JPH06136000A - 免疫血清グロブリンの精製方法 - Google Patents
免疫血清グロブリンの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、活性なウイルス、夾雑脂質、活性
化補体及び低分子量ペプチドを実質的に含まず効率的で
大量生産に適する免疫血清グロブリン分画の精製方法を
提供することを目的とする。 【構成】 粗製の血漿蛋白分画の水性懸濁液から免疫血
清グロブリン以外の蛋白質を蛋白質沈澱剤によって沈澱
させ、この上澄にウイルス不活化剤を加え、次いで陽イ
オン交換樹脂に吸着させて夾雑物を洗浄除去した後、溶
出液を限外濾過により濃縮するとともに低分子量物質を
分離除去し、更に該濃縮液を陰イオン交換樹脂に接触さ
せ、夾雑物が吸着している条件下で該免疫血清グロブリ
ンを通過させ、濾液を分子洗浄することよりなる、精製
された免疫血清グロブリンの製造方法。
化補体及び低分子量ペプチドを実質的に含まず効率的で
大量生産に適する免疫血清グロブリン分画の精製方法を
提供することを目的とする。 【構成】 粗製の血漿蛋白分画の水性懸濁液から免疫血
清グロブリン以外の蛋白質を蛋白質沈澱剤によって沈澱
させ、この上澄にウイルス不活化剤を加え、次いで陽イ
オン交換樹脂に吸着させて夾雑物を洗浄除去した後、溶
出液を限外濾過により濃縮するとともに低分子量物質を
分離除去し、更に該濃縮液を陰イオン交換樹脂に接触さ
せ、夾雑物が吸着している条件下で該免疫血清グロブリ
ンを通過させ、濾液を分子洗浄することよりなる、精製
された免疫血清グロブリンの製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫血清グロブリンの
精製方法に関する。更に具体的には、本発明は粗製の血
漿蛋白分画からの免疫血清グロブリンの精製方法に関す
る。
精製方法に関する。更に具体的には、本発明は粗製の血
漿蛋白分画からの免疫血清グロブリンの精製方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血漿蛋
白質は、哺乳類の体内において、幅広い種々の機能を果
たしている。これらの蛋白質は血液の量、粘性、浸透圧
その他の重要な物理的パラメーターの維持に関与してい
る。ある種の血漿蛋白質は、それ自体重要な生物学的に
活性な分子であるか、又は、活性な非蛋白質分子の担体
としての機能を営んでいる。血漿蛋白質のうち大きな一
群をなすものが免疫反応に関与している。ガンマグロブ
リンとしても知られている免疫血清グロブリンには多く
の病原性物質に対抗する抗体が包含される。
白質は、哺乳類の体内において、幅広い種々の機能を果
たしている。これらの蛋白質は血液の量、粘性、浸透圧
その他の重要な物理的パラメーターの維持に関与してい
る。ある種の血漿蛋白質は、それ自体重要な生物学的に
活性な分子であるか、又は、活性な非蛋白質分子の担体
としての機能を営んでいる。血漿蛋白質のうち大きな一
群をなすものが免疫反応に関与している。ガンマグロブ
リンとしても知られている免疫血清グロブリンには多く
の病原性物質に対抗する抗体が包含される。
【０００３】臨床上の最適の有用性を達成する目的で、
一又はそれ以上の血漿蛋白質を濃縮し精製した形で含有
する治療剤を製造するために人の血漿分画が長い間使用
されてきた。ヒトの血漿から臨床上有用な蛋白質を回収
するためには、様々な分画法が使用されてきた。広く用
いられている一つの方法は、よく知られているＣｏｈｎ
分画法であり、これは冷エタノールを使用した分別的沈
澱を基礎としている〔Ｃｏｈｎ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，６８，４５９（１９４６）〕。Ｃｏｈｎ
分画法は、最初に粗製の血漿蛋白分画を製造し、次いで
これを精製して精製品とする。粗製の血漿蛋白分画から
免疫血清グロブリン分画を精製するための効率的な方法
が求められている。かかる方法は大量生産に適し且つ粗
製の血漿分画に存するかも知れない、血液により媒介さ
れるいかなるウイルスをも不活化しなければならない。
一又はそれ以上の血漿蛋白質を濃縮し精製した形で含有
する治療剤を製造するために人の血漿分画が長い間使用
されてきた。ヒトの血漿から臨床上有用な蛋白質を回収
するためには、様々な分画法が使用されてきた。広く用
いられている一つの方法は、よく知られているＣｏｈｎ
分画法であり、これは冷エタノールを使用した分別的沈
澱を基礎としている〔Ｃｏｈｎ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，６８，４５９（１９４６）〕。Ｃｏｈｎ
分画法は、最初に粗製の血漿蛋白分画を製造し、次いで
これを精製して精製品とする。粗製の血漿蛋白分画から
免疫血清グロブリン分画を精製するための効率的な方法
が求められている。かかる方法は大量生産に適し且つ粗
製の血漿分画に存するかも知れない、血液により媒介さ
れるいかなるウイルスをも不活化しなければならない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、粗製の
血漿蛋白分画から免疫血清グロブリンを精製するための
方法が提供される。この方法は次の各段階を含む。すな
わち、粗製の血漿蛋白分画を水に懸濁し、血清グロブリ
ン以外の蛋白質の大部分を蛋白質沈澱剤で沈澱させ、免
疫血清グロブリン含有上澄を回収し、この免疫血清グロ
ブリン含有上澄にウイルス不活化剤を加え、免疫血清グ
ロブリンを陽イオン交換樹脂に吸着させ、該樹脂から血
清グロブリン以外の夾雑物を洗浄除去し、免疫血清グロ
ブリンを陽イオン交換樹脂から溶出し、溶出液を限外濾
過に付して免疫血清グロブリンを濃縮するとともに低分
子量物質から分離し、この濃縮液を陰イオン交換樹脂に
接触させて血清グロブリン以外の夾雑物を吸着させ、血
清グロブリン以外の夾雑物が樹脂に結合して残留する条
件下で免疫血清グロブリンを該陰イオン交換樹脂を通過
させ、得られた濾液を分子洗浄段階に付して精製された
免疫血清グロブリン分画を製する。
血漿蛋白分画から免疫血清グロブリンを精製するための
方法が提供される。この方法は次の各段階を含む。すな
わち、粗製の血漿蛋白分画を水に懸濁し、血清グロブリ
ン以外の蛋白質の大部分を蛋白質沈澱剤で沈澱させ、免
疫血清グロブリン含有上澄を回収し、この免疫血清グロ
ブリン含有上澄にウイルス不活化剤を加え、免疫血清グ
ロブリンを陽イオン交換樹脂に吸着させ、該樹脂から血
清グロブリン以外の夾雑物を洗浄除去し、免疫血清グロ
ブリンを陽イオン交換樹脂から溶出し、溶出液を限外濾
過に付して免疫血清グロブリンを濃縮するとともに低分
子量物質から分離し、この濃縮液を陰イオン交換樹脂に
接触させて血清グロブリン以外の夾雑物を吸着させ、血
清グロブリン以外の夾雑物が樹脂に結合して残留する条
件下で免疫血清グロブリンを該陰イオン交換樹脂を通過
させ、得られた濾液を分子洗浄段階に付して精製された
免疫血清グロブリン分画を製する。
【０００５】この方法のための出発原料は、免疫血清グ
ロブリンを含有しているいかなる粗製の血漿蛋白分画で
あってもよい。好ましい出発原料は、Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋
ＩＩ＋ＩＩＩである。この方法は効率と大量生産への適
合性という点において、特に有利であることが判明して
いる。加えて、この方法は活性なウイルスを実質的に含
まず、かつ、有害な生理学的作用を与え得る夾雑脂質、
活性化補体（例えばＣ５ａ、Ｃ３ａ等）及び低分子量ペ
プチド等を実質的に含有しない製品を与える。
ロブリンを含有しているいかなる粗製の血漿蛋白分画で
あってもよい。好ましい出発原料は、Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋
ＩＩ＋ＩＩＩである。この方法は効率と大量生産への適
合性という点において、特に有利であることが判明して
いる。加えて、この方法は活性なウイルスを実質的に含
まず、かつ、有害な生理学的作用を与え得る夾雑脂質、
活性化補体（例えばＣ５ａ、Ｃ３ａ等）及び低分子量ペ
プチド等を実質的に含有しない製品を与える。
【０００６】本発明の方法のための出発原料は有利的に
は通常の血漿分画法による免疫血清グロブリン含有分画
である。特に好ましい粗製の血漿蛋白分画は大量規模の
Ｃｏｈｎ分画操作により得られる分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ
である。この粗製の血漿蛋白分画は普通、通常の寒性沈
澱上澄をｐＨ６．９における冷エタノール沈澱に付すこ
とによって得られる。Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ
は、免疫血清グロブリンに加えてフィブリノーゲン、各
種のリポ蛋白質、止血系及び繊維素溶解系に関与する数
種の蛋白質及び非常に多種の少量成分を含有する。Ｃｏ
ｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩが出発原料として好ましい
が、他の出発原料も本方法には使用することができる。
かかる原料としては、例えば、血漿、寒性沈澱不含血
漿、Ｃｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩ及びＣｏｈｎ分画ＩＩが
挙げられる。
は通常の血漿分画法による免疫血清グロブリン含有分画
である。特に好ましい粗製の血漿蛋白分画は大量規模の
Ｃｏｈｎ分画操作により得られる分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ
である。この粗製の血漿蛋白分画は普通、通常の寒性沈
澱上澄をｐＨ６．９における冷エタノール沈澱に付すこ
とによって得られる。Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ
は、免疫血清グロブリンに加えてフィブリノーゲン、各
種のリポ蛋白質、止血系及び繊維素溶解系に関与する数
種の蛋白質及び非常に多種の少量成分を含有する。Ｃｏ
ｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩが出発原料として好ましい
が、他の出発原料も本方法には使用することができる。
かかる原料としては、例えば、血漿、寒性沈澱不含血
漿、Ｃｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩ及びＣｏｈｎ分画ＩＩが
挙げられる。
【０００７】本方法の最初の段階には、粗製の血漿蛋白
分画を、実質的に非変性温度で且つ酸性ｐＨにて、水に
懸濁させることが含まれる。本明細書において、「実質
的に非変性」とは、該語の及ぶ条件が免疫血清グロブリ
ンの生物学的活性に実質的且つ非可逆的な喪失を起こす
ことがない、ということを意味する。有利的には、粗製
の血漿蛋白分画を該分画重量の５乃至１０倍の液量の冷
水に懸濁させる。好ましくは水を低温に保つが、これは
免疫血清グロブリン蛋白の実質的な変性を防止する。典
型的には、約０℃乃至１０℃、好ましくは約１℃乃至約
３℃の温度とする。懸濁液を非変性的な酸で酸性とす
る。懸濁液のｐＨを好ましくは約４．５乃至約５．５、
より好ましくは約５．０乃至約５．２に保つ。
分画を、実質的に非変性温度で且つ酸性ｐＨにて、水に
懸濁させることが含まれる。本明細書において、「実質
的に非変性」とは、該語の及ぶ条件が免疫血清グロブリ
ンの生物学的活性に実質的且つ非可逆的な喪失を起こす
ことがない、ということを意味する。有利的には、粗製
の血漿蛋白分画を該分画重量の５乃至１０倍の液量の冷
水に懸濁させる。好ましくは水を低温に保つが、これは
免疫血清グロブリン蛋白の実質的な変性を防止する。典
型的には、約０℃乃至１０℃、好ましくは約１℃乃至約
３℃の温度とする。懸濁液を非変性的な酸で酸性とす
る。懸濁液のｐＨを好ましくは約４．５乃至約５．５、
より好ましくは約５．０乃至約５．２に保つ。
【０００８】蛋白質沈澱剤を用いて懸濁剤から血清グロ
ブリン以外の蛋白質を沈澱させる。実質的に非変性な水
溶性の蛋白質沈澱剤が、蛋白質精製技術においてよく知
られている。かかる沈澱剤は、水性の溶液又は懸濁液か
らの蛋白質の分別的沈澱に、従って部分的精製に、用い
られている。本発明の方法において使用に適する蛋白質
沈澱剤としては例えば、種々の分子量のポリエチレング
リコール、硫酸アンモニウム、ポリビニルピロリドン及
びプルロニック類が挙げられる。数種類のグレードのプ
ルロニックポリオール類〔Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商
標）、ＢＡＳＦＷｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．製）は効果的な蛋白質沈澱剤である。広範
囲に亘る分子量（１０００乃至１６０００以上）及び物
性を有するこれらのポリオール類は、界面活性剤として
使用されている。一群の液状、ペースト状及び固形等変
化に富んだ３２種のポリオール類が入手可能である。分
子量５０００のプルロニックＦ−３８及び分子量９００
０のプルロニックＦ−６８はいずれも８０重量％の親水
性ポリオキシエチレン基と２０重量％の疎水性ポリオキ
シプロピレン基を含んでいる。ポリエチレングリコール
は、特にポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ３３
５０）又はポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６
０００）が好ましい沈澱剤である（数字は化合物の平均
分子量を表す）。
ブリン以外の蛋白質を沈澱させる。実質的に非変性な水
溶性の蛋白質沈澱剤が、蛋白質精製技術においてよく知
られている。かかる沈澱剤は、水性の溶液又は懸濁液か
らの蛋白質の分別的沈澱に、従って部分的精製に、用い
られている。本発明の方法において使用に適する蛋白質
沈澱剤としては例えば、種々の分子量のポリエチレング
リコール、硫酸アンモニウム、ポリビニルピロリドン及
びプルロニック類が挙げられる。数種類のグレードのプ
ルロニックポリオール類〔Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商
標）、ＢＡＳＦＷｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．製）は効果的な蛋白質沈澱剤である。広範
囲に亘る分子量（１０００乃至１６０００以上）及び物
性を有するこれらのポリオール類は、界面活性剤として
使用されている。一群の液状、ペースト状及び固形等変
化に富んだ３２種のポリオール類が入手可能である。分
子量５０００のプルロニックＦ−３８及び分子量９００
０のプルロニックＦ−６８はいずれも８０重量％の親水
性ポリオキシエチレン基と２０重量％の疎水性ポリオキ
シプロピレン基を含んでいる。ポリエチレングリコール
は、特にポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ３３
５０）又はポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６
０００）が好ましい沈澱剤である（数字は化合物の平均
分子量を表す）。
【０００９】蛋白質沈澱剤は、実質的に免疫血清グロブ
リンを沈澱させることなく、大部分の夾雑蛋白質、脂質
及びウイルスを沈澱させるに十分な量、水性懸濁液に加
える。蛋白質沈澱剤は、粗製の血漿蛋白質懸濁液に、固
形のまま、又は市販の固体粉末若しくは薄片から得られ
る水性濃厚液として、加えることができる。使用する蛋
白質沈澱剤の実際の量は、使用する個々の沈澱剤、温
度、ｐＨ及び懸濁液中の蛋白質の濃度に依存して変動す
る。ＰＥＧ３３５０を使用した場合には、水性懸濁液中
の沈澱剤の最終濃度は、有利的には約３乃至約２０重量
％の範囲、好ましくは約６乃至約１２重量％の範囲に存
する。沈澱生成は、平衡に達するまで、例えば通常１時
間又はそれ以上にわたって進行させる。沈澱生成段階の
間を通じて懸濁液の温度を低く保つことが好ましい（例
えば、約１０℃以下、好ましくは約５℃以下）。
リンを沈澱させることなく、大部分の夾雑蛋白質、脂質
及びウイルスを沈澱させるに十分な量、水性懸濁液に加
える。蛋白質沈澱剤は、粗製の血漿蛋白質懸濁液に、固
形のまま、又は市販の固体粉末若しくは薄片から得られ
る水性濃厚液として、加えることができる。使用する蛋
白質沈澱剤の実際の量は、使用する個々の沈澱剤、温
度、ｐＨ及び懸濁液中の蛋白質の濃度に依存して変動す
る。ＰＥＧ３３５０を使用した場合には、水性懸濁液中
の沈澱剤の最終濃度は、有利的には約３乃至約２０重量
％の範囲、好ましくは約６乃至約１２重量％の範囲に存
する。沈澱生成は、平衡に達するまで、例えば通常１時
間又はそれ以上にわたって進行させる。沈澱生成段階の
間を通じて懸濁液の温度を低く保つことが好ましい（例
えば、約１０℃以下、好ましくは約５℃以下）。
【００１０】沈澱生成に続いて、沈澱の結果生じた固体
−液体混合物から、免疫グロブリン含有上澄を回収す
る。この上澄の回収は、遠心や濾過といった通常の固体
−液体分離技術によって達成することができる。好まし
くは、少なくとも約５０００Ｇの遠心又はミクロ濾過膜
による接線流濾過装置が使用される。
−液体混合物から、免疫グロブリン含有上澄を回収す
る。この上澄の回収は、遠心や濾過といった通常の固体
−液体分離技術によって達成することができる。好まし
くは、少なくとも約５０００Ｇの遠心又はミクロ濾過膜
による接線流濾過装置が使用される。
【００１１】粗製の血漿蛋白分画に依然含まれているか
も知れない病原性ウイルスは操作のこの段階において不
活化することができる。かかる不活化は、免疫血清グロ
ブリン含有上澄に殺ウイルス量のウイルス不活化剤を加
えることにより達成される。ウイルス不活化剤として好
ましいものは、界面活性剤であり、最も好ましくは、界
面活性剤−溶媒混合物である。ウイルスの不活化には様
々な種類の界面活性剤が使用できる。適当な界面活性剤
は、例えばＳｈａｎｂｒｏｍ等により米国特許第４３１
４９９７号、第４３１５９１９号及び４５４０５７３号
に記載されているが、これらの開示内容はここに含まれ
る。好ましい界面活性剤としてはオキシエチル化アルキ
ルフェノール類、例えばＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ社によ
りＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００なる商標で販売されている
もの、及び、Ｃ12-22 の脂肪酸とヘキシット無水物との
部分的エステルのポリオキシエチル化誘導体、例えば、
Ｔｗｅｅｎ ８０なる商標で販売されているものがあ
る。ウイルス不活化剤に使用するために好ましい溶媒と
しては、例えばＮｅｕｒａｔｈによる米国特許第３９６
２４２１号に記載されているような、リン酸の低級アル
キルエステルがあるが、この開示内容はここに含まれ
る。特に好ましい溶媒は、リン酸トリ（ｎ−ブチル）エ
ステルである。本発明の実施上好ましいウイルス不活化
剤は、リン酸トリ（ｎ−ブチル）エステル、Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ ８０の混合物である。
該混合物は、免疫血清グロブリン含有上澄におけるリン
酸トリ（ｎ−ブチル）エステルの濃度が約０．２乃至約
０．４重量％の範囲、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が
約０．７乃至約１．３重量％の範囲、及びＴｗｅｅｎ
８０の濃度が約０．２乃至約０．４重量％の範囲となる
ように処方して用いる。
も知れない病原性ウイルスは操作のこの段階において不
活化することができる。かかる不活化は、免疫血清グロ
ブリン含有上澄に殺ウイルス量のウイルス不活化剤を加
えることにより達成される。ウイルス不活化剤として好
ましいものは、界面活性剤であり、最も好ましくは、界
面活性剤−溶媒混合物である。ウイルスの不活化には様
々な種類の界面活性剤が使用できる。適当な界面活性剤
は、例えばＳｈａｎｂｒｏｍ等により米国特許第４３１
４９９７号、第４３１５９１９号及び４５４０５７３号
に記載されているが、これらの開示内容はここに含まれ
る。好ましい界面活性剤としてはオキシエチル化アルキ
ルフェノール類、例えばＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ社によ
りＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００なる商標で販売されている
もの、及び、Ｃ12-22 の脂肪酸とヘキシット無水物との
部分的エステルのポリオキシエチル化誘導体、例えば、
Ｔｗｅｅｎ ８０なる商標で販売されているものがあ
る。ウイルス不活化剤に使用するために好ましい溶媒と
しては、例えばＮｅｕｒａｔｈによる米国特許第３９６
２４２１号に記載されているような、リン酸の低級アル
キルエステルがあるが、この開示内容はここに含まれ
る。特に好ましい溶媒は、リン酸トリ（ｎ−ブチル）エ
ステルである。本発明の実施上好ましいウイルス不活化
剤は、リン酸トリ（ｎ−ブチル）エステル、Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ ８０の混合物である。
該混合物は、免疫血清グロブリン含有上澄におけるリン
酸トリ（ｎ−ブチル）エステルの濃度が約０．２乃至約
０．４重量％の範囲、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が
約０．７乃至約１．３重量％の範囲、及びＴｗｅｅｎ
８０の濃度が約０．２乃至約０．４重量％の範囲となる
ように処方して用いる。
【００１２】ウイルス不活化段階は、ウイルス不活化条
件で実施する。通常、かかる条件には、約１０乃至約３
０℃、好ましくは約１８乃至約２２℃の温度、及び実験
により効果的であることが判明しているインキュベーシ
ョン時間が含まれる。通常、インキュベーションは約１
時間で十分である。
件で実施する。通常、かかる条件には、約１０乃至約３
０℃、好ましくは約１８乃至約２２℃の温度、及び実験
により効果的であることが判明しているインキュベーシ
ョン時間が含まれる。通常、インキュベーションは約１
時間で十分である。
【００１３】ウイルス不活化後、溶液を陽イオン交換樹
脂と接触させて、ウイルス不活化剤と、血清グロブリン
以外の他の夾雑物を取り除く。この段階は好ましくは、
カルボキシメチルアガロースのような陽イオン交換樹脂
を充填したカラムに溶液を通過させることにより行われ
る。カラムは好ましくは、樹脂を塩の形に変換する緩衝
液と平衡させる。好ましい緩衝液の一例は、酢酸イオン
濃度が約５乃至約５０ｍＭ、好ましくは約１０乃至約２
０ｍＭの範囲にある酢酸緩衝液である。適当な酢酸緩衝
液は、酢酸ナトリウム３水和物及び氷酢酸から調製で
き、ｐＨは約５乃至約６の範囲である。他の適当な緩衝
液の一例はｐＨ５乃至６のリン酸緩衝液である。
脂と接触させて、ウイルス不活化剤と、血清グロブリン
以外の他の夾雑物を取り除く。この段階は好ましくは、
カルボキシメチルアガロースのような陽イオン交換樹脂
を充填したカラムに溶液を通過させることにより行われ
る。カラムは好ましくは、樹脂を塩の形に変換する緩衝
液と平衡させる。好ましい緩衝液の一例は、酢酸イオン
濃度が約５乃至約５０ｍＭ、好ましくは約１０乃至約２
０ｍＭの範囲にある酢酸緩衝液である。適当な酢酸緩衝
液は、酢酸ナトリウム３水和物及び氷酢酸から調製で
き、ｐＨは約５乃至約６の範囲である。他の適当な緩衝
液の一例はｐＨ５乃至６のリン酸緩衝液である。
【００１４】免疫血清グロブリン含有上澄をカラムに負
荷するに先立ち、好ましくは上澄の塩類濃度を、平衡化
緩衝液の塩類濃度と実質的に等量となるよう調整する。
例えば、酢酸緩衝液を使用している場合には、免疫血清
グロブリン含有液の酢酸塩濃度が緩衝液中の酢酸塩濃度
と略等しくなるようこれを調節する。免疫血清グロブリ
ン含有液をカラムに負荷した後、カラムを有利的には平
衡化に用いたのと同一の緩衝液で順次洗浄する。好まし
い操作手順は、ウイルス不活化剤濃度を減少させながら
順次洗浄し、最後はカラム床体積の少なくとも１０倍量
の、ウイルス不活化剤を含有しない緩衝液で洗浄するこ
とを含む。順次洗浄は、ウイルス不活化剤を陽イオン交
換樹脂から取り除く一方、樹脂に結合した脂質を減少さ
せる上で有利である。順次洗浄がプレカリクレイン活性
化因子を取り除くこともまた判明しており、従ってこの
蛋白質を実質的に含まない最終生成物が得られる。例え
ば、カラムに負荷した後、カラム床体積の少なくとも２
倍量の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０乃至６．０でＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％及びＴｗｅｅｎ ８０を
０．３％含有するか又はｐＨ５．０乃至６．０でＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００を１％含有する）で洗浄する。この
洗浄に続いて、カラム床体積の少なくとも４倍量の１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０乃至６．０でＴｗｅｅｎ
８０を１％含有する）で、２８０ｎｍにおける吸光度が
約１．２より低くなるまで洗浄を行うことができる。Ａ
280 の値が１．２より低くなったら、有利的にはカラム
をカラム床体積の少なくとも２０倍量の１０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０乃至６．０）で洗浄する。
荷するに先立ち、好ましくは上澄の塩類濃度を、平衡化
緩衝液の塩類濃度と実質的に等量となるよう調整する。
例えば、酢酸緩衝液を使用している場合には、免疫血清
グロブリン含有液の酢酸塩濃度が緩衝液中の酢酸塩濃度
と略等しくなるようこれを調節する。免疫血清グロブリ
ン含有液をカラムに負荷した後、カラムを有利的には平
衡化に用いたのと同一の緩衝液で順次洗浄する。好まし
い操作手順は、ウイルス不活化剤濃度を減少させながら
順次洗浄し、最後はカラム床体積の少なくとも１０倍量
の、ウイルス不活化剤を含有しない緩衝液で洗浄するこ
とを含む。順次洗浄は、ウイルス不活化剤を陽イオン交
換樹脂から取り除く一方、樹脂に結合した脂質を減少さ
せる上で有利である。順次洗浄がプレカリクレイン活性
化因子を取り除くこともまた判明しており、従ってこの
蛋白質を実質的に含まない最終生成物が得られる。例え
ば、カラムに負荷した後、カラム床体積の少なくとも２
倍量の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０乃至６．０でＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％及びＴｗｅｅｎ ８０を
０．３％含有するか又はｐＨ５．０乃至６．０でＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００を１％含有する）で洗浄する。この
洗浄に続いて、カラム床体積の少なくとも４倍量の１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０乃至６．０でＴｗｅｅｎ
８０を１％含有する）で、２８０ｎｍにおける吸光度が
約１．２より低くなるまで洗浄を行うことができる。Ａ
280 の値が１．２より低くなったら、有利的にはカラム
をカラム床体積の少なくとも２０倍量の１０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０乃至６．０）で洗浄する。
【００１５】免疫血清グロブリンは、該免疫血清グロブ
リンを実質的に溶出させるに十分なｐＨとイオン強度と
を有する実質的に非変性緩衝液で陽イオン交換樹脂から
溶出される。一般的には、溶離液たる緩衝液のｐＨは塩
基性側で、好ましくは約７．０乃至約８．５である。溶
離液たる緩衝液の塩類濃度は、樹脂から免疫血清グロブ
リン蛋白質を追い出すために相対的に高くする。好まし
い緩衝液の一例としては、約２５ｍＭのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、約０．２５Ｍの塩化ナトリ
ウム、約０．１％のポリエチレングリコール及び約０．
２ＭのグリシンをｐＨ８．０にて含有するものがある。
ポリエチレングリコールとグリシンの組合せは、溶出段
階において蛋白質の安定化に寄与する。当業者に明らか
なように、他の多数の緩衝系も免疫血清グロブリンを溶
出させるために用いることができる。
リンを実質的に溶出させるに十分なｐＨとイオン強度と
を有する実質的に非変性緩衝液で陽イオン交換樹脂から
溶出される。一般的には、溶離液たる緩衝液のｐＨは塩
基性側で、好ましくは約７．０乃至約８．５である。溶
離液たる緩衝液の塩類濃度は、樹脂から免疫血清グロブ
リン蛋白質を追い出すために相対的に高くする。好まし
い緩衝液の一例としては、約２５ｍＭのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、約０．２５Ｍの塩化ナトリ
ウム、約０．１％のポリエチレングリコール及び約０．
２ＭのグリシンをｐＨ８．０にて含有するものがある。
ポリエチレングリコールとグリシンの組合せは、溶出段
階において蛋白質の安定化に寄与する。当業者に明らか
なように、他の多数の緩衝系も免疫血清グロブリンを溶
出させるために用いることができる。
【００１６】陽イオン交換樹脂からの溶出に続いて、有
利的には溶出液を限外濾過により濃縮する。濃縮の程度
は相当に変動し得る。蛋白質濃度が約１乃至約３重量
％、好ましくは約１．５乃至約２．５重量％となるまで
溶液を濃縮するのが良いことが判明している。有利的に
使用される限外濾過膜は、約１００００乃至約１０００
００の分子量カット範囲を有するものである。本方法に
特に好ましい膜としてはは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より
入手される公称分子量カット１０００００のＰＴＨＫポ
リスルホン膜がある。同等のポア特性を有する他の市販
の限外濾過膜も使用することができる。濃縮に続き、有
利的には、同じ限外濾過装置を用いて濃縮液を分子洗浄
をする。この段階は、低分子量ペプチド夾雑物を効果的
に取り除き、次の精製段階に必要な緩衝液の交換の手段
を提供するものである。分子洗浄の段階の好ましい溶液
の一例は、約０．００５乃至約０．０１２重量％のポリ
エチレングリコールを含有する水溶液である。ポリエチ
レングリコールは蛋白質の安定化に寄与する。
利的には溶出液を限外濾過により濃縮する。濃縮の程度
は相当に変動し得る。蛋白質濃度が約１乃至約３重量
％、好ましくは約１．５乃至約２．５重量％となるまで
溶液を濃縮するのが良いことが判明している。有利的に
使用される限外濾過膜は、約１００００乃至約１０００
００の分子量カット範囲を有するものである。本方法に
特に好ましい膜としてはは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より
入手される公称分子量カット１０００００のＰＴＨＫポ
リスルホン膜がある。同等のポア特性を有する他の市販
の限外濾過膜も使用することができる。濃縮に続き、有
利的には、同じ限外濾過装置を用いて濃縮液を分子洗浄
をする。この段階は、低分子量ペプチド夾雑物を効果的
に取り除き、次の精製段階に必要な緩衝液の交換の手段
を提供するものである。分子洗浄の段階の好ましい溶液
の一例は、約０．００５乃至約０．０１２重量％のポリ
エチレングリコールを含有する水溶液である。ポリエチ
レングリコールは蛋白質の安定化に寄与する。
【００１７】分子洗浄は、限外濾液の塩類濃度が該溶液
の電気伝導度にして約５ｍＭＨＯ／ｃｍ以下、好ましく
は約３ｍＭＨＯ／ｃｍ以下に低下するまで続ける。濃縮
された溶液のｐＨを、実質的に非変性塩基性ｐＨ、例え
ば約７．０乃至約８．５，に調整する。濃縮液を次いで
陰イオン交換樹脂に接触させて血清グロブリン以外の夾
雑物を吸着させる。この段階は、ジエチルアミノエチル
セファロース（ＤＥＡＥセファロース）のような陰イオ
ン交換樹脂を充填したカラムに、濃縮液を通ずることに
より有利に行うことができる。該陰イオン交換カラムは
これを塩化物の形に変換する塩基性緩衝液にて最初に平
衡化させておく。種々の緩衝液がいずれも使用できる
が、好ましいものとしては２５ｍＭのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、２０ｍＭの塩化ナトリウムよ
りなるｐＨ８．０の緩衝液がある。他の多くの緩衝液が
平衡化に使用できることは当業者に明らかであろう。免
疫血清グロブリン濃縮液は、樹脂に負荷するに先立ち粒
子状の物質を含まないことを保証するために前置濾過を
行ってもよい。
の電気伝導度にして約５ｍＭＨＯ／ｃｍ以下、好ましく
は約３ｍＭＨＯ／ｃｍ以下に低下するまで続ける。濃縮
された溶液のｐＨを、実質的に非変性塩基性ｐＨ、例え
ば約７．０乃至約８．５，に調整する。濃縮液を次いで
陰イオン交換樹脂に接触させて血清グロブリン以外の夾
雑物を吸着させる。この段階は、ジエチルアミノエチル
セファロース（ＤＥＡＥセファロース）のような陰イオ
ン交換樹脂を充填したカラムに、濃縮液を通ずることに
より有利に行うことができる。該陰イオン交換カラムは
これを塩化物の形に変換する塩基性緩衝液にて最初に平
衡化させておく。種々の緩衝液がいずれも使用できる
が、好ましいものとしては２５ｍＭのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、２０ｍＭの塩化ナトリウムよ
りなるｐＨ８．０の緩衝液がある。他の多くの緩衝液が
平衡化に使用できることは当業者に明らかであろう。免
疫血清グロブリン濃縮液は、樹脂に負荷するに先立ち粒
子状の物質を含まないことを保証するために前置濾過を
行ってもよい。
【００１８】免疫血清グロブリン濃縮液をカラムに負荷
する。血清免疫グロブリンの大部分は吸着されずにカラ
ムを素通りし、カラム床体積の少なくとも２倍量の、平
衡化に用いたのと同一の緩衝液によって洗浄することに
より効果的に回収することができる。免疫血清グロブリ
ン含有分画を集め合わせ、そのｐＨを実質的に非変性酸
性側ｐＨに調整する。この精製された免疫血清グロブリ
ン溶液を再び限外濾過の操作によって濃縮するが、これ
によっても塩類と低分子量夾雑物が取り除かれる。更な
る分子洗浄操作を上に記載したのと実質的に同様に行
う。これらの操作によって高度に精製された免疫血清グ
ロブリン分画が得られる。
する。血清免疫グロブリンの大部分は吸着されずにカラ
ムを素通りし、カラム床体積の少なくとも２倍量の、平
衡化に用いたのと同一の緩衝液によって洗浄することに
より効果的に回収することができる。免疫血清グロブリ
ン含有分画を集め合わせ、そのｐＨを実質的に非変性酸
性側ｐＨに調整する。この精製された免疫血清グロブリ
ン溶液を再び限外濾過の操作によって濃縮するが、これ
によっても塩類と低分子量夾雑物が取り除かれる。更な
る分子洗浄操作を上に記載したのと実質的に同様に行
う。これらの操作によって高度に精製された免疫血清グ
ロブリン分画が得られる。
【００１９】
【作用】本発明の方法は、先行技術に記載の方法より数
多くの利点を有する。それは相対的に迅速な方法であ
り、且つ、Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩをＣｏｈｎ分
画ＩＩにするような、治療剤を得るための原料として使
用すべく粗製の血漿蛋白分画を更に精製する、という必
要性を回避させる。加えて、この方法は労力と収穫とい
う観点からみて効率的である。例えば、Ｃｏｈｎ法を用
いてＣｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩをＣｏｈｎ分画ＩＩ
に加工する工程は通常４乃至５日を要する。Ｃｏｈｎ分
画ＩＩを精製して使用に耐える生成物とするためには更
に２乃至３日を要する。本発明の方法を使用すれば、高
品質の免疫血清グロブリン製品を３乃至４日で得ること
ができる。しかも本発明の方法によって得られる製品
は、有害な生理学的作用をする可能性のある低分子量ペ
プチドの含有量が少ない。本方法はまた、Ｃｏｈｎ分画
ＩＩから出発する従来方法よりも免疫グロブリン収率が
高い。本方法の別の利点として、大量生産に適合するこ
とが挙げられる。
多くの利点を有する。それは相対的に迅速な方法であ
り、且つ、Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩをＣｏｈｎ分
画ＩＩにするような、治療剤を得るための原料として使
用すべく粗製の血漿蛋白分画を更に精製する、という必
要性を回避させる。加えて、この方法は労力と収穫とい
う観点からみて効率的である。例えば、Ｃｏｈｎ法を用
いてＣｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩをＣｏｈｎ分画ＩＩ
に加工する工程は通常４乃至５日を要する。Ｃｏｈｎ分
画ＩＩを精製して使用に耐える生成物とするためには更
に２乃至３日を要する。本発明の方法を使用すれば、高
品質の免疫血清グロブリン製品を３乃至４日で得ること
ができる。しかも本発明の方法によって得られる製品
は、有害な生理学的作用をする可能性のある低分子量ペ
プチドの含有量が少ない。本方法はまた、Ｃｏｈｎ分画
ＩＩから出発する従来方法よりも免疫グロブリン収率が
高い。本方法の別の利点として、大量生産に適合するこ
とが挙げられる。
【００２０】本方法が特に利点とするところは、治療量
の免疫血清グロブリンの投与を受けている患者にとって
有害となる可能性のある、粗製の血漿蛋白分画に含まれ
る諸々の成分を除去することである。Ｂ型肝炎ウイルス
及びＨＩＶ等のウイルスは不活化される。夾雑物たる脂
質及び補体成分、例えばＣ５ａやＣ３ａ等、もまた非常
に低いレベルまで低下させることができる。以下の実施
例により本発明に更に具体的説明を加えるが、これは本
発明の限定を意図したものではない。
の免疫血清グロブリンの投与を受けている患者にとって
有害となる可能性のある、粗製の血漿蛋白分画に含まれ
る諸々の成分を除去することである。Ｂ型肝炎ウイルス
及びＨＩＶ等のウイルスは不活化される。夾雑物たる脂
質及び補体成分、例えばＣ５ａやＣ３ａ等、もまた非常
に低いレベルまで低下させることができる。以下の実施
例により本発明に更に具体的説明を加えるが、これは本
発明の限定を意図したものではない。
【００２１】
【実施例】Ｃｏｈｎ分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩを１０倍量の
約２℃の水に懸濁させた。１Ｍの酢酸でｐＨを約５．０
に調整した。ｐＨが安定した後、５０％のポリエチレン
グリコール３３５０（ＰＥＧ３３５０）溶液を、得られ
る懸濁液中のＰＥＧ３３５０の濃度が８％となるよう十
分な量だけ該水性懸濁液に加えた。懸濁液を完全に混合
し約２℃にて１時間かけて沈澱生成を進行させた。生じ
た沈澱及び溶解しないペースト状物を５０００Ｇの遠心
又は濾過によって分離した。沈澱を捨て、上澄を濾過し
て澄明にした。次いで、界面活性剤を添加するに先立ち
この澄明な溶液を室温（２２℃）に戻した。最終濃度
が、重量でＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が１％、Ｔｗｅｅ
ｎ ８０が０．３％及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）エス
テル（ＴＮＢＰ）が０．３％となるよう、十分な量の溶
媒／界面活性剤を溶液に加えた。界面活性剤処理した溶
液を２２℃にて１時間インキュベートしてウイルスを不
活化した。
約２℃の水に懸濁させた。１Ｍの酢酸でｐＨを約５．０
に調整した。ｐＨが安定した後、５０％のポリエチレン
グリコール３３５０（ＰＥＧ３３５０）溶液を、得られ
る懸濁液中のＰＥＧ３３５０の濃度が８％となるよう十
分な量だけ該水性懸濁液に加えた。懸濁液を完全に混合
し約２℃にて１時間かけて沈澱生成を進行させた。生じ
た沈澱及び溶解しないペースト状物を５０００Ｇの遠心
又は濾過によって分離した。沈澱を捨て、上澄を濾過し
て澄明にした。次いで、界面活性剤を添加するに先立ち
この澄明な溶液を室温（２２℃）に戻した。最終濃度
が、重量でＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が１％、Ｔｗｅｅ
ｎ ８０が０．３％及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）エス
テル（ＴＮＢＰ）が０．３％となるよう、十分な量の溶
媒／界面活性剤を溶液に加えた。界面活性剤処理した溶
液を２２℃にて１時間インキュベートしてウイルスを不
活化した。
【００２２】インキュベートの後、溶液中の酢酸塩濃度
を１０ｍＭに調整した。免疫血清グロブリンを陽イオン
交換樹脂に吸着させることにより、界面活性剤及び蛋白
性夾雑物を分離除去した。酢酸塩濃度を調整し、界面活
性剤処理しこの溶液を、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸緩衝
液で予め平衡化しておいたＣＭセファロース高流速カラ
ム上に負荷した。界面活性剤と蛋白性不純物を、カラム
床体積の２倍量の、ｐＨ５．５で１重量％のＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００及び０．３重量％のＴｗｅｅｎ８０を含
有する１０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄してこの蛋白質結合樹
脂より除去した。引き続いて、洗浄廃液の２８０ｎｍに
おける光学的濃度が１．２を下回るまで、カラム床体積
の４倍量の、ｐＨ５．５で１重量％のＴｗｅｅｎ ８０
を含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄した。これに続い
て、カラム床体積の２０倍量のｐＨ５．５の１０ｍＭ酢
酸緩衝液で洗浄した。
を１０ｍＭに調整した。免疫血清グロブリンを陽イオン
交換樹脂に吸着させることにより、界面活性剤及び蛋白
性夾雑物を分離除去した。酢酸塩濃度を調整し、界面活
性剤処理しこの溶液を、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸緩衝
液で予め平衡化しておいたＣＭセファロース高流速カラ
ム上に負荷した。界面活性剤と蛋白性不純物を、カラム
床体積の２倍量の、ｐＨ５．５で１重量％のＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００及び０．３重量％のＴｗｅｅｎ８０を含
有する１０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄してこの蛋白質結合樹
脂より除去した。引き続いて、洗浄廃液の２８０ｎｍに
おける光学的濃度が１．２を下回るまで、カラム床体積
の４倍量の、ｐＨ５．５で１重量％のＴｗｅｅｎ ８０
を含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄した。これに続い
て、カラム床体積の２０倍量のｐＨ５．５の１０ｍＭ酢
酸緩衝液で洗浄した。
【００２３】洗浄段階に続き、２５ｍＭのトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（「トリス」という。）、
０．２５Ｍの塩化ナトリウム、０．１重量％のＰＥＧ３
３５０及び０．２ＭのグリシンよりなるｐＨ８．０の緩
衝液で、ＣＭセファロース高流速カラムからこれに結合
した免疫血清グロブリンを溶出した。溶出液のｐＨを
５．２に調整した。次いでＰＴＨＫ膜（公称分子量カッ
ト１０００００のポリスルホン膜）を装填した限外濾過
装置を用いて、溶出液を蛋白質濃度が約２重量％になる
まで濃縮した。同じ限外濾過装置を用いて０．００８重
量％のＰＥＧ３３５０で、電気伝導度が２ｍＭＨＯ／ｃ
ｍより低くなるまで、濃縮液の分子洗浄及び限外濾過を
行った。
ロキシメチル）アミノメタン（「トリス」という。）、
０．２５Ｍの塩化ナトリウム、０．１重量％のＰＥＧ３
３５０及び０．２ＭのグリシンよりなるｐＨ８．０の緩
衝液で、ＣＭセファロース高流速カラムからこれに結合
した免疫血清グロブリンを溶出した。溶出液のｐＨを
５．２に調整した。次いでＰＴＨＫ膜（公称分子量カッ
ト１０００００のポリスルホン膜）を装填した限外濾過
装置を用いて、溶出液を蛋白質濃度が約２重量％になる
まで濃縮した。同じ限外濾過装置を用いて０．００８重
量％のＰＥＧ３３５０で、電気伝導度が２ｍＭＨＯ／ｃ
ｍより低くなるまで、濃縮液の分子洗浄及び限外濾過を
行った。
【００２４】ｐＨ８．４の２Ｍトリスを用いて溶液のｐ
Ｈを８．０に調整し、この澄明な溶液を陰イオン性ＤＥ
ＡＥセファロース高流速カラムに通じ吸着を行わせた。
このカラムは予め２５ｍＭのトリス及び２０ｍＭの塩化
ナトリウムを含有するｐＨ８．０の緩衝液で平衡化させ
ておいた。免疫血清グロブリンを含有する非吸着溶液
（ＤＥＡＥ溶出液）のカラム空隙体積相当分を集めた。
次いで捕捉された免疫血清グロブリンを回収するため、
先に平衡化に使用したのと同じ２５ｍＭのトリス及び２
０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ８．０の緩衝液
を、カラム床体積の２倍量用いてＤＥＡＥカラムを洗浄
した。洗液をＤＥＡＥ濾液に加えた。１Ｍのクエン酸又
は同等なものでｐＨを５．２に調整し、０．００５％の
ＰＥＧ溶液で、必要なら通常のＲＩＡ法を用いて低分子
量の活性化補体成分蛋白質が検出されなくなるまで、限
外濾過を行った。溶液中のグリシンの濃度は０．２Ｍと
なるよう調製し、クエン酸ナトリウムで等張化した。次
いで溶液を１０％まで濃縮した。この１０％溶液を最終
濃度０．００７％のＴｗｅｅｎ ８０で安定化し、濾過
滅菌し、そして適当な容器に充填した。
Ｈを８．０に調整し、この澄明な溶液を陰イオン性ＤＥ
ＡＥセファロース高流速カラムに通じ吸着を行わせた。
このカラムは予め２５ｍＭのトリス及び２０ｍＭの塩化
ナトリウムを含有するｐＨ８．０の緩衝液で平衡化させ
ておいた。免疫血清グロブリンを含有する非吸着溶液
（ＤＥＡＥ溶出液）のカラム空隙体積相当分を集めた。
次いで捕捉された免疫血清グロブリンを回収するため、
先に平衡化に使用したのと同じ２５ｍＭのトリス及び２
０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ８．０の緩衝液
を、カラム床体積の２倍量用いてＤＥＡＥカラムを洗浄
した。洗液をＤＥＡＥ濾液に加えた。１Ｍのクエン酸又
は同等なものでｐＨを５．２に調整し、０．００５％の
ＰＥＧ溶液で、必要なら通常のＲＩＡ法を用いて低分子
量の活性化補体成分蛋白質が検出されなくなるまで、限
外濾過を行った。溶液中のグリシンの濃度は０．２Ｍと
なるよう調製し、クエン酸ナトリウムで等張化した。次
いで溶液を１０％まで濃縮した。この１０％溶液を最終
濃度０．００７％のＴｗｅｅｎ ８０で安定化し、濾過
滅菌し、そして適当な容器に充填した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリフォード・グラフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91342 レークビューテラス、アーンウッ ドロード 10437 (72)発明者 ジェラルド・ネスランド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91765 ダイアモンドバー、イーストスト ーンパインドライヴ 21846 (72)発明者 サウ−ジー・ユング アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01773リンカーン、バーチウッドレーン 60 (72)発明者 ジェームス・バーナム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91750 ラバーン、ジュニパーストリート 559 (72)発明者 ジーン・キム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91011 ラカナダ、ラタザドライヴ 1716 (72)発明者 ロドルフォ・アンソニー・バァスケス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90650 ノーウォーク、シルビーストリー ト 11503
Claims (21)
- 【請求項１】粗製の血漿蛋白分画からの免疫血清グロブ
リン分画の精製方法であって、（イ） 実質的に非変性
温度及び酸性ｐＨにて、粗製の血漿蛋白分画の水性懸濁
液であって該水性懸濁液中の蛋白質の濃度が、続く沈澱
段階において免疫血清グロブリンの実質的な沈澱を起こ
すことなしに血清グロブリン以外の蛋白質の大部分が沈
澱するに十分なものである液を調製し、（ロ） 段階
（イ）で製した水性懸濁液に、水溶性で実質的に非変性
な蛋白質沈澱剤を、免疫血清グロブリンの実質的な沈澱
を起こすことなしに血清グロブリン以外の蛋白質の大部
分の沈澱を起こすに十分な濃度に加えることにより、固
体−液体混合物を製し、（ハ） 段階（ロ）で製した固
体−液体混合物より免疫血清グロブリン含有上澄を回収
し、（ニ） 段階（ハ）で製した免疫血清グロブリン含
有上澄に、殺ウイルス量のウイルス不活化剤を加えるこ
とにより、実質的にウイルスを含まない免疫血清グロブ
リン含有溶液を製し、（ホ） 該実質的にウイルスを
含まない免疫血清グロブリン含有溶液を陽イオン交換樹
脂に接触させ、そして免疫血清グロブリンの溶出を実質
的に起こすことなしに該ウイルス不活化剤と、血清グロ
ブリン以外の他の夾雑物を該樹脂より除去するに十分な
ｐＨ及びイオン強度を有する緩衝液で洗浄して該樹脂よ
り血清グロブリン以外の夾雑物を除去し、（ヘ） 該
免疫血清グロブリンの実質的な溶出を起こすに十分なｐ
Ｈおよびイオン強度を有する実質的に非変性な緩衝液
で、免疫血清グロブリンを該陽イオン樹脂より溶出する
ことにより、免疫血清グロブリン含有溶出液を製し、
（ト） 該免疫血清グロブリン含有溶出液を限外濾過
に付して透析し、次いで該免疫血清グロブリンの濃縮及
び低分子量物質からの分離を行うことにより、免疫血清
グロブリン濃縮液を製し、（チ） 該免疫血清グロブ
リン濃縮液のｐＨを実質的に非変性な塩基性ｐＨに調整
することにより、塩基性免疫血清グロブリン濃縮液を製
し、（リ） 該塩基性免疫血清グロブリン濃縮液を陰
イオン交換樹脂に接触させて夾雑蛋白質を結合させ、結
合していない免疫血清グロブリンより夾雑蛋白質を分離
することにより、免疫血清グロブリン富化溶液を製し、
そして、（ヌ） 該免疫血清グロブリン富化溶液のｐ
Ｈを非変性な酸性ｐＨに調整し、実質的に免疫血清グロ
ブリンの全てを保持し且つ免疫血清グロブリンより低分
子量の夾雑物質を通す限外濾過膜を用いて該酸性化溶液
を分子洗浄することにより、精製された免疫血清グロブ
リン分画を製する、という段階よりなる方法。 - 【請求項２】段階（イ）における該懸濁液が、該粗製の
血漿蛋白分画の１重量部に対し約５乃至約１０体積部の
水を含有し該水性懸濁液の温度が約０℃乃至約５℃に維
持され且つ水性溶液相のｐＨが約４．５乃至約５．５に
維持されるものであることを特徴とする、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】段階（ロ）において使用する該蛋白質沈澱
剤が、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、ポ
リビニルピロリドン及びプルロニック類よりなる群から
選ばれるものであることを特徴とする、請求項２に記載
の方法。 - 【請求項４】該蛋白質沈澱剤がＰＥＧ３３５０又はＰＥ
Ｇ６０００であることを特徴とする、請求項３に記載の
方法。 - 【請求項５】該ウイルス不活化剤が界面活性剤であるこ
とを特徴とする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】該ウイルス不活化剤が非変性な界面活性剤
及びリン酸トリ（低級アルキル）エステル溶媒であるこ
とを特徴とする、請求項３に記載の方法。 - 【請求項７】該界面活性剤が非イオン性、陽イオン性及
び陰イオン性界面活性剤よりなる群から選ばれるもので
あることを特徴とする、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】該ウイルス不活化剤が、リン酸トリ（ｎ−
ブチル）エステル、オキシエチル化アルキルフェノール
及びＣ12-22 の脂肪酸と無水ヘキシットとの部分的エス
テルのポリオキシエチル化誘導体よりなる群から選ばれ
るものであり、ここにおいて該リン酸トリ（ｎ−ブチ
ル）エステルの濃度が該免疫血清グロブリン含有上澄中
約０．１乃至約０．５重量％であり、該オキシエチル化
アルキルフェノールの濃度が該免疫血清グロブリン含有
上澄中約０．５乃至約２重量％であり及び該Ｃ12-22 の
脂肪酸と無水ヘキシットとの部分的エステルのポリオキ
シエチル化誘導体の濃度が該免疫血清グロブリン含有上
澄中約０．１乃至約０．５重量％であることを特徴とす
る、請求項３に記載の方法。 - 【請求項９】該リン酸トリ（ｎ−ブチル）エステルの濃
度が該免疫血清グロブリン含有上澄中約０．２乃至約
０．４重量％であり、該オキシエチル化アルキルフェノ
ールの濃度が該免疫血清グロブリン含有上澄中約０．７
乃至約１．３重量％であり及び該Ｃ12-22 の脂肪酸と無
水ヘキシットとの部分的エステルのポリオキシエチル化
誘導体の濃度が該免疫血清グロブリン含有上澄中約０．
２乃至約０．４重量％であることを特徴とする、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１０】該陽イオン交換樹脂がカルボキシメチル
基を含有するものであることを特徴とする、請求項６に
記載の方法。 - 【請求項１１】該血清グロブリン以外の夾雑物が段階
（ホ）において、約５乃至約５０ｍＭの濃度の酢酸塩を
有する酢酸緩衝液によって溶出されるものであることを
特徴とする、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】該血清グロブリン以外の夾雑物を、段階
（ホ）において該ウイルス不活化剤の濃度を減少させな
がら約５乃至約５０ｍＭの濃度の酢酸塩を有するｐＨ約
５．０乃至約６．０の酢酸緩衝液によって順次溶出し、
最後に該陽イオン交換樹脂の床体積の少なくとも約１０
倍量の該ウイルス不活化剤を含有しない酢酸緩衝液によ
り溶出することを特徴とする、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１３】該免疫血清グロブリンが、ｐＨ約７．０
乃至約８．５の緩衝液によって該陽イオン交換樹脂から
溶出されるものであることを特徴とする、請求項１０に
記載の方法。 - 【請求項１４】該緩衝液が、約２０乃至３０ｍＭの濃度
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、約０．２
乃至約０．３Ｍの濃度の塩化ナトリウム、約０．０５乃
至約０．２％の濃度のポリエチレングリコール及び約
０．１乃至約０．３Ｍの濃度のグリシンをそれぞれ含有
するものであることを特徴とする、請求項１３に記載の
方法。 - 【請求項１５】段階（ト）の該限外濾過が分子量カット
約１００００乃至約１０００００を有する膜によって行
われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】該免疫血清グロブリン含有溶出液を、更
に約０．００１乃至約０．０１２重量％のポリエチレン
グリコールを含有する水溶液で、限外濾液の電気伝導度
が少なくとも約２ｍＭＨＯ／ｃｍに下がるまで分子洗浄
することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】該陰イオン交換樹脂がジエチルアミノエ
チル基を含有するものであることを特徴とする、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１８】ｐＨ約７．０乃至約８．５の緩衝液によ
って、結合していない免疫血清グロブリンを該陰イオン
交換樹脂を通過させることを特徴とする、請求項１７に
記載の方法。 - 【請求項１９】該緩衝液が、約２０乃至約３０ｍＭの濃
度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び約１
０乃至約３０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムをそれぞれ含
有するものであることを特徴とする、請求項１８に記載
の方法。 - 【請求項２０】段階（ヌ）における該精製された免疫血
清グロブリン溶液のｐＨ約を４．５乃至約６．０に調整
し、且つ分子量カット約１００００乃至約１２００００
を有する限外濾過膜によって分子洗浄を行うことを特徴
とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】請求項１，２，８，１４又は１９のいず
れかに記載の方法によって製造された免疫血清グロブリ
ン分画。
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