DD285113A5 - Verfahren zur gewinnung von reinem menschlichen wachstumshormon (hgh) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von reinem menschlichem Wachstumshormon (hGH), das in der biotechnologischen Produktion von hGH angewendet werden kann. Erfindungsgemaesz wird der zellfreie hGH-haltige Kulturueberstand einer Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatography) unterworfen und hGH mittels eines organischen Loesungsmittels eluiert, die hGH-haltige Fraktion mit einer physiologischen Pufferloesung oder Wasser um ein Vielfaches des Elutionsvolumens verduennt und diese verduennte Fraktion ueber eine Antikoerper-Affinitaetssaeule chromatographiert. Damit wird ein einfaches, nur aus zwei Reinigungsschritten bestehendes Verfahren zur Gewinnung von ueber 90%ig reinem hGH aus Kulturueberstaenden in hoher Ausbeute bereitgestellt.{Wachstumshormon, menschliches; Produktion, biotechnologische; Kulturueberstand; Reversephasen-Chromatographie; Antikoerper-Affinitaetssaeule; Reinigungsschritte, zwei; Ausbeute, hohe}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von reinem menschlichen Wachstumshormon. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie, insbesondere die biotechnologische ProduKtion von hGH.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

hGH ist ein Hormon des Hypophysenvorderlappens. Es beeinflußt regulatorisch mehrere Stoffwechselwege. Äußere Auswirkungen sind beispielsweise die Regulation des Körperwachstums und bestimmter regenerativer Vorgänge (z. B.

Geweberekonstitutionen, Wundheilungen u.a.). Die Wirkungen sind der Grund dafür, daß hGH u. a. als Therapeutikum für die Behandlung von Zwergenwuchs eingesetzt wird.

Zunächst wurde das Präparat aus Hypophysenextrakten isoliert und gereinigt. Gegen bärtig wird hGH fast ausschließlich nach biotechnologischen Verfahren hergestellt. Genetisch manipulierte» Bakterien bzw. mammalische Zellen liefern das Ausgangsmaterial. In letzterem Fall wird hGH in das Kulturmedium sezerniert. Das Kulturmedium ist somit Ausgangsmaterial für die anschließende Reinigung.

Anhand von Literaturdaten ist festzustellen, daß e.n breites Methodenspektrum für die Reinigung von hGH anwendbar ist.

Eingesetzt werden Methoden wie Fällungsreaktionen (z. B. mit Ammoniumsulfat bei unterschiedlichen Sättigungsmethoden) und Ultrafiltrationstechniken. Nachteile dieser Verfahren sind vor allem die üblicherweise erheblichen Verluste der zu reinigenden Substanz. Außerdem ist eine kontinuierliche Prozeßführung unter Einsatz dieser Methoden nicht realisierbar.

Der Aufbau eines kontinuierlichen Reinigungsverfahren ist bei Verwendung säulenchromatographischer Verfahren prinzipiell möglich. Zur Reinigung von hGH wird jedoch bisher die Mehrzahl der chromatographischen Trennmethoden nur im Labormaßstab angewandt. Für die industriemäßige Präparation wäre eine Vielzahl von Chromatographieschritten (bis zu zehn) nötig, um die notwendige Produktreinheit zu erzielen. Der Grund liegt einerseits bei der mangelnden Selektivität in bezug auf hGH (z.B. lonenaustauschchromatographie und Gelchromatographie). Andererseits sind einzelne Methoden hinsichtlich ihres Mengendurchsatzes beschränkt und erlauben deshalb nicht ohne weiteres die für den technischen Einsatz notwendige Maßstabserweiterung.

Zur Reinigung von hGH im Labormaßstab wurde auch die Umkehrphasenchromatographie eingesetzt. Der Nachteil dieser Methode besteht im notwendigen Einsatz organischer Lösungsmittel, die die Gefahr einer Proteindenaturierung in sich bergen (J.Chromatogr. 296 (1984), 61; J.Chromatogr. 317 [1984], 227).

Als selektive Methode zur hGH-Reinigung im Labormaßstab hat sich die Affinitätschromatographie erwiesen (B. Schwenzer, M.Werner, FRESENIUS-Z-ANAL-CHEM1983,330,347). Der Nachteil dieser Methods besteht darin, daß sie sehr kostenaufwendig ist. Ein effektives Verfahren zur industriemäßigen Reinigung von hGH aus Kulturüberständen ist bisher nicht bekannt geworden.

Die Erfindung hat das Ziel, ein effektives, in der biotechnologischen Produktion anwendbares Verfahren zur Gewinnung von mindestens 90%ig reinem hQH aus Kulturüberständen in hohen Ausbeuten bereitzustellen, das die Beibehaltung einer kontinuierlichen Prozeßführung In der biotechnologischen Produktion von hGH erlaubt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die Anzahl der notwendigen Reinigungsschritte gering zu halten und sie so zu gestalten, daß sie koppelbar sind. Das bedeutet, daß das Endprodukt des vorhergehenden Reinigungsschrittes ohne aufwendige Zwischenoperationen in den nächsten Reinigungsschritt überführbar sein muß. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von menschlichem Wachstumshormon umfaßt zwei chromatographische Trennschritte. Zunächst wird hGH-haltiger Kulturüberstand durch Zentrifugation oder in bestimmten Fällen durch Filtration über Glasfilterfritten von Zellen bzw. Bruchstücken befreit. Im ersten Reinigungsschritt wird hGH durch Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatogr.) aus dem zellfreien Kulturüberstand angereichert. Dies geschieht durch Bindung des hGH an die Träger RP8 oder RP4 (Fa. Merck) mit anschließender Elution durch ein organisches Lösungsmittel. Vorzugsweise wird der Träger RP8 mit einer Korngröße von 25-40pm eingesetzt. Bei der Elution wird als organisches Lösungsmittel ein Alkohol/Puffer-Gemisch, vorzugsweise ein Propanol/Puffer-Gemisch, mit steigenden Propanolkonzentrationen vorwendet. In der Literatur beschriebene Denaturationserscheinungen traten unter den von uns gewählten Bedingungen überraschenderweise nicht auf. Überraschenderweise ist auch die adsorptive Wirkung des Trennmaterials im Hinblick auf die Anlagerung von hGH selektiver als erwartet. Anhand elektrophoretischer Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß das die Chromatographiesäule ungebunden passierende Material noch alle Hauptbestandteile des eingesetzten Kulturmediums enthält, während hOH gleichzeitig zu etwa 90% an den Träger gebunden wird. Damit ist die Möglichkeit einer kontinuierlichen Produktreinigung mit Rückführung des Zellzuchtmediums in den Fermentationsprozeß gegeben. Andere Vorzüge der im ersten Reinigungsschritt eingesetzten Methode sind hoher Mengendurchiatz an Ausgangsmaterial und die Regenerierungsmöglichkeit des Trägers bei obendrein niedrigen Beschaffungskosten. Im zweiten Reinigungsschritt wird hGH durch Affinitätschromatographie unter Einsatz eines monoklonalen anti-hGH-Antikörpers bis auf eine Reinheit von über 90% geführt. Ein speziell ausgewählter Antikörper wird für diese Zwecke an cyanogenbromidaktivierter Sepharose 4 B (Fa. Pharmacia) oder nach DD 219490 an N-IChlorcarbonyloxyj-B-norbornen^.S-dicarboximid-aktivierter Perlcellulose immobilisiert. Als monoklonaler anti-hGH-Antikörpei· wird vorzugsweise der vom Hybridomklon Il A9(ZIM-0289) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch die Auswahl dieses Antikörpers wird eine hohe Adsorptions- und Desorptionseffektivität der Affinitätschromatographie gewährleistet. Um die beiden Chromatographieschritte ohne aufwendige Zwischenoperationen koppeln zu können, werden die vereinigten hGH-haltigen Fraktionen des ersten Reinigungsschrittes erfindungsgemäß mit einer physiologischen Pufferlösung oder Wasser um ein Vielfaches des Elutionsvolumens verdünnt. Vorzugsweise wird mit PBS um das maximal 10fache des Elutionsvolumens verdünnt. Diese verdünnte Fraktion wird dann unmittelbar über die antikörperbeladene Trennmatrix geschickt. Durch milde Elution mit Glycinpuffer oder einem flüchtigen Puffer wird über 90%ig reines hGH in 60% Ausbeute eluiert.

Erfindungswesentlich ist, daß die Kopplung beider Reinigungsschritte zur gegenseitigen Aufhebung von Nachteilen dieser Trennmethoden, die bei deren separater Anwendung auftreten, führt. Der wesentliche Nachteil der Umkehrphasenchromatographie besteht in der Anwesenheit einer organischen Phase (Propanol) im Wirkstoff-Eluat. Erfindungsgemäß wird aber dieser Nachteil überwunden, da in der sich anschließenden Antikörper-Affinitätschromatographie auf Grund des äußerst selektiven Reinigungseffektes das hGH zu 100% an den Träger gebunden wird, während Propanol die Ch' omatographiesäule in den ungebundenen Fraktionen durchläuft und damit sehr vorteilhaft entfernt wird. A' idererseits kommt bei der Antikörper-Affinitätschromatographie aus Kostengründen einer häufigen Wiederverwendbarkeit der antikörperbeladenen Trennmatrix Bedeutung zu. Die Wiederverwendbarkeit wird erfindungsgemäß durch den Einr.atz von vorgereinigtem Material aus dem 1. Reinigungsschritt erhöht.

Damit wird durch die Erfindung ein einfaches, nur aus zwei Reinigungsschritten bestehendes Verfahren i'ur Gewinnung von über 90%ig reinem hGH aus Kulturüberständen in hoher Ausbeute bereitgestellt, das kostengünstig ist. Gleichzeitig erlaubt das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren die Beibehaltung einer kontinuierlichen Prozeßführung in der biotechnologischen Produktion von hGH. Die spezifische Aktivität des gereinigten hGH-Präparates wird internationalen Ansprüchen gerecht.

Ausführungsbeispiel

Zellfreier Kulturüberstand, der hGH in einer Konzentration von 10pg/ml enthielt, wurde über eine G-4-Fritte filtriert. Im ersten Reinigungsschritt wurde eine Umkehrphasenchromatographie durchgeführt. 0,51 des Filtrats wurden über eine Säule 0,8 χ 9cm, gefüllt mit Lichroprep RP8 25-40pm (Fa. Merck), gepumpt. Dabei bindet sich das hGH an die RPS-Phase. Anschließend wurde damit 100ml eines Propanolgradienten in Ammoniumacetatpuffer (0,1 M; pH 6,0) eluiert. Der Propanolgehalt wurde dabei linear von 25% auf 40% gesteigert. hGH wurde bei einer Propanolkonzentration von 35% eluiert. Die Bestimmung des hGH-Gehalts in den Fraktionen erfolgte mit einem Enzymimmuntest. Im zweiten Reinigungsschritt wurden die vereinigten hGH-haltigen Fraktior en aus der Umkehrphasenchromatographie zunächst um das 10fache mit PBS verdünnt und dann über eine Immiina'finitätssäule Chromatographien. Diese Säule enthielt CNBr-Sepharose-4B, an die ein monoklonaler anti-hGH-Antikörpe: (IIA9-ZIM-0289) gekoppelt war. Die Säulenabmessung betrug 0,9 x 5cm. Nach dem Beladen der Säule mit dem hGH-haltigen Material wird diese nacheinander mit PBS (0,05% Tween-20 enthaltend) und 0,5m Natriumchlorid; 0,02% Natriumazid gewaschen. Die Wachvolumina betrugen jeweils das Doppelte des Säulenvolumens. Die Elution des hGH erfolgte mit 0,2m Glycinpuffer (pH 2,8), der 0,5mM Natriumchlorid enthielt. Der pH-Wert der Eluat-Fraktionen wurde durch Vorlage von

1M Trispuffer (pH 7,4) sofort neutralisiert. Die quantitative hGH-Bestimmung erfolflte erneut im Enzymimmuntest. Untersuchungen des Präparats in der SDS-Polyakrylamidgelolektrophorese mit Silberfärbung ergab eine Reinheit von über 90%, hGH wurde nach diesem Verfahren mit einer Ausbeute von 60% erhalten. Der hGH-Gehalt beträgt ohne zusätzliche Konzentrierungsmaßnahmen mehr als 250ug/ml. Die Bestimmung der biologischen Aktivität Im Tibia-Teet war positiv. Die spezifische Aktivität des gereinigten hGH-Präparats wird internationalen Ansprüchen gorecht.

Claims (9)

1. Verfahren zur Gewinnung von reinem menschlichen Wachstumshormon (hGH) mittels chromatographischer Methoden, gekennzeichnet dadurch, daß man den zellfreien hGH-haltigen Kulturüberstand einer Umkehrphasenchromatographie unterwirft und hGH mittels eines organischen Lösungsmittels eluiert, die hGH-haltige Fraktion mit einer physiologischen Pufferlösung oder Wasser um ein Vielfaches des Elutionsvolumens verdünnt und diese verdünnte Fraktion über eine Antikörper-Affinitätssäule chromatographiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Träger in der Umkehrphasenchromatographie RP8 oder RP4 eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger RP8 mit einer Korngröße von 25-40pm eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als organisches Lösungsmittel ein Alkohol/Puffer-Gemisch verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Alkohol Propanol verwendet wird.

6. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Propanol/Puffer-Gemisch mit steigenden Propanolkonzentrationen eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die hGH-haltige Fraktion mit PBS um das maximal 10fache des Elutionsvolumens verdünnt wird.

8. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß als Träger für die Antikörper-Affinitätssäule Cyanogenbromid aktivierte Sepharose 4B oder N-'Chlorcarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dicarboximid aktivierte Perlcellulose eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß auf der Antikörper-Affinitätssäule der vom Hybridom Il A9 (ZIM-0289) produzierte monoklonale Antikörper gegen hGH immobilisiert ist.