DE2819297A1

DE2819297A1 - Verfahren zur abtrennung und reinigung von produkten mit interferonaktivitaet, die hierbei erhaltenen produkte und deren verwendung als arzneimittelwirkstoffe

Info

Publication number: DE2819297A1
Application number: DE19782819297
Authority: DE
Inventors: Edward De Maeyer; Geb Guignard Jaqueline Maeyer; Minh-Nguy Thang
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1977-05-02
Filing date: 1978-05-02
Publication date: 1978-11-16
Also published as: JPS53139714A; FR2389380B1; FR2389380A1; GB1601744A; CH633716A5

Description

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BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Produkten mit Interferonaktivität oder einer interferonartigen Wirkung, diese Produkte enthaltende Präparate und deren Verwendung als Arzneimittelwirkstoffe, sowie insbesondere ein Verfahren zur Reinigung solcher Produkte.

Es ist bekannt, daß das Interferon ein Produkt von hohem therapeutischen Wert ist, insbesondere aufgrund seiner bemerkenswerten antiviralen und immunsupressiven Wir-ο kung.

Nach den üblichen in vitro-Syntheseverfahren erhält man dieses Produkt durch Einwirkung von Viren oder chemischen Substanzen auf Gewebekulturen. Die erhaltenen . Präparate enthalten jedoch auch verunreinigende Sub-15' stanzen. Insbesondere enthalten diese Präparate Proteine, die eine pyrogene Wirkung ausüben und zusätzlich den Nachteil besitzen, daß sie eine spezifische Sensibilisierung des behandelten Patienten verursachen können.

Die rohen Interferonpräparate können daher insbesondere für die oben angestrebten Anwendungszwecke nicht direkt verwendet werden und müssen gereinigt werden.

Es sind bereits verschiedene Reinigungsverfahren vorge-" schlagen worden, insbesondere Gelfiltrationsmethoden oder Ionenaustauscherverfahren.

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Die Anwendung dieser Methoden zur Reinigung von Interferonpräparaten führt jedoch zu erheblichen Schwierigkeiten, insbesondere wegen der sehr geringen Ausbeuten.

Es wurden auch Affinitätschromatographieverfahren vorgeschlagen. Man weiß, daß diese letzteren Verfahren auf einer selektiven Affinität zwischen einem gegebenen Produkt und einer adsorbierenden Phase, die einen kovalent an einen festen Träger gebundenen Liganden aufweisen, beruhen. Das Hindurchführen eines das abzutrennende Produkt enthaltenden Präparats durch die adsorbierende Phase ermöglicht die selektive Rückhaltung des fraglichen Produkts durch den Liganden und somit dessen Abtrennung aus dem es enthaltenden Präparat. Zur Rückgewinnung des gebundenen Produkts ist es anschließend erforderlich, ein Desorptionsmittel zu verwenden.

Bei den Methoden, die auf dem Prinzip der Affinitätschromatographie beruhen, verwendet man als Ligand - Antiinterferon-Antikörper. Die bislang erzielten Ergebnisse sind jedoch nicht zufriedenstellend, insbesondere wegen der Tatsache, daß die Herstellung von Antiseren schwierig, langwierig und kostspielig ist und dies in erschwertem Ausmaß, wenn man die Methode auf einen industriellen Maßstab erweitern will.

Es sind ferner Affinitätschromatographieverfahren bekannt, bei denen man einen Liganden einsetzt, der auf die hydrophoben Eigenschaften des Interferons anspricht. Bei diesen Verfahren werden für die Desorption organische Lösungsmittel verwendet.

Wegen der therapeutischen Anwendung des Interferons ist es notwendig, sämtliche Spuren von organischen Lösungs-

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mitteln zu beseitigen und dies derart, daß die Interferonaktivxtät nicht zerstört wird, wenn sie in das wäßrige Medium überführt wird. Diese Verfahrensweisen machen somit äußerst komplizierte Maßnahmen erforderlieh.

Bei anderen Verfahren dieser Art verwendet man als Ligand ein Derivat, das eine polycyclische Struktur der Art des blauen Chromophors, wie er im Handel unter der Bezeichnung Cibacron Blau F3GA erhältlich ist, aufweist. Diese Liganden besitzen den Vorteil, daß sie unter solchen Bedingungen eingesetzt werden können, die das Arbeiten in wäßrigen Medien ermöglichen, was die Nachteile der herkömmlichen Methoden überwindet, insbesondere für den Fall, daß die gereinigten Interferonpräparate therapeutisch eingesetzt werden sollen.

Diese Verfahrensweisen ermöglichen weiterhin die Abtrennung des größten Teils der verunreinigenden Proteine.

Es wurde nunmehr gefunden, daß es möglich ist, diese Ergebnisse noch weiter zu verbessern, indem man zur Abtrennung und Bindung der Produkte mit Interferonaktivität aus sie enthaltenden Präparaten neue Liganden verwendet. Im folgenden und auch in den Ansprüchen ist unter der Bezeichnung "Präparat" eine Zubereitung zu verstehen, die die Produkte mit Interferonaktivxtät oder Interferonwirkung in nicht gebundener Form als auch in gebundener Form und insbesondere in Form eines Komplexes enthalten.

Die Erfindung beruht somit auf der Feststellung, daß Produkte mit Interferonaktivxtät eine bemerkenswerte Affinität für bestimmte Strukturtypen besitzen.

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So ist es möglich, unter Ausnützung dieser besonderen Affinität in extrem spezifischer Weise Produkte mit
Interferonaktivität aus sie enthaltenden Präparaten
oder ähnlichen Zubereitungen abzutrennen und in einfächer Weise zufriedenstellendere Interferonpräparate zu erhalten, als sie bislang gebildet werden konnten, insbesondere hinsichtlich ihres Interferongehalts und ihrer Reinheit.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur
selektiven Abtrennung von Produkten mit Interferonaktivität oder Interferonwirkung aus sie enthaltenden Präparaten unter Beseitigung oder Entfernung von
verunreinigenden Substanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man diese Präparate mit einer Phase in Kontakt bringt, die mindestens eine Verbindung des PoIynucleotidtyps enthält, welche als spezifischer Ligand bezüglich der Produkte mit Interferonaktivität wirkt.

Die bemerkenswerte spezifische Affinität zwischen den Polynucleotiden und den Produkten mit Interferonaktivi-' tat ermöglicht die Abtrennung der letzteren Produkte
mit sehr großer Selektivität aus sie enthaltenden
Präparaten.

Die erhaltenen Ergebnisse sind völlig zufriedenstellend sowohl beim Einsatz von Interferonpräparaten mensch-

liehen oder tierischen Ursprungs und insbesondere bei der Anwendung der überstehende Flüssigkeiten von
Gewebekulturen, von frischen Kulturen (Primär- oder
Sekundärkulturen) oder fortgepflanzten Kulturen, oder wenn man von Zellen ausgeht, die man vorteilhafter-

weise in einem serumfreien Kulturmedium mit einem Virus oder einer synthetischen Nucleinsäure, wie Poly-1. C, zur Produktion von Interferon angeregt hat.

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Die eingesetzten Interferonpräparate können andererseits auch aus Fibroblasten oder Leucocyten stammen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man auch jene Präparate einsetzen, die man durch Weiterzüchten in acellularem Medium insbesondere nach den Methoden erhalten hat, die in "Molecular Mechanismn of Prot.Biol.Synthesis", herausgegeben von H.Weissbach und S.Pestka (Acad.Press (1977), 574 bis 582).

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Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bringt man das Produkte mit Interferonaktivität enthaltende, zu reinigende Präparat mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt, das mit einem Puffer äquilibriei^t oder ins Gleichgewicht gebracht worden ist, dessen SaIzkonzentration, bezogen auf diejenige des Blutes, isomolar oder vorzugsweise hypomolar ist, wobei das Adsorptionsmittel einerseits einen festen, gelbildenden Träger, dessen Porenweite so groß ist, daß Makromoleküle hindurchdringen können, und andererseits eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthält, welche an den Träger gebunden ist und gegenüber den selektiv abzutrennenden Produkten als Ligand wirkt, wobei die eingesetzte Menge des Adsorptionsmittels und die Dauer des Kontakts zwischen dem Liganden und dem zu reinigenden Präparat dazu ausreichen, die gewünschte Bindung oder Fixierung der Produkte mit Interferonaktivität zu ermöglichen.

Zur Bildung von gereinigten Präparaten mit Interferonaktivität führt man eine zusätzliche Stufe durch, nach der man die Desorption der gebundenen Produkte mit Hilfe eines Puffers bewirkt, dessen Salzkonzentration, in Bezug auf diejenige des Blutes, hypermolar ist.

In dieser Weise erhält man extrem reine Produkte mit Interferonaktivität, die einen hohen Interferongehalt aufweisen und direkt für therapeutische Zwecke eingesetzt werden können.

Es ist darauf hinzuweisen, daß das Interferon ohne weiteres und praktisch quantitativ ohne denaturiert zu . werden wieder aus dem Kupplungsprodukt, das es mit den Liganden eingegangen ist, zurückgewonnen werden kann. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist darin zu sehen, daß die Adsorptionskapazität des verwendeten

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Adsorptionsmittels praktisch nicht beeinträchtigt wird. Somit kann das gleiche Adsorptionsmittel für eine Vielzahl von Reinigungsmaßnahmen angewandt werden, was erhebliche wirtschaftliche Vorteile mit sich bringt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bringt man eine Zubereitung, die einen die an einen Liganden gebundenen Produkte mit Interferonaktivität enthaltenden Komplex enthält, mit einer Phase in Kontakt, die mindestens eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthält, welche bezüglich der Bindung der Produkte mit Interferonaktivität mit dem Liganden in kompetitive Wechselwirkung treten und die Produkte mit Interferonaktivität freisetzen kann, wobei die Zubereitung und die Phase mit einem Puffer äquilibriert worden sind, dessen Salzkonzentration, in Bezug auf diejenige des Blutes, isomolar oder hypomolar ist, und wobei die Menge der Polynucleotide in der genannten Phase und die Dauer des Kontakts zwischen den PoIynucleotiden und den an den Liganden gebundenen Produk" ten mit Interferonaktivität dazu ausreichen, die Desorption der Produkte mit Interferonaktivität zu bewirken.

Es ist festzuhalten, daß bei dieser Ausführungsform die Produkte mit Interferonaktivität an einen Liganden gebunden sind, für den sie eine geringere Affinität zeigen als für die Polynucleotide. Wegen der starken Affinität des Interferons für die Polynucleotide erfolgt die kompetitive Bindung des Interferons zugunsten der Polynucleotide.

Es ist weiterhin festzustellen, daß hierdurch eine zusätzliche Reinigung der Produkte mit Interferonaktivität bewirkt wird. In der Tat werden die verunreinigenden

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Substanzen, insbesondere die Proteine, die in den rohen Interferonpräparaten enthalten sind und die dazu neigen, zusammen mit dem Interferon an das eingesetzte Adsorptionsmittel gebunden zu werden, praktisch nicht durch die Polynucleotide abgelöst. Somit stellt diese Ausführungsform der Erfindung ein sehr selektives Reinigungsverfahren dar.

Weiterhin ermöglicht dieses Verfahren den Vorteil, daß es dem Interferon einen erheblichen Schutz gegen die thermische Denaturierung und damit eine große Stabilität verleiht.

Gemäß einer bevorzugten Durchführungsweise der genannten ersten Ausführungsform der Erfindung trennt man die Produkte mit Interferonaktivität aus sie enthaltenden rohen Präparaten dadurch ab, daß man diese Präparate mit einer adsorbierenden Phase in Kontakt bringt, die mindestens ein Derivat des Polynucleotidtyps an einen festen Träger gebunden umfaßt.

Das Derivat des Polynucleotidtyps ist ein Polyribonucleotid oder ein Polydesoxyribonucleotid, bei dem einer oder mehrere der es bildenden Bausteine gegebenenfalls modifiziert sein kann, ohne daß diese Modifizierung das spezifische Verhalten gegenüber dem Interferon beeinträchtigt.

Mit Vorteil verwendet man Polynucleotide, die etwa 10 bis 500 Nucleotideinheiten aufweisen. Diese Derivate, die aufgrund ihrer Konfiguration und ihrer Konstitution dazu geeignet sind, Produkte mit Interferonaktivität : zu binden, können sowohl synthetischen als auch natürliehen Ursprungs sein.

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Als Derivate des ersteren Polynucleotidtyps sind Produkte, wie Polyriboinosinsäure (nachstehend auch Poly I genannt), Polyriboadenosxnsäure oder Polyriboadenylsäure (Poly A) und Polyribourxdylsäure (Poly U) besonders geeignet. Im allgemeinen verwendet man Produkte mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 bis etwa 250 000.

Als Polynucleotide natürlichen Ursprungs, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, verwendet man mit Vorteil Zellribonucleinsäuren und insbesondere Transfer-Ribonucleinsäuren (nachstehend auch als t-RNA bezeichnet.

Man kann auch die Gesamtheit der t-RNA-Fraktionen einsetzen, die man aus Zellen extrahiert hat, oder einen Teil dieser Fraktionen oder auch Fraktionen, die spezifisch bezüglich der Synthese einer gegebenen Aminosäure sind.

Es ist bekannt, daß diese t-RNA etwa 70 bis 85 Nucleorideinheiten aufweisen und ein Molekulargewicht von etwa 25 000 besitzen.

Man kann verschiedene Quellen für t-RNA verwenden, insbesondere Eukaryoten oder Prokaryoten und kann auf Bakterien, wie die des Genus E.CoIi oder Hefen, wie die der Gruppe der Bierhefen zugehörenden, zurückgreifen.

Als festen, gelbildenden Träger des Adsorptionsmittels verwendet man ein Polysaccharid, wie Agarose, oder ein Derivat davon, insbesondere eine modifizierte Agarose, deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Gitter vernetzt sind, insbesondere verwendet man das Produkt, das im Handel unter der Bezeichnung "Sepharose" erhältlich ist, oder man verwendet ein Polyacrylamid

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oder ein Acrylharz.

Aus noch nicht erklärbaren physiologischen Gründen hat es sich gezeigt, daß die Produkte mit Interferonaktivität eine sehr starke Affinität für die genannten PoIynucleotide besitzen. Diese Eigenschaft kann daher in der Praxis zur Reinigung des Interferons ausgenützt werden.

Durch einfachen Kontakt bei Anwendung der oben angesprochenen Bedingungen der Isomolarität oder der Hypomolarität, die man vorteilhafterweise mit Hilfe eines Puffers mit einer Molarität von etwa 0,01 bis 0,05 m erreicht, werden die Produkte selektiv adsorbiert, während die Mehrzahl der in den Präparaten enthaltenen unerwünschten Substanzen nicht zurückgehalten wird.

Besonders bequem bewirkt·man den Kontakt des Adsorptionsmittels mit dem zu reinigenden Präparat in einer Chromatographiesäule, durch die man das zu reinigende Präparat führt. Die mit dem Adsorptionsmittel gefüllte Säule wird mit dem genannten Puffer äquilibriert, dessen pH-Wert im Bereich von 3 bis 9 und vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunktes liegt.

Man'verwendet rohe Interferonpräparate, deren Interferongehalt etwa 10 bis 10 internationale Einheiten pro 0,1 bis 0,2 g Proteine beträgt, was einer spezifischen Aktivität (internationale Interferoneinheiten oder

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IFE pro Milligramm Protein) zwischen 10 und 10 entspricht. Diese Präparate können so wie sie sind, unter isomolaren Bedingungen, durch die Säule geführt werden oder zuvor einer Dialyse gegen den für das Äquilibrieren der Säule verwendeten Puffer unterworfen werden. Bei der Behandlung eines Gewebekulturmediums unter den Bedingungen der Isomolarität beträgt die

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Interferonausbeute etwa 80 bis 90%, während man bei Bedingungen der Hypomolarität eine Ausbeute von 100% erreicht. Im letzteren Fall verwendet man als Puffer vorzugsweise einen Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 und einer Konzentration von 10 mMol/1 (wobei die Abkürzung "Tris" für Tris(hydroxymethylaminomethan) steht).

Die Stufe der Abtrennung der Produkte mit Interferonaktivität aus den sie enthaltenden Präparaten liegt somit ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die Komplexe, die aus den Produkten mit Interferonaktivität gebildet sind, die an die oben beschriebenen adsorbierenden Phasen gebunden sind, die mindestens ein Derivat des

Polynucleotidtyps enthalten. Wie bereits erwähnt, können diese Interferone unterschiedlichsten Ursprungs sein.

Solche Komplexe ergeben sich durch die Wechselwirkung zwischen den Produkten mit Interferonaktivität und den Polynucleotide^ Die Art der Wechselwirkung ist bislang nicht geklärt. Die bislang durchgeführten Arbeiten las- sen jedoch erkennen, daß es sich um nicht-kovalente Bindungen handelt und daß Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoff brückenbindungen, hydrophobe Bindungen, schwache ionische Bindungskräfte etc. vorliegen können.

Die gebundenen oder fixierten Produkte können dadurch gewonnen werden, daß man die Salzkonzentration des Puffers - insbesondere durch Zugabe von Acetaten, Phosphaten, Chloriden oder anderen Salzen - derart erhöht, daß man eine Salzkonzentration erreicht, die in Bezug auf diejenige des Blutes hypermolar ist und mindestens 0,5 Mol pro Liter und vorzugsweise 1 Mol pro Liter beträgt.

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Diese Gewinnung der Produkte mit Interferonaktivität wird vorteilhafterweise durch Elution in der Säule bewirkt. Durch Auffangen der eluierten- Fraktionen erhält man gereinigte Interferonpräparate mit erhöhtem Interferongehalt, die praktisch vollständig frei sind von verunreinigenden Proteinen.

Wenn man andererseits die Phase der Desorption mit einem Durchsatz von nicht mehr als 0,2 ml/cm²/min bewirkt, gewinnt man die Hauptmenge der Produkte mit Interferonaktivität in einer einzigen Eluatfraktion geringen Volumens, insbesondere dann, wenn die Phase der Adsorption unter hypomolaren Bedingungen durchgeführt worden ist, was den weiteren Vorteil mit sich bringt, daß man Präparate erhält, die eine erhöhte Interferonkonzentration im Vergleich zu den eingesetzten Rohpräparaten besitzen.

Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man somit mit praktisch quantitativer Ausbeute in einer einzigen Stufe Interferonpräparate mit sehr hoher Reinheit.

Es ist weiterhin festzuhalten, daß diese Präparate in äußerst vorteilhafter Weise in wäßriger Lösung vorliegen und somit so wie sie sind bei therapeutischen Anwendungszwecken eingesetzt werden können. So erhält man beispielsweise bezüglich des Interferons der Maus, auf die das Verfahren zum ersten Mal angewandt worden ist, Präparate, die 10 Einheiten pro Milligramm Protein enthalten können.

Wie weiter oben angegeben ist, ist es aufgrund der von der Anmelderin festgestellten bemerkenswerten Affinität zwischen den Produkten mit Interferonaktivität und den Polyribonucleotiden möglich, diese letzteren von Korn-

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plexen oder Zubereitungen, in denen sie gebunden enthalten sind, abzutrennen und einen neuen Komplex aus einem Polynucleotid und den Produkten mit Interferonaktivität zu bilden.

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Gemäß einer bevorzugten Durchführungsweise dieser Ausführungsform der Erfindung bringt man einerseits eine Zubereitung, die die an ein Adsorptionsmittel gebundenen Produkte mit Interferonaktivität enthält, und andererseits eine Phase, die mindestens ein Derivat des Polynucleotidtyps enthält, in Kontakt.

Das verwendete Adsorptionsmittel umfaßt einen festen, gelbildenden Träger, dessen Porengröße derart ist, daß das Hindurchdringen von Makromolekülen möglich ist, und andererseits eine an den Träger gebundene Verbindung, die bezüglich der abzutrennenden Produkte einen selektiven Liganden darstellt, der eine polycyclische Struktur aufweist, wie diejenige des blauen Chromophors, der im Handel unter der Bezeichnung Cibacron Blau F3GA der folgenden Formel

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SO₂ONa

SOpONa

erhältlich ist, oder der in Form eines äquivalenten Produkts vorliegt, dessen Konfiguration dazu geeignet ist, das Interferon in selektiver Weise zurückzuhalten.

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Als festen Träger dieser Art verwendet man mit Vorteil einen ein Gel bildenden Träger, wie denjenigen, den man zur Bildung des Kupplungsprodukts mit dem Polynucleotid gemäß der oben beschriebenen ersten Ausführungsform der Erfindung verwendet.

Der an den festen Träger gebundene Ligand ist vorteilhafterweise die Verbindung Cibacron Blau F3GA als solche oder das im Handel unter der Bezeichnung Cibracon Blau 3 GA erhältliche Produkt (das sich im wesentlichen von der zuvor genannten Verbindung durch die Anwesenheit eines Wasserstoffatoms anstelle der Gruppe der Formel -SO₂ONa an dem Phenylkern am Ende der Kette unterscheidet) oder ein äquivalentes Produkt. Unter einem "äquivalenten Produkt", wie es in der Beschreibung und in den Ansprüchen angesprochen wird, ist dabei ein Produkt zu verstehen, das die gewünschte selektive Bindung des Interferons ermöglicht, selbst wenn es sich durch die Art und/oder Stellung der Substituenten von den oben angegebenen blauen Chromophoren unterscheidet.

Die als Ligand verwendete cyclische Verbindung kann ohne Nachteile an ein Polysaccharid, insbesondere an ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, im Bereich von 2 Millionen, das im Handel unter der Bezeichnung "Dextran 2000" erhältlich ist, gebunden sein. In diesem Fall ist das Polysaccharid an den festen Träger gebunden.

Eine bevorzugte Verbindung dieser Art, das heißt eine Verbindung, die aus einer an Dextran 2000 gebundenen cyclischen Verbindung besteht, ist das im Handel unter der Bezeichnung "Dextran Blau 2000" (Bleu Dextran 2000). erhältliche Produkt, das dem an Dextran 2000 gebundenen Cibacron Blau F3GA entspricht. Das Produkt ist vorteilhafterweise über Dextran 2000 an einen festen Träger, wie Agarose, insbesondere Sepharose, gebunden, was einem

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Produkt entspricht, das im Handel unter der Bezeichnung Dextran-Sepharose-Blau (Bleu Dextran Sepharose) entspricht.

Das die an den festen Träger gebundenen Produkte mit Interferonaktivität umfassende Adsorptionsmittel wird mit einem Puffer äquilibriert, dessen Salzkonzentration in Bezug auf diejenige des Blutes isomolar oder vorzugsweise hypomolar ist. Man stellt diese Bedingungen mit Vorteil mit Hilfe eines Puffers einer Molarität von weniger als 50 mMol/1 und insbesondere mit dem Tris-Puffer ein, der in der Phase der Adsorption der Produkte mit Interferonaktivität an eine Polynucleotide der oben beschriebenen Art enthaltenden Phase verwendet wird.

Die Phase, die mindestens ein Derivat des Polynucleotidtyps enthält, umfaßt diese Polynucleotide als Lösung in einem Puffer, dessen Salzkonzentration in Bezug auf diejenige des Blutes mit Vorteil hypomolar ist.

Als Polynucleotide verwendet man vorzugsweise die weiter oben angesprochenen. So stellen Polyribonucleotide, die etwa 10 bis 500 Nucleotideinheiten aufweisen, bemerkenswerte Desorptionsmittel dar. Als geeignete Polyribonucleotide kann man Polyriboguanylsäure (Poly G), Poly I und Poly U nennen.

Man kann auch Ribonucleinsäuren, insbesondere t-RNA, verwenden. Diese letzteren können aus Bakterien, wie Bakterien des Genus E.CoIi extrahiert werden. Man kann sie auch aus Hefen, wie Bierhefe, gewinnen. Schließlich kann man auf Ribonucleinsäuren tierischen oder menschlichen Ursprungs zurückgreifen und insbesondere auf aus tierischen Organen gewonnene.

Von den letzteren sind diejenigen besonders bevorzugt,

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die aus den Zellen extrahiert worden sind, die ihrerseits das zu reinigende Interferon produzieren. So verwendet man zur Reinigung von Präparaten, die Produkte mit Mäuseinterferonaktivität enthalten, mit'Vorteil Mäusezellen der Gewebezellkultur (lignee cellulaire) C 243.

Vorzugsweise löst man die als Desorptionsmittel verwendeten Polynucleotide in einer Menge von 10 bis 100 μg/ml und vorzugsweise in einer Menge von 30 bis 50 μg/ml in einem Puffer. Ein hierfür geeigneter Puffer ist der 0,01m (10 itiMol/1) Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5.

Aus praktischen Gründen ist es von Vorteil, die die Produkte mit Interferonaktivität enthaltenden Komplexe mit den Polynucleotiden im Rahmen einer Desorptionsbehandlung in einer Säule für die Affinitätschromatographie in Kontakt zu bringen. Diese Maßnahme besteht somit darin, die an das die Säule ausfüllende Adsorptionsmittel gebundenen Produkte mit Interferonaktivität mit Hilfe der Polynucleotide abzulösen und zurückzugewinnen.

'Zu diesem Zweck leitet man eine Polynucleotidlosung, die 10 bis 100 μg und vorzugsweise 30 bis 50 μg/ml eines Elutionspuffers, nämlich eines 0,01m Tris-HCl-Puf fers (10 rtiMol/1 (mit einem pH-Wert von 7,5)), durch eine Säule, die als adsorbierendes Gel Dextran-Sepharose-Blau (Bleu Dextran Sepharose) enthält, an das die Produkte mit Interferonaktivität gebunden sind. Das Hindurchführen dieser Lösung erfolgt vorteilhafterweise mit einem Durchsatz von 0,2 ml/cm²/ min.

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Zur Erleichterung der Desorption in einem geringen Eluatvolumen, insbesondere in dem Fall, bei dem die Affinität zwischen den Polynucleotiden und den Produkten mit Interferonaktivität nicht sehr stark ist, beläßt man die Lösung der Polynucleotide mit Vorteil während einiger Zeit mit dem adsorbierenden Gel in Kontakt, bevor man die Elution bewirkt. Im allgemeinen hat sich eine Kontaktzeit von einer halben bis zu etwa 18 Stunden als ausreichend erwiesen.

Die Erfahrung hat gezeigt, daß die Phase der Desorption vorzugsweise unter Anwendung eines Elutionsvolumens durchgeführt wird, das etwa dem Zwei- bis Vierfachen des Gesamtvolumens des adsorbierenden Gels entspricht.

Wegen der bemerkenswerten Spezifität dieses Verfahrens erhält man Produkte mit Interferonaktivität sehr hoher Reinheit

Dabei wird das Interferon an die Polynucleotide gebunden, so daß die Erfindung auch die gebildeten Kupplungsprodukte betrifft.

Wie weiter oben bereits ausgeführt, stellen die Polynucleotide in vorteilhafter Weise einen Schutz der Produkte mit Interferonaktivität gegen die thermische Denaturierung sicher. So kann man feststellen daß dann, wenn man ein erfindungsgemäßes Kupplungsprodukt auf etwa 60°C erhitzt, ein erheblicher Anteil insbesondere der antiviralenAktivität beibehalten wird, während 95% dieser Aktivität bei den Kontrollpräparaten verloren geht.

Die gereinigten Präparate der Produkte mit Interferonaktivität, die die Produkte mit Interferonaktivität enthalten, die man durch Desorption aus den Komplexen, die

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sie mit den an einen festen Träger gebundenen PoIynucleotiden bilden, erhält, sowie die Komplexe,, die sie gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit den genannten Polynucleotiden bilden, besitzen bemerkenswerte pharmazeutische Eigenschaften, zu denen sich der Vorteil einer äußerst interessanten antiviralen Wirkung hinzugesellt. Diese Wirkung wurde insbesondere bei Patienten ermittelt, die an chronischer Hepatitis B leiden, wozu die von Desmyter et al(in The Lancet, II (1976) 645 bis 647) und Greenberg et aH New England, in J.Med. (1976) 295 - 517 - 522Jbeschriebenen Verfahrensweisen angewandt wurden.

Diese Interferonpräparate sind ebenfalls zur Heilung von dendritischer Keratitis geeignet, wie es die Untersuchungen zeigen, die nach den von Sundmacher et alfin Albrecht v. Graefes Arch'.Klin.exp.Ophtal.2O1 (1976) 39 bis 45} beschriebenen Methoden durchgeführt wurden.

Diese Präparate haben sich ferner als wirksam zur vorbeugenden Behandlung von Rückfällen bei herpetischer Keratitis erwiesen, wie es die Untersuchungen von Kaufman et al gezeigt haben (J. Infect. Dis. 133 (suppt) A (1976) 165 bis 168). Weiterhin können die Interferon-Präparate eine günstige Wirkung auf Patienten mit Krebs geschwüren ausüben. Einerseits vermindern diese Präparage die Häufigkeit und die Dauer von Virusinfektionen, die insbesondere durch Herpes Zoster verursacht werden, wie aus den Versuchen von Jordan et al hervorgeht (J. Infect. Dis. 130 (1974) 56 bis 62). Andererseits scheinen sie aufgrund ihrer Antitumorwirkung das überleben der an-einem Osteosarkom leidenden Patienten zu begünstigen. Diese Wirkungen können mit der Methode von Strander et al nachgewiesen werden (Acta Orthop. Scand. 45 (1974) 958 bis 959).

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Sämtliche Untersuchungen haben die bemerkenswerte Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Präparate mit Interferonaktivität erkennen lassen,

Wie eine Reihe von Arbeiten gezeigt hat, verursacht das Interferon weiterhin keine sichtbaren Toxizitätsphänomene. Hierzu kann auf die Ergebnisse von J. Desmyter et al (The Lancet (25. September 1976) 645 bis 647) und auf die in diesem Aufsatz angegebenen Literaturstellen verwiesen sein, die sic-h mit der Ab-Wesenheit der Toxizität dieser Produkte befassen, das heißt der Artikel von H.Strander et al (Nat.Cancer Inst. 51 (1973) 733), der Artikel von G.W.Jordan et al (Infect.Dis. 130 (1974) 56) und der Artikel von G.Emödi et al (Nat.Cancer Inst. 54 (1975) 1045).

Da das Interferon artspezifisch wirkt, muß man beispielsweise zur Anwendung in der Humanmedizin ein Interferon einsetzen, das aus menschlichen Zellen gewonnen worden ist.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel, die als Wirkstoffe die erfindungsgemäß gereinigten Präparate enthalten, können insbesondere in Form von Lösungen auf intra-'muskulärem und subkutanem Wege an den Menschen verabreicht werden. Beispielsweise kann man zur Behandlung von chronischer Hepatitis während 2 Wochen alle 2 Tage eine Fibroplastinterferondosis von 10 Einheiten verabreichen, während man zur Behandlung des Osteosarkoms dreimal wöchentl
ten verabreicht.

-eine Fibroplastinterferondosis von 10 Einheiten ver-

: I
dreimal wöchentlich 3 χ 10 Leucocyteninterferoneinhei-

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

Bereitung einer Polynucleotide enthaltenden Säule für die Affinitätschromatographie zur Abtrennung von Produk- . ten mit Interferonaktivität aus sie enthaltenden Präparaten.

Man bildet zunächst ein aktiviertes Sepharose-Gel, das als fester Träger für die Polynucleotide dient, wonach man in einer zweiten Stufe die Polynucleotide an die aktivierte Sepharose bindet, wozu man eine Methode anwendet, die von der von D.L.Robberson und N.Davidson (Biochem. II, 4 (1973) 533) beschriebenen abgeleitet ist.

a) Herstellung des aktivierten Sepharosegels

Man verwendet eine Agarose des Typs Sepharose 4B, wie sie von der Firma Pharmacia (Uppsala, Schweden) vertrieben wird. Dieses Produkt liegt in Form von Kügelchen vor. Die Kügelchen werden durch Filtration über einer Glasfritte mit Wasser gewaschen und dann in einer Menge von 5 ml der als Ausgangsmaterial eingesetzten Sepharose pro 10ml Wasser in Wasser suspendiert.

Anschließend aktiviert man die Sepharose mit Bromcyan (BrCN). Zu jeweils 10 ml der Sepharosesuspension, die man durch langsames Rühren mit einem Magnetrührer in Suspension hält, gibt man nach und nach 15 ml einer 6,5 bis 7%igen wäßrigen Bromcyanlösung.

Man hält die Temperatur der Suspension mit Hilfe eines Eisbades bei 4⁰C und stellt den mit Hilfe eines pH-Meßgerätes überwachten pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid, auf einen Wert von 10 ein. Nachdem der pH-Wert stabilisiert und eine Temperatur von etwa 20⁰C erreicht sind, filtriert man die in dieser Weise aktivierte Sepharose mit Hilfe einer Glasfritte ab und wäscht sie

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mit einem O,1m Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9, den man zuvor abgekühlt hat, wobei man ein Puffervolumen verwendet, das dem 10fachen des Volumens des Sepharosegels entspricht. Anschließend suspendiert man das Gel in dem gleichen Bicarbonatpuffer, wobei man 8,5 ml des Puffers pro 10 ml der Suspension einsetzt. Das in dieser Weise aktivierte Sepharosegel wird dann mit dem £-Amino-carponsäuremethylester gekuppelt. Man behandelt jede Fraktion von 8,5 ml mit 10 ml einer 30%igen Lösung des Esters in dem Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9. Man stellt den pH-Wert der Mischung mit Hilfe von Natriumhydroxid auf 9 ein und rührt die Mischung während 24 Stunden mit langsamer Geschwindigkeit bei 4⁰C.

Das Sepharosegel wird anschließend mit 10 Volumen eisgekühlten Wassers gewaschen und erneut mit Wasser bis zu dem ursprünglichen Volumen suspendiert. Dann gibt man 0,7 ml einer 98%igen Hydrazinhydratlösung zu, erhitzt die Mischung anschließend während 15 Minuten auf 70⁰C und kühlt sie dann ab. Das Gel wird erneut abfiltriert, gut mit eisgekühltem Wasser gewaschen und anschließend erneut bis zum Anfangsvolumen mit Wasser suspendiert.

Zur Blockierung der Carboxylgruppen der Sepharose gibt man 9 g Glycinamid-hydrochlorid pro 100 ml der Suspension des Sepharose-hydrazids zu. Man stellt den pH-Wert auf 4,75 ein und gibt dann (pro 1OO ml der Suspension) 1,12 g Carbodiimid zu der Mischung. Man läßt die Mischung während 2 Stunden stehen, wobei man den pH-Wert durch Zugabe von 1n Chlorwasserstoffsäure auf 4,75 einstellt.

Nach dem Waschen mit eisgekühltem Wasser durch Filtrieren suspendiert man das Sepharosegel in dem doppelten Volumen

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einer 5 χ 10 m-Lösung von Äthyl

(EDTA) mit einem pH-Wert von 7.

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einer 5 χ 10 m-Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure

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Die in dieser Weise aktivierte Sepharose kann bei 4⁰C aufbewahrt werden.

b) Bindung der Sepharose an den Polynucleotiden

Es bestehen verschiedene Methoden zur Bildung eines Komplexes aus Polynucleotiden und der aktivierten Agarose, wie der oben erhaltenen Sepharose, die man zur Bildung der gewünschten Bindung, insbesondere am Ende der Phosphatgruppe in der 3'-Stellung des Zuckerrests der Polynucleotide oder am Ende der Phosphatgruppe in der 5'-Stellung, anwenden kann.

Zur Bindung der aktivierten Sepharose am Ende der Phosphatgruppe in der 3'-Stellung des Zuckerrests der Polynucleotide, wie von Poly I, Poly U oder t-RNA, wendet man mit Vorteil eine' Methode an, die auf der von D.L.Robberson und N.Davidson in dem oben angegebenen Artikel beschriebenen Methode beruht. Diese Methode umfaßt die Behandlung der Polynucleotide mit einer alkalischen Phosphatase, dann eine Oxidationsstufe der Polynucleotide und schließlich deren Kupplung mit dem aktivierten Sepharosegel.

t".) Behandlung mit einer alkalischen Phosphatase

Vor der Bindung der Polynucleotide werden diese einer Oxidationsbehandlung mit Natriumperjodat unterworfen. Zur Steigerung der Ausbeute der Reaktion werden die Polynucleotide zuvor systematisch mit der alkalischen Phosphatase behandelt, um sämtliche Phosphatgruppen am Ende der 3'-Gruppe des Zuckerrests der Polynucleotide zu entfernen.

2.) Oxidation der Polynucleotide Die Oxidation mit Perjodat erfolgt nach der Methode

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3ο

von Hunt (Biochem.J. 95 (1965) "542).

Die Polynucleotide, die mit einer Konzentration von 1 bis 2 mg/ml in einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,2 vorliegen, werden durch Zugabe eines Zehntels des Volumens einer frisch bereiteten 0,2m Natriumperjodatlösung oxidiert. Die Reaktion wird unter Lichtausschluß während 45 Minuten durchgeführt. Das überschüssige Perjodat wird durch Zugabe eines einem Zehntel des Volumens entsprechenden Volumen Äthylenglykol beseitigt. Man gewinnt die in dieser Weise oxidierten Polynucleotide durch Ausfällen mit Äthanol, wonach man sie in einem 0,1m Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 löst und in Form dieser Lösung einer Dialyse gegen den gleichen 0,1m Acetatpuffer unterzieht, wodurch es möglich wird, den zuvor gebildeten Formaldehyd zu entfernen.

3.) Kupplung der Polynucleotide an das aktivierte ' Sepharosegel

Man gibt etwa 50 bis 60 A 260-Einheiten der Polynucleotide zu jedem Milliliter des aktivierten Sepharosegels, das in der oben beschriebenen Weise mit Hydrazin blockiert worden ist (wobei das Volumen durch Abscheidung gemessen wird). Diese Mischung suspendiert man in 5 bis 6 ml und rührt sie während 12 bis 15 Stunden langsam bei 4⁰C. Die nicht gebundenen Polynucleotide werden durch wiederholtes Waschen mit einem 0,1m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,2 und dann mit einem 0,1m Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9 entfernt.

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Das die Polynucleotidketten tragende Sepharosegel wird dann erneut in dem gewünschten Puffer suspendiert. Zur Bildung eines Komplexes aus dem aktivierten Sepharosegel und Polynucleotide^ wie Poly A und Poly C, arbeitet man mit Vorteil in einem Puffer mit einem pH-Wert von 6 nach der Verfahrensweise von Wagner et al (BBRC, 45 (1971) 184).
Zu einer Lösung der Polynucleotide (mit einer Konzentration von 2 bis 4 ml/ml in einer 0,2m 4-Morpholino-äthansulfonsäurelösung mit einem pH-Wert von 6,0) gibt man eine Suspension des in der oben beschriebenen Weise aktivierten Sepharosegels in einem Verhältnis von 1:3 (Volumen/Volumen). Man rührt die Mischung langsam während 12 bis 15 Stunden bei 4⁰C. Die nicht mit Sepharose umgesetzten Polynucleotide werden durch Filtration und dann durch wiederholtes Waschen mit dem 4-Morpholino-äthansulfonsäurepuffer und dann mit Wasser entfernt.

In diesem Fall nimmt man an, daß die Polynucleotide über die Phosphatgruppe gebunden sind, die sich am Ende der Gruppe in 5'-Stellung des Zuckerrests der Polynucleotide befindet.

Zur Bindung von Poly U an aktivierte Sepharose arbeitet man in der oben beschriebenen Weise in einem Puffer mit einem neutralen pH-Wert, wie Tris-Puffer, der in einer Konzentration von 10 bis 20 mMol/1 eingesetzt wird.

c) Bereitung der Affinitätschromatographiesäule

Man gießt das Polynucleotid-Sepharose-Gel in eine Chromatographiesäule geeigneter Abmessungen. Man nimmt an, daß 1 ml des Gels etwa 8 Millionen inter-

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AlIVAR

nationale Interferoneinheiten binden kann.

Vor der ersten Anwendung der Säule spült man diese mit 20 Säulenvolumen eines 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, den man mit 0,02% Natriumazid versetzt hat. Da das Azid für Zellen toxisch ist, muß man mindestens 3 Säulenvolumen des kein Azid enthaltenden Tris-HCl-Puffers durch die Säule führen, bevor man die Bindung des Interferons bewirkt.

Beispiel 2

Reinigung eines Mäuseinterferonpräparats durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der nach Beispiel 1 bereiteten Poly U-Sepharose-Säule.

Das rohe Interferonpräparat besteht aus der überstehenden Flüssigkeit einer Gewebekultur, die von C 243-Zellen abgeleitet ist, die mit Hilfe des Virus der Newcastle-Krankheit dazu gebracht worden sind, ^Interferon zu produzieren. Nach der Inaktivierung des Virus bei einem pH-Wert von 2 dialysiert man die überstehende Flüssigkeit während etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4⁰C gegen den 0,01m Tris-HCl-Puffer ■mit einem pH-Wert von 7,5.

Der Interferontiter des rohen Präparats beträgt 1,3 χ 10 internationale Einheiten, sein Proteingehalt beträgt 0,1 mg/ml und seine spezifische Aktivität ergibt sich zu 1,3 χ 10 Interferoneinheiten pro Milligramm Protein.

Das Chromatogramm der Reinigungsbehandlung ist in der Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt.

Man leitet 10 ml des zu reinigenden Präparats in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm, die 2 ml des

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Poly U-Sepharose 4B-GeIs (ein Produkt, das von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden im Handel vertrieben wird) enthält.

Während der Sorptionsphase sowie der sich daran anschließenden Phasen des Waschens und der Desorption fängt man Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml auf.

Nach dem Eindringen des Interferonpräparats in das Gel (Fraktionen 1 bis 4 des Chromatogramms) wäscht man die Säule mit 6 ml 0,01m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, um die nicht adsorbierten verunreinigenden Substanzen (Fraktionen 5 bis 7) zu entfernen.

Zur Gewinnung des Interferons bewirkt man die Desorption, indem man 10 ml des 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, der mit 1 Mol/l. Natriumchlorid versetzt worden ist, durch die Säule führt (Fraktionen 8 bis 13 des in der Fig. 1 dargestellten Chromatogramms).

Man bestimmt dabei jeweils den Interferontiter jeder Fraktion, die man während der Phasen der Sorption, des Waschens und der Desorption aufgefangen hat. Man stellt dabei fest, daß das in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten rohen Präparat enthaltene Interferon quantitativ gewonnen wird und praktisch vollständig in zwei bei der Desorption erhaltenen Fraktionen, das heißt in Fraktionen 8 und 9 (was einem Volumen von 4 ml entspricht) enthalten ist.

Der Interferontiter (IFE/ml) dieser Fraktionen ist der folgende:

Fraktion 8 = 2,5 χ 10
Fraktion 9 = 5 χ 10⁶.

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Die Rückgewinnung des Interferons ist somit vollständig.

Der Proteingehalt der Fraktion 9 liegt unterhalb 2,5 μg/ml, so daß ihre spezifische Aktivität oberhalb

2 χ 10 liegt, was einer Reinigung um einen Faktor von mehr als 150 entspricht.

Beispiel 3

Reinigung eines Humaninterferonpräparats durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der in Beispiel 1 bereiteten Poly I-Sepharose-Säule.

Als rohes Interferonpräparat verwendet man die überstehende Flüssigkeit einer Humanfibroblastkultur, die durch Poly I-Poly C zur Bildung von Interferon induziert worden ist.

Der Interferontiter beträgt 4096 internationale Interferoneinheiten pro Milliliter. Das Material weist einen Proteingehalt von 660 μg/ml auf, was einer spezifischen Aktivität von 6,2 χ 10 internationalen Intei feroneinheiten pro Milligramm Protein entspricht.

Man führt 5 ml (20480 internationale Einheiten) des zuvor nicht dialysierten Präparats mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min durch die Säule mit einem Durchmesser von 0,9 cm, die 2 ml des gemäß Beispiel 1 bereiteten Sepharose-Poly I-Gels enthält, das mit dem 0,01 Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 äquilibriert worden ist.

Nachdem das Präparat in das Gel eingedrungen ist, wäscht man dieses nach der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise.

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Anschließend bewirkt man die Desorption des Interferons, indem man 10 ml des 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, der mit 1 Mol/l Natriumchlorid angereichert worden ist, mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,2 ml/min durch die Säule führt.

Im Verlaufe dieser verschiedenen Phasen der Adsorption, des Spülens, des Waschens und der Desorption fängt man 2 ml-Fraktionen auf. Durch Bestimmen des Interferontiters dieser verschiedenen Fraktionen läßt sich erkennen, daß man in den drei ersten Fraktionen von jeweils 2 ml 1024 Einheiten Interferon, das heißt insgesamt 6144 Einheiten Interferon, gewinnt, was 30% des auf die Kolonne aufgebrachten Interferons entspricht. In den Waschfraktionen ist keine Interferonaktivität festzustellen.

Bei der Desorption stellt man fest, daß die Produkte mit Interferonaktivität praktisch in den Fraktionen 10 und 11 enthalten sind, wobei die Fraktion 10 lediglich 1 ml umfaßt. Der Interferontiter dieser Fraktionen ist daher der folgende:

Fraktion 10 = 2048
Fraktion 11 = 16 384

was einer Gesamtmenge von 18 432 internationalen Einheiten Interferon pro Milliliter entspricht.

Da das in der Säule gereinigte rohe Ausgangspräparat 20 480 internationale Einheiten Interferon enthalten hat, ist zu erkennen, daß 90% des Interferons zurückgewonnen worden sind.

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Beispiel 4

Bereitung einer Dextran-Sepharose-Bläu (Bleu Dextran Sepharose) enthaltenden Säule für die Affinitätschromatographie zur Reinigung von Interferon tierischen Ursprungs einerseits und Interferon menschlichen Ursprungs andererseits unter Verwendung von Polynucleotiden als Desorptionsmittel.

1.) Herstellung des Dextran-Sepharose-Blau-Gels

Das Verfahren zur Herstellung von Dextran-Sepharose-Blau-Gelen (Βίεμ Dextran Sepharose) wurde von L.D.Ryan und C.S.Vestling beschrieben (Arch.Biochem.Biophys. 160 (1974) 279 bis 284). Nach dieser Veröffentlichung ist es nicht mehr notwendig, die Sepharose mit Bromcyan nach dem Verfahren von Cuatrecasas (P.Cuatrecasas, J.Biol.Chem. (1970) 3059 bis 3065) zu aktivieren, da man handelsübliche gefriergetrocknete, bereits aktivierte Sepharose verwenden kann, die unmittelbar eingesetzt werden kann.

Man verwendet mit Bromcyan aktivierte Sepharose 4B und Dextran Blau 2000 (Bleu Dextran 2000), wie sie im Handel von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, erhältlich sind.

a) Herstellung des Sepharosegels (BrCN-Sepharose-4B)

Zum Quellen des Gels und zur Entfernung der in dem gefriergetrockneten Präparat enthaltenen Bakterizide wäscht man das Material auf einer Glasfritte mit einer 0,001m Chlorwasserstoffsäurelösung während etwa 1 Stunde, wobei man davon ausgeht, daß 1 g der trockenen BrCN-Sepharose etwa 3,5 ml Gel ergibt. Man verwendet somit 200 ml 0,001m Chlorwasserstoff-

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säurelösung pro Gramm der trockenen BrCN-Sepharose. Das in dieser Weise gebildete Gel wird anschliessend an Dextran Blau 2000 gebunden.

b) Kupplung des Sepharosegels mit Dextran Blau 2000 (Bleu Dextran 2000)

Man bestimmt die für das Kuppeln notwendige Dextran-Blau-Menge, indem man davon ausgeht, daß 1 g der trockenen Sepharose 80 bis 100 mg Dextran Blau zu binden vermag.

Man löst diese Menge in einem alkalischen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 8 bis 10, insbesondere in einem 0,4m Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 10 (wobei man ohne weiteres 20 mg Dextran Blau 2000 in 1 ml Carbonatpuffer lösen kann).

Man gießt die Dextran-Blau-Lösung auf das Sepharosegel, das man zuvor mit dem 3- oder 4-fachen seines Volumens eines 0,4m'Carbonatpuffers mit einem pH-Wert von 10 gespült hat. Man gießt die Mischung aus dem Gel und Dextran Blau dann in einen dunklen Glaskolben und bewegt das Material dann beispielsweise mit Hilfe eines Drehtisches während 18 bis •24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4⁰C, um die Kupplung zu bewirken.

Nach der Durchführung der Kupplung spült man das erhaltene Dextran-Blau-Sepharose-Produkt auf einem Glasfrittefilter mit einem Überschuß des 0,4m Carbonatpuffers mit einem pH-Wert von 10, um das nicht gebundene Dextran Blau zu entfernen, bis der" Puffer sich nicht mehr verfärbt (was einer optischen Dichte von ^ 0,02 entspricht).

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3a

Zur Entfernung der aktiven Bindungsstellen, an die kein Dextran Blau gebunden worden ist, bringt man das Kupplungsprodukt mit einer Alkanolaminlösung, insbesondere einer 1m Äthanolaminlösung mit einem pH-Wert von 8 während etwa 2 Stunden bei einer Temperatur von +4⁰C in Kontakt. Hierzu überführt man das Kupplungsprodukt vorzugsweise in einen anderen Behälter.

Um das Gel gegen Änderungen des pH-Wertes, der MoIarität oder anderer Parameter beständig zu machen, unterzieht man es drei alternierenden Spülvorgängen mit einer sauren Lösung, die aus einem 0,1m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,0, der mit 1 Mol/l NaCl versetzt worden ist, besteht, und mit einer alkalischen Lösung aus einem 0,1m Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5, der mit 1 Mol/l NaCl versetzt worden ist.

Nach diesen Spülvorgängen äquilibriert man das Gel mit einem 0,01m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert 2Q von 7,5, den man mit einem bakteriziden und aseptischen Mittel, insbesondere mit 0,02% Natriumazid, versetzt hat.

2.) Bereitung der Affinitätschromatographiesäule

Man gießt das Dextran-Sepharose-Blau in eine Chromatographiesäule geeigneter Abmessungen (wobei man davon ausgeht, daß 1 ml des Gels etwa 8 Millionen internationale Interferoneinheiten zu binden vermag).

Vor der ersten Benutzung der Säule spült man diese mit dem 20fachen ihres Volumens eines 0,01m Tr is-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, der mit 0,02% Natriumacid versetzt worden ist.

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Um die Dextran-Blau-Moleküle, die sich ablösen können, zu entfernen, führt man den für die Elution verwendeten Puffer, nämlich den 0,01m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, der mit 1 Mol/l NaCl versetzt worden ist, durch die Säule, bis die optische Dichte des eluierten Puffers bei 254 nm Null beträgt (im Fall von Säulen großer Abmessungen ist es angebracht, mehrere aufeinanderfolgende Spülvorgänge mit dem Tris-Puffer mit und ohne Natriumchlorid durchzuführen, um die Säulen an Änderungen des pH-Wertes, der Molarität oder anderer Parameter anzupassen).

Eine Dextran-Sepharose-Blau-Säule kann während mehrerer Monate und für mehrere Interferon-Reinigungs-Zyklen verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie nicht mit Bakterien verunreinigt wird. Man sollte sie daher bei Nichtbenutzung unter Natriumazid und in der Kälte bei etwa +4⁰C aufbewahren.

Da das Natriumazid jedoch für Zellen toxisch wirkt, muß man vor der Bindung des Interferons mindestens drei Säulenvolumen des azidfreien Tris-HCl-Puffers durch die Säule führen, um sämtliche Spuren des antiseptischen Mittels zu entfernen.

Beipiel 5

Reinigung eines Mäuseinterferonpräparats einerseits und eines Humaninterferonpräparats andererseits durch Chromatographie über die gemäß Beispiel 4 bereitete Dextran-Sepharose-Blau-Säule mit Hilfe- von Polynucleotiden als Desorptionsmxtteln.

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a) Interferonpräparate

Als Mäuseinterferonpräparat verwendet man die überstehende Flüssigkeit einer Gewebekultur (Zellen C 243), die durch den Virus der Newcastle-Krankheit dazu gebracht wurde, Interferon zu produzieren. Nach dem Inaktivieren des Virus bei einem pH-Wert von 2 dialysiert man die überstehende Flüssigkeit bei einer Temperatur von etwa 4⁰C während etwa 24 Stunden gegen einen O,O1m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5.

Der Interferontiter und der Proteingehalt des Präparats sowie die spezifische Aktivität entsprechen den Werten des in Beispiel 2 verwendeten Präparats.

Als zu reinigendes Präparat von Humaninterferon verwendet man die überstehende Flüssigkeit einer Fibroblastkultur, wie sie in Beispiel 3 angegeben ist. Dieses Präparat wird ohne vorhergehende Dialyse direkt verwendet.

b) Adsorptionsphase

Man trägt 3 bis 8 ml des oben angesprochenen Mäuseinterferonpräparats (das heißt 3,8 χ 10 bis -1 x 10 internationale Interferoneinheiten) in einer Menge von 0,5 ml pro Minute auf 1,5 bis 4 ml der gemäß Beispiel 4 bereiteten Dextran-Sepharose-*Blau-Säule auf.

Zur Reinigung des Humaninterferons trägt man 7 ml des oben beschriebenen Präparats, das 2560 Interferoneinheiten pro Milliliter enthält, was insgesamt 17 920 Interferoneinheiten entspricht, auf die Kolonne mit einem Volumen von 7 ml auf.

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Diese Adsorptionsphase wird nach der"in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Weise durchgeführt.

c) Desorptionsphase

Nach dem Eindringen der Präparate und dem Spülen der Säule nach der Verfahrensweise der Beispiele 2 und 3 bewirkt man die Desorption des Interferons mit Hilfe von Polynucleotiden in der nachstehenden Weise:

Man führt pro Minute 0,5 ml eines Elutionsmittels, das 0,1 g Polynucleotide pro Milliliter eines 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5 enthält, durch die Säule. Das verwendete Gesamteluatvolumen entspricht 2 Volumen des Gels (wobei man im Fall von Poly U eine 4 Volumen des Gels entsprechende Menge einsetzt). Als Polynucleotide verwendet man synthetische Polyribonucleotide, das heißt Poly G, Poly I und Poly U, wie die von den Laboratorien· Choay vertriebenen Materialien.

Man verwendet auch Polynucleotide natürlichen Ursprungs, wie aus Bierhefe, aus Escherichia CoIi und aus Mäusezellen des Typs C-243 gewonnene t-RNA (Gesamtfraktion). Diese Produkte sind unter ihrer chemischen Bezeichnung im Handel erhältlich, wobei die Polyriboinosinsäure ,beispielsweise unter der Bezeichnung Poly I vertrieben wird.

Nach der oben beschriebenen Desorptionsphase führt man einen zweiten Waschvorgang durch und eluiert dann den Rest der noch an die Säule gebundenen Produkte mit Interferonaktivität mit Hilfe eines 0,01m Tris-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, der 1 Mol/l NaCl enthält.

- Man gewinnt Fraktionen, die jeweils einem Drittel des Gesamtvolumens der Dextran-Sepharose-Blau-Säule entsprechen. In der nachstehenden Tabelle ist der Prozent-

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satz der in zwei Gesamtvolumen des Elutionsmittels rückgewonnenen Interferons in Abhängigkeit von dem verwendeten Polynucleotid angegeben. (Die Werte sind in der Hinsicht korrigiert, daß der Prozentsatz des durch die Polynucleotide desorbierten Interferons und der Prozentsatz des anschließend mit dem hypermolaren Puffer desorbierten Interferons jeweils 100 betragen. )

Tabelle I

Prozentsatz der Desorption in Abhängigkeit von dem verwendeten Polynucleotidtyp

Polynucleotidtyp

Prozentsatz des von der Dextran-Sepharose-Blau-Säule desorbierten Interferons

I.) Mäuseinterferon

Poly G
Poly I
Poly U

t-RNA (Gesamtfraktion, extrahiert aus Bierhefe)

t-RNA (Gesamtfraktion, extrahiert aus E.CoIi)

t-RNA (Gesamtfraktion, extrahiert aus Zellen C-243)

17 86

43

(wenn man die Elution fortführt, gewinnt man 73%)

90 23

30

II.) Humaninterferon Poly I

94

Bei einer weiteren Untersuchungsreihe wurde der erzielte Reinigungsgrad untersucht, indem man die Desorption

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des an eine Dextran-Sepharose-Blau-Säule gebundenen Interferons mit Polynucleotiden bewirkt.

Die mit Mäuseinterferonpräparaten und Humaninterferonpräparaten erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen 6 und 7 angegeben.

Beispiel 6

Man verwendet ein Interferonpräparat aus Mäusezellen (Zellen C-243), die mit Hilfe des Virus der Newcastle-Krankheit zur Bildung von Interferon gebracht worden sind, wie es auch in Beispiel 2 eingesetzt wurde.

Der Interferontiter des rohen Präparats beträgt 2,6 χ 10 internationale Einheiten pro Millilit Proteingehalt beträgt 100 μg/ml und seine spezifische Aktivität betr
gramm Protein.

2,6 χ 10 internationale Einheiten pro Milliliter. Sein Aktivität beträgt 2,6 χ 10 Interferoneinheiten pro Milli-

Man führt 130 ml dieses Präparats (das somit insgesamt

3,3 χ 10 Interferoneinheiten entspricht) über die gemäß Beispiel 4 bereitete Dextran-Sepharose-Blau-Säule, die ein Gesamtvolumen von 9 ml aufweist.

Die Phasen der Adsorption, des Spülens und des Waschens werden in der oben beschriebenen Weise durchgeführt. Die Desorption erfolgt nach der Verfahrensweise des Beispiels 5 unter Verwendung von 18 ml eines Elutionslösungsmittels, das als Desorptionsmittel 100 μg Poly I pro Milliliter des Puffers enthält.

Das Interferon wird in zwei Fraktionen a bzw. b mit einem Volumen von 7 bzw. 5 ml aufgefangen. Der Interferontiter dieser Fraktionen beträgt 4,1 χ 10 bzw. 5,1 χ 10⁶.

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Insgesamt gewinnt man 3,16 χ 10 internationale Einheiten Interferon, was einem Rückgewinnungsprozentsatz von 96% entspricht.

In der Fraktion a beobachtet man die Anwesenheit von 19 μ9 Proteinen, was einer spezifischen Aktivität von

g
2,1 χ 10 entspricht.

Der Reinheitsgrad beträgt somit 80 (spezifische Aktivität des Ausgangsmaterials, dividiert durch die

9 spezifische Aktivität des Endprodukts: 2,1 χ 10 /

2,6 χ 10⁷).

Beispiel 7

Das zu reinigende Humaninterferonpräparat besteht aus der überstehenden Flüssigkeit einer Humanfibroblastkultur, die durch Poly IC zur Interferonproduktion angeregt wurde.

Der Titer dieses Präparats beträgt 2560 internationale Einheiten pro Milliliter, während sein Proteingehalt 410 μg/I

tragen.

410 μg/ml und seine spezifische Aktivität 6,2 χ 10 be-

Man überführt 7 ml dieses Präparats (das 17 920 Einheiten Interferon entspricht) auf 5 ml einer Dextran-Sepharοse-Blau-Säule.

Die Phasen der Adsorption, des Spülens und des Waschens erfolgen unter Anwendung der in den obigen Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen. Die Desorption der Produkte mit Interferonaktivität erfolgt unter Verwendung von 10 ml einer Lösung, die 100 μg Poly I pro Milliliter eines 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5 enthält.

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Man gewinnt die Produkte mit Interferonaktivität in fünf Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 2 ml. Der Titer jeder dieser Fraktionen ist in der nachstehenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Fraktion Titer

1 650 )

2 5120 \

3 1280 ) χ 2 = insgesamt 16 960 4 1280 \ Einheiten

5 160 )

Der Prozentsatz der Rückgewinnung beträgt somit:

16 960

17 920

= 95%

Die Fraktion 2 enthält 10 μg Proteine pro Milliliter. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion beträgt damit 5,1 χ 10 . Der Reinigungsgrad entspricht somit einem Faktor von 82 (5,1 χ iO⁵/6_f2 χ 10³).

Beispiel 8

Wie weiter oben angegeben, verleihen die mit den Produkten mit Interferonaktivität gekuppelten Polynucleotide diesen Produkten einen äußerst interessanten Schutz gegen die thermische Denaturierung. Zur Verdeutlichung dieses Effekts sei auf die Fig. 2 und 3 der Zeichnungen verwiesen, die durch Auftragen des Prozentsatzes der Aktivität der Proben gegen die Inkubationszeit bei 60°C erhalten wurden.

In der Fig. 2 sind die Ergebnisse angegeben, die man mit

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Produkten der Kupplung des aus Mäusezellen C 243, die mit Hilfe des Virus der Newcastle-Krankheit zur Produktion von Interferon induziert worden sind, gewonnenen Interferons mit Poly U, Poly I, Poly C, Poly I-Poly C und Poly A im Vergleich zu Kontrollinterferonpräparaten, die keine Polynucleotide enthalten, erhalten hat. Die Polynucleotidkonzentration beträgt dabei 10 Mg/Milliliter des Präparats.

Die Fig. 3 verdeutlicht die Ergebnisse, die man mit den Produkten der Kupplung von Interferon mit t-RNA (Valin), t-RNA (Tryptophan), t-RNA (Gesamtfraktion aus Bierhefe), t-RNA (Tyrosin), t-RNA (Gesamtfraktion von Weizenkeimen) und t-RNA (Lysin) erhalten hat.

Bei den Versuchen wird die antivirale Aktivität der Interferonpräparate mit· Hilfe eines Mikrotests nach der folgenden Methode bestimmt: Man bewirkt geeignete Verdünnungen der zu bestimmenden Proben auf für die Mikrobestimmung geeigneten handelsüblichen Falcon-Platten (Mikrotiterplatten - Falcon Plastic Company). In jedes Näpfchen jeder Platte gibt man anschließend 100 μΐ einer Suspension von Zellen, die von der gleichen Art abgeleitet sind, aus der auch das Interferon ge- -wonnen wurde, und inkubiert die Platten dann während 18 Stunden bei 37⁰C in einem C0₂-lnkubator. Der Nachweisvirus wird dann zugesetzt (wobei man bei diesen Beispielen den Virus der Mundschleimhautbläschenentzündung in einer Menge von 100 Infektionseinheiten pro Näpfchen verwendet).

Die Platten werden dann in den C0₂-lnkubator zurückgebracht und 24 Stunden später wird mit Hilfe eines Mikroskops die den Virus verursachte Zellenzerstörung beobachtet.

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Der Interferontiter entspricht dem Kehrwert der Verdünnung, bei der mindestens 50% der Zellen gegen die zerstörende Wirkung des Virus geschützt .werden. Wenn somit bei einer Verdünnung von 1:20 000 50% der Zellen noch. intakt sind, beträgt der Titer 20 000.

Die bei dem Laboratoriumsmikrotest ermittelten Einheiten wurden in internationale Vergleichsexnheiten umgewandelt (wobei eine Mikrotesteinheit pro 0,2 ml 10 internationalen Einheiten pro Milliliter entspricht).

Bei der Untersuchung, deren Ergebnisse in der Fig. 2 angegeben sind, wurde das rohe Mäuseinterferonpräparat gegen einen 0,01m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 dialysiert. Dann wurden die Polynucleotide in einer Konzentration von 10 μg/ml eingeführt. Es wurden aliquote Anteile von 0,3 ml' (das heißt 3,9 χ 10 Interferoneinheiten und 3 μg Polynucleotid) bei 60°C im Wasserbad inkubiert. Zu den in der Zeichnung angegebenen Zeitpunkten wurden Proben von 20 μΐ entnommen, mit dem 3% Kälberserum enthaltenden Kulturmedium um den Faktor 100 verdünnt und sofort in einem Eisbad abgekühlt. Die Bestimmung des Interferons erfolgte nach Beendigung der Inkubation.

Bei den Untersuchungen, deren Ergebnisse in der Fig. 3 angegeben sind, arbeitet man bei den gleichen Bedingungen, die oben bezüglich der Untersuchung der thermischen Denaturierung in Gegenwart von Polynucleotiden angegeben sind, verwendet jedoch anstelle dieser Polynucleotide die angegebenen t-RNA.

Die Untersuchung dieser Kurven zeigt, daß die Produkte mit Interferonaktivität, die mit Polynucleotiden gekuppelt worden sind, selbst nach einer thermischen Behandlung bei 60⁰C während 30 Minuten eine erhebliche thera-

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peutische Aktivität beibehalten, während diese Aktivität bei den Kontrollprodukten schnell absinkt. Dieser Effekt, der auf der Schutzwirkung der Polynucleotide gegenüber den Produkten mit Interferonaktivität beruht, ermöglicht die problemfreie Aufbewahrung der Interferonpräparate und gestattet es, sie bei verschiedenen Untersuchungen Temperaturänderungen zu unterwerfen, ohne daß sie hierdurch denaturiert werden oder ihre Eigenschaften verlieren.

Beispiel 9

Reinigung eines Mäuseinterferonpräparats durch Chromatographie über eine Dextran-Sepharose-Blau-Säule mit Hilfe von t-RNA als Desorptionsmittel.

Das zu reinigende Mäuseinterferonpräparat ist vergleichbar mit dem in Beispiel 5 eingesetzten. Nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise trägt man das dialysierte Präparat, das 1 χ 10 Interferoneinheiten enthält, auf die mit Dextran-Sepharose-Blau beschickte . Säule auf. Man spült die Säule mit (insgesamt 4 Volumen) ' Tris-Puffer und bewirkt dann die Desorption des Interferons, indem man 3 bis 4 ml einer t-RNA-Lösung mit einer Konzentration von 100 μg/ml in dem 0,01m Tris-HCl-Puffer auf die Lösung aufträgt.

Man führt eine zweite Spülphase mit dem genannten Puffer durch und bewirkt dann die Desorption der verbliebenen Produkte mit Interferonaktivität und mit Hilfe eines 0,01m Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5, der mit 1 Mol/l NaCl versetzt worden ist.

Die Prozentsätze der Desorption des Mäuseinterferons mit Hilfe der aus Bierhefe, E.CoIi, Mäusezellen C 243 und Rattenleber gewonnenen t-RNA-Gesamtfraktionen betragen 91, 23, 54 bzw. 10%,

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Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing.H.Liska

8 MÜNCHEN 86, DEN - 2. Mai 1978

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Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Produkten mit Interferonaktivität, die hierbei erhaltenen Produkte und deren Verwendung als Arzneimittelwirkstoffe.

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur selektiven Abtrennung von Produkten mit Interferonaktivität aus sie enthaltenden Präparaten unter Beseitigung von verunreinigenden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Präparate mit einer Phase in Kontakt bringt, die mindestens eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthält, welche als spezifischer Ligand bezüglich der Produkte mit Interferonaktivität wirkt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1,dadu~rch gekennzeichnet, daß man ein Produkte mit Interferonaktivität enthaltendes zu reinigendes Präparat mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt bringt, das mit einem Puffer äquilibriert worden ist, dessen Salzkonzentration in Bezug auf diejenige des Blutes isomolar oder vorzugsweise hypomolar ist, wobei das Adsorptionsmittel einerseits einen festen, gelbildenden Träger, dessen Porenweite so groß ist, daß sie das Hindurchdringen von Makromolekülen ermöglicht, und andererseits eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthält, die an den Träger gebunden ist und als Ligand bezüglich der selektiv abzutrennenden Produkte wirkt, und die Menge des eingesetzten Adsorptionsmittels und die Kontaktdauer zwischen dem Liganden und dem zu reinigenden Präparat dazu ausreichen, die gewünschte Bindung der Produkte mit Interferonwirkung zu ermöglichen.
3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von gereinigten Präparaten mit Interferonaktivität, dadurch ■gekennzeichnet, daß man eine zusätzliche Stufe durchführt, bei der man die Desorption der gebundenen Produkte mit Interferonaktivität mit Hilfe ' eines Puffers bewirkt, dessen Salzkonzentration bezüglieh derjenigen des Blutes hypermolar ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zubereitung, die einen die an einen Liganden gebundenen Produkte mit Interferonaktivität enthaltenden Komplex enthält, mit einer Phase in Kontakt bringt, die mindestens eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthält, die bezüglich der Bindung der Produkte mit Interferonaktivität mit dem Liganden in kompetitive Wechselwirkung treten und die Produkte mit Interferonakti-

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vität abtrennen kann, wobei die Zubereitung und die genannte Phase mit einem Puffer äquilibriert worden sind, dessen Salzkonzentration bezüglich derjenigen des Blutes isomolar oder hypomolar ist, und die Menge der Polynucleotide in der genannten Phase und die Kontaktdauer der Polynucleotide mit den an den Liganden gebundenen Produkten mit Interferonwirkung dazu ausreichen, die Desorption der Produkte mit Interferonaktivität zu ermöglichen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung des Polynucleotidtyps mindestens ein Polyribonucleotid und/oder Polydesoxyribonucleotid synthetischen oder natürlichen Ursprungs verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e kennz eichnet, daß man ein Polyribonucleotid verwendet, das 10 bis 300 Nucleotideinheiten aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e -

k ennz eichnet, daß man als Polyribonucleotid Polyriboinosinsäure, Polyriboadenosxnsaure, Polyribouridylsäure und/oder Polyriboguanylsäure verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyribonucleotid t-RNA verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8,dadurch gekennzeichnet, daß man die Gesamtfraktion der t-RNA verwendet, die man aus Bakterien, Hefen oder Organen von Säugetieren gewonnen hat.

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10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man t-RNA einsetzt, die man aus Bakterien des Genus Escherichia CoIi, Hefen der Art der Bierhefen oder Zellen tierischen

5 oder menschlichen Ursprungs, insbesondere Zellen, die das zu reinigende Interferon bilden, gewonnen hat.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und

5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen gelbildenden Träger des Adsorptionsmittels ein Polysaccharid, wie Agarose oder ein Derivat davon, insbesondere eine modifizierte Agarose, deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Gitter vernetzt sind, insbesondere das unter der Bezeichnung "Sepharose" im Handel erhältliche Material, oder ein Polyacrylamid oder ein Acrylharz verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und

5 bis 11,dadurch gekennzeichnet, daß man zum Äquilibrieren des Adsorptionsmittels einen Puffer mit einer Salzkonzentration von ^0,15 Mol pro Liter verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution einen Puffer mit einer Salzkonzentration von mindestens 0,5 Mol pro Liter verwendet.
14. An eine adsorbierende Phase gebundene Produkte
mit Interferonaktivität, die die Wirkungen und
Eigenschaften jener Produkte besitzen, die man bei Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 13 erhält.

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15.

Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die die nicht an einen Liganden gebundenen Produk-.te mit Interferonaktivität enthaltende Zubereitung eine adsorbierende Zubereitung ist, die einen festen, gelbildenden Träger, dessen Porenweite so groß ist, daß sie das Hindurchdringen von Makromolekülen ermöglicht, und andererseits eine an den Träger gebundene Verbindung, die bezüglich der selektiv abzutrennenden Produkte als Ligand wirkt und die eine polycyclische Struktur des Typs des blauen Chromophors, der unter der Bezeichnung "Cibracron Blau F3GA" der folgenden Formel

SO₂ONaI

SO₂ONa

im Handel erhältlich ist, besitzt, oder ein äquivalentes Produkt, dessen Konfiguration die selektive Rückhaltung des Interferons ermöglicht, enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine adsorbierende Zubereitung verwendet, die als an den festen Träger gebundenen Liganden den Chromophor Cibacron Blau F3GA oder Cibracron Blau 3GA aufweist.

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17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Chromophor an ein Polysaccharid gebunden ist, das unter der Bezeichnung "Dextran" und insbesondere unter der Bezeichnung "Dextran 2000" bekannt ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch g e kennz eichnet, daß man eine adsorbierende Zubereitung verwendet, die das im Handel unter der Bezeichnung "Dextran-Sepharose-Blau" (Bleu Dextran Sepharose) erhältliche Produkt enthält.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Äquilibrieren des Adsorptionsmittels einen Puffer verwendet, dessen Salzkonzentration ^CO,5 Mol pro Liter ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gek-ennzeichnet, daß man als mindestens eine Verbindung des Polynucleotidtyps enthaltende Phase eine Phase verwendet, die die Polynucleotide in einem Puffer gelöst enthält, dessen Salzkonzentration in Bezug auf diejenige des Blutes hypomolar ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polyribonucleotide als Lösung in einem Puffer in einer Konzentration von 10 bis 100 μg/ml und vorzugsweise 30 bis 50 μg/Inl verwendet.
22. Produkte mit Interferonaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie an PoIynucleotide gebunden sind und die Wirkungen und Eigenschaften jener Produkte besitzen, die man bei

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Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 10 und 14 bis 21 erhält.
23. Gereinigte Präparate mit Interferonaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Wirkungen und Eigenschaften der Produkte besitzen, die man durch Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und 15 bis 21 erhält.
24. Verwendung der Präparate nach Anspruch 23 als Arzneimittelwirkstoffe.
25. An Polynucleotide gebundene Produkte mit Interferonaktivität.

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