｏ
ＪＩＭＬ−トリプトファン　　　　　　　７０■／ｌチ
アミン・ＨＣｆｆｉ　　　　　　　　　　２に／　１グ
ルコース　　　　　　　　　　　５ｇ／１発酵槽を冷却
し、そして凍結Ｅ、コリ培養物又は種母Ｅ、コリ培養物
を２■／Ｉ！で接種した。グルコース濃度を５〜ＬＯｇ
／ｌに維持するためにグルコ−スフ・−ドを行った。発
酵開始後約１５時間において、ＫＯＨによりｐＨを６．
８に調整した。

サンプルの光学濃度測定及び残留グルコースの測定を１
４〜１６時間目、及びその後１時間間隔で行った。

培地からのＬ−）リプトファンの消耗による■ＦＮ−β
Ｉ＠１Ｆ１７生産の誘導が約０Ｄａｓｏ”　１０におい
て起こり、次に００６１１゜＝１５における最後濃度が
２％となるようにカザミノ酸の添加を行った。グルコー
スの消費が４０±６ｇ／ｌに達した時に培養物を収得し
た。

のｔ−並びに　　射撃　び　已　の′砕ＩＦＮ−β８□
１．を含有する屈折体を単離した。

１００に分子量カットオフのＵＦクロス−フロー濾過カ
ートリッジに加圧下で収得物を循環せしめることにより
、それを約５〜１０倍に濃縮した。高圧ホモジナイザー
に６　、０００〜８．ＯＯＯｐｓｉｇにて通すことによ
り細胞を破砕した。

ダイアフィルトレージョン この破砕物にＥＤＴＡを添えて最終濃度５ｚＭとした。

次に、この懸濁液を５容量の脱イオン水に対してダイア
フィルトレージョンした。

再腋詮 次に、ＥＤＴＡを最終濃度２ｍＭになるように加えた。

オクタツールを１　　（Ｖ／Ｖ）％となるように加えて
、破砕された生成物中に残留する生存細菌をすべて殺し
た。懸濁液を６．０００〜８，０００ｐｓｉｇにて高圧
ホモジナイザーに２個通すことにより再破砕した。

シュークロース懸ゞ　び心　↑ 前記再破砕物にシュークロースを添加して最終濃度を２
３Ｗ／Ｗ％として１．１及び１．２５　ｇ　／　ｍ１０
間の最終密度勾配を生じさせた。この混合物をｔｏ、ｏ
ｏｏ〜１５，０ＯＯＸ　ｇにて遠心分離し、そして粒子
ベレット又はペーストを集めた。遠心分離前及び遠心分
離中、２０℃以上の温度を維持した。

亡　ベーストの口・′六　　び− 次に、粒子ベレットを２％ＳＤＳを含有するリン酸緩衝
化塩溶液中に可溶化した。固体ＤＴ’Ｔ及びＥＤＴＡを
それぞれ１０ｍＭ及び２ｍＭの最終濃度となるように添
加した。懸濁液を窒素のもとで５０±５℃にて１０分間
加熱した。次に、反応混合物を約２５℃に冷却し、そし
て混合物のｐｌ＋を７．４に調整した。

び　・冒 懸濁液の合計容量と同じ容量の２−ブタノールを量り取
っ゛た。懸濁液及び有機溶剤を別々にしかし同時に１．
１〜１．３１／分の流速で静止混合器を通して相分離の
ための連続遠心分離機（約１１　、７７０Ｘｇ）にポン
プ輸送した。ＩＦＮ−β５１１１”１７を含有する２−
ブタノールリッチ相（有機抽出物）を集めた。

この有機抽出物を、リン酸緩衝化塩溶液中０．１％Ｓ　
Ｄ　３２．５容量と混合した。固体ＤＴＴを最終濃度が
２ｍＭとなるように添加した。有機抽出物／緩衝液のｐ
Ｈを氷酢酸により６．２±０．１に調整した（酸沈澱）
。

連立分離 次に、この混合物を約２〜６時間１３，０ＯＯＸ　ｇに
て遠心分離し、上清をデカントし、そして次に約８１％
のＩＦＮ−βを含有する最終ベレットを集めた。

次に、屈折体を含有するこの最終ベレットを下流処理に
よりさらに精製した。

”？　ｉＲ’　　０）ＨＨ＝ヒ−ヒ””　　（ＲＳＡＰ
）次に、最終ベレットを、２％ＳＤＳ及び５ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液に再懸濁した。

固体ＤＴＴを添加して最終濃度を２０ｍＭとし、次にＮ
ａＯＨによりρ］１を８．５に調整した。懸濁液を窒素
のもとて５０±５℃にて１０分間加熱し、そして次に約
２５℃に冷却した。次に、氷酢酸によりｐＨを５．５に
調整し、そして０．６５／Ｍフィルターを通して濾過し
た。この時点でＩＦＮ−βは再懸濁された酸沈澱物（Ｉ
？ＡＳＰ）として知られる形態にあった。

Ｓ−２００プレ−Ｌｉ人 次に、濾液を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００プレーカ
ラムに負荷し、そして５０ｍＭアセテート（ｐＨ５，５
）、ＩＩＴＩＭ　ＥＤＴＡ及び１％ＳＤＳから成る溶出
緩衝液を用いて清浄なパイロジエンを伴わない容器に両
分を集めることにより、該濾液をプレーカラムクロマト
グラフィーにより処理した。ＩＦＮ−βモノマーを含有
する画分をプールした。

次に、ＩＯＫ分子量カットオフの中空繊維限外濾過ユニ
ットを用いてプレーカラムプールを濃縮した。

たプレーカームプール　′−るための’ｉｎ−次に、ｆ
Ｈｋ宿されたブレーカラムプールードソ安息香酸（ＩＢ
Ａ）を用いて酸化した。２１ビロリン酸ナトリウム、０
．１％ＳＤＳ及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する反応容器に
等モル量の蛋白質及びＩＢＡを添加することにより酸化
を行った。２０団過剰のＩＢＡが酸化の終点において存
在した。

酸化中、ＮａＯＨによりｐｌ＋を９．　０±０、■に調
節し、そして酸化が完了した時；）−酢酸により５．５
±０．　２に調整した。

１−踏 次に、ＩＯＫ分子量カットオフの中空繊維限外濾過ユニ
ッ１−を用いて、ＩＦＮ−β蛋白質を濃縮した。

」」四土立立人 次に、蛋白質を主カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２
００）に負荷し、そして５０ｍＭアセテート（ｐＨ５．
５）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．　１％ＳＤＳから成
る溶出緩衝液を用いて清浄なパイロジエンを除去した容
器に集めた。

プールされるべきピークの最初からピークの終りまでの
各両分チューブからのサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行った。ＳＯＳ−ＰＡＧＥの結果を用いて、高分子
量汚染物を含有しない画分を決定した。次に、これらの
百分をプールした。

１−血 次に主カラムプールを、ＩＯＫ分子量カフトオフの中空
繊維限外濾過ユニットを用いて濃縮した。

鉦互左立人 主カラムを用いて行った上記の方法をＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−７５カラム−にで反復した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を用いて、低分子量汚染物及び高分子量汚染物の両方
を含有しない両分をプールした。

鉦益左旦左及ｈ！！！−整 次に、０．１％ラウリン酸ナトリウムを移行成分として
用いてｐｌ＋９．２において脱塩段階を行った。

例えば１　ｍＭ　Ｎａｉｌのごとき適当な塩基性剤を用
いてｐＨを調製した。

次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ９．２）中０．　１％ラウリ
ン酸ナトリウムにより平衡化し、そしてＯ．　１％ＳＤ
Ｓを含有するＳｅｐｈａ−ｄｅｘ　Ｇ−７５プールを負
荷した。プロセスクロマトグラムを用いてＩＦＮ−β□
，１□のピークを集めた。次に、溶出液のｐｌ＋を１．
　Ｏ　Ｎ　　ＩＩｃβにより迅速にｐＨ３、０に低下せ
しめた。このｐＨがラウリン酸すトリウムを沈澱せしめ
たがＩＦＮ−βＳ．□，を溶液中に残した。

遠冗づｂ１及ｐ上 混合物を３５．ＯＯＯＸ　ｇにて３０分間遠心分離し、
そして上滑を０．２２ミクロンのニトロセルロースフィ
ルターを通して濾過した。ｓＤｓ７壱度をアクリジンオ
レンジによりアッセイした（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ等、”Ｒ
ａｐｉｄ　　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　
　Ａｓｓａｙ　　ｏｆ　　ＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔ
ｅ　Ｕｓｉｎｇ　Ａｃｒｉｄｊｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ”　
Ａｎａｌ．旧ｏｃｈｅｍ　、　。

１１８、１３８−１４Ｈ１９８１）　）。Ｇ−２５プー
ルの回収は８５％以上であり、そしてＳ　Ｄ　Ｓ　？５
度は１０ｉ／■未満に低下した。

以下余白 配Ｕ匪止 次に、０．１５％Ｔｒｙｃｏｌ　ＬＡＬ−１２を添加す
ることにより濾過された上清を安定化した。次に、配合
された生成物のｐＨをＮａＯＨにより約７．０±０．３
に上昇せしめた。次に増量／安定化剤である５％デキス
トロースを加えた。次に、溶液を前−濾過し、そして０
．４５及び０．２２ミクロンのニトロセルロースフィル
ターを通して無菌濾過した。この直後に、０．５Ｘ１０
”ユニットを含むＩＦＮ−β５ａｒ１７の正しい投与１
０．２５■を、注意深くモニターされた衛生的で無菌の
条件下で、無菌の株を有する無菌のバイアルに無菌的に
充填した。次にバイアルを、適当な熱電対が取りイ１け
られた凍結乾燥機に手早く入れた。バイアルを一３５℃
〜−４５℃にて凍結せしめた。凍結乾燥サイクルを完了
し、そしてバイアルを真空下に機械的にシールした。

良λ　ＲＰ−＋１ＰＬｃによる′　：汎　レベルのＧ−
２５カラム（例１を参照のこと）から溶出した約５０■
のＩＦＮ−β蛋白質を撹拌されたアミコンセル中で１７
．４■／Ｉ１１に濃縮した。３ｄのアリコート（５２，
２■）を、５０％アセトニトリル、０．１％ＨＦＢＡ中
で平衡化された２２ｍ１ＣＩｌｌカラム（１５〜２０ミ
クロンの粒子）に適用した。１分間当り０．３３％のア
セトニトリル濃度の上昇による直線グラジェントで、１
５−７分の流速においてＩＦＮ−β蛋白質を溶出せしめ
た。溶出された両分を２つの方法で、すなわちウェスタ
ンブロッティング、及び分析用Ｃｌ１ｌカラムへの再注
入により分析した。

ウェスタンブロッティングのため、濃縮器を用いて少量
のＳＤＳの存在下で両分を蒸発乾燥せしめ、そして１％
ＳＤＳ中に再懸濁した。ウェスタンプロットを行い、そ
してＩＦＮ−β（モノクローナル抗−ＩＦＮ−β；　０
．５　ｔｔｇ蛋白質／レーン）又はＥ。

コリ蛋白質（ラビット抗−Ｅ、コリ蛋白質；１０ｎ蛋白
質／レーン）について発色せしめた。

サンプルが還元されている（尿素／５ＯＳ−ＰＡＧＥ）
か又は還元されていない（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）種々の両
分中のＩＦＮ−β種のウェスタンプロットは、主ピーク
（ピークＢ）の尾部からの両分に低分子種が濃縮されて
おり、他方主ピーク（ビー”６Ｂ＞の頭部及び尾部の両
方からの百分にはオリゴマーが濃縮されていることを示
した。中央ピーク画分は相対的にオリゴマーを含まなか
った。

各両分及びＧ−２５出発材料中に存在するＥ、コリ蛋白
質種のウェスタンプロットを行った。Ｅ、コリ蛋白質種
の量は少なかったため、Ｇ−２５材料においてさえ、結
論を引き出すことは困難であった。

分析用ＲＰ−１１ＰＬｃ分析のため、約２０．ｗの蛋白
質を含有するアリコートを分析用ＣＩ８カラム（５ミク
ロン粒子サイズ）に再注入した。アセトニトリル１０．
１％ＨＦＢＡの５０−６５％直線グラジェントを用いて
サンプルを溶出した。

クロマトグラフ上のピークＡ及びＣは微少不純物と考え
られる微量のＩＦＮ−β種を示し、他方ピークＢは主Ｉ
ＦＮ−β生成物を含有する。各両分及びＧ−２５出発材
料中のピークＡ及びＢの量を第１表に示す。この結果は
、クロマトグラムを通して次第にピークＡの比率が低下
し、そしてピークＢの比率が上昇することを示している
。

以下余白 」」−表 ３２．５分　　　９９．８　　　　　検出限界下　　　
　　２０．０３６．０分　　　４．２　　　　　検出限
界下　　　　　２４．５３８．０分　　　２．１　　　
　　　４９，８　　　　　　２５．４３９．０分　　　
０．３　　　　　　６９．４　　　　　　２５．４４０
．０分　　　０．３　　　　　　９８，７　　　　　　
　２５．４４２．０分　　　０．３　　　　　　９７．
７　　　　　　　２５．６４５．５分　検出限界下　　
　　１００．０　　　　　　２５．８この例が示すとこ
ろによれば、ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、分析用ＲＰ−１１Ｐ
ＬＣ及びウェスタンブロッティングの両者により見られ
多くのＩＦＮ−β種の良好な分離をもたらす、　Ｇ−２
５出発材料に比べて、このＲＰ−ＨＰＬＣ分離により得
られる中央ピーク画分においては、ピークＡ　、　Ｃ，
及びピークＢの前及び後からの他の種、並びに低分子量
ＩＦＮ−β画分及びオリゴマーが減少している。

この例は、０．５ｇのＧ−７５１ＦＮ−β　（例１を参
照のこと）がこの発明のＲＰ−ＨＰＬＣ法により精製さ
れる場合、逆相プールが出発材料の約３分の１のピーク
Ａを含有し、そして分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより検出さ
れるピークＣ及び他の種、並びにウェスタンプロットに
より検出される低分子種及びダイマーが減少することを
示す。

５０■のＧ−２５１ＦＮ−βをＣ１１ｌカラムを通して
溶出した例２はＩＦＮ−βのＲＰ−ＨＰＬＣ精製の分取
レベルへのスケールアップの中間段階を示すが、この例
においては、ＲＰ−ＨＰＬＣ負荷が１０倍に増加され、
分取用分離法において用いられる負荷量に相当する。例
１に従って調製されたＧ−７５１ＦＮ−βを出発材料と
して使用した。

まずＧ−７５１ＦＮ−βを撹拌されたアミコンセル中で
２３．８ｍｇ／−に濃縮することにより実験を行った。

合計４７６■の蛋白質を含有する５Ｗｔｌずつの５個の
アリコートを、５０％アセトニトリル１０．１％ＨＦＢ
Ａ中で平衡化された、プレーバックＣ１１ｌカラム（１
５〜２０ミクロン粒子）に適用した。１５ｍＡ／分の流
速で１分間当り０．３３％でアセトニトリル濃度が増加
する５０％〜８０％アセトニトリルのグラジェントによ
り溶出を行った。０．５分間の百分を集めた。５分間間
隔で採取した両分を、例２に記載したウェスタンブロッ
ティング及び分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。

溶出されたＩＦＮ−β蛋白質の合計量が６６％である望
ましい収量を達成するために、５５−８０分の画分をプ
ールした。コンピューター化された指数スキム積分法を
用いて、プールされた両分をウェスタンブロッティング
及び分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。

Ａｔ＊。の読みにより判定される蛋白質の回収は約１０
０％であった。５−の１％ＳＤＳを適用しそして同じグ
ラジェントで溶出することによりカラムを洗浄した。２
８Ｏｒ＋ｎ＋における吸光の非常にわずかなピークのみ
が溶出された。

第２表に、Ｇ−７５出発材料及び選択された画分のＲＰ
−ＨＰＬＣ分析の結果を要約し、そして数量化する。

ＲＰ−１１ＰＬＣによる゛　　　れた１以下余白 第２表の結果が示すように、４２．５〜８２．５分間に
集めた両分中のピークＡの量が次第に減少し、そしてそ
れに対応してピークＢの比率が増加し、そして８２．５
分の画分中に“ピークＢ後”の種の量が上昇する。

ＩＦＮ−β蛋白質のウェスタンプロットは、３７〜４７
分の画分において低分子量ＩＦＮ−β種が濃縮されるこ
とを示した。このプロットが示すところによれば、ダイ
マー及びさらに高分子のＩＦＮ−β種は前画分及び後画
分の両方に濃縮されるが、クロマトグラムの中央部から
の両分ではこれらの蛋白質様が減少する。ＩＦＮ−βモ
ノマーからの高分子量ＩＦＮ−βバンドの分離は達成さ
れなかった。

Ｅ、コリ画分についてのウェスタンプロットによれば、
これらの蛋白質は初期画分中に濃縮されるようであり、
５２分から後の両分中には検出されなかった。しかしな
がら、出発材料中のＥ、コリ蛋白質レベルは非常に低い
ので、結論を出すことは困難であった。

５５〜８０分の画分をプールして溶出された蛋白質の収
率６６％を得た。プールされた両分及び出発材料のＲＰ
−ＨＰＬＣ分析により、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからのプ
ールされた材料ではＧ−７５ＩＰ、Ｎ−βに比べてビー
クＡが減少していることが示された。

コーンピユータ−化された指数スキム積分により数量化
されたビークＡ、ビークＢ、及び他の種の量を第３表に
示す。

ＲＰ−ＨＰＬＣ？容出からのプールされた両分は、Ｇ−
７５１ＦＮ−βに比べて約３分の１のビークＡｆｉを含
有し、そしてＩＦＮ−βの他の微量種が減少している。

さらに、ウェスタンプロットによれば、プールされた両
分はＧ−７５１ＦＮ−βが含有するのより少ない低分子
種及びＩＦＮ−βのダイマーを含有する。

この例は、２２ｍｍＣｔｓカラム上での酸化されたプレ
ーカラムプール（例３を参照のこと）の分取スケールで
のＲＰ−ＨＰＬＣを示し、この方法においては溶剤系は
０．１％ＩＩＦＢＡ中アセトニトリアセトニトリルェン
トであり、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより検出されるビー
クＡと他の種の分離、及びウェスタンプロットにより見
られる低分子量断片とダイマーとオリゴマーとの分離が
行われる。これらの種の溶出パターンは、より純粋な出
発材料であるＧ−７５ＩＦＮ−β　（例３を参照のこと
）に見られる溶出パターンに類似する。

実験においては、まず、例１の方法に従って調製された
酸化されたプレーカラムＩＦＮ−βを０．４５ミクロン
フィルターを通して濾過した。次に、この濾過され、酸
化されたブレーカラムプール７５０　ｍｇを、５０％ア
セトニトリル１０．１％ＨＦＢＡ中で平衡化されたプレ
ーバンクＣ１１ｌカラム（直径２２璽■、１５−２０ミ
クロン粒子）にポンプ輸送した。ＩＦＮ−βを二相溶剤
グラジェントにより溶出した。この場合、溶剤Ａは水中
０．１％）ＩＦＢへであり、そして溶剤Ｂはアセトニト
リル中０．１％肝ＢＡであり、５０％から１００％まで
のグラジェントとした。流速は１５−７分であった。２
８０ｎｍにおける吸光により測定した場合、ＩＦＮ−β
蛋白質の回収は約７５％であった。

０．５分間隔で両分を集めた。これらの両分の比活性を
、Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｗ、ｆｉ、　Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ　Ｓ　ｓｔｅｍにューヨーク、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ＋　１９８１）による細胞変性効果（
ＣＰＥ）アッセイにより決定した。

結果を、５分間隔で集めた両分について第４表に示す。

以下余白 第１１゜ Ｒｐ−Ｈｐｔ、ｃ　　−；の　　のＩＦＮ−２両　　分
　　　　　比活性（＋１　　（（Ｊ／■）第４表が示す
ところによれば、クロマトグラムの中間からの両分は出
発材料より約１オーダー活性が高く、他方、初期画分及
び後期画分の活性は出発材料のそれより低いか又は同じ
である。ＣＰＥアッセイに従えばもとのＩＦＮ−β活性
の約７００％が回収される。

選択された両分をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）及びウェスタ
ンプロットにより分析した。

ウェスタンプロット分析のため、５分間隔で集めた両分
を、濃縮器を用いて少量のＳＤＳの存在下で蒸発乾燥し
、そして１％ＳＤＳに再懸濁した。

モノクローナル抗−ＩＦＮ−β［（０，２μｇ蛋白質／
レーン）；還元されたサンプル（尿素／５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅ）及び非還元サンプル（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）　）を用
いて、及びポリクローナル抗−Ｅ、コリ蛋白質（１０Ｉ
Ｊｇ／蛋白質／レーン）を用いてウェスタンブロッティ
ングを行った。ＩＦＮ−β蛋白質についての前者のプロ
ットにおいては高分子量ＩＦＮ−βバンド初期画分に一
層濃縮されているようであるが、クロマトグラム全体に
わたって検出された。中間画分は最も少ない量の不純物
、すなわち低分子種及び高分子種並びにダイマーを含有
している。

Ｅ、コリ蛋白質についての後者のウェスタンプロフトに
おいて、Ｅ、コリ蛋白質の量は中間画分のいくつかにお
いて非常に低かった。

約２０鱈の蛋白質を含有するアリコートを分析用Ｃ１１
ｌカラム（５ミクロン粒子）に注入することにより、５
分間隔で集められた両分のＲＰ−）ＩＰＬＣ分析を行っ
た。アセトニトリル１０．１％ＩＩＦＢへの５０−６５
％直線グラジェントを用いてサンプルを溶出した。比較
のため、例１に従って調製されたＧ、７５１ＦＮ−β、
及びこの例のための酸化され、たブレーカラムプール出
発材料も分析した。分析用ＲＰ−１１ＰＬｃの結果を第
５表に定量的に要約する。

以下余白 、ＬＬ表 分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ及びウェスタンプロットが示すと
ころによれば、２２１１ｍＩＣ＋ａカラムでの酸化され
たプレーカラムプールの分取スケールのＲＰ−１１ＰＬ
Ｃ分離は、Ｒｒ’−ＨＰＬＣにより検出されるビークＡ
及び他の種の分離、並びにウェスタンブロッティングに
より見られる低分子量断片、ダイマー及びオリゴマーの
分離をもたらす。非常に初期の両分にはビークＡ１及び
ビークＡとＢの間で溶出する種が濃縮されており、他方
後期の両分ではピークＢ後のＩＦＮ−β種が濃縮されて
いる。これらの種の溶出パターンは一層純粋な出発材料
であるＧ７５１ＦＮ−βの溶出パターンに類似している
。さらに、ＲＰ−１１ＰＬＣ処理された材料についてク
ロマトグラフ全体にわたって検出される高分子量ＩＦＮ
−βバンドの分離は、出発材料としてＧ−７５１ＦＮ−
βを使用した場合には見られなかった。

さらに、Ｅ、コリ蛋白質についてのウェスタンプロット
は、この明細書において開示する改良されたＲＰ−１１
ＰＬＣ法の代表である、酸化されたブレーカラムプール
の分取スケールのＲＰ−ＨＰＬＣ法がＥ。

コリ蛋白質を分離したことを示した。

■ この例は、分取可能な量の再懸濁された酸沈澱物（ＲＳ
ＡＰ　：例１を参照のこと）を２２鶴Ｃ１１ｌカラムに
適用し、次に逆相プールを酸化し、そしてＳ−２００主
カラム上でさらに精製することにより、Ｇ−７５１ＦＮ
−β（例１を参照のこと）のＥ、コリ蛍白質に匹敵する
Ｅ、コリ蛋白質レベルを有する生成物が得られ、さらに
ピークＡ種の比率が低下することを示す。従って、ＲＰ
−１１ＰＬｃとＳ−２００ゲル濾過とのこの様な組合わ
せは、例１に詳細に記載したものより一層効率的な方法
、及びより純粋な生成物をもたらす。この例はまた、負
荷量及び溶出グラジェントの勾配がバランスしておれば
Ｃｌ１ｌカラム上で十分な量のＲＳＡＰを取り扱うこと
ができることを示している。

例１に従って調製された８００■のＲＳＡＰを、５０％
アセトニトリル１０．１％ＨＦＢ＾出発緩衝液中で平衡
された２２ｍ１ＩＣ＋ｓカラムに適用することにより実
施した。

カラムを出発溶剤で洗浄し、そして次に５０−６５％ア
セトニトリル１０．１％ＨＦＢＡの直線グラジェントに
より溶出した。この負荷量の故に、溶出グラジェントの
勾曽６を、少量の材料を逆相カラムに負荷する場合に比
べて非常に小さくした。溶出グラジェントの勾配は、Ｒ
ＳＡＰの５８０■の負荷について例えばアセトニトリル
濃度の１分当り０．１％の上昇ではなく、この実験にお
いては０．０４％の上昇とした。

逆相カラムからの両分を、銀染色された５ＤＳＰｈａｓ
　ｔゲルにより、及びＥ、コリ蛋白質についてのウェス
タンブロッティングにより評価した。この時点における
Ｅ、コリ蛋白質のレベルは、ＲＳＡＰの負荷量が少ない
がしかし溶出グラジェントの勾配が上記のものよりも大
きい場合のレベルに匹敵することが示された。

Ｓ−２００主カラム上でさらに精製することにより試行
を完了した。逆相プールからの蛋白質を沈澱せしめ、０
．２５■／−の濃度に再溶解し、そして米国特許１１ｍ
　４，５６９．７９０に記載されているＣｕ（ｌｘ法に
より酸化した。次に、酸化された材料をＳ−２００主カ
ラム上で溶出した。

Ｓ−２００力ラム画分を銀染色されたＳＤＳ　Ｐｈａｓ
Ｌゲルにより試験し、そしてプールして、高分子量ＩＦ
Ｎ−βモノマーが最高である両分を除去した。この方法
のこれらの段階からのプールをＩＦＮ−β及びＥ、コリ
蛋白質についてのウェスタンブロッティングにより、及
び分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。

この例の方法からのＳ−２００プールと例１に従って調
製されたＧ−７５１ＦＮ−βのサンプルとの分析用ＲＰ
−ＨＰＬＣによる比較によって、この例の方法からの材
料においてはピークＡが明らかに低いことが示される。

第６表に示されるこの方法の材料の全体的純度は、ＲＰ
−ＨＰＬＣクロマトグラムからの接線スキム分析に従っ
て、ピークＢが９２％から９９％に上昇した。

サンプル　　ピークＡ（％）　ピークＢ（％）ｃ−７５
４，２９２，１ 以下余白 ＩＰＮ−β蛋白質についての還元されたサンプル及び非
還元サンプルの両者のウェスタンプロットは、５−２６
ｏプールにおいては例１に従って製造されたＧ−７４材
料におけるよりもダイマーが少ないことを示した。

この例の方法のＳ−２００プール及び例１０Ｇ−７５プ
ールの両者からのＥ、コリ蛋白質についてのウェスタン
プロットは、いずれもＥ、コリ蛋白質が少ないので比較
することが困難であった。従って、この例の方法は、Ｅ
、コリ蛋白質量が非常に少い生成物をもたらすことが確
認された。この実験からの結論は、逆相カラムに負荷さ
れる材料の量とこの発明の溶出グラジェント精製法の勾
配とのバランスが、療法的に許容されるレベルのＥ、コ
リ蛋白質を有する生成物をもたらすということであった
。

鈷−一輪 要約すれば、この明細書に記載したＲＰ−１１ＰＬｃ法
は組換生産された■ＦＮ−βを精製するための新規で且
つ効率的な方法を提供することがわかる。この様なＲＰ
−ＨＰＬＣ精製法の利点は非−ＩＦＮ−β蛋白質及び細
菌エンドトキシンの除去、並びにＩＩＩＦＮ−β種のレ
ベルの低下を包含する。さらに、この発明のＲＰ−１１
ＰＬｃ法を組み入れた精製方法は、他の精製段階への付
加として、あるいは１又は複数のこのような精製段階に
代るものとして、組換ＩＦＮ−βを精製するための非常
に効果的且つ効率的方法をもたらすことができる。

ＩＦＮ−βについて記載されたこの発明の代替下流精製
法の利点は、下流精製法の単純化、下流工程の時間の短
縮、細菌エンドトキシン除去の確実性、再現性あるスケ
ールアップの可能性、及び微少ＩＦＮ−β種のレベルが
低下しており非常に純情なＩＦＮ−β生成物が得られる
こと、を包含する。

寄−一圧 前記のごとく、プラスミドｐｓＹ２５０１を担持するＥ
、コリに１２／ＭＭ２９４−１の培養物は、１９８３年
１１月１８日にアメリカン・タイフ゛カルチエア・コレ
クション、　１２３０１パークラウンドライブ、ロック
ビル。

門Ｐ２Ｏ８５２、米国に、ＡＴＣＣ１ｌｈ３９，５１７
としてブタペスト条約に基き国際寄託された。

寄託された微生物の入手可能性は、いずれかの政府の権
威のもとにその特許法により認められた権利を侵害して
この発明を実施することを許容するものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）の精製方
   法であって、ＩＦＮ−βを生産するために形質転換され
   た宿主からＩＦＮ−βを単離し、そしてこの単離された
   ＩＦＮ−βを、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）及びト
   リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から成る群から選択された有
   機酸並びにアセトニトリルを含んで成る有機変性剤を含
   む溶剤系を用いて、少なくとも１個の結合相広孔シリカ
   ゲル逆相高速液体クロマトグロフィーカラムに通す、こ
   とを含んで成る方法。 ２、前記カラムがアルカリ性逆相カラムである、特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記溶剤系による溶出がグラジエントであり、そし
   てアセトニトリルの容量／容量濃度が０％から１００％
   までであり、そしてＨＦＢＡ又はＴＦＡの容量／容量濃
   度が約０．００１％から約２％までである、特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、微生物により生産されたＩＦＮ−βの回収及び精製
   方法であって、 （ａ）前記ＩＦＮ−βを生産するために形質転換された
   宿主微生物の培養細胞の細胞壁及び細胞膜を破砕し； （ｂ）前記破砕物から９９重量％より多くの塩を除去し
   ； （ｃ）前記脱塩された破砕物を再破砕し； （ｄ）前記破砕物中の液体の密度又は粘度を上昇させあ
   るいは該液体中に密度又は粘度の勾配を生じさせるため
   の物質を該破砕物に添加し；（ｅ）ＩＦＮ−βを含有す
   る屈折体を高速遠心分離により回収し； （ｆ）前記屈折体中のＩＦＮ−βを、該組換体ＩＦＮ−
   βと共に水溶性複合体を形成することができる可溶化剤
   の水溶液により可溶化し、ここで該水溶液は還元剤を含
   有しており； （ｇ）段階（ｆ）の生成物を酸化し； （ｈ）ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）又はトリフルオ
   ロ酢酸（ＴＦＡ）のいずれか及びアセトニトリルを含ん
   で成る溶剤系を用いて、結合相広孔シリカゲル逆相高速
   液体クロマトグラフィーカラムに、段階（ｇ）の酸化さ
   れた生成物を通し；（ｉ）段階（ｈ）の生成物から溶剤
   系を除去し、それからＩＦＮ−β蛋白質を回収し、そし
   て該ＩＦＮ−β蛋白質を適当な緩衝液中に再溶解し；そ
   して、（ｊ）段階（ｉ）の生成物をさらに精製する；こ
   とを含んで成る方法。 ５、段階（ｅ）の後であって段階（ｆ）の前にさらに、 （ｅ′）前記屈折体を還元条件下で可溶化し；（ｅ″）
   この可溶化された屈折体を有機溶剤により抽出し；そし
   て、 （ｅ″′）該屈折体を抽出物から単離する；段階を含ん
   で成る特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記カラムがアルカン逆相カラムであり、前記溶剤
   系による溶出がグラジエントであり、アセトニトリルの
   濃度（容量／容量）が０％から１００％までであり、そ
   してＨＦＢＡ又はＴＦＡの濃度（容量／容量）が約０．
   ００１％〜約２％である、特許請求の範囲第４項又は第
   ５項に記載の方法。 ７、前記酸化段階（ｇ）が、Ｃｕ＾＋＾＋陽イオンを含
   有する酸化促進剤又はヨードソ安息香酸を用いて行われ
   る制御された酸化段階である、特許請求の範囲第４項〜
   第６項のいずれか１項に記載の方法。 ８、段階（ｆ）の後であって段階（ｇ）の前に、前記還
   元剤の存在下で、得られる溶液からＩＦＮ−βを単離す
   る、特許請求の範囲第４項〜第７項のいずれか１項に記
   載の方法。 ９、段階（ｊ）をゲルろ過により又は免疫アフィニティ
   ー精製段階により行う、特許請求の範囲第４項〜第８項
   のいずれか１項に記載の方法。