DD235077A1

DD235077A1 - Verfahren zur gewinnung von hochreinem interleukin-2

Info

Publication number: DD235077A1
Application number: DD27371485A
Authority: DD
Inventors: Ida Koerner; Rudolf Dettmer; Joachim Kopp
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-03-04
Filing date: 1985-03-04
Publication date: 1986-04-23

Abstract

Die Erfindung betrifft das Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Interleukin-2. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein sehr einfaches Reinigungsverfahren zu entwickeln, das wenig zeitaufwendig ist und darueber hinaus im Vergleich zu den meisten gaengigen Verfahren durch geringere Verluste ausgezeichnet ist. Ein Interleukin-2-haltiger Kulturueberstand wird direkt ueber eine mit HPLC-Traeger gefuellte Saeule gepumpt und das Interleukin-2 zusammen mit anderen Proteinen des Kulturueberstandes an den Traeger gebunden und chromatographiert. Die beim ersten Reinigungsschritt anfallenden Interleukin-enthaltenden Fraktionen werden mit PBS 1:2 verduennt und mittels einer HPLC weiter aufgereinigt. Der Aufreinigungsfaktor betraegt etwa 10 000, die spezifische Aktivitaet 5-10106 Einheiten/mg Protein. Die Ausbeute liegt bei 60%. Anwendungsgebiete der Erfindung sind Biochemie und Immunologie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2. Anwendungsgebiet ist die Biochemie, speziell bei der Herstellung von Präparaten mit hoher spezifischer Aktivität, und die Immunologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen lnterleukin-2 ist ein T-Zellwachstumsfaktor und damit von essentieller Bedeutung für die Aktivierung, den Verlauf und Effekt einer immunologischen Reaktion. Sowohl das lnterleukin-2 als auch Antikörper gegen lnterleukin-2 gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Aufklärung immunregulatorischer Zusammenhänge und als potentielle immunotherapeutische Agenzien in der Medizin. Für die genannten Einsatzgebiete sind die Reinheitsanforderungen an das Antigen naturgemäß sehr hoch.

Die bisher zur Reinigung von lnterleukin-2 bekannten Verfahren umfassen meist 3-5 unterschiedliche Reinigungsschritte. Dabei werden Verfahren kombiniert, die verschiedene Eigenschaften von Proteinen ausnutzen. So werden im allgemeinen nach einer Aufkonzentrierung des lnterleukin-2-haltigen Kulturüberstandes folgende Verfahren in verschiedensten Kombinationen bevorzugt angewandt: die Gelfiltration, die Makromoleküle nach ihrer Größe trennt, Verfahren, die auf hydrophober Wechselwirkung der Proteine mit substituierten Agarosemolekülen wie z. B. Phenylsepharose oder Blue-agarose beruhen, isoelektrisches Focusing, bei dem zur Trennung der Proteine das unterschiedliche isoelektrische Verhalten ausgenutzt wird oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), die immer häufiger zur Anreicherung und Reinigung hydrophober Proteine herangezogen wird (K. Welte u.a., J. Exp. Med. 156,454-464,1982; E.M.Kniep u.a., Eur. J. Biochem. 143,199-203,1984; D.Riendeau u.a., J. Biol. Chem. 258,12114-12117,1983; A.Godard u.a., J. Immunol. Meth. 70,233-244,1984). Die neuesten Verfahren sind umständlich zu handhaben, zeitfordernd und führen darüberhinaus häufig zu großen Verlusten (die Ausbeuten liegen bei vielen Verfahrenskombinationen nurzwischen 15 und 40%).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein sehr einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2 zu entwickeln, das wenig zeitaufwendig ist und darüber hinaus im Vergleich zu den meisten gängigen Verfahren durch geringere Verluste ausgezeichnet ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein serumfreier lnterleukin-2 enthaltender Kulturüberstand direkt über eine mit HPLC-Träger gefüllte Vorsäule gepumpt wird, wobei . das lnterleukin-2 zusammen mit anderen Proteinen des Kulturüberstandes gebunden wird (ein beträchtlicherTeil der Proteine, aber kein lnterleukin-2, befindet sich im Durchlauf der Säule). Anschließend wird die Vorsäule mit 15%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5.0 gewaschen, um schon einen Teil der gebundenen, weniger hydrophoben Proteine von der Säule zu eluieren. Dann erfolgt die Kopplung der Vorsäule an die mit dem gleichen HPLC-Träger gefüllte Hauptsäule, die mindestens die 4fache Kapazität der Vorsäule aufweist. Daran anschließend beginnt die Chromatographie mit einem linearen Gradienten von 15-40%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0. Die lnterleukin-2 enthaltenden Fraktionen werden mit einem Phosphatpuffer 1:2 verdünnt und sofort mittels HPLC weiter aufgereinigt.

Im Gegensatz zu allen anderen bisher bekannten Reinigungsverfahren, die vor einer HPLC-Chromatographie mindestens 2 Reinigungsschritte durchführen, gestattet das erfindungsgemäße Verfahren eine Hochreinigung des lnterkeukin-2 mit nur 2 Reinigungsschritten, wobei die Ausbeute und die spezifische Aktivität des gereinigten IL-2 besser sind im Vergleich zu den meisten wesentlich aufwendigeren üblichen Reinigungsverfahren. Bemerkenswert ist, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren schon nach dem ersten Reinigungsschritt eine spezifische Aktivität von 1-2x10® Einheiten/mg Protein erreicht werden kann, ein Vorteil, den kein anderes bisher bekanntes Reinigungsverfahren liefert.

Ausführungsbeispiel 11 Kulturüberstand mit bekanntem lnterleukin-2-Gehalt, der durch serumfreie Induktion humaner peripherer Lymphozyten erhalten wurde, wird über eine Vorsäule (0,8 x 6cm), die mit LiChroprep RP-8 (25-40pm) gefüllt und mit destilliertem Wasser equilibriert ist, gepumpt (Durchfluß: 40ml/h; Druck: 1 MPa). Unter diesen Bedingungen wird das lnterleukin-2, zusammen mit anderen Proteinen des Kulturüberstandes, an den Träger gebunden. Die Vorsäule wird zunächst mit 20 ml 15%igen Propanols in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0 gewaschen (dabei wird bereitsein beträchtlicherTeil gebundener Proteine von der Säule eluiert) und anschließend mit der, ebenfalls mit LiChroprep RP-8 gefüllten Hauptsäule (0,8 x 25cm), gekoppelt. Danach vviv Ί mit einem linearen Gradienten von 200 ml 15-40%igen Propanols in 1 m Pyriain-EssigsäurepH 5,0 bei einem Druck von 1-2 MPa eluiert. Die anfallenden 6-ml-Fraktionen werden in einem spezifischen Test auf IL-2 Aktivität überprüft, die Abtrennung der Fremdproteine vom lnterleukin-2 wird über Ninhydrindetektion erfaßt. Die IL-2 enthaltenden Fraktionen (im allgemeinen 3-4) werden in einem Phosphatpuffer (PBS) 1:2 verdünnt und sofort über eine mit RP-18 gefüllte Säule (0,4 x 10cm. Vydac,5pm) gepumpt (Durchfluß 20ml/h, Druck: 7 MPa), die vorher mit 15%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0 equilibriert wurde. Nach einem Waschen der Säule mit 5 ml desgleichen Puffers folgt eine Chromatographie mit 50 ml eines linearen Gradienten von 15-50%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0. Die Abtrennung weiterer Fremdproteine v ird über Fluoreszenzdetektion verfolgt. Die gesamte IL—2—Aktivität befindet sich in 1-2 Fraktionen (max. 2ml). Das hochgereinigte humane lnterleukin-2 hat eine spezifische Aktivität von ca. 5-10x10® Einheiten/mg Protein. Der Aufreinigungsfaktor beträgt etwa 10000, die Ausbeute liegt bei 60%.

Claims

Erfindungsanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturüberstand lnterleukin-2 bildender Zellen direkt an einen HPLC-Träger gebunden und fraktioniert wird und die lnterleukin-2 enthaltenden Fraktionen mittels HPLC gereinigt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2. Anwendungsgebiet ist die Biochemie, speziell bei der Herstellung von Präparaten mit hoher spezifischer Aktivität, und die Immunologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

lnterleukin-2 ist ein T-Zellwachstumsfaktor und damit von essentieller Bedeutung für die Aktivierung, den Verlauf und Effekt einer immunologischen Reaktion. Sowohl das lnterleukin-2 als auch Antikörper gegen lnterleukin-2 gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Aufklärung immunregulatorischer Zusammenhänge und als potentielle immunotherapeutische Agenzien in der Medizin. Für die genannten Einsatzgebiete sind die Reinheitsanforderungen an das Antigen naturgemäß sehr hoch. Die bisher zur Reinigung von lnterleukin-2 bekannten Verfahren umfassen meist 3-5 unterschiedliche Reinigungsschritte. Dabei werden Verfahren kombiniert, die verschiedene Eigenschaften von Proteinen ausnutzen. So werden im allgemeinen nach einer Aufkonzentrierung des lnterleukin-2-haltigen Kulturüberstandes folgende Verfahren in verschiedensten Kombinationen bevorzugt angewandt: die Gelfiltration, die Makromoleküle nach ihrer Größe trennt, Verfahren, die auf hydrophober Wechselwirkung der Proteine mit substituierten Agarosemolekülen wie z. B. Phenylsepharose oder Blue-agarose beruhen, isoelektrisches Focusing, bei dem zur Trennung der Proteine das unterschiedliche isoelektrische Verhalten ausgenutzt wird oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), die immer häufiger zur Anreicherung und Reinigung hydrophober Proteine herangezogen wird (K.Weite u.a., J. Exp. Med. 156,454-^64,1982; E.M.Kniep u.a., Eur. J. Biochem. 143,199-203,1984; D.Riendeau u.a., J. Biol. Chem. 258,12114-12117,1983; A.Godard u.a., J. Immunol. Meth. 70,233-244,1984). Die neuesten Verfahren sind umständlich zu handhaben, zeitfordernd und führen darüberhinaus häufig zu großen Verlusten (die Ausbeuten liegen bei vielen Verfahrenskombinationen nurzwischen 15 und 40%).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein sehr einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2 zu entwickeln, das wenig zeitaufwendig ist und darüber hinaus im Vergleich zu den meisten gängigen Verfahren durch geringere Verluste ausgezeichnet ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von hochreinem lnterleukin-2 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein serumfreier lnterleukin-2 enthaltender Kulturüberstand direkt über eine mit HPLC-Träger gefüllte Vorsäule gepumpt wird, wobei das lnterleukin-2 zusammen mit anderen Proteinen des Kulturüberstandes gebunden wird (ein beträchtlicher Teil der Proteine, aber kein lnterleukin-2, befindet sich im Durchlauf der Säule). Anschließend wird die Vorsäule mit 15%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5.0 gewaschen, um schon einen Teil der gebundenen, weniger hydrophoben Proteine von der Säule zu eluieren. Dann erfolgt die Kopplung der Vorsäule an die mit dem gleichen HPLC-Träger gefüllte Hauptsäule, die mindestens die 4fache Kapazität der Vorsäule aufweist. Daran anschließend beginnt die Chromatographie mit einem linearen Gradienten von 15-40%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0. Die lnterleukin-2 enthaltenden Fraktionen werden mit einem Phosphatpuffer 1:2 verdünnt und sofort mittels HPLC weiter aufgereinigt.

Im Gegensatz zu allen anderen bisher bekannten Reinigungsverfahren, die vor einer HPLC-Chromatographie mindestens 2 Reinigungsschritte durchführen, gestattet das erfindungsgemäße Verfahren eine Hochreinigung des lnterkeukin-2 mit nur 2 Reinigungsschritten, wobei die Ausbeute und die spezifische Aktivität des gereinigten IL-2 besser sind im Vergleich zu den meisten wesentlich aufwendigeren üblichen Reinigungsverfahren. Bemerkenswert ist, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren schon nach dem ersten Reinigungsschritt eine spezifische Aktivität von 1-2x10⁶ Einheiten/mg Protein erreicht werden kann, ein Vorteil, den kein anderes bisher bekanntes Reinigungsverfahren liefert.

Ausführungsbeispiel

11 Kulturüberstand mit bekanntem lnterleukin-2-Gehalt, der durch serumfreie Induktion humaner peripherer Lymphozyten erhalten wurde, wird über eine Vorsäule (0,8 χ 6cm), die mit LiChroprep RP-8 (25-40/xm) gefüllt und mit destilliertem Wasser equilibriert ist, gepumpt (Durchfluß: 40ml/h; Druck: 1 MPa). Unter diesen Bedingungen wird das lnterleukin-2, zusammen mit anderen Proteinen des Kulturüberstandes, an den Träger gebunden. Die Vorsäule wird zunächst mit 20 ml 15%igen Propanols in 1 m Pyridin-EssicsäurepH 5,0 gewaschen (dabei wird bereits ein beträchtlicher Teil gebundener Proteine von der Säule eluiert) und anschließend mit der, ebenfalls mit LiChroprep RP-8 gefüllten Hauptsäule (0,8 χ 25cm), gekoppelt. Danach ν Φ .i mit einem linearen Gradienten von 200 ml 15-40%igen Propanols in 1 m Pyriain-EssigsäurepH 5,0 bei einem Druck von 1-2MPa eluiert. Die anfallenden 6-ml-Fraktionen werden in einem spezifischen Test auf IL-2 Aktivität überprüft, die Abtrennung der Fremdproteine vom lnterleukin-2 wird über Ninhydrindetektion erfaßt. Die IL-2 enthaltenden Fraktionen (im allgemeinen 3-4) werden in einem Phosphatpuffer (PBS) 1:2 verdünnt und sofort über eine mit RP-18 gefüllte Säule (0,4 χ 10cm. Vydac, δμ,ιη) gepumpt (Durchfluß 20 ml/h, Druck: 7MPa), die vorher mit 15%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0 equilibriert wurde. Nach einem Waschen der Säule mit 5 ml desgleichen Puffers folgt eine Chromatographie mit 50 ml eines linearen Gradienten von 15-50%igem Propanol in 1 m Pyridin-Essigsäure pH 5,0. Die Abtrennung weiterer Fremdproteine ν ird über Fluoreszenzdetektion verfolgt. Die gesamte IL—2—Aktivität befindet sich in 1-2 Fraktionen (max. 2ml). Das hochgereinigte humane lnterleukin-2 hat eine spezifische Aktivität von ca. 5-10x10⁶ Einheiten/mg Protein. Der Aufreinigungsfaktor beträgt etwa 10000, die Ausbeute liegt bei 60%.