DE1940130C2

DE1940130C2 - Verfahren zur Reinigung von Insulin, nach diesem Verfahren gereinigtes Insulin und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE1940130C2
Application number: DE1940130A
Authority: DE
Inventors: Klavs Holger Virum Jørgensen; Jørgen Dr.phil. Brønshøj Schlichtkrull
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1968-08-09
Filing date: 1969-08-07
Publication date: 1983-12-08
Also published as: IL32665A; BG25638A3; HK51077A; CU33401A; DE1940130A1; HK61977A; GB1285023A; FR2015369A1; IE33239B1; CS225117B2; ZM12069A1; SE7901917L; NL141377B; YU40003B; MTP620B; MY7800209A; ES370345A1; YU204569A; IE33239L; AT354634B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von aus Schweine- oder Rinderpankreasdrüsen gewonnenem handelsüblichen oder rohen Insulin, nach diesem Verfahren gereinigtes Insulin und dessen Verwendung entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Es wurde ursprünglich angenommen, daß sorgfältig rekristaflisiertes Insulin in Form scharfkantiger Rhomboeder, die von ebenen Kristallflächen begrenzt sind, das reine Protein Insulin darstellt, dessen Konfiguration von Sanger und Mitarbeitern bestimmt wurde (vgl. z. B. Biochemical Journal 60 [1955], 556). Später ergab sich, daß diese Annahme nicht zutrifft Wissenschaftliche analytische Untersuchungen zeigten, daß das vorer-

jo wähnte kristalline Insulin Proteine pankreatischen Ursprungs mit einem Molekulargewicht oberhalb des von reinem Insulin (etwa 6000) und daneben insulinähnliche Substanzen von etwa demselben Molekulargewicht wie das von reinem Insulin enthält.

Hiernach konnte gezeigt werden, daß in 1 M Essigsäure aufgelöstes kristallines Insulin durch Gelfiltration auf einer Säule von Sephadex® G-50 in Komponenten (a), (b) und (c) fraktioniert werden konnte. Bei Sephadex® G-50 handelt es um mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, wodurch sich eine Ausschlußgrenze von etwa 10 000 (unterstes Molgewicht der abzutrennenden Substanz) ergibt. Das Sephadex® G-50 liegt in Kugelform (Durchmesser 20 bis 80 μ) vor. Die genannten drei Komponenten können aus ihren Lösungen nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz bei neutraler Reaktion, Gefriertrocknung usw. isoliert werden. Die beiden Komponenten (a) und (b) enthalten Proteine pankreatischen Ursprungs mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000.

Die Menge der Komponente (a) kann 2 bis 5 Gew.-% des kristallisierten Insulins und weniger als 1 Gew.-% des rekristallisierten Insulins betragen. Die Menge der Komponente (b) kann in beiden Fällen 4 bis 8% sein. Die Komponente (b) kann weiter in eine Anzahl von Proteinen mit annähernd derselben Molekulargröße, jedoch unterschiedlichen Anteilen zerlegt werden. Dies konnte mit dem Anionenaustauscher DEAE-Sephadex® A-50 und einer Lösung der Komponente (b) in mit TRIS

bo (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) gepuffertem 7 M Harnstoff bei pH 7,7 gezeigt werden. Bei dem DEAE Sephadex® A-50 handelt es sich um ein Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist, wodurch sich eine Ausschlußgrenze von etwa 10 000 (unterstes Molgewicht

b5 der abzutrennenden Substanzen) ergibt und das Diethylaminoethylgruppen als funktionell Gruppen besitzt.

Das DEAE Sephadex® A-50 liegt in Kugelform vor

(Durchmesser 40-120 μ). Das Ergebnis des Trennungsprozesses ist in Fig. 1 veranschaulicht Die Peaks 4, 6 und 7 in dieser Figur entsprechen den bekannten Substanzen, nämlich dem Proinsulin, der Zwischenstufe und dem nicht-umwandelbaren Dimeren. Die anderen Peaks konnten noch nicht identifiziert werden. Sie können aus ihrer Lösung nach an sich bekannten Methoden isoliert werden. Das Proinsulin ist aus kristallinem Rinderinsulin von Yip und Lin (IHo. Biophys. Ren. Com, 29, 382-387 [1967]) und aus Schweineinsulin von Chance und Mitarbeitern (Science, 161,165-167 [1968]) isoliert worden. Die Existenz der Zwischenstufe wurde ebenfalls von Chance und Mitarbeitern (a. a. O.) erwähnt

Die Komponente (c), welche die Proteine pankreatischen Ursprungs mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 enthält, kann ebenfalls durch Ionenaustausch-Chromatographie zerlegt werden. Sie enthält eine Hauptfraktion, die als reines Insulin angesehen wird, und einige Nebenfraktionen von insulinähnlichen Substanzen, wie Desamidoinsuline und insulinähnliche Substanzen, die mehr Arginin enthalten als das Insulinmolekül und demnach als »Arginininsulin« bezeichnet werden. Die Existenz des Desamidoinsulins ist von Harfenist & Craig (J. Am. Chem. Soc. 74, 3083 [1952]), von Thompson & O'Donnell (Austr. J. Biol. Sei. 393-400 [I960]) und von Chance und Mitarbeitern (Science, 161, 165-167 [1968]) erwähnt worden, die auch eine insulinähnliche Komponente angeben, von der angenommen wird, daß es sich um »Arginininsulin« handelt.

Der Anteil von Monodeasmidoinsulin in der Komponente (c) ist variabel und hängt von der Herkunft des Insulins ab. Im allgemeinen handelt es sich um 3 — 10 Gew.-% der Komponente (c). Das Arginininsulin kann 2 — 3 Gew.-% der Komponente (c) betragen.

Die Feststellung von Verunreinigungen sogar in rekristallisiertem Insulin, die wissenschaftliche Fraktionierung der Verunreinigungen und die Identifizierung des Hauptteils von diesen, gab nicht Veranlassung zu Versuchen, um die Zusammensetzung von Insulinpräparaten zu ändern, die aus Pankreasdrüsen gewonnenes Insulin enthielten und für die Diabetestherapie eingesetzt wurden. Die Überempfindlichkeit bzw. Allergie gegenüber den vorhandenen Insulinpräparaten verschwand fast vollständig nach der üblichen Verwendung von kristallisiertem und rekristallisiertem Insulin. Auf der anderen Seite bestanden und bestehen noch eine Reihe von Nebenwirkungen, welche durch die Tatsache verursacht sind, daß nach der Behandlung über einige Monate das Serum von Diabetespatienten Immunoglobuline aufwies, die in vitro und in vivo sich mit Insulin verbinden, was bedeutet, daß die Injektion der Insulinpräparate die Bildung von Insulinaniikörpern hervorruft. Dies wurde aus einer Reihe von Gründen als unerwünscht angesehen:

1. Die Erzeugung von Insulinantikörpem zeigt einen Zustand von andauerndem Antagonismus des Körpers gegenüber dem wichtigen Hormon Insulin an.

2. Dieser Zustand wirkt sich wahrscheinlich schädlich auf die Körperzellen aus, z. B. auf die ^-Zellen, die bei Kaninchen durch die Immunisierung mit Insulin und den Nebenstoffen zerstört werden. Es war zu erwarten, daß die späten Diabeteskomplikationen, wie die Angiopathie, schlimmer werden können.

3. Es wurde festgestellt, daß ein hoher Insulinantikörper-Spiegel manchmal zu einer Insulinresistenz führt, demzufolge eine hohe Dosis erforderlich macht und eine metabolische Kontrolle ausschließt

4. Es ist in Betracht zu ziehen, daß die tatsächliche Dosis, die zur Behandlung von Diabetes erforderlich ist, bei weitem die Dosis übersteigt, die nui dann erforderlich wäre, wenn die Antikörperbildung vermieden werden könnte.

5. Bei einigen Patienten binden die Antikörper ίο Rinderinsulin stärker als Schweineinsulin; es wird von hypoglykanischen Erscheinungen nach einem Wechsel in der Zusammensetzung der Insulinpräparate berichtet.

6. Wenn sich Insulinantikörper in den Patienten aufbauen, dann ist dies von einem Anstieg der Konzentration an zirkulierendem exogenen Seruminsulin begleitet Von dem Seruminsulin wird etwas an die Antikörper gebunden. Die Konzentrationen an dem gesamten und sogar an dem freien Insulin können Werte erreichen, die 10— lOOmal so groß sind wie die normale physiologische Konzentration. Diese hohen Konzentrationen können für die Gewebe schädlich sein. Hierdurch kann eine Artereosklerose gefördert und es können die noch verbleibenden jS-Zellen geschädigt werden. Es wurde nachgewiesen, daß hohe Konzentrationen an Insulin einen inhibitorischen Effekt auf die Sekretion der /J-Zellen haben.

Der Mechanismus, der hinter der Entwicklung der Insulinantikörper steht, sowie deren Eigenschaften sind in steigendem Maße während der letzten 5 bis 10 Jahre untersucht worden.

Es wurde festgestellt, daß die Insulinspezies der beherrschende Faktor für die Entwicklung der Antikörper zu sein scheint. Rinderinsulin, das sich mehr (3 Aminosäurepositionen) von menschlichem Insulin unterscheidet als das Schweineinsulin (eine Aminosäureposition) hat, wie erwartet werden kann, eine stärkere antigene Wirkung als Schweineinsulin. Andererseits führt Schweineinsulin zu der Bildung von Antikörpern gegen Scii'veineinsulin (sogar bei Schweinen). Bisher wurde keine Erklärung für diese Beobachtung gefunden, wenngleich vermutet wird, daß die abnorm hohen Konzentrationen von Schweineinsulin an der Injektionsstelle den immunologischen Mechanismus im Schwein dazu anregen, Antikörper gegen das eigene Insulin zu bilden.
Die unerwünschte Bildung der obenerwähnten

so Insulinantikörper wurde bis zur vorliegenden Erfindung als unvermeidbar angesehen, und zwar deswegen, weil allgemein die Annahme bestand, daß reines Insulin ein Antigen wäre. Diese These wurde auch noch von Decken in seinem Aufsatz »Insulin Antibodies« (Kopenhagen 1964) gestützt.

Dort wird die Fraktionierung und Isolierung von einigen der im kristallinen Schweineinsulin festgestellten Verunreinigungen beschrieben und es sind dort auch biologische und chemische Untersuchungen erwähnt, die zeigen sollen, daß die Verunreinigungen zu der Bildung von Antikörpern Veranlassung geben, die von Insulinantikörpem verschieden sind, daß jedoch die Bildung der Insulinantikörper begünstigt wird, wenn die Insulinpräparate unrein sind (a. a. 0.90 und 195).

Die vorliegende Erfindung beruht auf zwei neuen und überraschenden Beobachtungen, die eine grundsätzliche Abkehr von dem bisherigen Wissensstand darstellen.
Die erste Beobachtung besteht darin, daß bei an

Tieren durchgeführten immunologischen Versuchen das Insulin keine Bildung von Insulinantikörpern auslöste, wenn das Insulin frei von pankreatischen Proteinen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 war und im wesentlichen nur einen einzigen Bestandteil bei der Analyse vermittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) auswies.

Die zweite Beobachtung besteht darin, daß die aus kristallisiertem Insulin isolierten Verunreinigungen, nämlich die vorerwähnten Komponenten (a) und (b) und im gewissen Umfang auch die insulinähnlichen Substanzen in der Komponente (c) grundsätzlich für die antigene Wirkung der bekannten Insulinpräparate verantwortlich sind.

Für die immunologischen Versuche wurden Kaninchen ausgewählt, weil sie auf Serumantikörper in derselben Weise reagieren wie Menschen, wenn die Behandlung mit bekannten Insulinpräparaten durchgeführt wird; d. h. die Antikörper besitzen ähnliche Eigenschaften in bezug auf ihre Fähigkeit Insulin zu binden und in bezug auf die Affinität zu Insulin.

Den Kaninchen wurden dreimal wöchentlich Injektionen mit einer konstanten Dosis des zu untersuchenden Proteins: 40 μg in 1 ml 0,04 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 aufgelöst, verabreicht. Bei den Proteinen handelte es sich um die Komponente (a), die Fraktion 3 der Komponente (b), dem Dimeren.dem Proinsulin, dem Arginininsulin und dem Monodesamidoinsulin, wobei alle diese Proteine aus Rinderinsulin stammten. Außerdem wurden den Kaninchen dreimal wöchentlich entsprechende Lösungen von rekristalüsiertem Rinderinsulin und solchem Rinderinsulin injiziert, das frei von den Komponenten (a) und (b) sowie Arginininsuiin und auch im wesentlichen frei von Monodesamidoinsulin ist, so daß es im wesentlichen reines Insulin darstellt. Die Dosis betrug etwa 0,5 int. Einheiten pro kg. Die Serumantikörperspiegel wurden in regelmäßigen Abständen in an sich bekannter Weise geprüft.

Der Spiegel wird in dem Prozentsatz des zugesetzten '"!-Insulin (Rind) ausgedrückt, der in dem betreffenden Versuch an Antikörper gebunden wurde. Einige dieser Ergebnisse sind in der F i g. 2 wiedergegeben. Nicht gezeigt ist in dieser Figur die Feststellung, daß Arginininsulin der Komponente (c) in kleinen, jedoch immerhin nennenswerten Mengen nach 45 Tagen Antikörper erzeugte, während es fraglich erscheint, ob Monodeasmidoinsulin ein Antigen darstellt.

Die ersten beiden der folgenden vier Resultate sind überraschend und widersprechen den Erwartungen:

1. Die Insulinaufbereitung, die nur reines Insulin enthält, erzeugt keine Antikörper zu Insulin.

2. Die Komponente (a), die kein Insulin ist, erzeugt eine außerordentlich große Menge an Antikörper gegen Insulin. Die wahrscheinlichste Erklärung besteht darin, daß sie etwas enthält das in unbekannter Weise in einer chemischen Beziehung zu Insulin steht

3. Herkömmliches Insulin von hoher Reinheit d. h. rekristallisiertes Insulin, erzeugt Antikörper, wie es bei Menschen der Fall ist

4. Substanzen, die zur Komponente (b) gehören, nämlich No. 3 (vgl. Fig. 1), das Dimere und das Proinsulin, haben eine antigene Wirkung, die die Erzeugung von Antikörpern gegen Insulin ansteigen läßt

Bei den immunologischen Versuchen wurde festgestellt, daß bei einigen Kaninchen die Neigung zu höheren Blutzuckerwerten besteht, nämlich bei solchen Kaninchen, denen die Komponente (b) injiziert wurde, wobei diese Wirkung insbesondere dann beobachtet wurde, wenn eine der Fraktionen der Komponente (b), nämlich das Dimere, verabreicht wurde. Das Dimere führt zwar nicht zu dem höchsten Spiegel an Antikörpern, jedoch waren aus unbekannten Gründen die Blutzuckerwerte bei diesen Tieren am höchsten, ίο Dieser Effekt der Komponente (b) und des Dimeren kann als diabetogene oder antiinsuline Wirkung bezeichnet werden, wenn es sich tatsächlich herausstellt, daß die Tiere gegen Insulin resistent werden, wie es in F i g. 3 gezeigt ist.

Nach einer Behandlungszeit von 14 Wochen mit dem Dimeren (Rind 40 μg dreimal wöchentlich) ließ man die Kaninchen über 16 Stunden fasten, wonach ihnen auf intravenösem Wege Insulin verabreicht wurde (0,5 int. Einheiten pro kg). Für den Kontrollversuch wurde eine Gruppe von Kaninchen mit einer reines Insulin enthaltenden Aufbereitung behandelt Aus den in F i g. 3 gezeigten Kurven für die Serumglukose ist zu ersehen, daß die für den Kontrollversuch eingesetzten Kaninchen in der erwarteten Weise auf Insulin reagierten, während die mit dem Dimeren der Komponente (b) behandelten Kaninchen sich gegenüber Insulin resistent verhielten. Die Resistenz mag zwar für den Anstieg der Blutzuckerwerte ursächlich sein, ohne daß jedoch hierfür eine Erklärung gefunden wurde. Diese Beobachtung dürfte wohl auch der sich bei einigen Patienten im Verlaufe der Behandlung mit den bekannten Insulinaufbereitungen zeigenden Resistenz entsprechen. Es ist zu erwarten, daß die klinische Resistenz durch Verabreichung von Insulinaufbereitungen, die frei von der Komponente (b) und dem Dimeren sind, vermieden werden kann.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Komponenten von Schweineinsulin erzielt.

Die überraschenden Ergebnisse bei den obenerwähnten Untersuchungen beweisen, wie wichtig es ist, daß das für die Herstellung von injizierbaren Insulinpräparaten für klinische Zwecke verwendete Insulin nicht nur frei von pankreatischen Proteinen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 ist, sondern auch keine insulinähnlichen Substanzen wie Arginininsulin und vorzugsweise auch kein Monodesamidoinsulin enthält. Für analytische Zwecke wurde früher die diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) eingesetzt, auch in Verbindung mit Lösungen von kristallinem Insulin. Diese spezielle Gel-Elektrophorese wurde von B. j. Davis und L Ornstein entwickelt und ist in Ann. N. Y. Acad. ScU 121, S. 321 - 349 und 404 - 427 (1964) beschrieben.
Wenn das zuletzt beschriebene Insulin der DISC PAGE unterworfen wird und nur einen einzigen Bestandteil ausweist dann kann es als reines Insulin angesehen werden. Wenn das reine Insulin von geringen Mengen an Monodesamidoinsulin begleitet wird, kann das Insulin als im wesentlichen rein angesehen werden.

Entsprechend den vorstehenden Ausführungen ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von aus Schweine- oder Rinderpankreasdrüsen gewonnenem handelsüblichen oder rohen Insulin dadurch gekennzeichnet daß man mit diesem Insulin

A) eine Gelfiltration an einem vernetzten Dextran oder an einem Polyacrylamid in einem wäßrigen Medium in einem pH-Bereich zwischen 2 und 9 in

an sich bekannter Weise durchführt und
diejenigen Fraktionen, die frei von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 sind, sammelt, hiermit

B) eine Säulenchromatographie bei einer Temperatur zwischen —10° und 40⁰C an einem

Bi) Kationenaustauscher oder
B2) Anionenaustauscher
durchführt,

C) dieSäule(n)mit

Ci) einem Wasser enthaltenden und mit Wasser

mischbaren organischen Lösungsmittel oder
C2) einem wäßrigen Medium, das Harnstoff in

einer Konzentration von 4 bis 8 mol/1 enthält,
bei einem für die Verfahrensweise Bi) auf Werte zwischen 3 und 6,5, für die Verfahrensweise B2) auf Werte zwischen 5,5 und 10 eingestellten pH-Wert eluiert, wobei die Aufeinanderfolge der Verfahrensstufen A/B/C oder B/C/A sein kann,

D) die dem mittleren Hauptteil des Insulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen PoIyacrylamidgel-Elektrophorese im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden Fraktionen sammelt und

E) das darin enthaltene Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt.

Aufgrund der obigen Beschreibung ist selbstverständlich, daß das Hauptziel der aufgrund der Erfindung vorzunehmenden Reinigung darin besteht, daß aus dem als Ausgangsmaterial verwendeten Insulin die aus dem Pankreas stammenden Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 6000 entfernt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß das Insulin einer Gelfiltration unterworfen wird. Diese Filtration wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das mit Wasser mischbare nicht-wäßrige Flüssigkeiten enthalten kann.

In einem wäßrigen Medium kommt vorzugsweise ein pH-Bereich zwischen 2 und 4 zur Anwendung. Die Stabilität von Insulin bei einem pH von weniger als 2 und mehr als 9 ist gering, so daß dann das Insulin abgebaut wird. Deshalb sind sehr hohe oder sehr niedrige pH-Werte wenig zweckmäßig. Ein pH-Bereich zwischen 4 und 9 kann angewendet werden, falls die Löslichkeit des Insulins erhöht wird, beispielsweise durch die Zugabe von Harnstoff, der gleichzeitig der Bildung von Assoziationsprodukten entgegenwirkt, die zwischen Insulinmolekülen und den Verunreinigungen im neutralen Bereich gebildet werden können. Wird bei einem niedrigen pH gearbeitet, dann wird vorzugsweise eine organische Säure, beispielsweise Essigsäure, für dL-Einstellung des pH verwendet; es können jedoch auch starke Mineralsäuren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommt eine Konzentration von 0,5 bis 4 M Essigsäure zur Anwendung.

Für die Gelfiltration ist die Temperatur nicht kritisch. Sie wird im wesentlichen durch die Stabilität und die Löslichkeit des Insulins begrenzt. Es wird deshalb vorzugsweL.; im Bereich normaler Raumtemperatur, beispielsweise 20° bis 25° C, gearbeitet. Die vor der Insulin enthaltenden Komponente (c) eluierten Fraktionen werden verworfen. Diejenigen Fraktionen der Komponente (c), die frei von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 sind, werden gesammelt, wonach das Insulin abgetrennt wird, beispielsweise durch Abdampfen, Aussalzen oder durch Fällen mit Zinkionen.

Um Insulinaufbereitungen mit einer möglichst niedrigen antigenen Wirkung zu erhalten, ist es erforderlich, die Insulin-ähnlichen Substan^n zu entfernen, die ungefähr dasselbe Molekulargewicht wie Insulin haben, jedoch in ihrer chemischen Zusammensetzung etwas vom Insulin abweichen, wie z. B. das bekannte Mono-desamido-Insulin und diejenigen Verbindungen, die als Argininderivate des Insulins angesehen werden können.

Das Mono-desamido-Insulin kann sich sogar nach seiner vollständigen Abtrennung wieder in kleinen Mengen während der Lagerung von pharmazeutischen Insulinaufbereitungen bilden. Hierbei ist jedoch die antigene Wirkung sehr gering. Für die Abtrennung des Argininderivats und diamidierten Insulins wird vorzugsweise die Säulenchromatographie auf einem Ionenaustauscher angewandt. Hierfür können fast alle handelsübliehen Ionenaustauscher eingesetzt werden, welche die Durchwanderung des Insulins gestatten, vorausgesetzt, daß das Verfahren in einem Medium ausgeführt wird, in welchem das Insulin weder mit sich selbst noch mit den Verunreinigungen Aggregate bilden kann.

In der nachfolgenden Tabelle sind geeignete Substanzen für die Reinigung des Insulins angegeben:

Säulenfüllungen für die chromatographische Reinigung von Insulin

Material	Ausgangsprodukt synthetisch	Dowex® 1	Bio-Gel· DM	B Abkömmlinge natürlicher Verbindungen
	Polyacryl- Polystyrol Polyacryl amid säure	Dextran Cellulose Alginsäure vernetzt
Gelfiltrations-Materiali en	Bio-Gel® P-10	Sephadex® G50
	Bio-Gel* P-30	Sephadex G 75
Typ des Anionenaustauschers
stark basische Gruppen	QAE- Sephadex®
schwach basische Gruppen	DEAE- DEAE- Sephadex* Cellulose

9 Fortsetzung	19 40	Dowex® 50W	130	10	Cellulose phosphat CM- Cellulose	Alginsäure
Material	Ausgangsprodukt synthetisch Polyacryl- Polystyrol amid	Polyacryl säure
Typ des Kationen austauschers stark saure Gruppen schwach saure Gruppen	Bio-Gel® CM	Amberlite® CG 50	Abkömmlinge natürlicher Verbindungen Dextran Cellulose Alginsäure vernetzt
		SE- Sephadex® CM- Sephadex⁸

Der lonenaustauschprozeß kann mit einem Wasser enthaltenden und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel als Eluierungsmittel durchgeführt werden. Als Beispiele für derartige Lösungsmittel seien genannt: Tetramethylharnstoff, Dimethylformamid, Dioxan, mit Wasser mischbare Ketone wie Aceton, niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol und Propanol. Vorzugsweise Anwendung finden Alkohole, die in einer Konzentration von 30 bis 80% (v/v), vorzugsweise zwischen 50 und 70% (v/v), eingesetzt werden können.

Wenn das Eluierungsmittel weniger als 50% (v/v) an dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel enthält, kann es als wäßriges Medium bezeichnet werden. In solchen Fällen kann das organische Lösungsmittel durch Harnstoff ersetzt werden, der in einer Menge entsprechend einer 4 bis 8, vorzugsweise etwa 7molaren Lösung verwendet wird. Die Harnstofflösungen müssen Ammoniumcyanat-frei sein, da sonst das Cyanation mit der Aminogruppe im Insulinmolekül reagiert.

Die Eluierungsmittel enthalten immer eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Eluierungsmittels zu regeln. Vorzugsweise wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet. Falls ein Kationenaustauscher verwendet wird, wird der pH-Wert des Eluierungsmittels auf einen Wert zwischen 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6 eingestellt. Wird ein Anionenaustauscher eingesetzt, dann wird der pH-Wert des Eluierungsmittels auf einen Wert zwischen 5,5 und 10, vorzugsweise 6 und 9, eingestellt

Die angegebenen pH-Werte werden mii einer Glaselektrode gemessen, die gegen einen Standardpuffer in der üblichen Weise eingestellt wird.

Geeignete Puffersubstanzen können aus der Literatur entnommen werden.

Es ist wesentlich, daß die Temperatur bei dem Ionenaustausch verhältnismäßig konstant ist Die Temperatur liegt zwischen — 10° und 4O⁰C, vorzugsweise 0° und 30⁰C letzteres sofern es sich bei dem Eluierungsmittel nicht um eine wäßrige Harnstofflösung handelt In diesem Falle wird die Temperatur vorzugsweise unter 5° gehalten.

Für den Reinigungsprozeß wird als Ausgangsmaterial im allgemeinen das marktgängige Insulin, also amorphes Insulin oder kristallines Insulin verwendet das wiederholt kristallisiert worden ist Es kann allerdings auch rohes Insulin eingesetzt werden, wie z. B. der Insulin enthaltende Salzkuchen, der bei der Aufbereitung von Insulin aus Pankreasdrüsen erhalten wird und im allgemeinen 10 bis 30 Gew.-% Insulin enthält Wegen der hohen Gehalte an Verunreinigungen ist jedoch ein solches Ausgangsmaterial weniger für den gemäß vorliegender Erfindung durchzuführenden Reinigungsprozeß geeignet. Ein besseres Ausgangsmaterial kann dadurch erhalten werden, daß eine Lösung des Salzkuchens einer isoelektrischen Ausfällung unterworfen wird, indem der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt wird; der Niederschlag kann durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Als Ergebnis der Reinigungsstufen wird immer eine Lösungsmittelfraktion mit gereinigtem Insulin erhalten, aus der das Insulin in der üblichen Weise, beispielsweise durch Abdampfen, Aussalzen oder Ausfällen in Gegenwart von Zinkionen gewonnen werden kann. Das Insulin kann gegebenenfalls kristallisiert und zu einem injizierbaren Insulinpräparat in an sich bekannter Weise aufbereitet werden.

Aus Biochem. 4 (1965), 1044-1048, ist es bekannt, Angler-Fisch-Insulin zu gewinnen, und zwar mittels einer Kombination von Gelfiltration und Säulenchromatographie. Die betreffende Reinigung wird aber bei solchen Bedingungen durchgeführt, daß das erhaltene Insulin insulinähnliche Substanzen mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 enthält.

Überdies ist es aus Biochem. J. 106 (1968), 531 -541, bekannt, Fischinsulin mittels einer Kombination von Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie zu reinigen. Das dabei erhaltene Insulin enthält aber insuiinähnliche Substanzen mit einem Molekulargewicht von etwa 6000.

Die erfindungsgemäße Reinigung des Insulins wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht

Beispiel la

5 kg Sephadex® G 50, feinkörnig, werden in 1 M Essigsäure gequollen und die feinsten Teilchen durch Dekantieren abgetrennt. Dieses Material wird zur Füllung einer Säule mit einem Durchmesser von 15 cm und einer Höhe vor. 130 cm verwendet Die Säule wird mit 1 M Essigsäure equilibriert

10 g Schweineinsulin, das zuvor aus einem Citratpuffer kristallisiert worden war, wurden in einer Mischung aus 390 ml 1 M Essigsäure und 8 ml 1 N HCl aufgelöst Mit dieser Lösung wird die Säule beschickt Die Eluation wird mit 1 M Essigsäure mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter/h durchgeführt Fraktionen von 200 ml werden gesammelt

Die Extinktionen bei 260 nm werden gemessen und gegen die Fraktionszahlen graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um die größte Spitze) entsprechen, werden gesammelt und das Insulin durch Zugabe von 200 g NaCl auf 1 Liter der gesammelten Fraktionen ausgefällt Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und durch eine isoelektrische Ausfällung und Kristallisation aus einem

Aceton enthaltenden Citratpuffer in an sich bekannter Weise kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 8 g an kristallisiertem Insulin, das frei von pankreatischen Proteinen mit einem Molekulargewicht von oberhalb etwa 6000 ist.

Beispiel Ib

Das erhaltene, kristalline, gereinigte Insulin wird durch eine lonenaustausch-Chromatographie aus einem Amberlite®-Ionenaustausch-Harz weiter gereinigt. Hierzu werden Lösungen von 7 M Harnstoff hergestellt und entionisiert, indem die Lösungen durch Säulen mit einem Mischbett-Ionenaustausch-Harz geschickt werden (Amberlite® MB-I). Der entionisierte Harnstoff wird dann für die Herstellung des folgenden Puffers verwendet: 0,13 M Natriumphosphat — 7 M Harnstoff - 1% n-Butanol, pH 6,0 bei 25°C. Der Puffer wird gelagert und bei 4° C eingesetzt. 1,5 kg Amberlite® CG 50 Type II wird behandelt mit: 1) Wasser; 2) Aceton; 3) Wasser + NaOH; 4) Wasser; 5) Wasser + HCl und 6) Wasser. Das gewaschene Harz wird dann mit 5 Liter des Puffers aufgerührt. Der pH der Suspension fällt sofort und annähernd 30 ml Anteile von 40%iger (w/v) NaOH werden jeweils nach wenigen Minuten zugegeben, um den pH bei etwa 6,0 zu halten. Wenn der pH der Suspension bei 6,00 (nach 15minutigem Rühren) stehen bleibt, wird die Mischung über Nacht bei 4°C gerührt. Das Harz wird filtriert und mit 30 Litern des Puffers 8 Stunden gewaschen. Der pH des Endfiltrats sollte identisch mit dem des einfließenden Puffers sein. Das auf diese Weise erhaltene Material wird zum Füllen einer Säule mit einem Durchmesser von 7,5 cm und einer Höhe von 80 cm benutzt. Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert

15 g Insulin, das nach dem Verfahren gemäß Beispiel la hergestellt worden war, werden als 10%ige (w/v) Lösung in dem Puffer auf die Säule gegeben. Die Eluierung wird mit dem Puffer bei einer Temperatur von 4° C und mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/h durchgeführt. Fraktionen von jeweils 10 ml werden gesammelt.

Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern graphisch aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, die dem zentralen Hauptteil der Insulinspitze (es handelt sich hierbei um die größte Spitze) entsprechen, werden gesammelt und das Insulin durch Zugabe von 2 Litern H₂O, 15 ml 4 N HCl und 600 g NaCl zu 1 Liter der gesammelten Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert, einer isoelektrischen Ausfällung sowie einer Kristallisation aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer in an sich bekannter Weise unterworfen. Die Ausbeute beträgt 10 g kristallines Insulin, das nur eine Komponente enthält, wenn es der Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen wird. Mit anderen Worten: das kristalline Insulin kann als reines Insulin angesprochen werden.

Beispiel 2

Ein Puffer der nachfolgenden Zusammensetzung wird hergestellt: 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,085 N Salzsäure, 60% (v/v) Ν,Ν-dimethylformamid. Der pH-Wert beträgt 7,5 bei Raumtemperatur.

40 Gramm DEAE-Sephadex® A-25 werden in dem Puffer gequollen und daraufhin die feinsten Partikel durch Dekantieren entfernt Das Material wird zum Beladen einer Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 25 cm verwendet Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht.

250 mg Schweineinsulin, einmal aus einem Citratpuffer kristallisiert, werden in 2,5 ml 0,1-N-Salzsäure aufgelöst. Anschließend werden 6,25 ml N,N-Dimethylformamid, 200 μΐ 0,2molares Dinatriumethylendiamintetraacetat, 150 μΐ 2-M-Tris(hydroxymethyl)aminomethan und 1,15 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird auf die

ίο Säule aufgegeben. Die Elution mittels des Puffers erfolgt bei einer Temperatur von 2O⁰C und mit einer Rate von 15 ml/h. Fraktionen von etwa 6 ml werden gesammelt. Nach der Elution mit 1200 ml wird das Lösungsmittel gegen einer, anderen Puffer ausgetauscht, der wie der erste Puffer zusammengesetzt ist, mit der Ausnahme, daß er zusätzlich 0,06 M-Natriumchlorid enthält.

Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, welche den zentralen Hauptteil des Insulins-Peaks entsprechen, werden gesammelt. Das Insulin wird durch Zusetzen eines Sammelvolumens Wasser, Einstellen des pH-Wertes auf 6,5 und Zusetzen von 0,02 Sammelvolumen 1 M-Zinkacetat präzipitiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert und zweimal mit Wasser gewaschen.

Eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 40 cm wird mit einer Aufschlämmung von Bio-Gel® P-10 (erhältlich von der Firma BIO-RAD Laboratories) mit einem Puffer beladen, der aus 1 M-Essigsäure und 0,1 M-Natriumacetat besteht (pH:

3,7). Die Säule wird mit dem Puffer bei 4°C equilibriert.

Das Zinkpräzipitat aus der ersten Chromatographie

wird durch die Zugabe von 100 μΐ Eisessig aufgelöst (resultierender pH-Wert der Lösung: 3,6) und dann wird die Lösung auf die Säule aufgegeben. Die Elution mittels des Essigsäure/Acetat-Puffers erfolgt bei einer Temperatur von 4° C und mit einer Rate von 15 ml/h. Fraktionen von etwa 2,5 ml werden aufgenommen.
Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Diejenigen Fraktionen, welche dem zentralen Hauptfeil des Insulins-Peaks entsprechen, werden gesammelt. Das Insulin wird durch Zusetzen von 40 ml 5 M-Natriumchlorid pro 10 ml der gesammelten Mengen präzipitiert.

Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert, in 10 ml Wasser aufgelöst und durch Zusetzen von 1 ml 1 M-Zinkacetat erneut präzipitiert

Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert, zweimal mit Wasser gewaschen und in bekannter Weise

so einer Kristallisation aus einem acetonhaltigen Citratpuffer unterworfen.

Das gereinigte Insulin (45 mg) zeigt im wesentlichen eine einzige Komponente bei der Analyse mittels DISC PAGE und Gelfiltration auf einem Bio-Gel® P-30 in 1 M-Essigsäure.

Beispiel 3

20 Gramm Sephadex® G 75, superfein, werden dreimal in 11 1 M-Essigsäure gequollen. Das Gelmaterial wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 50 cm aufgegeben. Die Säule wird 16 Stunden mit 500 ml 1 M-Essigsäure equilibriert 150 mg Schweineinsulin, einmal aus einem Citratpuffer kristallisiert, werden in 3 ml 1 M-Essigsäure aufgelöst und auf die Säule mit einer Flußrate von 6 ml/h aufgegeben. Die Säule wird mit 1 M-Essigsäure mit einer Flußrate von 6 ml/h bei Raumtemperatur eluiert, wobei Fraktionen von etwa 3 ml gesammelt werden.

Die Extinktionen bei 276 nm werden in den Fraktionen gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem zentrakn Hauptteil der Insulinspitze entsprechenden Fraktionen werden gemeinsam gesammelt und lyophilisierL

Das lyophilisierte Material wird durch Zusetzen von Z5 ml 0,1 N-Salzsäure, 6,25 ml Ν,Ν-Dimethylformamid, 02 ml 0,2M Dinatriummethylendiamintetraacetat und 1,15 ml Wasser aufgelöst Der pH-Wert in der Lösung wird auf 7,5 eingestellt ι ο

Die Lösung wird auf eine Säule (Durchmesser: 2,5 cm, Höhe: 25 cm) aufgegeben, die mit DEAE-Sephadex® A-25 beladen und mit einem Puffer I ins Gleichgewicht gebracht ist, welcher aus 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,085 N-Salzsäure, 0,045 M-Natriumchlorid, 60% (v/v) N,N-Dimethylformamid besteht, mit einem pH-Wert von 74. Die Säule wird mit dem Puffer I bei Raumtemperatur unter Anwendung einer Flußrate von

15ml/heluiert

Fraktionen von 6 ml werden gesammelt Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragea Die dem zentraler Hauptteil der Insulimspitze entsprechenden Fraktioner werden gemeinsam gesammelt und deren Volumer bestimmt (56 ml). Die Lösung wird mit einem Volumer (56 ml) Wasser verdünnt Der pH-Wert wird mittels 50 μΐ 4 N-Salzsäure auf 63 eingestellt woraufhin 1,12 ml 1 M-Zinkacetat zugegeben werden. Das gebildete Präzipitat wird durch Zentrifugieren aufgenommen und zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Das gereinigte Insulin wird abschließend lyophilisiert

Das gereinigte Insulin (30 mg) zeigt im wesentlichen eine einzige Komponente bei der Analyse mittels DISC PAGE und Gelfiltration auf einem Bio-Gel® P-30 in 1 M-Essigsäure.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von aus Schweineoder Rinderpankreasdrüsen gewonnenem handelsüblichen oder rohen Insulin, dadurch gekennzeichnet, daß man mit diesem Insulin

A) eine Gelfiltration an einem vernetzten Dextran oder an einem Polyacrylamid in einem wäßrigen Medium in einem pH-Bereich zwischen 2 und 9 in an sich bekannter Weise durchführt und diejenigen Fraktionen, die frei von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 sind, sammelt, hiermit

Bi) Kationenaustauscher oder
B2) Anionenaustauscher
durchführt,

C) die Säule(n) mit

Ci) einem Wasser enthaltenden und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder

C2) einem wäßrigen Medium, das Harnstoff in einer Konzentration von 4 bis 8 mol/l enthält,

bei einem für die Verfahrensweise Bi) auf Werte zwischen 3 und 6,5, für die Verfahrensweise B2) auf Werte zwischen 5,5 und 10 eingestellten pH-Wert eluiert, wobei die Aufeinanderfolge der Verfahrensstufen A/B/C oder B/C/A sein kann,

D) die dem mittleren Hauptteil des Insulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel-Elektrophorese im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden Fraktionen sammelt und

E) das darin enthaltene Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufe Ci) mit einer Mischung aus Wasser und

a) Tetramethylharnstoff,

b) Dimethylformamid,

c) Dioxan,

d) einem mit Wasser mischbaren Keton oder

e) einem mit Wasser mischbaren niederen Alkohol

durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensweise e) mit einer Alkohol-Wasser-Mischung in einer Alkoholkonzentration von 30% bis 80% (v/v) durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei einer Alkoholkonzentration zwischen 50% und 70% (v/v) durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ve; .ahrensstufen B|/C bei einem auf Werte zwischen 4 und 6 eingestellten pH-Wert durchführt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen B₂/C bei einem auf Werte zwischen 6 und 9 eingestellten pH-Wert durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,

dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufe Ci bei einer Temperatur zwischen 0⁰C und 30° C durchführt

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufe C2 bei einer Temperatur unterhalb 5° C durchführt

9. Aus Schweine- oder Rinderpankreasdrüsen gewonnenes Insulin, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Verwendung eines Insulins gemäß Anspruch 9 bei der Bekämpfung von Diabetes.