DE3039566A1

DE3039566A1 - Verfahren zur reinigung von interferon

Info

Publication number: DE3039566A1
Application number: DE19803039566
Authority: DE
Inventors: Alfons Josef Denis Alida Prof. Linden Billiau; Jochen Wilhelm North Chicago Ill. Heine
Original assignee: Stichting Rega VZW
Current assignee: Stichting Rega VZW
Priority date: 1979-10-23
Filing date: 1980-10-20
Publication date: 1981-05-21
Also published as: FR2467602A1; GB2061285B; JPS5673028A; CH647158A5; GB2061285A; NL7907791A; FR2467602B3; US4359389A; CA1166959A

Description

Interferon ist ein von lebenden Zellen bei der Abwehr von VirusInfektionen erzeugtes Glykoprotein. Seine chemische
Struktur kann in Abhängigkeit von dem zu seiner Herstellung verwendeten Zelltyp leicht variieren. Das Interferon besitzt verschiedenartige biochemische Aktivitäten, wie
beispielsweise Antivirus-, Antiprotozoen-, Zeilwachstumsinhibitor- und Immunosuppressions-Aktivität, und es wird
daher mit Erfolg in der Medizin angewendet. Bezüglich
einer allgemeinen Übersicht über den derzeitigen Kenntnisstand betreffend Interferon sei auf das Buch "Interferons and their actions" von V. E. Stewart II, CRC
Press, Inc., Cleveland, Ohio, verwiesen.

Für medizinische Anwendungen in Humanpatienten sollte
Interferon von menschlichen Zellen gewonnen werden, wobei für diesen Zweck derzeit die folgenden Verfahren in Gebrauch sind:

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1. Erzeugung durch Infektion von aus menschlichen Blutspenden frisch gewonnenen Leukocyten mit Sendai-Virus. Dieses Verfahren ergibt das sogenannte Leukocyten-Interferon, wie es bei Cant eil et al, In Vitro, J^, 35-38 (1974·), beschrieben ist.

2. Erzeugung auf kultivierten diploiden menschlichen Pibroblast-Zellen mit Hilfe eines sogenannten "Poly-1:C-Superinduktionsprogramms" ("Poly-1:C-superinduction schedule"). Das so erhaltene Fibroblast-Interferon unterscheidet sich von dem Leukocyten-Interferon hinsichtlich verschiedener biologischer und physikochemischer Kriterien (vgl. A. Billiau et al, J. Gen. Virol., 1£, 1-8, (1973)).

3· Erzeugung in lymfoblastoiden Zellreihen unter Verwendung eines virusartigen Interferon-Einleiters ("interferon inducer"). Das hierbei erhaltene Lymfoblast-Interferon weist eine starke Ähnlichkeit mit dem Leukocyten-Interferon auf (vgl. Strander et al, J. Clin. Hicobiol., I_-, 116-117, (1975)).

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf menschliches Fibroblast-Interferon, d. h. auf nach dem zweiten der vorstehend genannten Verfahren erhaltenes Interferon; näherhin betrifft die Erfindung ein Eeinigungsverfahren für derartiges Interferon.

Die Reinigung von Interferon ist sowohl für Untersuchungen über die chemische Natur des Interferons als auch für dessen klinische Anwendung erforderlich, da eine Roh-Interferonlösung kontaminierende Proteine enthalten kann, die sich negativ auf die Ergebnisse der erwähnten

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Untersuchungen oder klinischen Anwendung auswirken können.

Pur beide Verwendungszwecke werden ziemlich große Mengen an gereinigtem Interferon benötigt. Zwar wurden vielfältige Techniken zur Teilreinigung und einige zur vollständigen Reinigung von Interferon beschrieben, die jedoch sämtlich Unvollkommenheiten aufweisen. Diese ünvollkommenheiten beruhen im allgemeinen entweder auf der Notwendigkeit, komplexe Adsorbentien oder Reagentien zu verwenden, oder auf der Anwendung eines vielstufigen Verfahrens, das sich nicht zur Anwendung für die Produktion im großen Maßstab eignet, oder auf der Tatsache, daß nur ein kleiner Bruchteil der anfänglichen Gesamt-Interferonakti-

·Λ-~±. · · · ±. -η zurück . vitat xn gereinigter Form gewonnen wird.

Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Reinigungsverfahren für Interferon und insbesondere nach einem Reinigungsverfahren für menschliches Fibroblast-Interferon, das zu einem hohen Aktivitätswiedergewinnungsgrad in gereinigter Form führt, keine komplexen Reagentien oder eine Vielzahl von Stufen benötigt und das sich zur Anwendung in ziemlich großem Maßstab eignet.

Gemäß der Erfindung wurde als Ergebnis intensiver Forschung nun gefunden, daß ein hoher Wiedergewinnungsgrad von Interferonaktivität in Form vollständig gereinigten Interferons erreicht werden kann, indem man menschliches Fibroblast-Interferon mit einem einfachen Zweistufen-Reinigungsverfahren behandelt, das eine Kombination von zwei an sich bekannten Verfahren darstellt. Dieses erfindungsgemäße zweistufige Reinigungsverfahren besteht

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darin, daß man (a) eine wäßrige Interferonlösimg einer chromatοgraphischen Behandlung auf porösen Glasperlen und (b) sodann die so erhaltene wäßrige Interferonlösung einer chromatographischen Behandlung auf immobilisiertem Zinkchelat unterwirft.

Wird in der ersten Verfahrensstufe eine kontaminierende Proteine enthaltende Interferonlösung mit porösen Glasperlen bei neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert in Berührung gebracht, so wird das Interferon selektiv an diesen Glasperlen adsorbiert, während die Hauptmenge der kontaminierenden Proteine in Lösung verbleibt und ausgewaschen werden kann. Das adsorbierte Interferon kann danach bei einem sauren pH-Wert aus den Glasperlen eluiert werden.

Wird danach im zweiten Verfahrensschritt die eluierte Interferonlösung bei neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert mit einem immobilisierten Zinkchelatgel in Kontakt gebracht, so wird das Interferon selektiv an diesem Zinkchelat adsorbiert, wahrend eventuell noch vorhandene kontaminierende Proteine in Lösung verbleiben und ausgewaschen werden können. Das adsorbierte Interferon kann sodann bei saurem pH aus dem Zinkchelat eluiert werden und ergibt ein Endprodukt extrem hoher Reinheit.

Durch Anwendung dieses erfindungsgemäßen zweistufigen Reinigungsverfahrens läßt sich ein hoher Reinigungsgrad erzielen* das Endprodukt besitzt einen so hohen Reinheitsgrad, daß es als praktisch vollkommen rein betrachtet werden kann. Des weiteren wird ein hoher Rückgewinnungsgrad der anfänglichen Interferon-Aktivität

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erreicht. Diese Rückgewinnung "beträgt etwa 50 "bis 70 % im ersten Verfahrensschritt -und etwa 90 bis 95 °/° iⁿ der zweiten Verfahrensstufe, derart, daß sich ein Gesamtrückgewinnungsgrad von etwa 4-5 "bis 67 % ergibt.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren erhaltene Endprodukt praktisch frei von jeglichem hautreaktivem Agens ist. Die nach bekannten Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte riefen stets Hautreaktionen bei der klinischen Anwendung an Patienten hervor; demgegenüber hat sich ergeben, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt keine derartigen Reaktionen verursacht, was für die klinische Anwendung äußerst bedeutsam ist.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Reagentien leicht verfügbar sind und viele Male aufeinanderfolgend verwendet werden können, da sowohl die Glasperlen als auch das immobilisierte Zinkchelat nach der jeweiligen Anwendung zurückgewonnen und regeneriert werden können. Des weiteren finden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich zwei Verfahrensstufen Anwendung; all dies ergibt ein einfaches Verfahren, das sich zur Anwendung in einem großen Maßstab eignet.

Durch die Erfindung wird somit ein Verfahren zur Reinigung von Interferon geschaffen, bei dem (a) eine wäßrige Lösung von menschlichem Fibroblast-Interferon einer Chromatographiebehandlung an porösen Glasperlen und (b) hierauf die so erhaltene Interferonlösung einer Chromatographiebehandlung an immobilisiertem Zinkchelat unterworfen wird.

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Es sei hier ausdrücklich betont, daß beide Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens an sich bekannt sind und bereits zur Reinigung von menschlichem Eibroblast-Interferon angewandt wurden. Hierzu wird auf A. Billiau et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1j6, 49-55 (1979), für die erste Verfahrensstufe und auf V. G. Edy et al, J. Biol. Chem., 2£2, 5934-5955 (1977), für die zweite Verfahrensstufe verwiesen. Im Zeitpunkt dieser Veröffentlichungen wurden jedoch die beiden Stufen vollständig unabhängig voneinander angewandt und es bestanden keinerlei Anhaltspunkte oder Hinweise darauf, daß durch Kombination dieser Verfahrensstufen in einem einfachen Zweistufen-Verfahren eine praktisch vollständige Reinigung erreichbar wäre.

Im übrigen sind eine ganze Reihe verschiedener anderer Verfahren zur Reinigung von Interferon bekannt und es wäre nicht möglich, vorherzusagen, daß eine Kombination der beiden genannten Schritte ohne zusätzliche weitere Schritte zu dem gewünschten Ergebnis führen würde. Des weiteren muß das Ausbleiben jeglicher Hautreaktivität in den Endprodukten des erfindungsgemäßen Verfahrens als überraschend und unerwartet angesehen werden, da bis dahin sämtliche gereinigte Pibroblast-Interferonprodukte bei der klinischen Anwendung an Patienten derartige Hautreaktivität zeigten (vgl. A. Billiau et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1j5, 56-63 (1979)).

Des weiteren sei betont, daß die erfindungsgemäße Kombination der beiden Verfahrensschritte zu einem Zweistufen-Verfahren zu einer gewissen Modifizierung der ersten Verfahrensstufe geführt hat; hinsichtlich des Eluats der

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Glasperlen war in der oben erwähnten ersten Billiau-Veröffentlichung eine Dialyse dieses Eluats gegen. PoIyäthylenglykol in einem Natriumacetatpuffer vorgesehen, um es für die Lyophilisierung und klinische Anwendung vorzubereiten; bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hingegen wird das Eluat gegen einen Phosphatpuffer dialysiert, um es für die Chromatographiebehandlung in der nächsten Reinigungsstufe vorzubereiten, wie weiter unten noch im einzelnen beschrieben wird.

Im folgenden wird nun das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

Als Ausgangslösung für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren eignet sich jede beliebige wäßrige Lösung von menschJßhem ITbroblast-Interferon, welche kontaminierende Proteine enthält und eine Reinigung erforderlich macht. Eine derartige Lösung kann aus einer beliebigen Stufe eines herkömmlichen Interferon-Herstellungsverfahrens stammen. Es sei betont, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich nur zur Anwendung für Humanfibroblast-Interferon eignet und daß für andere Interferonarten eine anderweitige Reinigungsbehandlung erforderlich ist.

Zwar kann in der Ausgangslösung das Interferon in einem beliebigen wäßrigen Medium in Lösung gehalten werden; gate Ergebnisse wurden jedoch mit einer Interferonlösung in Eagle's minimal-essentiellem Medium ("Eagle's minimal essential medium'¹) erzielt (vgl. Science, 150, 432 (1959)). Diesem Medium kann gegebenenfalls ein Stabilisator zugesetzt werden; ein bevorzugter Stabilisator für diesen Zweck ist eine menschliche Plasmaproteinfraktion, wie sie

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beispielsweise von Blutbanken verfügbar ist.

Der anfängliche Proteingehalt und die anfängliche Interferon-Aktivität der Ausgangslösung sind nicht an kritische Grenzen gebunden. Jedoch kann die Lösung zunächst verdünnt oder konzentriert werden, falls der Proteingehalt so hoch erscheint, daß die Gefahr einer Ausfällung besteht, oder so niedrig, daß das Verfahren unwirtschaftlich wird. Es sei jedoch an dieser Stelle betont, daß der Gehalt an kontaminierenden Proteinen den Interferongehalt übersteigen kann und daß er mehr als 85 % der Gesamtmenge an gelösten Substanzen ausmachen kann.

Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt eine Chromatographie an porösen Glasperlen. Derartige poröse Glasperlen sind im Handel unter verschiedenen Handelsbezeichnungen erhältlich; häufig wird für sie eine " kontrollierte Porengröße" angegeben, d. h. eine um einen speziellen Mittel- oder Durchschnittswert herum konzentrierte ziemlich einheitliche Porengröße. Dieser Mittelwert kann beispielsweise 350 oder 900 A betragen; allgemein eignet sich jeder beliebige Wert von 170 bis 1700 A oder mehr (vgl. W. Haller, Nature, 206, 693-696 (1965), und H. G. Bock et al, Science, 1^1., 380-383 (1976)). Der Durchmesser der Glasperlen kann weniger gleichmäßig sein und allgemein im Bereich zwischen etwa 50 um und etwa 500 yum liegen. Diese Perlen können in Säulen gepackt sein, einfacher ist jedoch ihre Anwendung in freier Form für absatzweisen Betrieb.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ausgangslösung mit den porösen Glasperlen in Kontakt

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gebracht, zur selektiven Adsorption von Interferon an den Glasperlen. Am wirtschaftlichsten kann diese Kontaktierung in der Weise erfolgen, daß man die Ausgangslösung zusammen mit einer Menge der Glasperlen in einem Behälter schüttelt; {jedoch kann man die Ausgangslösung auch über eine mit Glasperlen gepackte Säule führen. Die Kontaktierung führt zu einer Adsorption von Interferon aus der Lösung an den Glasperlen, während der Hauptanteil der in der Ausgangslösung enthaltenen kontaminierenden Proteine nicht an den Perlen gebunden wird und in Lösung verbleibt.

Der pH-Wert während dieser Kontaktierung ist der pH-Wert der Ausgangslösung. Dieser pH-Wert beträgt bei Verwendung von Eagle's minimal-essentiellem Medium normalerweise etwa 7j4-» jedoch arbeitet das System allgemein gut bei Ausgangs-pH-Werten zwischen 7jO und 8,2. Oberhalb pH 8,2 wird ein Teil des Interferons inaktiviert und unterhalb pH 7jO wird ein großer Teil des eingesetzten Interferons nicht an den Glasperlen adsorbiert.

Die Dauer der Kontaktierung ist nicht an kritische Grenzen gebunden, soll jedoch selbstverständlich ausreichend sein, damit nahezu das gesamte Interferon an den Glasperlen adsorbiert wird; diese Dauer kann normalerweise zwischen 0,5 und 26 Stunden variieren.

Nach der Kontaktierung kann die verbleibende Lösung entfernt werden, beispielsweise durch Dekantieren oder Ablassen. Danach können die Glasperlen mit einer herkömmli chen Waschflüssigkeit, wie beispielsweise einer phosphat gepufferten Salzlösung, von im wesentlichen neutralem

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pH-Wert gewaschen werden, um jegliche nicht-gebundenen kontaminierenden Proteine au entfernen. Die Molarität dieser Waschflüssigkeit soll ziemlich niedrig sein, um eine Elusion von adsorbiertem Interferon zu vermeiden. Gute Waschergebnisse wurden mit einer Calcium- und Magnesiumsalze enthaltenden phosphatgepufferten Salzlösung erhalten (vgl. R. Dulbecco et al, J. Exp. Med., 99, 167-182 (i954-))5 jedoch können anderweitige Waschflüssigkeiten mit dem gleichen Effekt verwendet werden. Es können weitere Waschungen mit einer speziellen Pufferlösung von niedrigerem pH-Wert, beispielsweise einem 0,01 M Glycin-HCl-Puffer von pH 3>5j vorgenommen werden, zur Entfernung jeglicher eventueller kontaminierender Proteine, die zufällig in der Säule gebunden worden sein mögen. Der pH-Wert dieser Waschflüssigkeit soll nicht niedriger als etwa 3»Ο sein und seine Ionenstärke soll nicht höher als etwa 0,05 M betragen, da niedrigere pH-Werte bzw. höhere Ionenstärken eine Elusion bzw. Ausspülung großer Interferonmengen hervorrufen würden.

Nach dem Waschschritt kann das adsorbierte Interferon mit Hilfe einer sauren wäßrigen Pufferlösung aus den Glasperlen eluiert werden. Diese Lösung soll im allgemeinen einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2,7 "und vorzugsweise einen pH-Wert von 2,0 besitzen. Bei pH-Werten oberhalb 2,7 wird keine gute Ausspülung erreicht, pH-Werte unterhalb 1,5 haben eine Instabilität des eluierten Interferons zur Folge. Die Ionenstärke (Molarität) der Eluier- bzw. Spüllösung ist etwas weniger kritisch und kann in der Praxis zwischen 0,05 M und 0,5 M variieren. Bei Werten unterhalb 0,05 M besteht die Gefahr einer unzureichenden Pufferung, wodurch die pH-Kontrolle verloren ginge, höhere Werte

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oberhalb 0,5 M können zur Kristallisation von Bestandteilen führen.

Für die Eluierung kann jede beliebige geeignete wasserlösliche Puffersubstanz, oder Kombination von Puffersubstanzen, Anwendung finden, vorausgesetzt, daß die vorstehenden Bedingungen hinsichtlich pH-Wert und Ionenstärke erfüllt sind. So kann die Eluierlösung beispielsweise eine Kombination einer Aminosäure und einer anorganischen Säure, oder eine Kombination eines anorganischen Salzes und einer anorganischen Säure, oder eine beliebige anderweitige Kombination oder einzelne Substanz enthalten. Gute Ergebnisse wurden mit einer 0,1 M KCl-HCT-Pufferlösung von pH 2,0 und noch bessere Ergebnisse mit einer 0,3 M Glycin-HCl-Pufferlösung von pH 2,0 erzielt. Des weiteren kann die Eluierlösung einen geeigneten Stabilisator, beispielsweise in Form einer menschlichen Plasmaproteinfraktion wie oben erwähnt, enthalten.

Mit Hilfe einer derartigen sauren Eluierlösung kann im wesentlichen das gesamte adsorbierte Interferon aus den Glasperlen eluiert werden.

Fach dem Eluieren können die Glasperlen gewaschen und zurückgewonnen werden, beispielsweise durch Spülen über mehrere Tage mit starken Säuren oder durch Erhitzen im Dampfbad mit 10 % Salpetersäure, in beiden Fällen jeweils mit nachfolgendem Spülen mit Wasser bis zur Neutralität. Danach können die Glasperlen wieder zur Chromatographiebehandlung von Interferon in der oben beschriebenen Weise verwendet werden.

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Als Ergebnis der Eruierbehandlung erhält man eine wäßrige Interferonlösung, welche den Hauptanteil der Interferonaktivität der Ausgangslösung enthält und daneben nur einen kleinen Anteil der kontaminierenden Proteine. In der Praxis liegt der Rückgewinnungsgrad der Interferonaktivität in dieser ersten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens im Bereich von 50 ^is 70 % und die spezifische Aktivität des Produkts pro Milligramm Protein wird gegenüber dem Ausgangsmaterial ganz wesentlich erhöht.

Das in der ersten Verfahrens stufe erhaltene Eluat weist einen sauren pH-Wert auf und enthält Glycin oder eine andere Substanz, wodurch das Eluat weniger geeignet zur unmittelbaren Anwendung in der zweiten Verfahrensstufe ist. Daher sollte des Eluat vor der weiteren Behandlung neutralisiert und von Glycin befreit werden. Dies kann durch Dialyse des Eluats gegen eine phosphai?gepufferte Salzlösung von im wesentlichen neutralem pH-Wert geschehen. Gute Ergebnisse wurden hierbei bei Anwendung einer Pufferlösung erhalten, die 0,02 M Natriumphosphate (Dinatrium und Mononatrium) und 1 M natriumchlorid bei pH 7,4 enthielt, jedoch können auch anderweitige Pufferlösungen gleichgut geeignet sein. Der hohe Natriumchloridgehalt in dieser Pufferlösung wird auf die Interferonlösung übertragen und eine günstige Auswirkung während der nächsten Verfahrensstufe ausüben.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt eine Chromatographiebehandlung auf immobilisiertem Zinkchelat.

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Die Ausgangslösung für diese zweite Verfahrensstufe ist eine wäßrige Lösung von menschlichem Fibroblast-Interferon, wie es beispielsweise aus der ersten ITerfahrensstufe nach Feutralisierung und Entfernung des G-lycins erhalten wurde. Diese Lösung kann gegebenenfalls verdünnt oder konzentriert werden, normalerweise sind jedoch derartige Behandlungen nicht erforderlich.

An sich kann für diese zweite Stufe jede beliebige Art immobilisiertes Zinkchelat auf einem geeigneten Träger verwendet werden; das bevorzugte Material ist jedoch ein auf Sepharose immobilisiertes Zinkchelat von Iminodiacetat (vgl. J. Porath et al, Nature, 2£8, 598-599 (1975), und Y. G. Edy et al, J. Biol. Ohem. 2£2, 5934-5935 (1977); diese Literaturstellen werden hier ausdrücklich in Bezug genommen). Zur Herstellung eines derartigen Adsorbens kann in der Weise vorgegangen werden, daß man zunächst das Dinatriumsalz der Iminodiessigsäure an epoxyaktivierte Sepharose (d. h. Agarose mit einer Seitenkette mit endständiger Epoxygruppe) kuppelt und sodann Zinkionen zur Chelierung durch die Iminodiacetatgruppen einführt. Falls das gekuppelte Material bereits in einer Säule gepackt ist, kann das Zink in einfacher Weise durch Hindurchleiten einer Zinkchloridlösung durch die Säule eingeführt werden, wobei das Produkt unmittelbar gebrauchsfertig erhalten wird. In diesem Produkt sind die Zinkionen durch starke Bindungen gebunden und vermögen Interferonmoleküle reversibel zu binden, wobei dieser zuletzt genannte Prozeß pH-abhängig ist.

Im einzelnen vermögen die chelierten und immobilisierten Zinkionen menschliches Fibroblast-Interferon bei

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neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert und bei niedriger Ionenstärke der mineralischen Zusätze ziemlich selektiv zu binden. Bei Herabsetzung des pH-Wertes und Erhöhung der Ionenstärke wird jedoch das Interferon eluiert. Eine gute Eluierung läßt sich durch Verwendung eines pH-Gradienten bei konstant hoher Ionenstärke erzielen (vgl. die obengenannte Veröffentlichung von Edy).

In der zweiten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ausgangslösung mit dem immobilisierten Zinkchelat in Berührung gebracht, zur selektiven Adsorption des Interferons an diesem. Diese Kontaktierung kann in der Weise erfolgen, daß man die Ausgangslösung über eine mit dem Adsorbens gepackte Säule leitet, oder durch Schütteln der Ausgangslösung mit einer Menge des Adsorbens in einem Behälter. Die Verwendung einer Säule ist vorzuziehen, da, wie oben erwähnt, das Adsorbens in einfacher Weise in dieser Form hergestellt werden kann. Die Kontaktierung führt zu einer Adsorption von Interferon aus der Lösung an dem Zinkchelat, während kontaminierende Proteine, soweit sie noch vorliegen, nicht gebunden werden und in Lösung verbleiben.

Der pH-Wert während der Kontaktierung beträgt normalerweise 7>4·» falls die Ausgangslösung gegen die obengenannte phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert wurde; jedoch arbeitet das System allgemein bei Ausgangs-pH-Werten von 7,0 bis 8,2. Oberhalb pH 8,2 geht einige Aktivität verloren, unterhalb pH 7?0 wird ein großer Teil des Interferons nicht adsorbiert und geht glatt durch die Säule hindurch.

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Die Dauer der Kontaktierung ist nicht an kritische Grenzwerte gebunden, soll aber selbstverständlich für eine C Adsorption im wesentlichen des ganzen Interferons ausreichen. Diese Dauer kann zwischen 0,5 und 26 Stunden variieren.

Nach der Kontaktierung wird die verbleibende Lösung entfernt und die Säule kann mit einem herkömmlichen Waschagens wie beispielsweise einer phosphatgepufferten Lösung von pH 7j4- gewaschen werden, zur Entfernung residueller, nicht-adsorbierter Proteine aus der Säule. Weitere Waschungen können mit einer Pufferlösung von niedrigerem pH, beispielsweise einer 0,1 M Natriumacetat/Essigsäurelösung von pH 5₅9 vorgenommen werden, zur Entfernung jeglicher Proteine, die eventuell in der Säule gebunden worden sein mögen. Der pH-Wert dieser Pufferlösung soll nicht niedriger als etwa 5»9 sein, um eine Eluierung des Interferons zu vermeiden. Diese sämtlichen Waschflüssigkeiten können 1 M Natriumchlorid enthalten, wie die obengenannte Dialyseflüssigkeit, um eine nicht-spezifische Bindung von Proteinen an das Adsorbens zu verhindern.

Nach dem Waschen kann das Interferon mit Hilfe einer sauren wäßrigen Lösung aus dem Zinkchelatadsorbens eluiert werden. Diese Lösung kann im allgemeinen einen pH-Wert zwischen 4,0 und 6,0 besitzen; zur Erzielung bester Ergebnisse kann ein pH-Gradient von 6,0 bis herab zu 4,0 verwendet werden. Bei pH-Werten oberhalb 6,0 wird keine gute Eluierung erreicht, pH-Werte unterhalb 4,0 haben eine Instabilität des eluierten Interferons zur Folge.

Die Ionenstärke (Molaritat) des Eluanten ist nicht sehr

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kritisch und kann in der Praxis zwischen O,05 M und 0,5 M variieren. Bei niedrigeren Werten besteht die Gefahr unzureichender Pufferung und eines daraus folgenden Verlusts an pH-Steuerung, bei höheren Werten können sich Schwierigkeiten durch Kristallisation von Bestandteilen ergeben. Gute Ergebnisse wurden mit einer 0,1 M Uatriumacetatlösung, die mit Bisessigsäure auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt war, erzielt, jedoch sind anderweitige Lösungen, wie etwa die in der obengenannten Arbeit von Sdy erwähnten, nicht ausgeschlossen. Falls diese Eluantlösung von pH 4,2 unmittelbar nach der Waschflüssigkeit von pH 5» 9 angewandt wird, wird automatisch ein pH-Gradient erzielt. Alternativ können Ο,Ί M Natriumacetatlösungen von schrittweise abnehmendem pH in Aufeinanderfolge angewandt werden. Diese sämtlichen Eluierlosungen sollen 1 M Natriumchlorid enthalten, um das NaCl-Gl eichgewicht in der Säule aufrechtzuerhalten.

Mit Hilfe eines derartigen Eluanten läßt sich im wesentlichen das gesamte adsorbierte Interferon aus dem Zinkchelat-Adsorbens eluieren.

Nach dem Eluieren kann das Adsorbens gewaschen und regeneriert werden, beispielsweise durch Spülen der Säule mit einer gepufferten Äthylendiamintetracetatlösung (EDTA), Auswaschen des EDTA mit einer phosphatgepufferten Salzlösung von pH 7»4-, Behandlung der Säule mit einer sauren Zinkchloridlösung bis zur erneuten Sättigung des Chelats mit Zink sowie Auswaschen des überschüssigen Zinkchlorids mit einer Natriumacetatpufferlösung und Gleichgewichtseinstellung der Säule auf im wesentlichen neutrale pH-Werte.

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Als Ergebnis der Eluierbehandlung erhält man eine flüssige Interferonlösung, die noch die gesamte oder doch den Hauptteil der Interferonaktivitat der Ausgangslösung enthält und in welcher der Gehalt an kontaminierenden Proteinen auf einen sehr kleinen Wert abgesenkt ist. Die Rückgewinnung der Interferonaktivitat in dieser zweiten Verfahrensstufe kann 90 bis 95 % "betragen, derart, daß die Gesamtrückgewinnung innerhalb des gesamten zweistufigen erfindungs gemäß en Verfahrens etwa. 4-5 bis 67 % beträgt .

Die spezifische Aktivität des Produkts kann bis zu 1Cr Einheiten/mg Protein betragen, was mehr als irgendein anderer bisher erhaltener Wert ist. Die Reinheit der als Endprodukt erhaltenen Interferonlösung kann nach verschiedenen Verfahren festgestellt werden. Eines dieser Verfahren ist eine normale Proteinanalyse, beispielsweise mit Pluorescamin. Ein anderes Verfahren umfaßt eine Markierung des gereinigten Interferons mit einer radioaktiven Markiersubstanz wie beispielsweise "M mit anschließender Acrylamid-Gel-Elektrophorese des Interferons und nachfolgende Röntgenstrahl-Autoradiographie. Dies liefert eine Anzeige, ob das gereinigte Interferon ein Einzeloder ein Mehrfachprodukt ist. Danach kann ein Test vorgenommen werden, ob das Endprodukt bei Anwendung am menschlichen Körper eine Hautreaktion hervorruft.

Diese sämtlichen Verfahren zeigen bei Anwendung auf die Endprodukte des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens einen sehr hohen Reinheitsgrad an. So wird beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen der Beschreibung gezeigt, daß die zurückbleibenden Unreinheiten durch

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Proteinanalyse nicht meßbar sind und daß ausweislich der elektrophoretischen Untersuchung die Endprodukte ein homogenes Produkt darstellen. Des weiteren riefen die Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Anwendung auf Menschen keinerlei Fieber oder Hautreaktionen hervor.

Zusammenfassend ist festzuhalten, daß das erfindungsgemäße zweistufige Reinigungsverfahren zu einer sehr hohen Rückgewinnung der anfänglichen Interferonaktivität in einer sehr reinen Form führt. Infolge des Fehlens von Hautreaktionen eignet sich das Produkt für die klinische Therapie. Die Produktion in großem Maßstab ist nunmehr möglich, da die Reagentien leicht verfügbar und in einfacher Weise zu regenerieren sind. Das bedeutet, daß künftig große Mengen an menschlichem Fibroblast-Interferon zur Verfugung gestellt werden können, wie dies für Zwecke der chemischen Eigenschaftsuntersuchung wie auch zur klinischen Anwendung erforderlich ist.

Im folgenden werden Beispiele der Erfindung beschrieben, denen jedoch keine einschränkende Bedeutung zukommen soll.

Beispiel I

Das Ausgangsmaterial war eine aus mit Polyinosin-Polycytidylsäure stimulierten menschlichen Embryo-Fibroblast-Zellen gewonnene wäßrige Interferonlösung. Das Interferon befand sich in Eagle's minimal-essentiellem Medium von pH 7,4-, mit einem Gehalt von 1 Vol./6 einer vom belgischen

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Roten Kreuz gelieferten menschlichen Plasmaproteinfraktion. Die Interferonaktivität und der Proteingehalt dieser Lösung in einem Versuch in kleinem Maßstab sind in der Tabelle A angegeben.

Diese Ausgangslösung wurde mit porösen Glasperlen (Electro-Nucleionies Ine) mit einer Porengröße von etwa 35O A und einer Perlengröße von 75 bis 120 yum, in einem Verhältnis von etwa 30 ml Lösung auf etwa 1 ml Glasperlen gemischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang leicht gerührt, um die Perlen in Suspension zu halten und eine selektive Adsorption von Interferon aus der Lösung an den Perlen zu bewirken. Danach ließ man die Perlen sich absetzen und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Dekantieren entfernt. Die Perlen wurden zweimal mit einer phosphatgepufferten Salzlösung gewaschen, welche 8 g NaGl, 1,15 S Wa₂HPO₄, 0,2 g KH₂PO₄, 0,2 g KCl, 0,12 g KgSO₄ und 0,10 g CaCl₂ pro Liter enthielt (vgl. Dulbecco et al, J. Ξχρ. Med., 99, 167-182 (1954-)), wobei die Waschlösung im Verhältnis von 20 ml Lösung je ml Perlen angewandt wurde. Sodann wurden die Perlen einmal mit einer 0,01 M Glycin-HCl-Pufferlösung von pH 3,5 im gleichen Verhältnis gewaschen. Danach wurden die Perlen eruiert, indem man sie 2x5 Minuten lang mit einer 0,3 M Glycin-HCl-Pufferlösung von pH 2,0 und 2 χ 30 Minuten lang mit der gleichen Pufferlösung umrührte, wobei die Eluierlösung Jeweils im Verhältnis von 2 ml Pufferlösung pro ml Perlen verwendet wurde. Diese Pufferlösung enthielt 0,09 mg/ml menschliche Plasmaproteinfraktion, als Stabilisator. Der Proteingehalt und die Interferonaktivität der kombinierten Eluate sind in der Tabelle A angegeben und man erkennt, daß der Wiedergewinnungsgrad an

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Interferonaktivität in diesem Experiment 68 % betrug.

Nach dem Eluieren wurden die Glasperlen regeneriert, und zwar durch Spülen mit starken Säuren über mehrere Tage und anschließendes Waschen mit destilliertem Wasser bis zur Neutralität. Vor der erneuten Verwendung wurden sie im Autoclaven sterilisiert.

Ein Teil der kombinierten Eluate wurde gegen 4 χ 500 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung dialysiert, welche 0,02 M Natriumphosphat und 1,0 M Natriumchlorid enthielt und einen pH-Wert von 7» ^ besaß. Diese Pufferlösung wurde alle 6 bis 8 Stunden gewechselt. Als Ergebnis erhielt man einen pH-Wert von etwa 7»4- und die Glycinkonzentration war von 0,3 M auf etwa 0,0001 M abgesenkt, bei gleichzeitiger Einführung eines Natriumchloridgehalts von 1 M.

Die erhaltene Interferonlösung wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h durch eine mit immobilisiertem Zinkchelat beschickte Säule von 0,9 x 8 cm geschickt. Zur Herstellung des immobilisierten Zinkchelats wurde Irainodiacetat an epoxyaktivierte Sepharose 6 B gekuppelt und eine Zinkchloridlösung zugegeben, wie von Edy et al, in J. Biol. Chem. 2£2, 5934-5935 (1977), beschrieben.

Nach der Einbringung des Interferons wurde die Säule mit einem Bettvolumen (10 ml) phosphatgepufferter Salzlösung (der gleichen Lösung wie oben für die Dialyse verwendet) gewaschen, zur Entfernung von nicht adsorbierten Proteinen. Sodann wurde die Säule, zur Entfernung jeglicher adsorbierter unerwünschter Proteine, mit 3 Bettvolumen

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eines 0,1 M Natriumacetatpuffers von pH 5)9 mit einem 1 M Natriumchloridgehalt gewaschen.

Sodann wurde die Säule mit 2 Bettvolumen einer 0,1 M Natriumacetatpufferlösung, welche 1 M Natriumchlorid enthielt und einen pH-Gradienten von 6 "bis 4 aufwies, eluiert. Die innerhalb eines pH-Bereichs von 5>2 bis 4,5 gelegenen Fraktionen wurden gesammelt, da sie den Hauptanteil der Interferonaktivität enthielten.

Der Proteingehalt und die Interferonaktivität des erhaltenen Eluats sind in der Tabelle A angegeben. Man erkennt, daß der Rückgewinnungsgrad der Interferonaktivität in dieser zweiten Verfahrens stufe 94 % betrug, entsprechend einem Gesamtrückgewinnungsgrad von 64 %.

Das Eluat zeigte eine spezifische Interferonaktivität von etwa 1,1 χ 10⁷ Einheiten/mg, was bedeutet, daß das Produkt eine sehr hohe Reinheit aufwies.

Die Zinkchelatsäule wurde durch Waschen mit 5 Bettvolumen von 0,05 M EDTA in einer phosphatgepufferten Salzlösung von pH 7j4 regeneriert. Das zurückbleibende EDTA wurde durch Waschen mit 5 Bettvolumen von phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7)4) entfernt. Sodann wurde Zink durch Waschen mit 0,1 M Natriumacetat (pH 4,0), das 1 M NaCl und 1 mM ZnCIp enthielt, bis zur Sättigung wieder eingeführt. Der Sättigungspunkt wurde in der Weise getestet, daß man einen Tropfen des Eluats aus der Säule mit einer kleinen Menge Natriumcarbonatlösung mischte und die Bildung eines Niederschlags beobachtete. Danach wurde durch Waschen mit Natriumacetatpuffer (pH 4,0) überschüssiges

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Zink entfernt und die Säule durch Waschen mit 5 Bettvolumen einer phosphatgepufferten Salzlösung auf einen Gleichgewichtszustand mit pH 7»4- eingestellt, zur Behandlung einer neuen Probe.

Die Reinheit des Endprodukts wurde mittels Proteinanalyse, Acrylamid-Gel-Elektrophorese sowie Aufbringung auf die menschliche Haut untersucht. Bei der Proteinanalyse (nach dem Fluorescamin-Verfahren) erwies sich die Proteinmenge als nahezu unmeßbar (die Nachweisgrenze bei diesem Yerfahren liegt bei etwa 2 ug pro Milliliter). Die Elektrophorese in Acrylamid-Gel nach Markierung mit einer radioaktiven Markiersubstanz und nachfolgender Röntgenstrahl-Autoradiographie ergab das Vorliegen nur einer radioaktiven Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 22 000. Bei der Anwendung an Menschen wurde keinerlei Hautreaktivität festgestellt. Dies führt zur Annahme, daß das bei diesem Beispiel erhaltene Produkt eine hohe Reinheit besaß und praktisch als vollkommen rein betrachtet werden kann.

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Tabelle A

ro

Material	YoIumen ml	Gesamtprotein- gehalt mg	Gesamt aktivität Einheiten	ί	2,	4	χ	10⁶	Spezifische Aktivität Einheiten/mg
Aus gangsIb" sung	125	67,92			0		5 χ 10⁴
Glasperlen: unadsorbiert + Waschungen	3OO	60,81		,7	χ	10⁶	0
Eluate	34	2,04	2	,7	χ	10⁶	1,5 χ 10⁶ j
Dialysierte Lö sung	34	2,04	2		0		r 1,5 χ ιο°
Zinkchelat: unadsorbiert + 1. Vaschung	44	2,03			0		0
2. Waschungen	30	0	55	χ	10⁶	0
Eluate	3	~ 0,002	; -V 1,1 X 10⁹

CO O LO CD

cn cn cn

Beispiel II

Hierbei wurde das gleiche Ausgangsmaterial wie in Beispiel I für zwei Experimente in großem Maßstab verwendet. Die Vorgangsweise war ähnlich wie in Beispiel I mit dem Unterschied, daß die Eluate aus den Glasperlen gegen 4· χ 4- 1 phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert wurden und daß eine Zinkchelatsäule von 1,5 x 16 cm verwendet wurde. Diese Zinkchelatsäule (Bettvolumen 30 ml) wurde zuerst mit einem Bettvolumen phosphatgepufferte Salzlösung und sodann mit 5 Bettvolumen ITatriumacetatpuffer gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 2 Bettvolumen von 0,1 M Natriumacetatpufferlösung von pH 4,2, mit 1 M Hatriumchloridgehalt, das einen pH-Gradienten im Eluat ergab. Die Fraktionen innerhalb des pH-Bereichs von 5»2 bis 4-,5 wurden gesammelt und enthielten den Hauptanteil der Interferonaktivität.

Die Proteingehalte und Interferonaktivitäten der Ausgangslösung und ihrer Produkte sind in der Tabelle B gezeigt. Aus dieser Tabelle ergibt sich, daß der Rückgewinnungsgrad der Interferonaktivität in der ersten Verfahrensstufe 57»5 % bzw. 58 % betrug und in der zweiten Verfahrensstufe 91 »4- % bzw. 91 »6 %, entsprechend einer Gesamtrückgewinnung von 52»6 % bzw. 53»2 %.

Die Eluate besaßen eine spezifische Interferonaktivität

QQ

von etwa 1,7 x ICr und 2 χ 10' Einheiten/mg, was bedeutet, daß das Produkt eine sehr hohe Reinheit besaß. Des weiteren wurde die Reinheit der Endprodukte in gleicher Weise wie in Beispiel I getestet, mit ähnlichen Ergebnissen. Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich in der Tat zur Anwendung in großem Maßstab eignet.

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Tabelle B

Material

Ausgangslösung

Glasperlen:
unaiDsorbiert
+ Waschungen

Eluate

Dialysierte Lösung

Zinkchel at:
una<3 sortiert
+ 1. Waschung

2. Waschungen

Eluate

Volumen ml

3200 3200

4700 4700

280 280

100 100

130 130

150 150

10 10

Ge s amtprοt e ingehalt mg

1075,2
1462,9

124,6
169,54

44,46 60,55

42,51 60,01

1,60 0,48

0,007 0,014

Gesamtaktivität Einhe it en

64 χ 10έ

Spezifische

Aktivität Einheiten/mg

1,5

3,68 χ Λθί

8,7 χ 10''

1,32 χ 10?,

3,11 χ 10''

0
0

0,76 χ 10

12,02 χ 10,S 2,85 χ 10'

5,9 χ 10, 10,3 X

2,96 χ 10ζ

5.13 χ 10^ρ

2,96 χ 1θΙ

5.14 χ 1Ο^Ρ

0 0

0,47 χ

7 χ

2 χ

X λ.

cn cn cn

Claims

2 α ΟΚΤ. j.3ö0 Pat ent anspräche

1. Verfahren zur Reinigung von Interferon, dadurch gekennzeichnet , daß man (a) eine wäßrige lösung von menschlichem. Fibroblast-Interferon einer Chromatographiebehandlung an porösen Glasperlen und (b) sodann die so erhaltene Interferonlösung einer Chroaiatographiebehandlung an immobilisiertem Zinkchelat unterzieht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man in dem Verfahrensschritt (a) die wäßrige Interferonlösung bei neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert mit porösen Glasperlen in Berührung bringt zur selektiven Adsorption der Interferonlösung an den Perlen, und daß man die Perlen sodann mit einem Eluieragens bei einem sauren pH-Wert in Berührung bringt, aur Eluierung des adsorbierten Interferons von den Perlen.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Glasperlen nach der Adsorption und vor dem Eluieren mit einer phosphatgepufferten Salzlösung von etwa rimitralem pH-Wert geweschen und anschließend mit einer Pufferlösung von niedrigerem pH-Wert bis zu pH 3jG gewaschen werden.

4·. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3? dadurch gekennzeichnet , daß das Eluieragens einen

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pH-Wert zwischen. 1,5 -und 2,7 tmd eine Ionenstärke zwischen 0,05 M und 0,5 M besitzt,

5- "Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet , daß die Eluierung aus den Glasperlen mit einer 0,3 M Glycin-HCl-Pufferlösting von pH 2,0 erfolgt.

6. Verfahren nach einem oder taehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das aus der Verfahrensstufe (a) erhaltene Eluat zur Vorbereitung für die Verfahrensstnfe (b) gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert wird.

7- Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennz eichnet , daß in dem Verfahrensschritt (b) das dialysierte Eluat aus der Verfahrensstufe (a) mit immobilisiertem Zinkchelat bei neutralem oder schwach alkalischem pH kontaktiert wird, zur selektiven Adsorption von Interferon axis dem Sluat an dem Adsorbens, und daß sodann das Zinkchelat mit einem Eluieragens bei saurem pH-Wert in Berührung gebracht wird, zum Eluieren von Interferon aus dem Adsorbens.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Adsorbens ein Ohelat von Zink und an epoxyaktivierte Sepharose gekuppeltem Iminodiacetat ist.

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9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das immobilisierte Zinkchelat nach der Adsorption und vor dem Eluieren mit einer phosphatgepufferten Salzlösung von etwa neutralem pH-Wert gewaschen wird, mit nachfolgender Waschung mit einer Pufferlösung von niedrigerem pH-Wert bis au pH 5₅9·

10. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet , daß das Eluieragens einen pH-Wert zwischen 6,0 und 4,0 und eine Ionenstärke zwischen 0,05 M und 0,5 M besitzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Eluierung aus dem Zinkchelat mit einer 0,1 M Natriumacetatlösung von pH 4,2 erfolgt.

12. Nach dem Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche gereinigtes Interferon.