KR101044702B1 - 안정성 및 균질성이 향상된 혈청인증표준물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈청 내에 미생물이 10 cfu/ml 이하로 함유되는 혈청인증표준물질 및 A) 진공 필터를 이용하여 원료 혈청을 1차 여과하는 단계; 및 B) 1차 여과된 혈청을 미세 기공이 형성된 필터로 2차 여과하는 단계를 포함하는 혈청인증표준물질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 제조된 혈청인증표준물질은 냉동 건조로 보관하지 않아도 미생물 오염을 방지할 수 있으며, 액체 상태로 용이하게 보관할 수 있다는 장점이 있다.

혈청인증표준물질, 미생물 함량, 여과, 안정성, 균질성, 액체 상태

Description

안정성 및 균질성이 향상된 혈청인증표준물질 및 이의 제조방법{Serum certified reference material having stability and homogeneity and preparation method thereof}

본 발명은 안정성 및 균질성이 향상된 혈청인증표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

표준물질이란 측정기기의 교정, 측정방법의 평가 또는 물질의 값을 결정하는데 사용하는 것으로, 하나 또는 그 이상의 특성치가 충분히 확정되어 있는 균질한 소재 또는 물질을 의미한다.

한편, 혈청인증표준물질(Serum certified reference material ; Serum CRM)이란 특성치를 표현하는 단위의 정확한 실현을 위하여 소급성이 확립된 방법에 따라 하나 또는 그 이상의 특성치를 인증한 인증서가 첨부되어 있는 혈청의 표준물질을 말한다.

종래 이와 같은 혈청인증표준물질을 제조하는 방법은, 보관의 용이성을 고려하여 필터에 의한 여과공정 없이 직접 냉동 건조하거나 원료 혈청을 미세 필터에 바로 투입하여 오염원을 여과하는 방법을 사용하였다.

그러나 이 경우, 사용 도중에 미생물의 오염 가능성이 높으며, 이에 따라 인증표준물질로서, 안정성 및 균질성을 확보하기가 쉽지 않다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 미생물 오염이 제거되어 안정성 및 균질성이 우수한 혈청인증표준물질을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 2차 여과공정을 통하여 혈청에 존재하는 일반적인 침전물뿐만 아니라 잔여 미생물에 의한 감염을 원천적으로 방지할 수 있으며, 액체 상태로 보관할 수 있어 보관이 용이한 혈청인증표준물질의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 혈청 내에 미생물이 10 cfu/ml 이하로 함유되는 혈청인증표준물질을 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, A) 진공 필터를 이용하여 원료 혈청을 1차 여과하는 단계; 및 B) 1차 여과된 혈청을 미세 기공이 형성된 필터로 2차 여과하는 단계를 포함하는 혈청인증표준물질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 혈청인증표준물질 및 이의 제조방법에 의하면, 안정성 및 균질성이 향상된 혈청인증표준물질을 제공할 수 있으며, 냉동 건조하지 않아도 미생물에 의한 감염을 방지할 수 있으므로 액체상태로 용이하게 보관이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명은 혈청 내에 미생물이 10 cfu/ml 이하로 함유되는 혈청인증표준물질에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 혈청인증표준물질에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 혈청인증표준물질은 전술한 바와 같이, 혈청 내에 미생물의 단위 부피당 집락형성계수(Colony Forming Unit; cfu)가 10 이하이며, 바람직하게는 5 이하이고, 보다 바람직하게는 3 이하이며, 가장 바람직하게는 0이다.

즉, 본 발명에 따른 혈청인증표준물질은 원료 혈청에 존재하는 피브린이나 지단백과 같은 침전물뿐만 아니라 미생물에 의한 감염의 근원을 제거함으로써 안정성 및 균질성이 확보된 물질로서, 혈청 내에 미생물의 단위계수가 10 cfu/ml 이하인 혈청인증표준물질을 포함한다.

상기 혈청인증표준물질 내에서 미생물이 10 cfu/ml를 초과하여 함유되는 경우, 미생물의 오염 정도가 심하여 인증표준물질로 사용하기 어려울 수 있다는 문제 가 있다.

여기서, 상기 혈청인증표준물질은 -75℃에서 보관 시, 각 성분의 인증값이 최초 인증값의 불확도 범위 내에서 3년 이상 유지되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5년 이상 유지될 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 혈청인증표준물질은 -75℃의 온도 조건 하에서 보관하는 경우, 최초 인증값의 불확도 범위 내에서 적어도 3년 이상 각 성분의 인증값이 안정적으로 유지되는바, 종래 혈청인증표준물질과 비교하여 보다 우수한 안정성(stability)을 가진 인증표준물질로서 이용할 수 있다.

또한, 상기 혈청인증표준물질은 혈청 내의 각 성분에 대한 농도의 표준편차가 0.8% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5% 이하이며, 가장 바람직하게는 0.2% 이하일 수 있다.

여기서, 표준물질의 균질성이란 하나 또는 그 이상의 특정한 특성에 대하여 균일한 구조 또는 조성을 갖게 되는 상황을 의미하는데, 다른 공급 단위들 또는 단일한 공급 단위에서 채취된 특정한 크기의 시료들에 대한 시험에 의하여 결정된 특성치가 특정한 불확도 한계 내에 있는 경우, 해당 표준물질은 균질하다고 말할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 혈청인증표준물질은 혈청 내에 함유된 요소(urea), 콜레스테롤, 혈당, 뇨산, 코티졸, 뇨질소 또는 크레아티닌 등과 같은 다양한 성분들의 농도를 측정한 결과, 얻어진 표준편차 값이 0.8% 이하인 물질로서, 균질도가 우수하다.

이와 같이 제조된 혈청은 종래 혈청인증표준물질에 비하여 우수한 균질성 및 안정성을 나타내는바, 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 A) 진공 필터를 이용하여 원료 혈청을 1차 여과하는 단계; 및 B) 1차 여과된 혈청을 미세 기공이 형성된 필터로 2차 여과하는 단계를 포함하는 혈청인증표준물질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 혈청인증표준물질의 제조방법에 의하면, 우선, 준비된 원료 혈청을 진공 필터로 1차 여과하여 원료 혈청 내에 다수 존재하는 피브린, 지단백과 같은 고체 침전물들을 1차적으로 제거한다.

이와 같이 진공 필터를 통하여 상대적으로 큰 입경을 가지는 고체 침전물들을 1차적으로 여과함으로써 이후, 미세한 크기의 미생물들에 대한 여과가 수월해질 수 있으며, 미세한 크기의 미생물을 여과하기 위하여 미세 필터를 사용하는 경우에 상기와 같은 고체 침전물들이 미세 기공을 막는 현상을 방지할 수 있다.

한편, 상기 진공 필터의 진공율은 25 내지 100 mmHg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 고체 침전물의 여과를 용이하게 하기 위하여 상기 진공 필터의 진공율을 다양하게 변화시킬 수 있다.

또한, 미세 기공이 형성된 필터를 이용하여 상기 진공 필터에 의하여 1차 여과된 혈청으로부터 잔여 미생물을 2차 여과하며, 이에 따라 혈청 내에 남아있던 미세한 크기의 잔여 미생물들도 모두 제거할 수 있다. 따라서 미생물 감염으로 인한 오염을 미연에 방지할 수 있다.

여기서, 상기 1차 여과된 혈청을 2차 여과하는 미세 기공이 형성된 필터는 미세 기공의 기공크기가 0.1 내지 0.8㎛인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.3㎛일 수 있다.

상기 미세 기공의 기공크기가 0.1 ㎛ 미만인 경우, 필터링에 시간 소요가 너무 커서 비효율적일 수 있다는 문제가 있고, 0.8㎛를 초과하는 경우, 미생물의 필터링이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다는 문제가 있다.

이와 같이 상기 원료 혈청을 직접적으로 미세 기공이 형성된 필터에 여과하는 경우, 혈청 내에 다수 포함되어 있는 피브린 및 지단백과 같은 고체물들에 의하여 기공이 쉽게 막히게 되므로 효과적인 여과가 이루어지지 않을 우려가 있으나, 상기한 바와 같이 2차의 여과 공정을 거치는 경우, 진공 필터에 의해서 입자크기가 큰 피브린이나 지단백과 같은 고체 침전물들은 미리 1차적으로 여과를 한 후에 미세 기공이 형성된 필터를 이용하여 작은 크기의 미생물만을 분리해내므로 보다 효과적인 여과가 수행될 수 있다.

한편, 혈청인증표준물질을 제조하기 위하여 사용되는 원료 혈청은 4 내지 30 ℃에서 5000 내지 15000 rpm으로 10 내지 50분 동안 원심 분리하여 얻어진 것이 바람직하다.

상기와 같은 조건 하에서 원심 분리를 통하여 준비된 원료 혈청은 함유되어 있던 고체물들이 침전 분리되므로 이후 필터링 공정이 보다 원활하게 이루어질 수 있다.

나아가, 상기 원심 분리는 상기 한정된 조건 하에서 수행하는 것이 효율성의 측면에서 바람직하나, 본 발명에 따른 원심 분리가 상기 한정된 조건에 제한되는 것은 아니고, 적절한 원심 분리를 통하여 고체물들을 침전 분리할 수 있도록 다양한 조건 하에서 원심 분리가 수행될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 혈청인증표준물질의 제조방법은 C) 2차 여과된 혈청을 비활성 분위기에서 분주하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

즉, 질소 가스 등과 같은 안정한 비활성 가스를 공급하여 비활성 분위기에서 분주기를 사용하여 2차 여과된 혈청을 멸균된 병 등에 분주할 수 있다.

종래에는 보관의 용이성과 미생물의 오염방지를 위하여 필터 공정을 거치지 않고, 혈청을 냉동 건조시켜 고체상태로 보관하였으나, 이 경우, 냉동 건조된 혈청을 사용하기 위해서는 혈청을 녹여서 사용하여야 했기 때문에 사용 상 불편한 점이 있었다.

그러나 본 발명에 따른 혈청인증표준물질의 제조방법에 의하면, 필터 공정을 2차에 걸쳐 수행함으로써 미생물 오염 가능성을 방지하였을 뿐 아니라, 액체상태로 비활성 분위기에서 멸균 병 등에 혈청인증표준물질을 분주함으로써 보관이 용이하고, 사용 시에 녹이지 않고, 바로 액체상태에서 사용할 수 있는 바, 사용상 편리하다는 장점이 있다.

아울러, 본 발명에 따른 혈청인증표준물질의 제조방법은 D) 상기 분주된 혈청을 -50 ℃ 이하에서 보관하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

즉, 멸균된 병 등에 분주되어 밀봉(capping)된 혈청인증표준물질을 -50℃ 이하의 온도에서 보관함으로써 안정성을 확보할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하도록 한다. 다만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 것으로 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1 내지 3] 혈청인증표준물질의 제조

원료 혈청(서울의과학연구소)을 4℃ 냉장고에서 24시간 동안 녹인 후에 원심분리용 용기(bottle)에 상기 원료 혈청을 넣고, 4℃에서, 9000rpm으로 30분 동안 원심 분리하였다.

상기 혈청 취급에 사용되는 모든 용기는 121℃에서 15분간 살균하였으며, 살균 후 공기 중에 노출시키지 않았다.

원심 분리된 상층액은 다시 진공 필터(Miracloth, Biochem)로 1차 여과하여 혈청의 피브린이나 지단백과 같은 침전물을 제거하였다. 미생물의 감염에 대한 근원을 제거하기 위하여 1차 여과된 혈청을 다시 살균된 0.22 ㎛ 필터로 2차 여과하였다.

공기와의 접촉을 차단한 상태로 2차 여과를 통하여 얻어진 혈청을 질소 기체가 흐르는 비활성 분위기 하에서 최종 용기(bottle)에 분주하였다. 이때, 상기 최종 용기는 3 mL의 멸균된 폴리프로필렌 용기(polypropylene bottle)를 사용하였다.

상기 전 과정을 외부 공기가 차단된 상태에서 클린 벤치(clean bench)에서 수행하여 미생물에 의한 오염을 방지하고, 2차 여과된 혈청이 분주된 용기는 밀봉(capping) 과정을 거쳐 -75℃에서 보관하였다.

이와 같이 준비된 혈청을 실시예 1 내지 3에 따른 혈청인증표준물질로 사용하였다.

[비교예 1]

실시예 1에서 사용된 원료 혈청과 동일한 원료 혈청을 준비하여 원심 분리 및 여과단계를 수행하지 않고, -75℃에서 직접 냉동 건조를 하였다. 이와 같이 준비된 혈청을 비교예 1에 따른 혈청인증표준물질로 사용하였다.

[비교예 2]

실시예 1에서 사용된 원료 혈청과 동일한 원료 혈청을 준비하여 실시예 1과 동일한 크기의 미세 기공이 형성된 필터로 진공 필터에 의한 여과 없이 바로 여과를 수행한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 혈청을 준비하였고, 이와 같이 준비된 혈청을 비교예 2에 따른 혈청인증표준물질로 사용하였다.

[실험예 1] 미생물의 함량 측정

상기 실시예 1 내지 3, 비교예 1 및 2에 의하여 준비된 혈청인증표준물질의 오염여부를 측정하기 위하여 미생물 배양실험을 통하여 미생물에 의한 오염여부를 측정하였다.

먼저 NA(Nutrient Agar) 배지에 혈청을 도말하여 37℃에서 48 시간 동안 미생물 배양실험을 한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참고하면, 실시예 1 내지 3에 따른 혈청인증표준물질의 경우, 미생물에 의한 오염이 전혀 보이지 않아 단위 부피당 집락형성계수(cfu/ml)가 0으로 나타난 반면에, 비교예 1 및 2에 따른 혈청인증표준물질은 모두 미생물에 의한 오염이 관찰되었다.

[실험예 2] 안정성 테스트

상기 실시예 1에 의하여 준비된 혈청인증표준물질의 안정성을 측정하고자, -75℃에서 보존하면서 혈청 내 성분 중에서 코티졸(cortisol), 콜레스테롤(cholesterol), 요산(uric acid), 요소(urea), 혈당(glucose) 및 크레아티닌(creatinine)에 대한 인증값을 1년 단위로 측정하고, 그 결과를 도 2a 내지 도 2f에 나타내었다.

도 2a 내지 도 2f에 나타난 바와 같이, 2005년부터 2007년까지 측정된 인증값은 불확도 범위 내에서 변하지 않은 것으로 관찰되었는바, 상기 실시예 1에 따른 혈청인증표준물질은 적어도 3년 이상 안정성이 유지되는 것으로 확인되었다.

[실험예 3] 균질성 테스트

상기 실시예 1에 의하여 준비된 혈청인증표준물질 내에 포함된 성분들의 균질성을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

분석종	인증값 (mg/kg)	확장불확도(95%)	균질도(RSD)
혈당	779.9 ± 10.8	1.40%	0.38%
콜레스테롤	1273 ± 22	1.70%	0.80%
크레아티닌	27.36 ± 0.44	1.50%	0.75%
요산	117.63 ± 0.98	0.78%	0.20%
요소	1123.9 ± 7.6	0.67%	0.50%
코티졸(㎍/kg)	392.4 ± 6.9	1.75%	0.50%

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 해당하는 실시예 1에 따른 혈청인증표준물질의 균질도는 최대 0.80% 이하로 나타났으며, 요산의 경우, 0.20%까지 낮게 나타남으로써 균질성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

도 1은 종래 방법에 따라 제조된 비교예 1 및 2에 따른 혈청인증표준물질(A, B)과 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따른 혈청인증표준물질(C, D, E)의 오염도를 측정하여 비교한 사진이고,

도 2a 내지 도 2f는 본 발명의 실시예 1에 따른 혈청인증표준물질 내에 함유된 성분들의 안정성을 측정한 그래프이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. A) 진공 필터를 이용하여 원료 혈청을 1차 여과하는 단계;

   B) 1차 여과된 혈청을 미세 기공이 형성된 필터에 의하여 2차 여과하는 단계; 및

   C) 2차 여과된 혈청을 비활성 분위기에서 분주하는 단계

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청인증표준물질의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 미세 기공은 직경이 0.1 내지 0.8㎛인 것을 특징으로 하는 혈청인증표준물질의 제조방법.
6. 제 4항에 있어서,

   상기 원료 혈청은 4 내지 30℃에서 5000 내지 15000 rpm으로 10 내지 50 분 동안 원심 분리하여 얻어진 것을 특징으로 하는 혈청인증표준물질의 제조방법.
7. 삭제
8. 제 4항에 있어서,

   D) 분주된 혈청을 액체상태로 -50℃ 이하에서 보관하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청인증표준물질의 제조방법.

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