DE102010054766A1

DE102010054766A1 - Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung

Info

Publication number: DE102010054766A1
Application number: DE102010054766A
Authority: DE
Inventors: Dr. Müller Dirk
Original assignee: PREVIPHARMA AG
Current assignee: Instraction GmbH
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: WO2012080422A1; DE102010054766B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ist ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, wobei das Verfahren einen Chromatographie-Schritt, eine Filtration über ein Chromatographiematerial sowie einen Vireninaktivierungsschritt umfasst. Bei den für die Chromatographie und die Filtration verwendeten Sorbenzien handelt es sich jeweils um feste Trägermaterialen, deren Oberflächen mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen des IgG-Typs aus Humanplasma.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virusbestandteil enthält, aus einer Mischung unter Verwendung von Sorbentien, deren Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Sorbentien als Chromatographiematerial eingesetzt werden und wobei das Verfahren eine Virusinaktivierung einbezieht.
Hintergrund der Erfindung
Für die Virusinaktivierung von Blutprodukten wird seit vielen Jahren erfolgreich das Solvent-Detergent-Verfahren eingesetzt. Dieses Verfahren beruht darauf, dass viele Viren, beispielsweise HIV oder Hepatitis B, eine Lipidhülle besitzen, die durch Zusatz einer ”Seife” zerstört werden kann. Die Seife besteht bei den gängigsten Verfahren aus einer Mischung von organischem Phosphattriester, insbesondere Tri-N-butylphosphat, und einer nichtionischen Seife wie p-tert-(Octylphenoxy)polyethoxyethanol (Triton^® X-100). Durch die Behandlung mit diesen beiden Reagenzien können alle Viren inaktiviert werden, welche eine Lipidhülle aufweisen. Nach Beendigung des Verfahrens können die Reagenzien mechanisch und chromatographisch entfernt werden und so für Transfusionen geeignete virenfreie Plasmen erhalten werden. Die mechanische Entfernung vor allem des organischen Phosphats wird durch Extraktion mittels eines Öls erreicht, während die nichtionische Seife mit Hilfe von Reversed phase-Kieselgel oder Ionentauscherharz abgetrennt werden kann. Verfahren zur Durchführung von Solvent-Detergent-Verfahren sind beispielsweise durch P. Hornwitz et al., Blond, 79, 826–831 (1992) oder M. Pourmokhtar, DARU J. Pharm. Sci. Volume 11, No. 2 (2003) beschrieben.
Ein alternatives Verfahren zur viralen Inaktivierung ist z. B. in US 4,534,972 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Proteinlösung in Kontakt mit einem Übergangsmetall-Komplex, insbesondere mit Kupferphenanthrolin, und mit einem reduzierenden Mittel gebracht, um die Inaktivierung von Viren durchzuführen, ohne dass die Aktivität des Proteins wesentlich beeinflusst wird. Ein weiteres Verfahren, bei dem die Viren durch Inkontaktbringen mit Caprylsäure-enthaltenden Lösungen inaktiviert werden, ist in US 4,939,106 beschrieben.
Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen, wie insbesondere IgG, sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. So beschreibt die CA 1 201 063 die Zubereitung von IgG, das sich zur intravenösen Anwendung eignet, wobei eine Plasmafraktion einem zweistufigen Trennverfahren mit zwei verschiedenen Anionenaustauschphasen unterzogen wird. In jeder Stufe wird der Puffer, der dazu verwendet wird, das Anionaustauschharz ins Gleichgewicht zu setzen, auch dazu verwendet, die IgG enthaltene Fraktion aus dem Harz zu eluieren. Aus der US 4,983,722 ist die Anwendung von Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung von Antikörper-Zubereitungen bekannt. In diesem Verfahren wird eine Lösung, die Antikörper und kontaminierendes Protein A enthält, mit einem Anionaustausch-Harz in Kontakt gebracht, wobei die Antikörper aus dem Harz unter Bedingungen steigender Ionenstärke eluiert werden.
Schließlich ist in der DE 698 23 931 ein Verfahren beschrieben, das eine virale Inaktivierung mit einer Aufreinigung und Trennung von Gammaglobulinen kombiniert, und mit dem diese Gamma-Globuline in einer Reinheit von größer als 99% erhalten werden können. Bei diesem Verfahren wird die virale Inaktivierung durch Behandlung mit Caprylsäure bei einem pH-Wert von zwischen 3,8 und 4,9 erreicht. Die eingesetzte Caprylsäure wirkt dabei analog einem organisches Phosphat/nicht ionische Seife-Gemisch, das die Lipidhülle von Viren angreift. Auch das in DE 698 23 931 beschriebene Verfahren basiert auf der Aufreinigung von Gammaglobulinen mittels Ionenaustauschchromatographie, wobei ein starker Anionenaustauscher und anschließend ein schwacher Anionenaustauscher für die Reinigung zum Einsatz kommen. Bei Aufreinigung von Cohn II + III Fraktionen lässt sich mit diesem Verfahren eine Gesamtausbeute aus der Paste von 69% realisieren, die gegenüber dem Waschverfahren mit Alkohol (Ausbeute 48%) signifikant erhöht ist.
Trotz der gemachten Fortschritte weisen die bisher verfügbaren Methoden zur Aufreinigung von Plasmaproteinen, insbesondere von Antikörpern, den Nachteil auf, dass sie in der Regel aufwändig und zeitraubend sind, die Verwendung nicht regenerierbarer Reinigungsmaterialien einbeziehen, oder die funktionelle Integrität der Plasmaproteine durch die Aufreinigungsschritte beeinträchtigt wird und somit Plasmaproteine nur in geringer Ausbeute oder Reinheit und Aktivität erhalten werden können.
Beschreibung
Das technische Problem, mit dem sich die vorliegende Erfindung befasst, ist daher das Zurverfügungstellen eines neuen Trennungs-, Aufkonzentrations- und/oder Reinigungsverfahrens für (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile, das eine Virusinaktivierung einbezieht, ohne dass die im vorangehenden Abschnitt aufgezeigten Nachteile des bisher bekannten Verfahrens in Kauf genommen werden müssen. Dies bedeutet, dass das Verfahren die Isolation der gewünschten (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile in hoher Reinheit erlaubt und gleichzeitig vorhandene Viren inaktiviert werden und eine hohe Ausbeute erzielt werden soll. Gleichzeitig soll die funktionelle Integrität der (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile nicht beeinträchtigt werden und die Verwendung von teuren Materialen auf ein Minimum beschränkt werden. Ebenso soll das neue Verfahren die Verwendung von Standard-Reinigungs- und Sterilisierungsprotokollen des Equipments während der Verwendung erlauben und so die Zulassung des Verfahrens zur Herstellung von pharmazeutischen Produkten durch die entsprechenden Behörden gewährleisten. Mit anderen Worten ist Ziel der vorliegenden Erfindung das zur Verfügung stellen der gewünschten (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile in wirtschaftlich günstiger Weise und in einer für pharmazeutische Produkte geeigneten Qualität.
Dieses technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend

(i) das Inkontaktbringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist, mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden,
(ii) das Inkontaktbringen des Sorbenzes 1 mit dem daran gebundenen (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen,
(iii) das Durchführen eines Solvent-Detergent-Verfahrens mit dem vorgereinigten (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil,
(iv) das Filtrieren der aus Schritt (iii) enthaltenen Mischung über ein Sorbens 2,

Das vorstehend dargestellte Verfahren kann dadurch vorteilhaft weitergebildet werden, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)Plasmaproteins oder des Virenbestandteils an das Sorbens 1 in Schritt (i) das Sorbens mit einer weiteren Fähigkeit gewaschen wird. Alternativ oder zusätzlich dazu kann das oben beschriebene Verfahren verbessert werden, indem im Anschluss an das Lösen des (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils vom Sorbens 1 im Schritt (ii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird. Schließlich kann das Verfahren auch dergestalt weitergebildet werden, dass vor dem Binden des (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens im Schritt (i) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.
Hinsichtlich der Eigenschaften der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile bestehen keine besonderen Einschränkungen. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile aufgereinigt werden, deren isoelektrischer Punkt pl im Bereich von 5,5 bis 8,5 liegt, und die ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 500.000 da aufweisen. Die (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile sind vorzugsweise Antikörper, und besonders bevorzugt Immunoglobuline. Von diesen sind vor allem IgG, IgA und IgM für das beschriebene Verfahren besonders interessant. Neben Antikörpern können auch Fragmente oder Verbindungen von natürlichen Antikörpern, genetisch hergestellte Varianten von Virenbestandteilen mit dem beschriebenen Verfahren effektiv gereinigt werden.
Die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltene Mischung kann eine natürliche oder synthetische Mischung sein, insbesondere kann die Mischung aus Blutplasma oder einem Zwischen- oder Endprodukt aus Blutplasma bestehen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren unter Verwendung von Blutplasma oder einem proteinhaltigem Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren von Blutplasma erhalten wurde, durchgeführt. Zum Beispiel sind Cohn-Fällungsprodukte als A + 1, II + III oder I + II + III Pasten kommerziell erhältlich. Das Blut ist natürlichen menschlichen oder tierischen Ursprungs, allerdings ist die Verwendung von menschlichem Blut bevorzugt.
Bei den im Verfahren verwendeten Sorbentien 1 und 2 handelt es sich jeweils um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminverbindung zunächst mit dieser Aminverbindung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol. Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch Zugabe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden.
Anschließend wird das so erhaltene Polyamin beschichtete Sorbens mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen.
Es ist möglich, die im Sorbens vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98% der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden.
Für das Sorbens 1 hat es sich gezeigt, dass zum einen Rezeptormoleküle einem Pyridinring (-C₅H₄N) deren Wasserstoffatome substituiert sein können und Carboxylgruppen (-COOH) zu besonders selektiven Sorbentien führen. Dabei können sowohl der Pyridinring als auch die Carboxylgruppe über einen kovalent gebundenen Linker mit dem Polyaminmaterial verbunden sein.
Für das Sorbens 2 führt hingegen die Verwendung von Benzopyrrolresten in Kombination mit Pyrrolresten zu besonders effizienten Trennungs- und Reinigungsergebnissen. Der Pyrrolrest kann insbesondere ein 3-Azapyrrolrest und besonders bevorzugt ein 4-Imidazolacryliamidrest sein. Der Benzopyrrolrest ist vorzugsweise ein 3-Indolpropionamidrest, wobei sich die Kombination der genannten speziellen Reste als besonders effektiv herausgestellt hat. Auch die Benzolpyrrol- und Pyrrolreste können über einen Linker, wie er vorstehend für das Sorbenz 1 beschrieben ist, mit der Polyaminverbindung im festen Trägermaterial verbunden sein.
Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidverbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind.
Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in WO 2004/085046 , beschrieben.
Das Verfahren kann im Weiteren dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass die Flüssigkeiten 1 im Schritt (i) ein Puffer ist. Der Puffer hat bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 1 bis 100 mM, insbesondere von 2 bis 20 mM. Der pH-Wert der Flüssigkeit liegt unabhängig von der Konzentration zweckmäßigerweise in der Nähe des isoelektrischen Punktes pl des gebundenen Proteins oder Peptids, insbesondere in einem pH-Bereich von etwa 4.0 bis 6.0.
Hinsichtlich des Verhältnisses des aufzureinigenden (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenzes ergeben sich keine besonderen Beschränkungen. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, ein Verhältnis von 2–20, insbesondere 8–16 mg/ml zu wählen. Das Verhältnis von Flüssigkeit 1 zur Mischung enthaltend das Protein oder Peptid im Schritt (i) unterliegt ebenfalls keinen besonderen Einschränkungen. Für dieses hat sich ein Verhältnisbereich von 5:1 bis 15:1, insbesondere 8:1 bis 10:1 bezogen auf das Gewicht Flüssigkeit zu Protein als besonders geeignet herausgestellt.
Der in Schritt (i) als Flüssigkeit 1 verwendete Puffer ist vorzugsweise eine Substanz, die einen pKa-Wert im Bereich von 4.0 bis 6.0 aufweist, da dadurch eine möglichst hohe Pufferkapazität gewährleistet werden kann. Vorzugsweise ist der Puffer der Flüssigkeit 1 aus Kohlensäure/Silikatpuffern, Essigsäurepuffern, Citrat-Puffern, Phosphatpuffern und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern ausgewählt.
Die im Schritt (ii) verwendete Flüssigkeit 2 kann ebenfalls ein Puffer sein, der eine höhere Konzentration als der in Schritt (i) verwendete Puffer aufweist, insbesondere eine Konzentration im Bereich von 50–200 mM und bevorzugt 80–120 mM. Der pH-Wert der Flüssigkeit 2 liegt zweckmäßig im Bereich des isoelektrischen Punktes pl des Proteins oder Peptids, oder im Bereich von 6.5–8.5. Bevorzugt liegt der isoelektrische Punkt des Proteins oder Peptids innerhalb dieses Bereichs. Dabei werden ebenfalls Puffer verwendet, deren pKa innerhalb dieses pH-Intervalls liegt wie zum Beispiel Carbonatpuffer, Ammoniakpuffer, TRIS-Puffer, HEPES-, HEPPS- oder Phosphatpuffer.
Es hat sich gezeigt, dass das Verfahren hervorragende Trennleitungen liefert, wenn der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4.0 bis 6.0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6.5 bis 8.5 liegt.
Das Verfahren kann weiterhin dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass die im Schritt (ii) erthaltene Mischung vor dem Solvent-Detergent-Verfahren im Schritt (iii) aufkonzentriert wird. Diese Aufkonzentration kann zweckmäßig mit Hilfe einer Ultrafiltration durchgeführt werden. Weiterhin sollte die Flüssigkeit 2 vor Durchführung des Solvent-Detergent-Verfahrens mit der Flüssigkeit 3 ausgetauscht werden, was insbesondere mittels einer Diafiltration effizient und kostengünstig durchgeführt werden kann.
Das Solvent-Detergent-Verfahren wird in der Regel unter Zugabe einer nichtionischen Seife und eines organischen Phosphats durchgeführt, wobei als organisches Phosphat zweckmäßig Tri-N-butylphosphat gewählt wird, als nichtionische Seife hingegen ein p-tert-Octylphenolderivat mit einer Polyethylenglycolseitenkette (erhältlich zum Beispiel unter dem Handelsnamen Triton^®-X-100), oder einem Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder -monolaurat in Form von Polysorbat-20 bzw. Polysorbat 80 (erhältlich z. B. unter den Handelsbezeichnungen Tween^® 20 und Tween^® 80). Die jeweilige Seife wird in Konzentrationen im Bereich von 0,2 bis 5%, insbesondere 0,5 bis 2% eingesetzt, während für das Organophosphat eine Konzentration von vorzugsweise 0,01 bis 5%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,5%, gewählt wird.
Nach Zugabe der im vorstehenden Abschnitt beschriebenen Reagenzien werden vorhandene Viren durch Behandlung vorzugsweise über einen Zeitraum von 4 bis 16 Stunden inaktiviert.
Die aus dem Solvent-Detergent-Verfahren erhaltene Mischung kann direkt weiterverwendet werden, ohne dass ein Entfernung die Reagenzien durch Extraktion mit einen Öl nötig ist.
Bei der Flüssigkeit 3, die im Schritt (iv) verwendet wird, handelt es sich bevorzugt ebenfalls um eine Flüssigkeit auf Wasserbasis, insbesondere einen Puffer. Dieser weist zweckmäßigerweise einen pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 6,5 auf. Der Puffer sollte weiterhin eine Konzentration (des Puffers) im Bereich von 50 bis 400 mM, insbesondere von 150 bis 250 mM aufweisen. Auch der als Flüssigkeit 3 verwendete Puffer basiert zweckmäßigerweise auf eine Säure, deren pKa im Bereich des bevorzugten pH-Werts des Puffers, also im Bereich von 3,0 bis 6,5 liegt. So können wie bei der Flüssigkeit 1 Kohlensäure/Silikat, Essigsäure, Citrat, Phosphat und/oder 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES) als Pufferbasis gewählt werden.
Während des optional vorgeschalteten Equilibrierens der Solvenzien 1 und/oder 2, das den Schritten (i) und/oder (iv) vorgeschaltet sein kann, wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, der eine höhere Konzentration aufweist, als die Flüssigkeiten 1 und/oder 3. Für das dem Schritt (i) vorgeschaltete Equilibrieren des Sorbenzes 1 hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn der Puffer eine Konzentration im Bereich von 250 bis 3000 mM aufweist. Weiterhin ist es sinnvoll, einen Puffer aus demselben Säure/Salz-System zu wählen, wie er als Flüssigkeit 1 verwendet wird und der denselben pH-Wert aufweist, wie die danach verwendete Flüssigkeit 1. Anschließend kann das Sorbens 1 vor dem Aufbringen der Mischung im Schritt (i) zusätzlich noch mit der Flüssigkeit 1 gespült werden.
Für den Schritt (iv) wird als zum Equilibrieren verwendete Flüssigkeit vorzugsweise eine Säurelösung verwendet, insbesondere Essigsäurelösung. Diese sollte eine Konzentration im Bereich von 200 bis 600 mM aufweisen. Anschließend kann auch vor dem Schritt (iv) das Sorbens 2 mit der Flüssigkeit 3 gespült werden, um den pH-Wert des Sorbenzes auf die zum Auftragen der aus dem Solvent-Detergent-Verfahren erhaltenen Mischungen verwendeten Flüssigkeit 3 einzustellen.
Bei dem optionalen dem Schritt (i) nachgeschalteten Waschschritt des Solvents 1 wird zweckmäßigerweise die im Schritt (i) verwendete Flüssigkeit verwendet.
Beide Sorbenzien 1 und 2 können durch Spülen mit stark basischer Lösung regeneriert und von auf den Sorbenzien verbliebenem Restprotein oder Virenbestandteilen gereinigt werden. Dabei beträgt der pH-Wert der basischen Lösung vorteilhaft mindestens 9, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 10 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natrium- oder Kaliumhydroxid zu verwenden. Vor der Regenerierung insbesondere des Sorbenzes 2 kann das Sorbens zusätzlich noch mit einer Säurelösung gespült werden, insbesondere mit einer Konzentration von zwischen 250 und 1000 mM.
Für die Abtrennung der in der Mischung vorhandenen Bestandteile an organischem Phosphat und ionischer Seife kann das Sorbens 2 mit einer hohen Beladung von bis zu 100 mg/ml zu isolierendem (Blut)Plasmaprotein oder Virenbestandteil, bevorzugt im Bereich von 25 bis 75 mg/ml, beladen werden.
Nach dem Eluieren der (Blut)Plasmaproteine und/oder Virenbestandteile vom Sorbens 2 können die im Solvent-Detergent-Verfahren zugesetzten Reagenzien durch Behandlung mit 70%-igem iso-Propanol in Wasser oder 70%-igem Ethanol in Wasser von der Säule gewaschen werden.
Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der Vorrichtung lassen sich (Blut)Plasmaproteine und Virenbestandteile, insbesondere Immunoglobuline, wie IgG, IgM und IgA, in wenigen Schritten kostengünstig reinigen, wobei gleichzeitig im Ausgangsmaterial vorhandene Viren effektiv inaktiviert werden können. Das folgende Beispiel soll aber nur zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Das Sorbenz 1 wird mit 500 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) gespült und danach mit der gleichen Menge 10 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) equilibriert. Anschließend wird wird eine kommerzielle A + 1 Paste als 10%ige Lösung in 10 mM Citrat-Puffer bei pH 5 auf das Sorbens aufgebracht und mit demselben Puffer gespült. In den zuerst gewonnenen Fraktionen wird Albumin und Transferrin (Ausbeute quantitativ, Reinheit rund 90%) erhalten, die in weiteren Reinigungsstufen (Ionentauscher) gereinigt werden können. Nach dem Auffangen der Albumin/Transferinfraktionen wurde die Säule mit weiterem 10 mM Citrat-Puffer bei pH (5.0) gespült. Anschließend wurde vorgereinigtes IgG durch Spülen mit 100 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4 von der Säure eluiert. Das dabei erhaltene IgG hatte Reinheit von ≥ 80% und wurde in einer Ausbeute von ≥ 98% erhalten. Das Produkt war Albumin- und Transferrinfrei.
Anschließend wurde das erhaltene Zwischenprodukt zunächst durch Ultrafiltration auf etwa 50 mg/mL IgG aufkonzentriert. Danach wurde der Phosphatpuffer durch Diafiltration gegen einen Acetatpuffer mit einer Konzentration von 200 mM und einem pH-Wert von 4,3 bis 4,5 ausgetauscht. Anschließend wurde die Mischung einer Solvent-Detergent-Behandlung unterzogen, indem 1% Triton-X-100 und 0,3% Tri-N-Butylphosphat zugemischt wurden und für 8 bis 16 Stunden lang stehen gelassen wurde.

Vor dem Auftragen dieses Zwischenprodukts auf das Sorbens 2 wurde das Sorbens ebenfalls zunächst durch Spülen mit 400 mM Essigsäurelösung und anschließendem Spülen mit 200 mM Acetatpuffer bei pH 4,3 bis 4,5 equilibriert. Das in Acetatpuffer gelöste Zwischenprodukt wurde auf das Sorbens aufgebracht, wobei eine Beladung im Bereich von zwischen 25 und 75 mg/ml Produkt/Sorbens-Volumen gewählt wurde. Reines IgG wurde durch Spülen mit 200 mM Azetatpuffer bei pH 4,3 bis 4,5 von der Säule eluiert. Schließlich wurde das Sorbens mit 500 mM Essigsäure gespült und IgA und IgM mit einer Ausbeute von ≥ 90% in hoher Reinheit gewonnen. Das so gewonnene IgG als Lösung mit einem Gehalt von 5% weist die folgenden Eigenschaften auf:

Reinheit:	> 99,5%
Ausbeute:	99% (über zwei Säulen)
IgG-Aktivität:	95–105%
IgA:	10–30 μg/ml (≤ 0.01%)
IgM:	0.2 bis 0.7 μg/ml (0.00%)
Albonin:	50–100 μg/ml (≤ 0.05%)
Transferrin:	5–10 μg/ml (0.00%)
Restproteine:	Fibrinogen, Haptoglobolin, 2-Macroglobolin, Apolipoprotein A und B und IgD (alle unter dem Dedektionslimit ≤ 0.01%)
SD-Reagenzien:	Triton	X-100 unter dem Detektionslimit von 5 μg/ml
	TnBP	unter dem Detektionslimit von 0,2 μg/ml

Als Sorbens 1 wurde ein mit Pyridin-4-carboxyamidresten und 3-Carboxamidopropionsäureresten funktionalisiertes Trägermaterial, als Sorbens 2 ein mit 3-Indolpropionamidresten und 4-Imidazolacrylamidresten funktionalisiertes Trägermaterial verwendet. Die kommerzielle A + 1 Paste hatte die folgende Zusammensetzung: IgG: 77%; IgA: 7%; IgM: 3%; Albumin 12%; Transferrin 1%; Gesamtproteingehalt: 75%.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 4534972 [0003]
US 4939106 [0003]
CA 1201063 [0004]
US 4983722 [0004]
DE 69823931 [0005]
EP 1141038 [0012]
EP 1232018 [0012]
WO 2004/085046 [0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

P. Hornwitz et al., Blond, 79, 826–831 (1992) [0002]
M. Pourmokhtar, DARU J. Pharm. Sci. Volume 11, No. 2 (2003) [0002]

Claims

Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend: (i) das Inkontaktbringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist, mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden; (ii) das Inkontaktbringen des Sorbenzes 1 mit dem daran gebundenen (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen; (iii) das Durchführen eines Solvent-Detergent-Verfahrens mit dem vorgereinigten (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil; (iv) das Filtrieren der aus Schritt (iii) enthaltenen Mischung über ein Sorbens 2, wobei die Sorbenzien 1 und 2 feste Trägermaterialien sind, deren Oberflächen jeweils mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Oberfläche des Sorbens 1 mit Pyridin-4-Carboxyamido-Resten und 3-Carboxymidopropionsäure-Resten und die Oberfläche des Sorbens 2 mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens 1 im Schritt (i) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Lösen des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils vom Sorbens 1 im Schritt (ii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Binden des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens im Schritt (i) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 2 in der Nähe des isoelektrischen Punktes pl des gebundenen (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4,0 bis 6,0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6,5 bis 8,5 liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 3 im Bereich von 3,0 bis 6,5 liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil einen isoelektrischen Punkt pl im Bereich von 5,5 bis 8,5 und ein Molekulargewicht von 100 bis 500.000 Da aufweist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil ein Immunoglobulin (G) oder ein natürlicher Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyrrolreste 3-Indolpropionamid-Reste und 3-Azapyrrol-Reste 4-Imidazolacrylamido-Reste darstellen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 1 im Schritt (i) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 1 bis 100, insbesondere 2 bis 20 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Gewicht des aufzureinigenden (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenses im Schritt (i) im Bereich von 2 bis 30, insbesondere 5 bis 20 mg/ml liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 2 im Schritt (ii) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200, insbesondere 80 bis 120 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (ii) erhaltene Mischung vor dem Solvent-Detergent-Verfahren in Schritt (iii) aufkonzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufkonzentration mit Hilfe einer Ultrafiltration durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 2 vor Durchführung des Solvent-Detergent-Verfahrens mit der Flüssigkeit 3 ausgetauscht wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch der Flüssigkeiten 2 und 3 mittels einer Diafiltration erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Solvent-Detergent-Verfahrens durch Zugabe einer nicht-ionischen Seife und eines organischen Phosphats durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Solvens-Detergent-Verfahrens über einen Zeitraum von 4 bis 16 h durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 3 ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 400, insbesondere 150 bis 250 mM ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (i) verwendete Flüssigkeit ein Puffer ist, eine Konzentration im Bereich von 250 bis 3000 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer einen pH-Wert von zwischen 4,0 und 6,0 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (i) das Sorbens mit Flüssigkeit (1) gespült wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (iv) verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH < 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung eine Säure-Konzentration im Bereich von 200 bis 600 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (iv) das Sorbens 2 mit Flüssigkeit 3 gespült wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Waschen nach dem Schritt (i) verwendete Flüssigkeit die Flüssigkeit 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbens durch Spülen mit einer Lösung, einen pH von mindestens 9 aufweist, regeneriert wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Lösung einen pH-Wert von etwa 10 aufweist.