DE60207848T2

DE60207848T2 - Verfahren zur herstellung von konzentrierten menschlichen immunoglobulinen für die therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE60207848T2
Application number: DE60207848T
Authority: DE
Inventors: Sami Abdessatar CHTOUROU; Philippe Paolantonacci; Roland Schmitthaeusler; Jacky Lirochon
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: IL158893A0; WO2002092632A1; AU2002257887A2; EP1385886A1; US7186410B2; FR2824568A1; DK1385886T3; ATE312120T1; CA2446704C; JP4445202B2; DE60207848D1; CA2446704A1; IL158893A; FR2824568B1; EP1385886B1; JP2005500265A; US20040132979A1; ES2254676T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Konzentraten von Human-Immunglobulinen für die therapeutische Verwendung aus Human-Plasma oder einer Human-Plasma-Fraktion. Das Verfahren erlaubt die Herstellung von Konzentraten von Human-Immunglobulinen G (IgG), Human-Immunglobulinen A (IgA) und Human-Immunglobulinen M (IgM).
Die Verwendung von Fraktionen von Humanplasma, die an Immunglobulinen angereichert sind, für die Behandlung verschiedener Infektionen oder kongenitaler (angeborener) Defekte, ist seit der Entwicklung des Präzipitationsverfahrens mit Ethanol von Cohn bereits bekannt (vgl. Cohn et al., 1946, "J. Am. Chem. Soc." 68, 459; Oncley et al., 1949, "J. Am. Chem. Soc." 71, 541). Da sich die therapeutischen Indikationen für Immunglobuline vervielfacht haben, besteht ein Bedarf für ein immer leistungsfähigeres und reineres Produkt.
Die Komplexität der Struktur der Immunglobuline (vier Polypeptid-Ketten, die durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind), die Vielzahl der Antikörper, die in der Plasmamischung von mehreren Tausend Spendern enthalten sind, stellen derzeit keine Faktoren dar, welche die biotechnologische Entwicklung von Immunglobulinen begünstigen. Obgleich monoklonale Antikörper durch gentechnische Verfahren hergestellt werden können, stellt ihre extreme Spezifität einen Nachteil für therapeutische Anwendungen dar, bei denen eine Polyreaktivität erforderlich zu sein scheint.
Darüber hinaus werden zahlreiche Pathologien, insbesondere Autoimmunerkrankungen, derzeit behandelt mit IgG-Konzentraten. Diese weit verbreitete Venrvendung hat im Laufe der letzten Jahre zu einer Mangel-Situation in Europa und den Vereinigten Staaten von Amerika geführt.
Darüber hinaus wurde in gerade diesen Pathologien die Wirksamkeit von Präparaten, die angereichert an IgM sind, vor kurzem demonstriert (vgl. Hurez et al. "Blood" 90, 1997, 4004–4013), es gibt bisher jedoch kein Präparat für die therapeutische Verwendung, das ausreichend gereinigt und konzentriert an IgM ist.
Daher hat sich die Anmelderin der Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Human-Immunglobulinen gewidmet. Das Verfahren ist anwendbar auf einen "Pool" von Seren (von mindestens 10 000 Spendern), der die Anwesenheit aller Antikörper gewährleistet, die normalerweise in der Gesamtheit der Population eines ausgewählten Landstriches vorhanden sind, oder es ist anwendbar auf Hyperimmunseren, die wegen ihres Gehaltes an spezifischen Immunglobulinen ausgewählt worden sind. Das Verfahren erlaubt außerdem die Herstellung von Konzentraten an IgA und IgM.
Es wurden bereits zahlreiche Varianten des ursprünglichen Cohn-Verfahrens beschrieben. Darin werden neben der selektiven Präzipitation der Proteine mit Ethanol verschiedene zusätzliche Behandlungen wie die Präzipitation mit Polyethylenglycol, die schonende Behandlung mit proteolytischen Enzymen ... beschrieben, die dazu bestimmt sind, Aggregate von Immunglobulin-Polymeren zu eliminieren (die das Komplement-System aktivieren und anaphylaktische Reaktionen hervorrufen können).
Ein alternativer Weg zur Präzipitation mit Ethanol wurde von Steinbuch et al. in "Rev. Franc. et. Clin. et Biol.", 1969, XIV, 1054), beschrieben, bei dem eine Präzipitation mit Octansäure durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren wird der größte Teil der Proteine des Plasmas präzipitiert und in der überstehenden Flüssigkeit bleiben die Immunglobuline zurück. Die Reinigung dieser Immunglobuline wird durchgeführt durch Adsorption (im "Batch"-Betrieb) an einem Anionenaustauscher, der DEAE-Cellulose, bei der ebenfalls die Immunglobuline in der überstehenden Flüssigkeit zurückbleiben. Diese wird anschließend eingeengt.
Es wurden auch bereits verschiedene Verfahren entwickelt, um die Reinheit der Produkte zu erhöhen durch Durchführung von chromatographischen Trennungen. Die leistungsfähigsten unter ihnen (insbesondere nach EP 0 703 922 , WO 99/64462) umfassen mindestens zwei aufeinanderfolgende chromatographische Stufen, eine durch Behandlung mit Anionenaustauschern, die andere durch Behand lung mit Kationenaustauschern. Die Spezifität dieser Verfahren wird herbeigeführt durch die Eigenschaft der Anionenaustauscher, unter den klassischen Durchführungsbedingungen die Immunglobuline G nicht zurückzuhalten, sondern den größten Teil der anderen gleichzeitig gereinigten Proteine im Verlaufe der Vorreinigungsstufen zu fixieren.
Es stehen bereits verschiedene gereinigte IgG-Präparate zur Verfügung, ihre Herstellungsverfahren bringen jedoch noch Probleme in Bezug auf die Ausbeute und die Schwierigkeit der Durchführung der Verfahren in industriellem Maßstab mit sich. Diese Probleme werden noch verschärft durch die Notwendigkeit, in dem Verfahren eine Virus-Inaktivierung durchzuführen, die eine zusätzliche Stufe zur Eliminierung der verwendeten viriziden Agentien mit sich bringt.
Darüber hinaus wurde die Gesamtheit der bisher beschriebenen Verfahren nur entwickelt und optimiert für die Herstellung von einzelnen IgG.
Die Anmelderin hat nun gefunden, dass es möglich ist, mehrere Konzentrate von Immunglobulinen herzustellen durch Kombinieren einer Vorreinigungsstufe mit einer einzigen Chromatographie-Stufe durch Ionenaustausch und auf diese Weise ein sehr einfaches Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem eine hohe Ausbeute erzielt wird und das mit einer Virizid-Behandlung mit einem Lösungsmittel/Detergens kompatibel ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit anwendbar auf Blutplasma oder eine Blutplasma-Fraktion, das (die) bereits angereichert ist an Immunglobulinen (Ig) und das umfasst eine Vorreinigung durch Präzipitation von Lipid- und Protein-Kontaminanten und eine einzige Chromatographiestufe an Anionenaustauschern, die bei einem alkalischen pH-Wert durchgeführt wird, das die Adsorption der Immunglobuline an dem chromatographischen Anionenaustauscher-Träger erlaubt.
Die Vorreinigung wird mit bekannten Präzipitationsmitteln durchgeführt, wie z.B. Octansäure, Tricalciumphosphat und Bentonit.
Nach dieser Vorreinigungsstufe und vor der Chromatographiestufe umfasst das Verfahren eine Virus-Inaktivierungs-Behandlung, vorzugsweise mit einem Lösungsmittel-Detergens unter Anwendung eines bekannten Verfahrens.
Nach Beendigung dieser Behandlung wird die Mischung aus dem vorgereinigten Filtrat und dem Lösungsmittel-Detergens einer chromatographischen Trennung unterworfen, die an einem vernetzten Polysaccharid- oder Vinylpolymer-Gel, das mit DEAE-, TMAE- oder QAE-Gruppen betfropft ist, durchgeführt wird. Diese Chromatographie-Stufe umfasst:

– die Einstellung der Lösung, die der Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens unterzogen worden ist, auf einen pH-Wert von 8,9 bis 9,1;
– das Einführen derselben in die Chromatographie-Kolonne, die vorher mit einem Puffer von pH 8,9 bis 9,1 äquilibriert worden ist, wodurch die Adsorption der Immunglobuline möglich ist und die nicht-adsorbierten Proteine in den Abstrom gelangen;
– das Waschen mit dem gleichen Puffer bis zur Eliminierung aller nicht-adsorbierten Proteine und der Lösungsmittel-Detergensmischung; und
- das Eluieren der Immunglobuline mit einem geeigneten Puffer. Dieses Eluieren kann durchgeführt werden entweder mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert zwischen 4 und 7, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 6,2, um die Immunglobuline G zu eluieren, oder auf sequentielle Weise:
– in einer ersten Stufe wie vorstehend angegeben, um die Immunglobuline G zu eluieren;
– dann in einer zelten Stufe mit dem gleichen Phosphatpuffer, dem 100 bis 175 mM, vorzugsweise 150 mM, NaCl zugesetzt worden sind, bei einem pH-Wert von 6 bis 6,3, um eine Fraktion zu eluieren, welche die IgA und IgG4 enthält.

Das Verfahren kann dann fortgesetzt werden durch eine neue Elution mit dem gleichen Puffer, der auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt und mit 250 bis 350 mM, vorzugsweise 300 mM, NaCl versetzt worden ist, um die IgM zu eluieren.
Die auf diese Weise eluierten Immunglobuline werden abgetrennt (gewonnen), durch Ultrafiltration eingeengt und einer konventionellen sterilisierenden Filtration und danach einer Filtration durch Nanometer-Filter mit von 100 auf 15 nm abnehmender Porosität, insbesondere durch drei Filter, die hintereinander angeordnet sind und eine von 100 auf 50 und 20 nm abnehmende Schwellenwertsretention aufweisen, unterworfen. Diese Nanofiltration erlaubt die Eliminierung von Viren, die gegenüber der Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens resistent sind.
Die eingeengte und filtrierte Immunglobulin-Lösung wird mit einem pharmazeutisch akzeptablen Stabilisierungsmittel versetzt, dann wird sie im Zustand der sterilen Lösung konditioniert und gegebenenfalls eingefroren und lyophilisiert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
Beispiel I
Als Ausgangsmaterial verwendet man 1 kg des Präzipitats "I + II + III", das hergestellt worden ist aus einem Plasma, das mit Ethanol nach dem Verfahren von Cohn (wie oben erwähnt) oder von Kistler und Nitschmann (1962, "Vox Sang" 7, 414) hergestellt worden ist.
Dieses Präzipitat wird unter Rühren bei 20°C in einem Acetatpuffer (Natriumacetat-Essigsäure) mit einem pH-Wert von 4,7 bis 4,9 suspendiert.
Man gibt Octansäure zu bis zu einer Endkonzentration von 20 g/l. Die Zugabe muss langsam bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden.
Die Mischung wird mit einem Filtrations-Hilfsmittel versetzt und der Niederschlag wird durch Filtration mittels einer Filterpresse abgetrennt.
Das Filtrat wird gewonnen, geklärt und durch Ultrafiltration eingeengt, dann wird es einer sterilisierenden Filtration bei 0,45 μm und 0,2 μm unterzogen. Anschließend wird es einer Virusinaktivierungs-Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens unterworfen, wie von Neurath und Horowitz in dem US-Patent Nr. 4 764 369 beschrieben. Man verwendet eine Mischung aus Triton^® X 100 (Octoxinol 10) und TnBP.
Die Mischung wird auf 64 g/l Proteine eingestellt bei pH 6,5. Der Kontakt wird 4 bis 6 h lang zwischen 4 und 25°C aufrechterhalten. Anschließend wird der pH-Wert auf 9 eingestellt (mittels NaOH).
Danach wird die Mischung einer Anionenaustausch-Chromatographie in einer Kolonne unterworfen. Als Anionenaustauschermaterial verwendet man TMAE-Fractogel^®, das in eine Chromatographie-Säule eingeführt und mit einem Glycin-NaCl-Puffer (Glycin: 0,676 g/l-NaCl: 0,526 g/l) bei pH 9 äquilibriert wird. Die Mischung wird in die Kolonne in einer Menge von 50 g Proteinen pro Liter Gel eingeführt.
Nach dem Füllen wird die Kolonne mit einem Glycin-NaCl-Puffer von pH 9 gewaschen (der gleiche Puffer, wie er für die Äquilibrierung verwendet worden ist). Das Waschen wird anhand der optischen Dichte des Abstroms bei 280 nm überwacht.
Nach der Rückkehr zu der Basislinie wird die Kolonne mit einem Phosphatpuffer (Dinatriumhydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphat) bei pH 6,2 eluiert. Das Eluat, welches die Immunglobuline G enthält, wird auf pH 4,5 eingestellt und einer Ultrafiltration über Kassetten unterworfen.
Die Lösung wird anschließend einer sterilisierenden Filtration bei 0,22 μm und danach einer nanometrischen Filtration über drei Filter, die hintereinander angeordnet sind und eine von 100 auf 50 und 20 nm abnehmende Schwellenwertsretention aufweisen, unterzogen. An die Filtration schließt sich eine Ultrafiltration über eine Kassette an, um die Endlösung auf 120 bis 150 g/l einzuengen.
Die Analysen-Ergebnisse von drei Probechargen sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
Tabelle I: Probechargen
Beispiel II
Als Ausgangsmaterial verwendet man 1670 g "Präzipitat II", das aus 80 I Plasma, das mit Ethanol nach dem Cohn-Verfahren behandelt worden ist, hergestellt wurde.
Diese Verfahrensvariante erlaubt es insbesondere, einen Teil der eingefrorenen und gelagerten Präzipitate II abzuziehen, um diesen einer Behandlung zuzuführen.
Dieses Präzipitat wird in 9 kg Wasser-NaCl suspendiert. Der pH-Wert wird mit Essigsäure auf 6,2 eingestellt.
Als Adsorbens (Kontaminanten vom Lipid-, Kallikrein-Typ ...) gibt man 15 g Tricalciumphosphat zu. Nach 1-stündigem Kontakt wird die Mischung mit einem Filtrationsadjuvans versetzt und der Niederschlag wird durch Filtration unter Verwendung einer Filterpresse abgetrennt.
Das Filtrat wird gewonnen, mit Glycin (15 g/l) versetzt und mit Essigsäure auf pH 4,8 eingestellt. Als Adsorbens (insbesondere Spuren von aktiven Koagulationsfaktoren) gibt man 80 g Bentonit unter Rühren über einen Zeitraum von 30 min zu. Die Mischung wird mit einem Filtrationsadjuvans versetzt und der Niederschlag wird durch Filtration unter Verwendung einer Filterpresse abgetrennt.
Das Filtrat wird gewonnen (abgetrennt), durch Ultrafiltration eingeengt. Das Verfahren wird fortgesetzt (durch Behandlung mit einem Lösungsmittel/Detergens und Chromatographie) wie im Beispiel I angegeben.
Die Analysen-Ergebnisse von drei Probechargen sind in der folgenden Tabelle II angegeben.
Tabelle II: Probechargen
Beispiel III
Das Verfahren wird auf die gleiche Weise wie das Beispiel I durchgeführt, bei dem Ausgangsmaterial handelt es sich jedoch um ein Plasma, das nicht mit Ethanol präzipitiert worden ist.
Diese Variante ist nicht vorteilhaft im Hinblick auf die Ausbeute, sie bietet jedoch einen Vorteil (aufgrund ihrer verminderten Anzahl von Stufen) für die Behandlung von Plasmen, die besonders reich an seltenen Antikörpern sind.
Beispiel IV
Das Verfahren wird auf die gleiche Weise wie das Beispiel I durchgeführt, jedoch wird nach der Chromatographie auf sequentielle Weise wie folgt eluiert: nach dem Befüllen und Waschen der Kolonne wird diese mit einem ersten Phosphatpuffer bei pH 6,2 eluiert, um die IgG wie in Beispiel I zu eluieren; anschließend wird mit dem gleichen Puffer, dem 150 mM NaCl zugesetzt worden sind, eluiert, der eine Fraktion eluiert, die angereichert ist an IgA und IgG4.
Die IgG4 scheinen eine Rolle zu spielen beim Schutz gegen Parasiteninfektionen und gegen Pollen- und Akariden(Milben)-Allergien.
Überraschenderweise sind ihre biochemischen Eigenschaften und ihr Verhal ten beim Ionenaustausch mit den IgA verwandt.
Beispiel V
Das Verfahren wird auf die gleiche Weise wie das Beispiel VI durchgeführt, nach der zweiten Elution, bei der die an IgA angereicherte Fraktion erhalten wird, wird jedoch der gleiche Puffer mit 300 mM NaCl versetzt, wodurch die IgM abgelöst werden. Man erhält auf diese Weise eine Fraktion, die an IgM konzentriert ist (bis zu 80%). Diese wird eingeengt und mit pharmazeutisch akzeptablen Stabilisierungsmitteln versetzt.
Die Ergebnisse der Herstellung einer Charge an konzentrierten IgM sind in der folgenden Tabelle III angegeben.
Tabelle III

Claims

Verfahren zur Herstellung von Human-Immunglobulin-Konzentraten für die therapeutische Verwendung aus Blutplasma oder einer Plasmafraktion, die an Immunglobulinen angereichert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst eine Vorreinigung durch Präzipitation von Lipid- und Protein-Kontaminanten und eine einzige Chromatographie-Stufe, die unter Verwendung eines Anionen-Austauschers bei einem alkalischen pH-Wert durchgeführt wird, wodurch die Adsorption der Immunglobuline an dem Anionen-Austauscher ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorreinigung mittels bekannter Präzipitationsmittel, wie z.B. Octansäure, Tricalciumphosphat, Bentonit, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es nach der Vorreinigung und vor der Chromatographie eine Virus-Inaktivierungsbehandlung, vorzugsweise mit einem Lösungsmittel-Detergens, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie an einem vernetzten Polysaccharid- oder Vinylpolymer-Gel mit aufgepfropften DEAE- oder TMAE- oder QAE-Gruppen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie umfasst – die Verwendung einer Lösung, die einer Lösungsmittel-Detergens-Behandlung unterworfen worden ist; –ihre Einstellung auf einen pH-Wert von 8,9 bis 9,1; – ihre Aufgabe auf die vorher in einem Puffer bei pH 8,9 bis 9,1 äquilibrierte Chromatographie-Kolonne, welche die Adsorption der Immunglobuline und den Durchlauf der nicht adsorbierten Proteine in den Abstrom ermöglicht; – das Waschen mit dem gleichen Puffer bis zur Eliminierung aller nicht-adsorbierten Proteine und der Lösungsmittel-Detergens-Mischung; und – das Eluieren der Immunglobuline mit einem geeigneten Puffer.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluieren in einer Stufe mit einem Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 und vorzugsweise bei pH 6,2 durchgeführt wird, um die Immunglobuline G zu eluieren.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluieren sequentiell durchgeführt wird, – in einer ersten Stufe mit einem Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 und vorzugsweise bei pH 6,2, um die Immunglobuline G zu eluieren; und – in einer zweiten Stufe mit dem gleichen Phosphat-Puffer, dem 100 bis 175 mM NaCl, vorzugsweise 150 mM NaCl zugesetzt worden sind, bei einem pH-Wert von 6 bis 6,3, um eine Fraktion zu eluieren, welche die TgA und IgG4 enthält.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem umfasst ein Eluieren mit dem gleichen Puffer, der auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt worden ist und dem 250 bis 350 mM NaCl, vorzugsweise 300 mM NaCl zugesetzt worden sind, um die IgM zu eluieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Eluieren der Immunglobuline diese abgetrennt (gewonnen), durch Ultrafiltration konzentriert und einer konventionellen sterilisierenden Filtration und danach einer Filtration durch Nanometer-Filter mit einer von 100 nm auf 15 nm abnehmenden Porosität unterworfen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die konzentrierte und filtrierte Immunglobulin-Lösung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Stabilisierungsmittel versetzt und dann im Zustand einer sterilen Lösung konditioniert und gegebenenfalls eingefroren und lyophilisiert wird.