JP2010537960A - 第viii因子およびフォンビルブラント因子の精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i) FVIIIとFvWとの混合物を含む溶液、(ii) FvWを含む溶液、(iii)ヒト以外の動物の分泌物の溶液および(iv) FVIII含有植物抽出物由来の溶液の中から選択される溶液から、イオン交換クロマトグラフィ濾過メンブレンでFVIIIまたはFvWを吸収する段階を含む。
Description
(i) FVIIIとFvWの混合物を含む溶液、
(ii) FvWを含む溶液、
(iii)ヒト以外の動物の分泌物に由来する溶液
(iv)FVIII-含有植物抽出物に由来する溶液
の中から選択される溶液からFVIIIまたはFvWを精製する方法において、
イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプのメンブレンでFVIIIまたはFvWを吸着する階段を含むことを特徴とする方法にある。
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Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424
Cohn and al., J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946 and Kistler and al., Vox Sang., 7, 1962, 414-424
(i) 乳を可溶性塩、例えばリン酸ナトリウムと接触させ、得られるカルシウム化合物を沈澱させてタンパクを開放する。可溶性塩のアニオンは媒体中で上記不溶カルシウム化合物が形成でき、タンパクリッチな液相が得られるものを選択する。
(ii)タンパクリッチな液相をカルシウム化合物沈降物から分離する。液相をさらにリピド相とタンパクを含む非リピド水溶相とに分離し、
(iii)タンパクを含んだ非リピド水溶相を回収する。
a) 乳をスキミングして脱リピド化し、
b) タンパクを含むスキミングと脱リピド化した画分を疎水性とイオン性の両方の特性を有するリガンド、例えば、4-メルカプト−エチル−ピリジンがグラフトされたクロマトグラフ基材に上記タンパクを上記基材に保持できるpH条件下で通し、
c) タンパクを溶出し、
d) 溶出画分から乳タンパクを除去して溶出画分を精製し、
e) 前記タンパクを回収する。
(a)血漿から冷凍沈殿物を作り、
(b)イオン交換クロマトグラフィメンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィメンブレン上に第VIII因子およびフォンビルブラント因子を捕捉、吸着し、(c)溶出緩衝剤のイオン強度値を順次増加させることによってフォンビルブラント因子および第VIII因子を選択的に回収する。
(a) FVIIIおよびFvWを含む細胞培養の上清または精製済み溶液を作り、
(b) 上記のイオン交換クロマトグラフィ・メンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィメンブレンで第VIII因子およびフォンビルブラント因子を捕捉し、
(c) 溶出緩衝剤のイオン強度値を順次増加させてフォンビルブラント因子および第VIII因子を選択的に回収する。
(a) FVIIIまたはFvWを含む細胞培養上清または精製済みの溶液を作り、
(b) 上記イオン交換クロマトグラフィ・メンブレン、特にアニオン交換クロマトグラフィ・メンブレンで第VIII因子またはフォンビルブラント因子を捕捉し、
(c) フォンビルブラント因子または第VIII因子を回収する。
(c1) 上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてFvWを溶出させる。例えば、0.25M塩化ナトリウムを加えてイオン強度値を上げ、浸透圧重量モル濃度を600から約660mOsm/Kgへ増加させることができる。
(c2) 上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値をフォンビルブラント因子の回収値より増加させてFVIIIを溶出させる。例えば、0.7Mまたは0.35Mの塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムを加えることによってイオン強度値を増加させ、浸透圧重量モル濃度を1400から約1700mOsm/Kgまで上げることができる。
(d)上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてFvWを溶出させ、
(e)イオン交換クロマトグラフィメンブレン、好ましくは最初のメンブレンと同じタイプのメンブレン上でフォンビルブラント因子を捕捉し、
(f)上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子を溶出させる。
(g)階段(c)で溶出したフォンビルブラント因子リッチな画分をゼラチンリガンドを有する親和性ゲルカラムでクロマトグラフィを実行し、
(h) 保持されない非フィブロネクチンあ全く含まないフォンビルブラント因子画分を回収する。
(a) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてFvWを溶出させ、
(b) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値をフォンビルブラント因子の回収用の値より増加させてFVIIIを溶出させ、
(c) 上記イオン交換クロマトグラフィ・メンブレン上にフォンビルブラント因子を捕捉し、
(d) 上記クロマトグラフィ・メンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子を溶出させ、
(e) 階段(d)で溶出させたフォンビルブラント因子リッチな画分をゼラチン・リガンドを有する親和性ゲル・カラム上でクロマトグラフィを実行し、
(f) ゲルアフィニティーに保持されなかったフォンビルブラント因子リッチな画分を回収する。
、
本発明のさらに他の対象は、本発明の精製法を実行することから成る精製されたFvWの製造方法にある。
本発明の上記以外の観点および利点は以下の基する本発明の実施例から理解できよう。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
フォンビルブラント因子の精製法
新鮮な凍結血漿を1〜6℃の間の温度で融解して冷凍沈殿物を製造した。遠心分離後、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンビルブラント因子および第VIII因子を含んだ冷凍沈殿物を回収し、ヘパリンナトリウム(3lU/mL)を含んだ水溶液中にスラリー化した。溶液のpH値を7.0±0.1に合わせた。スラリー化した冷凍沈殿物をビタミンK依存因子を除去するためのアルミナゲルでの吸着と、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンコールド沈降によって予備精製した。すなわち、懸濁液に水酸化アルミニウムを加え、5分間撹拌した。pH値は0.1Mの酢酸を用いて6.5±0.2に合わせた。溶液を撹拌下に14〜18℃の温度範囲に冷却した。それから溶液を14〜18℃の温度で遠心分離した。上澄を回収し、0.22μm濾紙で濾過して清透化した。
第VIII因子の精製方法
新鮮凍結血漿を1〜6℃の間の温度で融解して冷凍沈殿物を製造した。遠心分離後にフィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンビルブラント因子および第VIII因子を含んだ冷凍沈殿物を回収し、ヘパリンナトリウム(3IU/mL)を含む水溶液中にスラリー化した。溶液のpH値は7.0±0.1に合せた。
精製ダイアグラムは[図2]に示してある。
Claims (14)
- 下記:
(i) FVIIIとFvWとの混合物を含む溶液、
(ii) FvWを含む溶液、
(iii) ヒト以外の動物の分泌物に由来する溶液、
(iv)FVIIIを含む植物抽出物由来の溶液、
の中から選択される溶液からFVIIIまたはFvWを精製する方法において、
イオン交換クロマトグラフィ濾過-タイプのメンブレンでFVIIIまたはFvWを吸着する階段を含むことを特徴とする方法。 - 上記の濾過-タイプのメンブレンがアニオン交換クロマトグラフィメンブレンである請求項1に記載の方法。
- 上記の濾過-タイプのメンブレンが強陰イオン交換樹脂である請求項1または2に記載の方法。
- 上記メンブレンが第四級アミン基を有する被覆を有する請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 上記メンブレンがマクロポーラス-タイプのメンブレンである請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 上記メンブレンがポリエーテルサルホン-タイプのメンブレンである請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 上記溶液がFVIIIとFvWとの混合物を含む請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 上記溶液が血漿由来のものである請求項7に記載の方法。
- 下記の工程から成る請求項8に記載の方法:
(a)血漿から冷凍沈殿物を取得し、
(b)上記イオン交換クロマトグラフィメンブレンで第VIII因子とフォンビルブラント因子とを吸着し、
(c)所定のイオン強度値を有する溶出緩衝剤を使用して第VIII因子またはフォンビルブラント因子を回収する。 - フォンビルブラント因子および第VIII因子の選択的な回収を下記工程に従って実行する請求項9に記載の方法:
(c1) 所定のイオン強度値を有する緩衝剤を用いて溶出でFvWを選択的に回収し、
(c2) (c1)階段で使用した緩衝剤のイオン強度値より高いイオン強度値を有する所定の緩衝剤を用いた溶出でFVIIIを選択的に回収する。 - 下記の追加の工程をさらに有する請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法:
(d)上記のクロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてFvWを溶出し、
(e) フォンビルブラント因子をイオン交換クロマトグラフィメンブレン上、好ましくは最初のメンブレンと同じタイプのイオン交換クロマトグラフィメンブレン上に捕捉し、
(f)上記クロマトグラフィメンブレンの平衡緩衝剤のイオン強度値を増加させてフォンビルブラント因子を溶出させる。 - 以下の工程をさらに有する請求項11に記載の方法:
(g)ゼラチンリガンドを有するアフィニティーゲルカラム上で請求項11の階段(c)で溶出させたフォンビルブラント因子の濃縮画分のクロマトグラフィを実し、
(h)フィブロネクチンを含まない保持されなかったフォンビルブラント因子画分を回収する。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法を実行する、精製されたFVIIIの製造方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を実行する、精製されたFvWの製造方法。
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