JP4445202B2 - 治療的使用のためのヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、血漿またはヒト血漿の画分からの、治療的使用のためのヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法に関する。本発明の方法は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）を得ることを可能にする。

Ｃｏｈｎによるエタノール沈殿方法の発達から、様々な感染症、または先天性欠乏症の治療のための免疫グロブリンを濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）された、ヒト血漿の使用が公知である（Ｃｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， １９４６， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ６８， ４５９； Ｏｎｃｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９４９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ７１， ５４１）。免疫グロブリンの治療的適用が増加するにつれ、非常に増大した能力（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、および純度を提供する生産物が必要である。

免疫グロブリンの構造の複雑さ（ジスルフィド結合によって連結された４つのポリペプチド鎖）、および数千人のドナーの血漿混合物中に存在する多様な抗体は、現在、免疫グロブリンの生物工学的開発に有利な要因ではない。いくつかのモノクローナル抗体が、遺伝子工学によって作製されたが、それらの極度の特異性は、多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が必要と考えられる、治療的適用に対する欠点を示した。

加えて、数々の病状、特に、自己免疫起原（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｏｒｉｇｉｎ）は、現在、ＩｇＧ濃縮物を用いて処理される。この広範にわたる使用は、ここ数年のヨーロッパおよびアメリカ合衆国における、不足を招いている。

さらに、これら同様の病理学において、近年、ＩｇＭ濃縮調製物の効果が示されてきた（Ｈｕｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９０， １９９７， ４００４−４０１３）が、十分に精製され、かつ十分なＩｇＭ濃度を有する治療的使用のための調製物は、存在しない。

これが、本出願人が新たなヒト免疫グロブリンの調製方法の開発に、傾倒した理由である。この方法を、選ばれた領域の個体群を通して通常存在する、全ての抗体の存在を裏付ける、（少なくとも１００００人の提供者からの）血清のプール（ｐｏｏｌ）に適用することができ、またはそれらの特異的免疫グロブリン内容物に対して選択される高度免疫血清に適用することができる。さらに、この方法は、ＩｇＡおよびＩｇＭ濃縮物の調製を可能にする。

オリジナルのＣｏｈｎ法の数々の改良型が記載されてきた。それらは、エタノールを用いたタンパク質の選択的沈殿に加え、ポリエチレングリコールでの沈殿、タンパク質分解酵素での穏やかな処理等、（補体システムを活性化させ、アナフェラキシー反応を引き起こしやすい）免疫グロブリンポリマーの凝集体を除去することを意図した、様々な付加的処理を提案する。

エタノール沈殿に代わるアプローチが、Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈらによって記載される（Ｒｅｖ． Ｆｒａｎc． Ｅｔ． Ｃｌｉｎ． ｅｔ Ｂｉｏｌ． １９６９， ＸＩＶ， １０５４）；このアプローチは、オクタン酸を用いた沈殿を使用する。この酸は、血漿中の殆どのタンパク質を沈殿し、上清中に免疫グロブリンを残す。これらの免疫グロブリンの精製は、同様に上清中に免疫グロブリンを残すアニオン交換器（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）、すなわちＤＥＡＥ−セルロースを使用し、（“バッチ”における）吸着作用によって、続けられる。その後、後者は濃縮される。

同様に、クロマトグラフ分離方法の使用を通して、生産物の純度を上げるために、様々な方法が開発されてきた。最も良い性能を生み出すもの（特にＥＰ０７０３９２２，ＷＯ９９／６４４６２）は、２つの連続的なクロマトグラフィー工程を含み、１つはアニオン交換を使用し、もう１つはカチオン交換を使用する。これらの方法の特異性は、従来の実施条件下において、免疫グロブリンＧを吸着しないが、前精製工程の間、共精製される他のタンパク質の大半を固定する、アニオン交換器の特性によって提供される。

従って、様々な精製されたＩｇＧ調製物がすでに利用可能であるが、それらの調製方法は、工業規模での実施の複雑性、および生産性の点では、未だ、問題を示す。これらの問題は、使用された殺ウイルス剤を除去するための追加工程に関連する、ウイルスの不活性化方法を含む必要性により、さらに増大される。

加えて、現在記載した全ての工程は、ＩｇＧのみの製造のために開発され、最適化されている。

本出願人は、前精製工程、および単一イオン交換クロマトグラフィー工程を組み合わせることによって、いくつかの免疫グロブリン濃縮物を製造することが可能であることを見出し、従って、高生産性および殺ウイルス性溶媒−界面活性剤処理に適合した、極めて簡易な方法を提供する。

本発明による方法は、したがって、血漿またはすでに免疫グロブリンを濃縮した血漿の画分に適用でき、そして、脂質（ｌｉｐｉｄｉｃ）、およびタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）の汚染物質の沈殿による前精製、およびアルカリ性ｐＨにて行われ、アニオン交換クロマトグラフ材料上への免疫グロブリンの吸着を可能にする、単一アニオン交換クロマトグラフィー工程を含む。

前精製は、オクタン酸、リン酸三カルシウム、またはベントナイト等の、公知の沈殿剤によって行われる。

この前精製工程の後、およびクロマトグラフィー前に、前記プロセスは、好ましくは、公知の方法に従った、溶媒−界面活性剤を用いた、ウイルス不活性化工程を含む。

この処理の最後に、前精製濾過液、および溶媒−界面活性剤混合物を、架橋多糖類、またはビニルポリマーのＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、またはＱＡＥ基−グラフト化ゲルを使用して行われる、クロマトグラフ分離にかける。クロマトグラフィー工程は、以下を含む：
―溶媒−界面活性剤処理をした溶液を、ｐＨ８．９〜９．１に調整する；
―免疫グロブリンの吸着を許容し（ｐｅｒｍｉｔ）、そして非吸着タンパク質を溶出液中に流出させる（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）、ｐＨ８．９〜９．１の緩衝液で前もって平衡化されたクロマトグラフカラム上に注入すること；
―全ての非吸着タンパク質、および溶媒−界面活性剤混合物が除去されるまで、同一の緩衝液で洗浄すること；ならびに
―好適な緩衝液で免疫グロブリンを溶出すること。

前記溶出は、免疫グロブリンＧを溶出するため、ｐＨ４〜７の間、好ましくは、ｐＨ６．２のリン酸緩衝液か、または、連続して以下：
―最初に、上記のように免疫グロブリンを溶出し；
―後に、ＩｇＡおよびＩｇＧ４を含む画分を溶出するため、１００〜１７５ｍＭ ＮａＣｌ、および好ましくは、１５０ｍＭを加えた、ｐＨ６．０〜６．３の前記と同一のリン酸緩衝液を使用すること、
のいずれでも行うことが可能である。

前記方法に、ＩｇＭを溶出するため、２５０〜３５０ｍＭ ＮａＣｌ、および好ましくは３００ｍＭを加え、ｐＨ６〜７に調整した前記と同一の緩衝液で、さらに溶出を続けることが可能である。

このようにして溶出された免疫グロブリンを、採取し、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）によって濃縮し、通常の濾過滅菌（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）にかけた後、１００から１５ナノメーターに減少する多孔度のナノメトリックフィルター（ｎａｎｏｍｅｔｒｉｃ ｆｉｌｔｅｒ）を通す濾過であって、特に、連続して配置され、保持の減少閾値（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）：１００、５０および２０ナノメートルを有する３つのフィルターを用いる濾過にかける。このナノ濾過は、除去される溶媒−界面活性剤処理にウイルス耐性を与える。

薬学的に許容される安定剤を、濃縮、および濾過した免疫グロブリン溶液に加え、そして後者をその後、無菌溶液として包装し、また、任意に低温凍結および凍結乾燥する。

以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、限定するものではない。
実施例Ｉ
出発材料として、Ｃｏｈｎ法（すでに記載済み）、またはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ法（１９６２， Ｖｏｘ Ｓａｎｇ． ７， ４１４）に従うエタノールで処理した血漿から得られた“Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ”沈殿物１ｋｇを使用する。

この沈殿物を、ｐＨ４．７〜４．９の酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム―酢酸）中に、、２０℃にて攪拌しながら、再懸濁する。

そこに、最終濃度２０ｇ／ｌまでオクタン酸を加える。この酸は、周囲温度にて、徐々に加えるべきである。

この混合物に濾過助剤（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｉｄ）を加え、そしてフィルタープレスによって濾過することで、この沈殿物を分離する。

濾液（ｆｉｌｔｒａｔｅ）を回収し、清澄にし（ｃｌａｒｉｆｙ）、そして限外濾過によって濃縮し、その後、それを０．４５μｍおよび０．２μｍにて滅菌濾過にかける。

その後、それを、ＮｅｕｒａｔｈおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ４，７６４，３６９）によって記載される、溶媒−界面活性剤ウイルス不活性化処理にかける。

Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）×１００（ｏｃｔｏｘｉｎｏｌ １０）／ＴｎＢＰ混合物を使用する。

この混合物を、６４ｇ／ｌのタンパク質、ｐＨ６．５に調整した。接触（Ｃｏｎｔａｃｔ）を、４〜６時間、４〜２５℃の間に保つ。その後、このｐＨを、（ＮａＯＨで）９に調整する。

その後、この混合物を、カラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーにかける。

クロマトグラフカラムを、アニオン交換材料として使用されるＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）で満たし、ｐＨ９のグリシン−ＮａＣｌ緩衝液（グリシン：０．６７６ｇ／ｌ−ＮａＣｌ：０．５２６ｇ／ｌ）で平衡化する。

この混合溶液を、ゲル１リットルに対しタンパク質５０ｇの割合で、前記カラム上に注入する。

一旦これを行うと、前記カラムを（平衡化の目的と同様に）ｐＨ９のグリシン−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄する。この洗浄液を、２８０ｎｍの溶出液の光学濃度でモニターする。

ベースライン光学密度（ｂａｓｅ ｌｉｎｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）に到達した後、前記カラムをｐＨ６．２のリン酸緩衝液（リン酸一水素二ナトリウム−リン酸二水素一ナトリウム）で溶出する。

免疫グロブリンＧを含む、この溶出液を、ｐＨ４．５に調整し、そしてカセットを使用する限外濾過にかける。

その後、この溶液を、０．２２μｍにて滅菌濾過にかけ、その後、連続して（ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ）配置され、保持の減少閾値（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）：１００、５０および２０ナノメーターを有する、３つのフィルターを使用したナノメトリック濾過にかける。濾過の次にカセットを用いた限外濾過を行い、最終溶液を１２０−１５０ｇ／ｌに濃縮する。

３つのパイロットバッチに対する解析結果を、以下の表に示す。

実施例ＩＩ
出発材料として、Ｃｏｈｎ法に従うエタノールで処理した８０リットルの血漿から得られた、１６７０ｇの“沈殿物ＩＩ”を使用する。

この方法の変形（ｖａｒｉａｎｔ）は、特に、さらなる処理にかけられる前に、低温凍結および保存されたタイプＩＩ沈殿物を利用することを可能にする。

この沈殿物を、９ｋｇの水−ＮａＣｌ混合溶液に再懸濁する。このｐＨは、酢酸で６．２に調整される。

そこに、（脂質型、カリクレイン等の汚染物質に対する）吸着剤として１５ｇのリン酸三カルシウムを加える。

接触の１時間後、この混合物に濾過助剤を加え、そしてフィルタープレスによって濾過することで、この沈殿物を分離する。

この濾液を回収し、グリシン（１５ｇ／ｌ）をそこに加え、そして酢酸でｐＨ４．８に調整する。

３０分間攪拌しながら、吸着剤として（特に、活性化凝固因子の痕跡のため）８０ｇのベントナイトを、そこに加える。

この混合溶液に濾過助剤を加え、そしてフィルタープレスによって濾過することで、この沈殿物を分離する。

この濾過物を回収し、限外濾過によって濃縮する。

この方法を、実施例Ｉのように、（溶媒−界面活性剤処理およびクロマトグラフィーによって）続ける。

３つのパイロットバッチに対する解析結果を、以下の表に示す。

実施例ＩＩＩ
この方法は、実施例Ｉと同様の方法にて実施することができるが、出発材料は血漿（エタノールで沈殿されていない）である。

この変形は、生産性の観点からは有利ではないが、（工程の数が少ないおかげで）とりわけ希少な抗体の高い含有量を与える（ｐｒｅｓｅｎｔ）血漿の処理は興味深い。
実施例ＩＶ
この方法は、実施例Ｉと同様の方法にて実施することができるが、クロマトグラフカラムを連続して溶出する：
カラムの注入および洗浄の後、実施例Ｉのように、ＩｇＧを溶出するためにｐＨ６．２の最初のリン酸緩衝液で溶出する；
次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌを加え、ＩｇＡおよびＩｇＧ４−濃縮画分を溶出する、同一の緩衝液で溶出する。

ＩｇＧ４は、寄生虫感染症、ならびに花粉およびダニ類に対するアレルギーからの防御において役割を果たすと考えられる。

驚いたことに、それらの生化学的特性、およびイオン交換中の挙動は、免疫グロブリンＡに似ている。
実施例Ｖ
この方法は、実施例ＩＶと同様の方法にて実施することができるが、ＩｇＡ濃縮画分を産生する２度目の溶出の後、同一の緩衝液に３００ｍＭ ＮａＣｌを加え、この緩衝液が、ＩｇＭを脱着させる。このようにしてＩｇＭの濃縮画分（８０％）が得られる。これらは、濃縮され、そしてそこに薬学的に許容される安定剤が加えられる。

濃縮ＩｇＭのバッチに対するこの産生結果を、以下の表に示す。

Claims (15)

1. 脂質およびタンパク質の汚染物質を沈殿することによる前精製、およびアニオン交換クロマトグラフ材料上に免疫グロブリンを吸着させることを可能にする、アルカリ性ｐＨにて行われる単一アニオン交換クロマトグラフィー工程を含むことで特徴付けられる、血漿または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分からの、治療的使用のためのヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法。
2. ａ）脂質およびタンパク質の汚染物質を沈殿することによる前精製工程；
   ｂ）工程ａ）からの溶液をアルカリ性ｐＨに調整する工程；
   ｃ）工程ｂ）の溶液を免疫グロブリンの吸着を許容するようにアニオン交換クロマトグラフ材料上に注入する工程；ならびに
   ｄ）緩衝液で免疫グロブリンを溶出する工程
   を含むことを特徴とする、血漿または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分からの、治療的使用のためのヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法。
3. 前記精製が、公知の沈殿剤によって行われることで特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前精製後およびクロマトグラフィーの前に、ウイルス不活性化処理を含むことで特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 架橋した多糖類またはビニルポリマーのＤＥＡＥ、ＴＭＡＥまたはＱＡＥ基−グラフト化ゲルを使用してクロマトグラフィーが行われることで特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. クロマトグラフィーが以下：
   −溶媒−界面活性剤処理を行った溶液の使用；
   −ｐＨ８．９〜９．１への調整；
   −免疫グロブリンの吸着を許容し、非吸着タンパク質を溶出液中に流出させる、ｐＨ８．９〜９．１の緩衝液で前もって平衡化されたクロマトグラフカラム上に注入すること；
   −上記と同一の緩衝液で、全ての非吸着タンパク質および溶媒−界面活性剤混合溶液が除去されるまで洗浄すること；ならびに
   −緩衝液で免疫グロブリンを溶出すること
   を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 免疫グロブリンＧを溶出するために、ｐＨ４〜７の間のリン酸緩衝液を用いて、１工程にて溶出が行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 溶出が連続的に以下：
   −最初に、免疫グロブリンＧを溶出するために、ｐＨ４〜７の間のリン酸緩衝液を使用すること；
   ―次に、ＩｇＡおよびＩｇＧ４を含む画分を溶出するため、１００〜１７５ｍＭ ＮａＣｌを加えた、ｐＨ６．０〜６．３の同一のリン酸緩衝液を使用すること
   を行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
9. さらに、ＩｇＭを溶出するために、２５０〜３５０ｍＭ ＮａＣｌを加え、ｐＨ６〜７に調整した同一の緩衝液を用いた溶出を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
10. 免疫グロブリンの溶出後、これらを採取し、限外濾過によって濃縮し、そして通常の濾過滅菌にかけた後、１００から１５ナノメーターに減少する多孔度のナノメトリックフィルターを通す濾過にかけることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 薬学的に許容される安定剤を、濃縮、および濾過した免疫グロブリン溶液に加え、そして後者をその後、無菌溶液として包装することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前精製後およびクロマトグラフィーの前に、溶媒−界面活性剤を使用するウイルス不活性化処理を含むことで特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
13. 免疫グロブリンＧを溶出するために、ｐＨ６．２のリン酸緩衝液を用いて、１工程にて溶出が行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
14. 溶出が連続的に以下：
    −最初に、免疫グロブリンＧを溶出するために、ｐＨ６．２のリン酸緩衝液を使用すること；
    ―次に、ＩｇＡおよびＩｇＧ４を含む画分を溶出するため、１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた、ｐＨ６．０〜６．３の同一のリン酸緩衝液を使用すること
    を行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
15. さらに、ＩｇＭを溶出するために、３００ｍＭ ＮａＣｌを加え、ｐＨ６〜７に調整した同一の緩衝液を用いた溶出を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。