KR100416483B1 - 동물세포 배양용 혈청의 단계적 여과 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동물세포 배양용 혈청(serum)을 여과하기 위한 새로운 단계적 혈청 여과 시스템(Cascade filtration system of serum)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물세포 배양용 혈청 제조시 여과 단계에 따라 점차적으로 필터의 구멍 크기가 작아지도록 고안되어 우수한 제균능력 및 빠른 유속 유지 능력을 가지는 단계적 혈청 여과 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 우수한 세포 배양능을 갖춘 동물세포 배양용 혈청을 경제적으로 여과하여 고효율로 정제하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 동물세포 배양용 혈청(serum)을 여과하기 위한 새로운 단계적 혈청 여과 시스템(Cascade filtration system of serum)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물세포 배양용 혈청 제조시 여과 단계에 따라 점차적으로 필터의 구멍 크기가 작아지도록 고안되어 우수한 제균능력 및 빠른 유속 유지 능력을 가지는 단계적 혈청 여과 시스템에 관한 것이다.
생명현상을 이해하기 위하여 이용되어 오던 박테리아 등의 미생물은 사람을 포함한 고등동물의 생체 시스템과는 유전학적 및 생리학적으로 많이 다르기 때문에 그 이용과 적용에 한계가 지적되어 왔다. 이에, 생명공학 분야에서는 이미 오래 전부터 실제 사람 또는 동물의 세포를 떼어내어 이를 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있는데, 특히 임상 및 의약계에서 유용한 단백질, 호르몬, 효소 및 면역체계에 관여하는 여러 물질들을 대량으로 생산하기 위하여 사람 또는 동물의 세포를 이용하여 왔다.
따라서, 사람 또는 동물의 세포를 이용하여 유용한 물질을 대량으로 생산하기 위해서는 이들 동물세포의 성공적인 배양이 필수적이다. 이를 위하여, 외부로부터의 오염을 배제할 수 있는 완전 무균된 실험공간과 실험장비가 필요하고, 특히 고도로 정제된 배양액(media)이 필수적으로 요구되어 왔다. 이는 동물의 본체에서 자라던 세포를 떼어 체외(in vitro)에서 장시간 연속배양하기 위해서는 체내에서이들의 생장을 위해 공급되었던 수많은 물질이 배양액에 포함되어야 하기 때문이다. 일반적으로 현재까지 개발된 동물세포 배양액에는 다음과 같은 7 가지 영양분이 기본적으로 첨가되어 있다:
i) 삼투압(osmotic balance) 및 막전위(membrane potential) 유지 등의 생리 기능에 필요한 다량의 무기이온(inorganic ion);
ii) Fe, Cu, V, Mb, Se 및 Zn 등의 미량원소(trace materials);
iii) 에너지원으로 이용되는 육탄당, 특히 포도당;
iv) 단백질 합성을 위한 아미노산;
v) 비타민 류, 특히 비타민 B;
vi) 세포대사 과정에서 기질로 작용하는 콜린(choline) 및 이노시톨(inositol); 및
vii) DNA를 이루는 퓨린계 뉴클레오타이드(purine nucleotide)의 공급원인 유리딘(uridine), 불포화 지방산(unsaturated fatty acids), 콜레스테롤, 지질 및 푸트레신(putrescine) 등의 기타 세포 생장에 필요한 물질.
상기와 같이, 동물세포 배양액은 기본적으로 상기의 7 가지 영양분을 함유하고 있지만, 모든 세포의 배양액에 상기의 영양분이 동일하게 적용되는 것이 아니라 세포 종류마다 이용되는 배양액의 조성 및 함량이 조금씩 달라지기 때문에 이에 따르는 배양액의 종류도 다양하다. 현재, BME(Basal Medium Eagle), MEM(Minimun Essential Midium), DMEM(Dulbecco's MEM Modification), DMEM/F12, IMDM(Iscove'sModified Dulbecco's Medium), L-15 배양액(L-15 Medium), 멕코이 배양액 5A (McCoy's Medium) 및 RPMI 1640등이 개발되어 동물세포 배양을 위한 배양액으로 시판되고 있으나, 이들 배양액으로는 모든 동물세포의 배양에 적용시킬 수 없다.
상기와 같은 문제점을 보완하기 위하여, 세포성장 및 유지에 필수적인 물질들을 다량 함유하고 있는 혈청을 세포 배양액에 첨가하여 대부분의 세포를 배양할 수 있는 기술이 개발되었다. 상기의 첨가되는 혈청은 소, 송아지, 말, 닭, 염소, 양, 돼지, 토끼 또는 쥐 등의 동물로부터 분리하여 이용하고 있는데, 현재 동물세포 배양에 가장 많이 이용되고 있는 혈청은 소의 태아로부터 분리한 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이다. 혈청은 호르몬, 성장인자(growth factors), 부착인자(attachment factors), 분산인자(spreading factors), 알부민, 글루타치온(glutathione), 운반 단백질(carrier proteins), 미량영양소(trace nutrients) 및 트립신(trypsin) 등의 다양한 영양분을 포함하고 있음이 밝혀져 동물세포 배양에 매우 유용함이 보고 되었으나, 현재까지 이들외에 밝혀지지 않은 세포성장 유해물질이 포함되어 있거나 동물세포 배양에 치명적인 박테리아, 진균(fungi), 마이코플라즈마(mycoplasma) 및 바이러스 등에 감염될 수 있는 오염 가능성이 존재하기 때문에 상기의 세포 성장 유해물질 및 미생물을 포함하는 오염요인의 제거 문제가 대두되고 있다. 이를 위하여, 상기의 유해물질 및 오염 요인을 제거하기 위한 여과 및 멸균 시스템의 개발이 활발히 진행되고 있으나, 그 과정이 매우 까다롭고 복잡할 뿐만 아니라 엄격한 조건 하에서 이루어져야 하기 때문에개발에 많은 어려움이 따르고 있는 실정이다.
동물세포 배양용 혈청을 제조하기 위해서는, 혈액의 채취부터 여과 및 충전까지의 전과정이 엄격한 품질관리 하에 이루어져야 하고 각 공정마다 고도의 기술이 요구되기 때문에 혈청을 제조하기가 용이하지 않다. 상기의 이유로 고도로 정제된 혈청을 개발하여 생산 및 판매하는 회사는 전세계적으로 많지 않으며, 국내 뿐만 아니라 일본에서도 세포배양용 배양액 및 혈청의 제조에 관련된 기술이 전무한 상태이다. 국외의 동물세포 배양용 혈청 생산 업체로는 라이프 테크놀로지(Life Technologies, 미국), 하이클론(Hyclone, 미국), JRH 바이오사이언스(JRH bioscience, 호주), 시그마(Sigma, 미국) 및 아메리칸 바이올로지콜 테크놀로지(American Biological Technologies, Inc., 미국) 등이 있다.
라이프 테크놀로지사는 약 3,000 가지의 생명공학 제품을 생산하고 있는 회사로서, 특히 세포배양용 배양액과 혈청에 관하여 세계 제일의 회사로 인정받고 있다. 라이프 테크놀로지사는 동물세포 배양용 혈청을 제조하기 위하여 최종단계에서 0.1 ㎛의 구멍 크기를 가진 필터를 이용하여 3 회 여과한다. 하이클론사는 세포배양용 혈청, 특히 소 태아 혈청을 전문적으로 생산하고 있는 회사로서, 동물세포 배양용 혈청 제조시 혈청내 내독소(endotoxin) 및 헤모글로빈의 양을 최소화시킬 수 있는 클로즈드 시스템 콜렉션(closed system collection) 방법에 관한 특허를 보유하고 있다. 하이클론사는 동물세포 배양용 혈청의 제조시 최종단계에서 0.04 ㎛의 구멍 크기를 가진 필터를 이용하여 1 회 여과하는 여과법을 사용하고 있다. 다음으로, JRH 바이오사이언스사는 ISO 9000(International Standardization Organization) 인증을 받은 세포배양액과 혈청을 판매하고 있으며, 혈청 제조시 최종단계에서 0.1 ㎛의 구멍 크기를 가진 필터를 이용하여 3 회 여과하는 여과법을 채택하고 있다. 시그마사는 약 90,000여 가지의 화학 및 생명공학 제품을 생산하는 회사로서, 0.2 ㎛의 구멍 크기를 가진 필터를 이용하여 2 회 여과한 후 0.1 ㎛ 구멍 크기의 필터로 1 회 여과하는 여과법을 이용하여 동물세포 배양용 혈청을 제조한다. 아메리칸 바이올로지콜 테크놀로지사는 ISO 9001 및 FDA 인증을 받은 세포배양용 혈청을 포함한 임상진단제재를 주문자 상표에 의한 생산법(OEM)으로 판매하고 있다.
상술한 바와 같이 현재 판매되고 있는 동물세포 배양용 혈청은 박테리아, 진균, 마이코플라즈마 및 바이러스 등의 미생물을 제거하기 위하여 여과법을 이용하고 있는데, 최종적인 여과 단계에서 0.04 ㎛ 필터를 이용하는 하이클론사를 제외하고 대부분의 혈청 제조회사들은 최종단계에서 구멍 크기가 0.1 ㎛인 필터를 이용하고 있다. 일반적으로, 박테리아와 진균은 대략 0.1 내지 20 ㎛의 직경을 가지고 있어 0.1 ㎛ 필터를 이용한 여과시 대부분이 제거되지만, 바이러스는 종류에 따라 0.1 ㎛ 이하의 직경을 가지는 것도 있기 때문에 0.1 ㎛ 필터의 여과만으로 완전히 제거되지 않는다. 또한, 박테리아의 일종인 마이코플라즈마는 직경이 0.5 ㎛이지만, 세포벽이 없어 유연성을 가지기 때문에 0.1 ㎛의 필터를 통과할 수 있다는 점이 0.1 ㎛의 필터로 여과할 경우의 문제점으로 제시되고 있다. 따라서, 여과법의 최종단계에서 0.1 ㎛ 필터를 이용하여 3 회 여과하는 기존의 여과 방법으로는 마이코플라즈마 및 바이러스를 완전히 제거할 수 없다. 이러한 단점을 보완하기 위한 방법이 하이클론사가 이용하고 있는 0.04 ㎛ 필터를 이용한 여과법이 있지만, 현재까지 이들이 혈청을 제조하기 위하여 여과법에 사용한 필터들의 종류와 그 구멍 크기가 알려지지 않아 상기 방법의 반복성을 보장할 수 없고 생산품의 가격면에서 볼 때 고가의 필터들을 이용하여 비경제적이라는 단점이 있다.
이에 본 발명자은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 동물세포 배양용 혈청 제조시 여과 단계에 따라 점차적으로 필터의 구멍 크기가 작아지도록 고안되어 우수한 제균능력 및 빠른 유속 유지 능력을 가지는 새로운 단계적 혈청 여과 시스템을 개발하였다. 본 발명자은 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 혈청내에 존재하는 생물성 오염인자 및 이물질 입자들이 그 크기에 따라 모두 효율적으로 제거되어 고도로 정제된 동물세포 배양용 혈청을 생산하고 상기 생산된 혈청이 다양한 동물세포주에서 우수한 세포 배양능을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 동물세포 배양용 혈청 생산시 혈청내 생물성 오염인자 및 이물질 입자들을 효율적으로 제거하여 우수한 세포 배양능을 가지는 혈청을 생산할 수 있는 새로운 단계적 혈청 여과 시스템을 제공하는 것이다.
도 1은 필터의 규격을 정하기 위한 여과성 시험에 이용한 여과 시스템을 나타낸 도면이고
A: 질소가스 B: 시료인 소 태아 혈청 C: 여과액
(F) : 47 mm/직경 폴 절대막 필터(Pall absolute membrane filter)
도 2a는 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 최종여과 단계에 사용되는 필터의 기능 수행을 평가하고, 여과설비(하우징, 관, 밸브, 이음부분 등)를 검사하기 위한 여과전 완전성 시험의 결과를 나타낸 도면이고,
도 2b는 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 최종여과 단계에 사용되는 필터의 기능 수행을 평가하고, 여과설비(하우징, 관, 밸브, 이음부분 등)를 검사하기 위한 여과후 완전성 시험의 결과를 나타낸 도면이고,
도 3은 세포배양용 혈청을 고도로 정제하기 위한 여과 시스템을 나타낸 도면이다.
A: 원료 탱크 B: 여과액 탱크
도 4는 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS와 외국혈청 제조회사의 FBS의 세포 배양능을 MRC-5 세포에서 비교한 결과를 나타낸 것이고,
A: A사의 FBS
B: B사의 FBS
C: 본 발명의 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS
도 5는 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS와 외국 혈청 제조회사의 FBS의 세포 배양능을 CHO-K1 세포에서 비교한 결과를 나타낸 것이고,
A: A사의 FBS
B: B사의 FBS
C: 본 발명의 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS
도 6은 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS와 외국 혈청 제조회사의 FBS의 세포 배양능을 Sp2/0 Ag14 하이브리도마에서 비교한 결과를 나타낸 것이다.
A: A사의 FBS
B: B사의 FBS
C: 본 발명의 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 여과 단계에 따라 점차적으로 필터의 구멍 크기가 작아지도록 고안된 새로운 단계적 혈청 여과 시스템을 제공한다.
본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은
1) 1.0 ㎛ ∼ 1.2 ㎛ 필터로 여과하여 대부분의 박테리아 및 진균을 제거하는 단계(단계 1);
2) 0.2 ㎛ ∼ 0.5 ㎛ 필터로 여과하여 박테리아와 진균을 완전히 제거하는 단계(단계 2);
3) 0.1 ㎛ 필터로 여과하여 크기가 큰 바이러스와 대부분의 마이코플라즈마를 제거하는 단계(단계 3); 및
4) 0.04 ㎛ ∼ 0.1 ㎛ 필터로 여과하여 작은 바이러스와 잔재하는 마이코플라즈마를 제거하는 단계(단계 4)로 이루어진다.
본 발명에서는 바람직한 실시예로써 단계 1에서는 1.0 ㎛ 필터, 단계 2에서는 0.2 ㎛ 필터, 단계 3에서는 0.1 ㎛ 필터, 단계 4에서는 0.04 ㎛ 필터를 이용하였고, 단계 1, 2 및 4에서는 1 회 여과하였으며 단계 3에서는 1 회 또는 2 회 여과하였다.
상기와 같은 4 단계로 구성된 본 발명의 여과 시스템은 원료탱크(A)로부터 들어온 혈청원료가 1.0 ㎛, 0.2 ㎛, 0.1 ㎛ 및 0.04 ㎛의 필터를 차례대로 통과되면서 단계적으로 여과되어 생물성 오염인자 및 이물질 입자들이 효율적으로 제거된혈청이 여과액 탱크(B)에 회수됨으로써 고도로 정제된 혈청을 얻게된다(도 3참조).
본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템에 있어서, 동물세포 배양용 혈청의 제조시 원료를 효율적으로 여과할 수 있도록 각 단계에서 이용되는 필터의 규격을 최적화하기 위하여, 여과성 실험을 통하여 각 단계에서 사용되는 필터들의 여과시간 및 유량을 측정한 후 여과면적을 이용하여 전체 예상 여과량을 계산하였다(도 1참조). 그 결과, 단계 4에 이용되는 0.04 ㎛ 필터의 전체 평균 유속 및 전체 여과량이 단계 1, 2, 및 3에서 사용되는 필터들에 비해 가장 낮은 수치를 보이므로 단계 4의 0.04 ㎛ 필터로 인한 전체 여과과정의 효율성 감소를 보완하기 위해서는 0.04 ㎛ 필터의 용량을 다른 3 종류의 필터보다 더 큰 것으로 이용해야 함을 알 수 있다. 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템에 이용되는 필터의 특징을 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1> 단계적 혈청 여과 시스템에 적용시킨 필터의 특징
| 막구멍크기 | 필터(제품번호) | 수지(필터 표면적*: ft2/cm2) | 특징 |
| 1.0 ㎛ | 울티포어 GF 플러스(AB2U010Z7H4) | 양전화를 띠고 있는 유리 섬유질(5.4/5000) | - 양전하를 띠고 있는 유리 섬유질로 효율적으로 오염인자를 제거- 주름잡힌 넓은 면적을 가짐- 고온고압 멸균 가능 |
| 0.2 ㎛ | 플루오로다인 II 필터(AB2DFL7H4) | 친수성 PVDF(5.5/5100) | - 높은 단백질 회수율- 빠른 유속- 제균용- 고온고압 멸균 가능 |
| 0.1 ㎛ | 플루오로다인 II 필터(AB2DJL7H4) | 친수성 PVDF(5.5/5100) | - 높은 단백질 회수율- 빠른 유속- 제균용- 마이코플라즈마 제거- 고온고압 멸균 가능 |
| 0.04 ㎛ | 울티포어 N66필터 | 나일론 66(8.7/8100) | - 절대 완전 제균 보장- 바이러스 제거용- 고온고압 멸균 가능 |
* 필터 표면적은 10 인치 길이의 필터를 기준으로 한 수치임
구체적으로, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 단계 1에서 이용된 필터는 대부분의 박테리아 및 진균을 제거할 수 있는 필터이다. 필터의 구멍 크기는 1.0 ㎛로서 전체적으로 주름이 잡혀있어 표면적이 넓으며 10 인치 길이의 필터를 기준으로 할 때 5.4/5000 ft2/cm2의 표면적을 갖는다. 상기 필터는 양전하(positive Zeta charge)를 띠고 있는 유리 섬유질(glass fiber) 수지로 구성되어 있어 필터의 구멍 크기인 1.0 ㎛ 보다 작은 이물질이라도 음전하를 띠는 입자 및 내독소를 포함하는 음전하성 이물질일 경우에는 상기 유리 섬유질의 양전하에 결합하기 때문에 여과시 혈청으로부터 효율적으로 제거된다. 또한, 유리 섬유질수지로 이루어진 상기 필터는 외부의 압력변화에 대하여 우수한 저항성을 가지고 있어 여과 과정중에 필터가 받는 압력변화를 최소화 할 수 있다.
단계 2에서 사용되는 필터는 박테리아 및 진균을 완전히 제거하기 위한 것으로 일반 제약업계에서 요구하고 있는 제균용 필터 구멍 크기의 최소 한계 기준인 0.2 ㎛의 구멍 크기를 가지며, 10 인치 길이의 필터를 기준으로 할 때 5.5/5100 ft2/cm2의 표면적을 갖는다. 단계 3에 이용되는 필터는 제균 뿐만 아니라 크기가 큰 바이러스 및 대부분의 마이코플라즈마의 제거에도 효과적인 0.1 ㎛의 구멍 크기를 가지며, 10 인치 길이의 필터를 기준으로 할 때 5.5/5100 ft2/cm2의 표면적을 갖는다. 단계 2 및 단계 3에 이용된 필터는 친수성 PVDF(hydrophilic polyvinylidene fluoride) 수지로 구성되어 있는데, 상기 수지는 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride)의 소수성을 친수성으로 전환시켜 제조된 것이다. 상기와 같이, 단계 2 및 단계 3에 이용되는 필터는 소수성 대신에 친수성을 띠는 수지로 이루어져 있기 때문에 혈청내에 존재하는 소수성의 고분자 물질(단백질 등)이 필터에 결합하는 것을 억제하여 혈청 여과시 친수성 단백질이 필터에 부착되는 것을 감소시킴으로써, 동물세포 배양에 필수적인 혈청내 단백질의 회수율을 증가시킬 뿐만 아니라 기존의 친수성 PVDF와 비교해 빠른 유속을 유지할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 친수성 PVDF 필터는 필터자체의 미세한 찌꺼기가 적고 다양한 화학물질의 여과도 가능하다.
마지막으로, 단계 4에서 이용되는 필터는 작은 바이러스 및 단계 3의 필터로제거되지 않는 마이코플라즈마를 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 필터는 가장 작은 오염인자도 제거할 수 있는 절대 무균용 필터 구멍 크기인 0.04 ㎛의 크기를 가지며, 10 인치 길이의 필터를 기준으로 8.7 ft2/cm2의 표면적을 갖는다. 또한, 상기 필터는 이중의 나일론 6,6 막(nylon 6,6 membrane) 수지로 이루어져 있어 물에 미리 적실(prewetting)필요 없이 흡수가 매우 빠르고 미세한 찌꺼기가 전혀 없다. 또한, 물 이외에 다양한 용액도 이용가능하기 때문에 혈청과 같이 구성성분이 무수히 많고 그 조성이 불분명한 원료를 여과할 경우에 여과가 용이하며 단백질 회수율도 높다는 특징을 나타낸다.
또한, 본 발명자은 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 최종여과 단계에 사용되는 필터가 그 기능을 완벽하게 수행하고 있는지를 평가하고, 여과설비(하우징, 관, 밸브, 이음부분 등)에 새는 부분이 없는지를 검사하기 위하여, 물 또는 기체의 압력만 사용하는 비파괴성 완전성 시험의 일종인 전방향 유량 시험(forward flow test)을 실시하였다. 상기 전방향 유량 시험은 필터 전단부를 충분한 물로 적신 후 일정 압력을 가해 필터에서 통과되어 나온 유량을 측정하고 기준치와 비교하여 필터에 새는 부분이 있는지를 확인하는 방법으로 여과전후에 각각 수행되어야 한다. 구체적으로, 각 필터의 막공크기마다 정해진 기준치 이하의 유량이 통과되어 나오면 필터가 완전하다고 확증할 수 있고, 기준치 이상의 유량이 통과되어 나오면 필터가 정해진 막공의 크기 보다 크거나 손상을 입어 새는 것을 나타낸다.
상기 전방향 유량 시험 결과, 여과전후의 필터를 통과한 유량이 기준치 이하로 나타나 여과전후의 필터 상태는 완전하고 여과설비도 새는 부분이 없어 최종단계에 이용되는 필터가 그 기능을 완벽하게 수행함을 알 수 있다(도 2a및도 2b참조).
본 발명의 동물세포 배양용 혈청을 제조하기 위한 단계적 혈청 여과 시스템의 제균능력, 여과 효율 및 생산단가의 경제성을 시험하기 위하여, 본 발명자은 바람직한 실시예로서 상술한 4 가지 구멍크기의 필터를 이용하여 미국에서 수입된 소 태아 혈청의 원료로부터 고도로 정제된 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, 이하 "FBS"로 약칭함)을 제조한 후 다양한 종류의 동물세포주를 이용하여 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템으로 정제된 FBS의 배양능을 외국 혈청 제조회사의 FBS와 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS는 세포의 종류에 따라 외국 혈청 제조회사의 FBS와 거의 동일하거나 훨씬 우수한 세포 배양능을 나타내었다(도 4,도 5및도 6참조).
또한, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 단계적으로 작아지는 필터의 구멍 크기(1.0 ㎛→0.2 ㎛→0.1 ㎛→0.04 ㎛)로 인해 원료 혈청내의 제거하고자 하는 물질들을 그 크기가 큰 순서대로 효과적으로 제거할 수 있을 뿐만 아니라 단계 1의 필터의 경우와 같이 필터 수지 자체의 성질에 의해서도 제균 및 이물질의 제거가 가능하였다. 아울러, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 혈청내 친수성 단백질과 결합력이 약한 친수성 필터를 이용하기 때문에 여과시 빠른 유속을 유지할 수 있어 전체 여과량이 증가되므로 단위 생산용기당 생산용량을 상대적으로 증가시킬 뿐만 아니라 생산 공정시간도 단축시켜 혈청의 대량생산이 매우 효율적임을 확인하였다. 상술한 이점 이외에도, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 이물질들을 크기별로 단계적으로 여과하기 때문에 필터에 가해지는 무리한 압력을 줄일 수 있어 필터의 수명이 연장되므로 경제적으로 FBS를 정제할 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 생산 단가면에서 매우 경제적이라는 장점을 갖는다. 예를 들면, 기존의 동물세포 배양용 혈청 제조시 최종단계에서 0.1 ㎛ 필터로 3 회 여과하는 라이프 바이오테크놀러지사 또는 JRH 바이오사이언스사의 경우 요구되는 순수 필터 비용은 1,773,750 원(200 ℓ 기준)이며, 최종단계에서 0.04 ㎛ 필터로 1 회 여과하는 하이클론사의 경우 요구되는 순수 필터 비용은 대략 2,467,125 원(200 ℓ 기준)으로 추정되는 반면, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템에서 요구되는 순수 필터 비용은 1,581,250 원(200 ℓ 기준)으로 0.04 ㎛ 필터를 1 회 이용하는 여과법에 의해 제조된 제품의 생산 단가에 비해 약 64%의 비용만이 소요되며, 0.1 ㎛ 필터를 3 회 이용하는 여과법에 의해 제조된 제품의 생산 단가에 비해 89%의 비용만이 소요되므로 기존의 여과법에 비해 월등히 경제적인 여과 시스템임을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 필터의 규격을 정하기 위한 여과성 실험(Filterability test)
본 발명자은 동물세포 배양용 혈청의 제조시 원료를 최적조건으로 여과할 수 있는 필터의 규격을 정하기 위하여 여과성 실험을 수행하였다.
4 단계로 구성된 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템에 이용된 필터는 모두 미국의 필터 제조 전문회사인 Pall Inc.사의 제품으로, 이들은 모두 cGMP(current Good Manufacturing Practices)와 ISO 9000에 적합하게 제작되었으며 고온고압멸균(autoclave) 및 증기멸균(steaming)이 가능한 제품들이다.
구체적으로, 4 가지 종류(U010, DFL, DJL, ND; Pall Inc., USA)의 직경 47 mm 원형 필터를 이용하여도 1에 나타낸 모식도와 같이 여과성 실험을 실시하여 여과시간 및 유량을 측정한 후 여과면적을 이용하여 전체 예상 여과량을 계산하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2> 필터의 여과성 실험 결과
| 필터 | 필터의 직경 | |||
| 47 mm (0.015 ft3) | 10 인치(inch)* | |||
| 평균 유속(㎖/분) | 전체 여과량(㎖) | 평균 유속(㎖/분) | 전체 여과량(㎖) | |
| U010 (1.0 ㎛) | 11.5 | 230 | 4.133 | 82 |
| DFL (0.2 ㎛) | 50.0 | 400 | 18.333 | 146 |
| DJL (0.1 ㎛) | 15.2 | 380 | 5.533 | 139 |
| ND (0.04 ㎛) | 2.1 | 85 | 1.200 | 49 |
* 10 인치 필터 면적(ft3)
U010 : 5.4, DFL : 5.5, DJL : 5.5, ND : 8.7
상기 표 2에 나타나 있듯이, 4 종류의 필터가 갖는 평균 유속(average flow rate)과 전체 여과량은(total throughput)이 서로 다르게 나타났는데, 특히 다른 3 종류의 필터에 비하여 ND(0.04 ㎛) 필터가 가장 낮은 수치를 보였다. 따라서, 상기 4 종류의 필터를 연결시켜 사용할 경우에는 ND 필터에 의해 전체 평균 유속 및 전체 여과량이 감소하여 효율성이 낮아지므로 이를 보완하기 위해서는 ND의 용량을 다른 3 종류의 필터보다 더 큰 것으로 이용해야 함을 알 수 있다.
<실시예 2> 필터의 완전성 시험(Integrity test)
본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 최종여과 단계에 사용되는 필터가 그 기능을 완벽하게 수행하고 있는지를 평가하고, 여과설비(하우징, 관, 밸브, 이음부분 등)에 새는 부분이 없는지를 검사하기 위하여, 본 발명자은 물 또는 기체의 압력만 사용하는 비파괴성 완전성 시험의 일종인 전방향 유량 시험(forward flow test)을 실시하였다.
필터 전단부를 충분한 물로 적신 후 일정 압력을 가해 필터에서 통과되어 나온 유량을 측정하고 각 필터의 막공크기마다 정해진 기준치와 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 단계적 혈청 여과시스템의 최종여과 단계에 이용되는 필터(0.04 ㎕)의 여과전 유량은 23.1 ㎖/min이고 여과후 유량은 18.5 ㎖/min으로 기준치인 75.0 ㎖/min 이하로 나타나 여과전후의 필터 상태는 완전하고 여과설비도 새는 부분이 없어 최종단계에 이용되는 필터가 그 기능을 완벽하게 수행함을 확인하였다(도 2a및도 2b).
<실시예 3> 여과 시스템을 이용한 FBS의 여과
본 발명의 동물세포 배양용 혈청을 제조하기 위한 단계적 혈청 여과 시스템의 제균능력, 여과 효율 및 생산단가의 경제성을 시험하기 위하여, 본 발명자은 미국에서 수입된 소 태아 혈청의 원료를 이용하여 고도로 정제된 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, 이하 "FBS"로 약칭함)을 제조하였다.
본 발명자은 상기 실시예 1의 여과성 실험을 통하여 정해진 규격의 필터를 이용한 본 발명의 4 단계 여과 시스템을 통하여 고도로 정제된 동물세포 배양용 소 태아 혈청을 정제하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
우선, 본 발명에서 이용된 FBS의 원료는 미국에서 수입한 1 차 가공된 것이고, 그 가공과정은 하기와 같다.
먼저, 완전 무균상태 하에서 임신 5 내지 9 개월된 소의 태아로부터 심장채혈법(cardiac puncture)을 이용하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 응고시킨 후 액상부분만을 취하여 섬유소와 세포성 물질을 제거하고 8.0 ㎛의 필터로 전여과(pre-filtration) 과정을 거친 후, -10℃ 내지 -40℃에서 보관하여 동결된 상태로 수입되었다.
상기와 같은 1 차 가공과정에 의해 8.0 ㎛의 필터로 전여과되어 큰 입자들이 제거된 FBS 원료를 단계 1에서 1.0 ㎛의 울티포어 GF 플러스 필터(Pall Inc, USA)로 여과하여 박테리아 및 진균을 대부분 제거하였을 뿐만 아니라 음전하를 띠고 있는 1.0 ㎛ 이하의 물질 및 내독소도 제거하였다. 상기 여과액을 단계 2에서 0.2 ㎛의 플루오로다인 II(Pall Inc, USA) 필터로 여과하여 잔존하는 박테리아 및 진균을 완전히 제거한 후 단계 3에서 0.1 ㎛의 플루오로다인 II(Pall Inc, USA) 필터로 여과하여 크기가 큰 바이러스 및 대부분의 마이코플라즈마가 제거된 여과액을 얻었다. 상기 여과액을 최종적으로 단계 4에서 0.04 ㎛의 울티포어 N66(Pall Inc, USA) 필터로 여과하여 크기가 작은 바이러스 및 잔존할 수 있는 작은 크기의 마이코플라즈마를 제거함으로써 FBS 원료에 함유되어 있던 동물세포 배양에 해로운 생물성 오염인자를 모두 제거하였을 뿐만 아니라 이물질 입자들도 그 크기에 따라 제거하여 고도로 정제된 동물세포 배양용 FBS를 얻었다(도 3).
<실시예 4> 단계적 혈청 여과 시스템에 의하여 정제된 FBS의 오염도 측정
상기에서 얻은 동물세포 배양용 FBS의 오염도를 측정하기 위하여, 최종여과 단계까지 통과한 FBS를 일정량 취하여 FBS내에 포함되어 있을 수 있는 생물성 오염인자 및 이물질의 함량을 측정하였다.
먼저, 내독소의 오염도는 LAL 젤 클롯(LAL gel clot) 방법을 이용하여 측정하였고, 헤모글로빈(Hemoglobin)의 양은 O-톨루이딘(O-Toluidine) 방법을 이용하여측정하였으며, 박테리아 및 진균의 오염도는 USP(full name을 기재하여 주시기 바랍니다.) 방법을 이용하여 측정하였다. 또한, 바이러스의 오염도는 형광 항체(fluorescent antibody)를 이용하는 9CFR 113.53을 사용하여 측정하였고, 마이코플라즈마의 오염도는 대용량 부피의 직접적인 배양법 및 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 측정하였다. 아울러, 대표적인 단백질의 각 함량은 전기적 프로필(electrophoretic profile)을 이용하여 측정하고 전체 단백질의 양은 뷰렛(biurette) 방법으로 측정하였으며, 효소의 양은 워팅톤(worthington) 방법으로 측정하였다. 마지막으로, 기타 생화학적 오염물질들의 함량은 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 측정하였다. 상술한 FBS의 오염도 측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3> 정제된 FBS(pH 7.5)의 오염
| 오염인자 | 종류 | 여과후 FBS | 표준 (인간 혈액) |
| 내독소 | 16 EU/㎖ | ≤20 EU/㎖*1 | |
| 헤모글로빈 | 14 ㎎/㎖ | 150 ㎎/㎖*2 | |
| 박테리아 및 진균 | 성장 무 | 성장 무*3 | |
| 바이러스 | 블루통그(Bluetongue) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 |
| 보바인 아데노바이러스(Bovine Adenovirus) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 | |
| 보바인 파보바이러스(Bovine Parvovirus) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 | |
| 보바인 레스피레토리 신시셜 바이러스(Bovine respiratory syncytial virus) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 | |
| 보바인 바이러스 디이어리어(Bovine virus diarrhea) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨 | |
| 레비스(Rabies) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 | |
| 레오바이러스(Reovirus) | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 | |
| 마이코플라즈마 | 대용량 부피의 직접 배양 | 탐지 안됨 | 탐지 안됨*3 |
| PCR | 탐지 안됨 | 탐지 안됨 | |
| 단백질 | 알부민(albumin) | 43.2%TP | 61.6%TP*2*4 |
| α-1 글로부린(α-1 globulin) | 11.7%TP | 34.2%TP*2*4 | |
| α-2 글로부린(α-2 globulin) | 38.2%TP | - | |
| β 글로부린(β globulin) | 6.8%TP | - | |
| γ 글로부린(γ globulin) | 0.1%TP | - | |
| 전체 단백질 양 | 3.7 g/㎗ | 3.7 g/㎗*2 | |
| 효소 | 알카린 포스페테이즈(Alkaline phosphatase) | 195 mU/㎖ | |
| 락테이트 탈수소화효소(Lactate dehydrogenase) | 3095 mU/㎖ | - | |
| 글루타믹 피로빅 트랜스아미네이즈(Glutamic pyruvic transaminase) | 27 mU/㎖ | - | |
| 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미네이즈(Glutamic oxaloacetic tranaminase) | 134 mU/㎖ | - | |
| 기타 생화학적 오염물질 | 크레아티닌(Creatinine) | 2.7 ㎎/㎗ | 1.0 ㎎/㎗*2 |
| 빌리루빈(Bilirubin) | 0.6 ㎎/㎗ | 0.2-1.2 ㎎/㎗*2 | |
| 나트륨(Sodium) | 135 mM | 145 mM*2 | |
| 칼륨(Potassium) | 9.8 mM | 4.0 mM*2 | |
| 칼슘(Calcium) | 12.5 ㎎/㎗ | 25 ㎎/㎗*2 | |
| 염소(Chloride) | 101 mM | 103 mM*2 | |
| 무기인(Inorganic phosphorus) | 9.2 ㎎/㎗ | 35 ㎎/㎗*2 | |
| 철(Iron) | 176 ㎍/㎗ | ||
| 포도당(Glucose) | 96 ㎎/㎗ | 100 ㎎/㎗*2 |
*1: 가장 많이 사용되고 있는 GibcoBRL사의 기준치
*2: 정상적인 인간혈액의 성분함량
*3: 미국약전에서 규정하는 내용
*4: %TP: 전체 단백질(Total protein)중의 백분율
상기 표 3에서 나타나 있듯이, 여과 후 FBS내의 내독소 함량은 오염이 안된 인간 혈액내 내독소 함량(표준함량) 보다 낮게 검출되었고, 헤모글로빈 함량은 혈액내 헤모글로빈 함량에 비해 열 배 이상 적게 검출되었는데, 이는 대부분의 헤모글로빈이 적혈구내 저장되어 있어 혈액에서는 헤모글로빈 함량이 높게 검출되지만 적혈구가 제거된 혈청내에서는 낮게 나타나게 되는 것이다. 또한, 박테리아, 진균 및 바이러스는 검출되지 않았고, 마이코플라즈마도 검출되지 않았으며, 전체 단백질 양은 인간 혈액내의 전체 단백질 양과 동일한 값을 나타내었으나 전체 단백질중 알부민 및 글로부린의 함량비가 다르게 나타났는데, 이는 항체를 구성하고 있는 단백질인 글로부린의 함량이 동물, 각 개체 및 환경에 따라 만들어지는 항체 양의 차이에 의하여 결정되기 때문이다. 아울러, 인간혈액내에서는 검출되지 않는 4 가지 효소가 여과된 FBS에서는 검출되었고, 칼슘 및 무기인의 함량이 인간혈액내에서 보다 여과된 FBS에서 매우 낮게 검출되었는데, 이는 혈액에서 혈청을 분리하는 방법으로 이용되는 혈액응고 방법에 칼슘 및 무기인을 요구하는 효소가 필요하기 때문에 칼슘 및 무기인이 혈액에서 보다 매우 낮게 나타난다.
<실시예 5> 동물세포 배양용 혈청의 대량생산을 위한 단계적 혈청 여과 시스템의최적화
본 발명자은 상기 실시예 1의 여과성 시험을 통해 결정된 필터의 규격을 사용하는 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 이용하여 실시예 2에서 효과적으로 FBS를 여과할 수 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명자은 혈청의 대량생산을 위한 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템을 하기 표 4와 같이 최적화시켰다.
<표 4> 동물세포 배양용 혈청의 대량생산을 위한 최적화된 단계적 혈청 여과 시스템
| 단계 | 필터 | 필터 막구멍 크기 | 높이/필터 면적 | 유속 | 전체 여과량 |
| 1 | U010 | 1.0 ㎛ | 20 인치/10.8 ft3 | 8.266 ℓ/분 | 164 ℓ |
| 2 | DFL | 0.2 ㎛ | 20 인치/11.0 ft3 | 36.666 ℓ/분 | 292 ℓ |
| 3 | DJL | 0.1 ㎛ | 20 인치/11.0 ft3 | 11.066 ℓ/분 | 278 ℓ |
| 4 | ND | ND | 30 인치/11.0 ft3 | 3.6 ℓ/분 | 147 ℓ |
상기 표 4에 나타나 있듯이, 소규모의 여과성 시험을 통해 결정된 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템의 대량화된 최적공정은 U010→DFL→DJL→ND의 순서로 진행되며, 단계적으로 작아지는 필터의 구멍 크기(1.0 ㎛→0.2 ㎛→0.1 ㎛→0.04 ㎛)를 갖는 단계적 여과 공정에 의하여 제거하고자 하는 이물질들이 그 크기가 큰 순서대로 제거되고 단계 1의 필터의 경우와 같이 필터 수지 자체의 성질에 의해서 제균 및 이물질의 제거가 가능하여 혈청의 여과에 매우 효과적이다. 또한, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 혈청내의 친수성 단백질과 결합력이 약한 친수성 필터를 이용하여 여과시 빠른 유속을 유지하고, 이로 인해 전체 여과량이 증가하여 단위 생산용기당 생산용량이 상대적으로 증가하였을 뿐만 아니라 전체적인 생산 공정시간도 단축되었다. 아울러, 본 발명의 여과 시스템은 이물질들을 크기별로 단계적으로 여과하기 때문에 여과과정중 필터에 가해지는 압력을 감소시킴으로써 필터의 수명을 연장시킬 수 있어 매우 경제적으로 FBS를 정제할 수 있다.
<실험예 1> 실시예 3의 FBS 및 타회사의 FBS를 이용한 동물세포 배양 실험
실시예 3에서 본 발명의 혈청 여과 시스템으로 정제된 FBS 및 외국 혈청 제조회사에서 정제한 FBS의 세포 배양능을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 3에서 본 발명의 혈청여과 시스템으로 정제된 FBS 및 외국 혈청 제조회사에서 정제하여 판매하는 FBS를 이용하여 다양한 종류의 동물세포주를 배양하였다.
먼저, 실시예 3에서 본 발명의 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제한 FBS 및 외국 혈청 제조회사인 A 및 B사에서 정제하여 판매하는 FBS를 동물세포 배양용 배지에 10% 농도로 각각 첨가하였다. 상기 배지를 필터로 여과하여 얻은 여과액 10 ㎖이 함유된 T25 플라스크(flask)에 MRC-5 세포, CHO-K1 세포, Sp2/0 Ag14 하이브리도마(hybridoma)를 접종하고, 이를 37℃, 5% 이산화탄소를 유지하는 항온조에서 15 일 동안 배양한 후 최종 세포농도를 측정하였다.
그 결과, MRC-5 및 CHO-K1 세포 배양에서 A사의 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 각각 약 2.5 X 106세포/T25 플라스크 및 2.9 X 106세포/T25 플라스크이고 B사의 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 각각 약 2.4 X 106세포/T25 플라스크 및 2.7 X 106세포/T25 플라스크인 반면, 본 발명의 여과 시스템으로 정제된 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 약 2.6 X 106세포/T25 플라스크 및 2.9 X 106세포/T25 플라스크로 나타나 A 및 B사의 FBS와 거의 동일한 최종 세포농도를 얻을 수 있었다(도 4및도 5). 또한, Sp2/0 Ag14 하이브리도마 배양에서 A사의 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 약 9 X 105세포/T25 플라스크이고 B사의 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 약 9 X 105세포/T25 플라스크인 반면, 본 발명의 여과 시스템으로 정제된 FBS를 이용한 경우에는 최종 세포농도가 약 1.2 X 106세포/T25 플라스크로 나타나 A 및 B사의 FBS보다 높은 최종 세포농도를 얻었다(도 6).
따라서, 본 발명의 혈청 여과 시스템을 이용하여 정제된 FBS는 세포의 종류에 따라 외국 혈청 제조회사에서 정제하여 판매하는 FBS와 거의 동일하거나 월등한 세포 배양능을 가지므로 본 발명의 혈청 여과 시스템이 동물세포 배양에 적합한 혈청을 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 동물세포 배양용 혈청 제조시, 필터의구멍 크기가 1.0 내지 1.2 ㎛→0.2 내지 0.5 ㎛→0.1 ㎛→0.04 내지 0.1 ㎛로 단계적으로 작아지면서 큰 이물질부터 순차적으로 제거하여 우수한 제균 능력 및 빠른 여과 유속 유지 능력을 나타냄으로써 전체 여과량의 증가 뿐만 아니라 생산 공정시간의 단축을 가져와 매우 효율적으로 우수한 세포 배양능을 가진 동물세포 배양용 혈청을 여과할 수 있으며, 여과에 이용되는 필터의 수명이 연장되어 기존의 생산시스템보다 상대적으로 매우 경제적인 방법이다. 따라서, 본 발명의 단계적 혈청 여과 시스템은 고도로 정제되어 우수한 세포 배양능을 갖춘 동물세포 배양용 혈청을 효율적 및 경제적으로 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (6)
1) 1.0 ㎛∼1.2 ㎛ 필터로 여과하여 대부분의 박테리아 및 진균을 제거하는 단계(단계 1);
2) 0.2 ㎛∼0.5 ㎛ 필터로 여과하여 박테리아와 진균을 완전히 제거하는 단계(단계 2);
3) 0.1 ㎛ 필터로 여과하여 크기가 큰 바이러스와 대부분의 마이코플라즈마를 제거하는 단계(단계 3); 및
4) 0.04 ㎛∼0.1 ㎛ 필터로 여과하여 작은 바이러스와 잔재하는 마이코플라즈마를 제거하는 단계(단계 4)를 포함하는, 단계적 혈청 여과 시스템(Cascade filtration system of serum).
제 1항에 있어서, 혈청은 소 태아 혈청인 것을 특징으로 하는 단계적 혈청 여과 시스템.
제 1항에 있어서, 단계 1에 이용되는 필터는 양전하성 유리 섬유질 수지(positive Zeta charge glass fiber resin)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단계적 혈청 여과 시스템.
제 1항에 있어서, 단계 2 및 단계 3에서 이용되는 필터는 친수성 PVDF 수지(hydrophilic polyvinylidene fluoride resin)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단계적 혈청 여과 시스템.
제 1항에 있어서, 단계 4에 이용되는 필터는 이중의 나일론 6,6 막 수지(nylon 6,6 membrane resin)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단계적 혈청 여과 시스템.
제 1항에 있어서, 단계 1, 단계 2 및 단계 4의 여과 횟수는 1 회이고 단계 3의 여과횟수는 1 회 또는 2 회인 것을 특징으로 하는 단계적 혈청 여과 시스템.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH03146067A (ja) * | 1989-11-02 | 1991-06-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 血漿濾過方法 |
| JPH03196819A (ja) * | 1989-12-26 | 1991-08-28 | Asahi Chem Ind Co Ltd | マイコプラズマ除去方法 |
| US5177194A (en) * | 1990-02-01 | 1993-01-05 | Baxter International, Inc. | Process for purifying immune serum globulins |
-
2000
- 2000-08-08 KR KR10-2000-0045842A patent/KR100416483B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03146067A (ja) * | 1989-11-02 | 1991-06-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 血漿濾過方法 |
| JPH03196819A (ja) * | 1989-12-26 | 1991-08-28 | Asahi Chem Ind Co Ltd | マイコプラズマ除去方法 |
| US5177194A (en) * | 1990-02-01 | 1993-01-05 | Baxter International, Inc. | Process for purifying immune serum globulins |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20020012674A (ko) | 2002-02-20 |
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