JPH05239091A - ビトロネクチンの製造方法 - Google Patents
ビトロネクチンの製造方法Info
- Publication number
- JPH05239091A JPH05239091A JP4078261A JP7826192A JPH05239091A JP H05239091 A JPH05239091 A JP H05239091A JP 4078261 A JP4078261 A JP 4078261A JP 7826192 A JP7826192 A JP 7826192A JP H05239091 A JPH05239091 A JP H05239091A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vitronectin
- milk
- precipitate
- added
- immobilized carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 3
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 11
- 239000005862 Whey Substances 0.000 abstract description 7
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 abstract description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 abstract 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 11
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 11
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 11
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 5
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 3
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- RYKWOUUZJFSJOH-FXQIFTODSA-N Asp-Gln-Glu Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RYKWOUUZJFSJOH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- KMWFXJCGRXBQAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Cys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N KMWFXJCGRXBQAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- PYUCNHJQQVSPGN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)CN=C(N)N PYUCNHJQQVSPGN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012756 surface treatment agent Substances 0.000 description 1
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ビトロネクチンを含有する乳を、アニオン交
換体、レクチン固定化担体及びグルコサミノグルカン固
定化担体に順次、接触吸着させ、溶出を行い、乳中に存
在するビトロネクチンを回収することよりなるビトロネ
クチンの製造方法、ビトロネクチンを含有する乳として
分娩後５日以内の初乳が用いられる。 【効果】 ビトロネクチン製造原料として、乳を用いる
ので、従来の原料の血液を用いる場合にくらべてウイル
ス感染などの危険もなく安全かつ大量にビトロネクチン
を製造することができる。
換体、レクチン固定化担体及びグルコサミノグルカン固
定化担体に順次、接触吸着させ、溶出を行い、乳中に存
在するビトロネクチンを回収することよりなるビトロネ
クチンの製造方法、ビトロネクチンを含有する乳として
分娩後５日以内の初乳が用いられる。 【効果】 ビトロネクチン製造原料として、乳を用いる
ので、従来の原料の血液を用いる場合にくらべてウイル
ス感染などの危険もなく安全かつ大量にビトロネクチン
を製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビトロネクチンの製造
方法に関する。本発明の方法により乳由来のビトロネク
チンを容易に、しかも大量に得ることが可能である。ま
た本発明の方法で得られたビトロネクチンは、医薬品、
細胞培養用培地、生化学試薬等に利用可能である。
方法に関する。本発明の方法により乳由来のビトロネク
チンを容易に、しかも大量に得ることが可能である。ま
た本発明の方法で得られたビトロネクチンは、医薬品、
細胞培養用培地、生化学試薬等に利用可能である。
【０００２】
【従来の技術】ビトロネクチンは血清中の伸展因子とし
て発見された、分子量 65000〜75000の糖蛋白質で、細
胞表面の親和性の高い受容体を介して細胞に結合し、細
胞間や細胞と基質の接着に寄与する物質と考えられてい
る。ビトロネクチンはS-プロテイン、エピボリン、ホー
ムズα-1蛋白質といわれている。ビトロネクチンは接着
性細胞の伸展効果を有することから、細胞培養の際の無
血清培地に添加されてきた。さらに細胞伸展性を有する
ことから特開昭63-196275 号公報には細胞培養基材の表
面処理剤としての用途が開示されている。また損傷した
角膜の修復作用を有することが知られており、特開平2-
212433号公報には点眼剤としての用途が開示されてい
る。
て発見された、分子量 65000〜75000の糖蛋白質で、細
胞表面の親和性の高い受容体を介して細胞に結合し、細
胞間や細胞と基質の接着に寄与する物質と考えられてい
る。ビトロネクチンはS-プロテイン、エピボリン、ホー
ムズα-1蛋白質といわれている。ビトロネクチンは接着
性細胞の伸展効果を有することから、細胞培養の際の無
血清培地に添加されてきた。さらに細胞伸展性を有する
ことから特開昭63-196275 号公報には細胞培養基材の表
面処理剤としての用途が開示されている。また損傷した
角膜の修復作用を有することが知られており、特開平2-
212433号公報には点眼剤としての用途が開示されてい
る。
【０００３】これまでは、ビトロネクチンを製造するに
は、ヒト血漿あるいは血清から単離精製する方法が一般
的に行われてきた。また、特開昭64-63600号公報には動
物の血液を原料としてビトロネクチンを単離精製する方
法が開示されている。これらの方法では原料が血液であ
るので、原料の血液の供給やその安全性に問題があり大
量のビトロネクチンの生産供給は困難であった。
は、ヒト血漿あるいは血清から単離精製する方法が一般
的に行われてきた。また、特開昭64-63600号公報には動
物の血液を原料としてビトロネクチンを単離精製する方
法が開示されている。これらの方法では原料が血液であ
るので、原料の血液の供給やその安全性に問題があり大
量のビトロネクチンの生産供給は困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ビトロ
ネクチンについて研究を進めた結果、これまで存在しな
いと考えられていた乳中にビトロネクチンが存在するこ
とを初めて見出し、本発明を完成するに至った。特に初
乳中には大量のビトロネクチンが存在しており、初乳を
原料とすることにより、容易にビトロネクチンを製造す
ることができる。特に、牛の初乳は大部分が未利用のま
ま廃棄処分されており、大量のビトロネクチンの生産に
は適している。従って、本発明は、乳を原料としたビト
ロネクチンの製造方法を提供することを課題とする。
ネクチンについて研究を進めた結果、これまで存在しな
いと考えられていた乳中にビトロネクチンが存在するこ
とを初めて見出し、本発明を完成するに至った。特に初
乳中には大量のビトロネクチンが存在しており、初乳を
原料とすることにより、容易にビトロネクチンを製造す
ることができる。特に、牛の初乳は大部分が未利用のま
ま廃棄処分されており、大量のビトロネクチンの生産に
は適している。従って、本発明は、乳を原料としたビト
ロネクチンの製造方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】ビトロネクチンは、これ
まではヒトあるいは動物の血液あるいは結合組織に存在
することが知られていた。本発明においては、全く新規
な原料として乳を用いる。原料とする乳はどのような動
物由来の乳でも差し支えないが、牛、ヒト、山羊、羊な
ど乳量の多い動物由来のものが良い。乳中のビトロネク
チン含量は初孔中が特に高く、その後減少してゆく。特
に初乳と呼ぶ、分娩後、５日の間に分泌される乳中には
高濃度にふくまれている。また初乳期間中は、牛などの
動物は、一般には搾乳しても利用せず廃棄処分されるた
め、初乳がビトロネクチン製造の原料とするのに適して
いる。
まではヒトあるいは動物の血液あるいは結合組織に存在
することが知られていた。本発明においては、全く新規
な原料として乳を用いる。原料とする乳はどのような動
物由来の乳でも差し支えないが、牛、ヒト、山羊、羊な
ど乳量の多い動物由来のものが良い。乳中のビトロネク
チン含量は初孔中が特に高く、その後減少してゆく。特
に初乳と呼ぶ、分娩後、５日の間に分泌される乳中には
高濃度にふくまれている。また初乳期間中は、牛などの
動物は、一般には搾乳しても利用せず廃棄処分されるた
め、初乳がビトロネクチン製造の原料とするのに適して
いる。
【０００６】本発明においては、まず、原料である乳を
遠心分離等の操作により脂肪を除去し、脱脂乳を調製す
る。脱脂乳は大量の蛋白質を含んでいるが、そのうちの
カゼイン画分を酸凝固法あるいはレンネット凝固法等の
方法で沈殿除去することが望ましい。このようにして得
たホエー画分をpH調整後、そのまま、あるいは硫安沈殿
法などの塩析を行いビトロネクチンを含む画分を濃縮し
たのち、アニオン交換体と接触させる。アニオン交換体
としては、通常のイオン交換クロマトグラフィーに使用
する樹脂や担体であれば、どのようなものでものでも使
用可能であるが、強陰イオン交換体が特に好ましい。イ
オン交換体は、あらかじめ、pH6 の0.2M酢酸アンモニウ
ム緩衝液で平衡化しておく。吸着操作後、イオン交換体
は平衡化に用いた緩衝液で十分洗浄後、吸着された目的
画分の溶出を行う。溶出は1.0M酢酸アンモニウム(pH6)
で行うことが好ましいが、これ以外の溶出液を用いても
良い。
遠心分離等の操作により脂肪を除去し、脱脂乳を調製す
る。脱脂乳は大量の蛋白質を含んでいるが、そのうちの
カゼイン画分を酸凝固法あるいはレンネット凝固法等の
方法で沈殿除去することが望ましい。このようにして得
たホエー画分をpH調整後、そのまま、あるいは硫安沈殿
法などの塩析を行いビトロネクチンを含む画分を濃縮し
たのち、アニオン交換体と接触させる。アニオン交換体
としては、通常のイオン交換クロマトグラフィーに使用
する樹脂や担体であれば、どのようなものでものでも使
用可能であるが、強陰イオン交換体が特に好ましい。イ
オン交換体は、あらかじめ、pH6 の0.2M酢酸アンモニウ
ム緩衝液で平衡化しておく。吸着操作後、イオン交換体
は平衡化に用いた緩衝液で十分洗浄後、吸着された目的
画分の溶出を行う。溶出は1.0M酢酸アンモニウム(pH6)
で行うことが好ましいが、これ以外の溶出液を用いても
良い。
【０００７】ついでレクチン固定化担体と、この溶出液
を接触させる。ビトロネクチンはフィブロネクチンと同
様に糖鎖を有しており、レクチンに結合することが確認
されている。レクチン固定化担体としてはアガロースに
結合させたものが一般に市販されており、コンカナバリ
ンＡ、ヒマの実レクチン、コムギ胚レクチン等を例示で
きる。これらレクチンの結合担体としては、アガロース
が一般に用いられているが、これ以外の担体に結合させ
たものも使用可能である。本発明においてはアガロース
結合コンカナバリンA (Con A) が特に好ましい。
を接触させる。ビトロネクチンはフィブロネクチンと同
様に糖鎖を有しており、レクチンに結合することが確認
されている。レクチン固定化担体としてはアガロースに
結合させたものが一般に市販されており、コンカナバリ
ンＡ、ヒマの実レクチン、コムギ胚レクチン等を例示で
きる。これらレクチンの結合担体としては、アガロース
が一般に用いられているが、これ以外の担体に結合させ
たものも使用可能である。本発明においてはアガロース
結合コンカナバリンA (Con A) が特に好ましい。
【０００８】レクチン固定化担体は、1.0M酢酸アンモニ
ウム緩衝液(pH6) で平衡化する。Con A を用いる場合は
平衡化に用いる緩衝液中に塩化カルシウム (CaCl2)、塩
化マグネシウム (MgCl2)、塩化マンガン (MnCl2)をそれ
ぞれ1mM 濃度になるように添加した溶液を用いると結合
の効率があがる。固定化担体はカラムに充填して行う。
平衡化の完了した担体を充填したカラムに、イオン交換
体から溶出した溶液を通液し、目的の画分を吸着させ
る。吸着操作後、平衡化に使用した緩衝液で担体を十分
洗浄し、ついで吸着された目的画分の溶出を行う。レク
チン結合特異性を有する糖を添加した緩衝液を通液し、
結合したビトロネクチン画分を溶出させる。レクチンと
してCon A を採用した場合は溶出液として、α−メチル
マンノピラノシド (α-methyl mannopyranoside)を含む
1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) を用いて担体から
の溶出を行う。溶出液は、0.15M 食塩を含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.5) に対して透析を行う。
ウム緩衝液(pH6) で平衡化する。Con A を用いる場合は
平衡化に用いる緩衝液中に塩化カルシウム (CaCl2)、塩
化マグネシウム (MgCl2)、塩化マンガン (MnCl2)をそれ
ぞれ1mM 濃度になるように添加した溶液を用いると結合
の効率があがる。固定化担体はカラムに充填して行う。
平衡化の完了した担体を充填したカラムに、イオン交換
体から溶出した溶液を通液し、目的の画分を吸着させ
る。吸着操作後、平衡化に使用した緩衝液で担体を十分
洗浄し、ついで吸着された目的画分の溶出を行う。レク
チン結合特異性を有する糖を添加した緩衝液を通液し、
結合したビトロネクチン画分を溶出させる。レクチンと
してCon A を採用した場合は溶出液として、α−メチル
マンノピラノシド (α-methyl mannopyranoside)を含む
1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) を用いて担体から
の溶出を行う。溶出液は、0.15M 食塩を含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.5) に対して透析を行う。
【０００９】透析終了後、グリコサミノグリカンを固定
化した担体と接触させ、吸着させる。グリコサミノグリ
カンとしてはヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタ
ン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸などが例
示できる。特にヘパリンは糖蛋白質の精製に用いられて
おり、ヘパリン固定化アガロースや、へパリン固定化ポ
リビニルアルコールなどが市販されており、本発明にお
いてはこのような担体を用いることが好ましい。ヘパリ
ン固定化アガロースはヘパリン−セファロース(Sepharo
se)(ファルマシア製) 、ヘパリン固定化ポリビニルアル
コールはヘパリン−トヨパール (Toyopearl)（東ソー
製) の名称で市販されている。
化した担体と接触させ、吸着させる。グリコサミノグリ
カンとしてはヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタ
ン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸などが例
示できる。特にヘパリンは糖蛋白質の精製に用いられて
おり、ヘパリン固定化アガロースや、へパリン固定化ポ
リビニルアルコールなどが市販されており、本発明にお
いてはこのような担体を用いることが好ましい。ヘパリ
ン固定化アガロースはヘパリン−セファロース(Sepharo
se)(ファルマシア製) 、ヘパリン固定化ポリビニルアル
コールはヘパリン−トヨパール (Toyopearl)（東ソー
製) の名称で市販されている。
【００１０】透析終了後の溶液を限外濾過(UF)膜を用い
て濃縮し、次いで最終濃度が8Mになるように尿素を添加
した溶液を調製する。一方、ヘパリン固定化担体をカラ
ムに充填し、0.15M NaCl および8M尿素を含む10mMリン
酸緩衝液(pH7.5) で平衡化し、このカラムに先の溶液を
通液し、ビトロネクチンを吸着させる。吸着操作後、平
衡化に使用した緩衝液で担体を十分洗浄し、ついで吸着
された目的画分の溶出を行う。
て濃縮し、次いで最終濃度が8Mになるように尿素を添加
した溶液を調製する。一方、ヘパリン固定化担体をカラ
ムに充填し、0.15M NaCl および8M尿素を含む10mMリン
酸緩衝液(pH7.5) で平衡化し、このカラムに先の溶液を
通液し、ビトロネクチンを吸着させる。吸着操作後、平
衡化に使用した緩衝液で担体を十分洗浄し、ついで吸着
された目的画分の溶出を行う。
【００１１】平衡化緩衝液に10mMの2-メルカプトエタノ
ールを添加した溶液を通液し、ビトロネクチン以外の吸
着物質を溶出させる。その後0.5M食塩を含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.5) を通液してビトロネクチンを溶出する。
溶出液には塩分がふくまれているため、脱塩を行う。脱
塩には透析、UF濃縮など種々の方法が採用できる。回収
液量が少量の場合は、ゲル濾過を行うことが簡便な方法
である。この場合のゲル濾過としたは5000以下の分子量
を分画するようなゲル例えば、セファデックス(Sephade
x) G-25などを例示できる。回収した画分は凍結乾燥等
の乾燥処理を行い粉末とすることができる。各工程のビ
トロネクチンの回収は、ビトロネクチンを固相としたEL
ISA 法により測定できる。
ールを添加した溶液を通液し、ビトロネクチン以外の吸
着物質を溶出させる。その後0.5M食塩を含む10mMリン酸
緩衝液(pH7.5) を通液してビトロネクチンを溶出する。
溶出液には塩分がふくまれているため、脱塩を行う。脱
塩には透析、UF濃縮など種々の方法が採用できる。回収
液量が少量の場合は、ゲル濾過を行うことが簡便な方法
である。この場合のゲル濾過としたは5000以下の分子量
を分画するようなゲル例えば、セファデックス(Sephade
x) G-25などを例示できる。回収した画分は凍結乾燥等
の乾燥処理を行い粉末とすることができる。各工程のビ
トロネクチンの回収は、ビトロネクチンを固相としたEL
ISA 法により測定できる。
【００１２】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【実施例１】乳由来ウシビトロネクチンの製造 ホエー画分の分離 分娩直後から分娩1 日以内に搾乳したウシ初乳12l を遠
心分離により脱脂乳とした。この脱脂乳に酢酸を添加
し、pH4.6 に調整しカゼインを凝固沈殿させた。次いで
遠心分離により沈殿を除去し、ホエー画分を得た。さら
に、酸ホエーにアンモニア水溶液を添加し、pH6.0 に調
整した。
心分離により脱脂乳とした。この脱脂乳に酢酸を添加
し、pH4.6 に調整しカゼインを凝固沈殿させた。次いで
遠心分離により沈殿を除去し、ホエー画分を得た。さら
に、酸ホエーにアンモニア水溶液を添加し、pH6.0 に調
整した。
【００１３】硫安塩析 ホエー画分に硫酸アンモニウムを、35％飽和度となるよ
うに、冷却下（４℃で攪拌しながら添加した。生じた沈
殿を遠心分離で除去し、上澄を回収した。この上澄に再
度硫酸アンモニウムを添加し、40％飽和度に調整し、ビ
トロネクチンを含む沈殿を遠心分離により回収した。こ
の硫安沈殿画分をその1.5 倍容量の蒸留水に溶解し、0.
2M酢酸アンモニウム溶液緩衝液(pH6.0) に対して透析し
て沈殿中の硫安を除去した。この透析内液画分を４℃で
保存した。
うに、冷却下（４℃で攪拌しながら添加した。生じた沈
殿を遠心分離で除去し、上澄を回収した。この上澄に再
度硫酸アンモニウムを添加し、40％飽和度に調整し、ビ
トロネクチンを含む沈殿を遠心分離により回収した。こ
の硫安沈殿画分をその1.5 倍容量の蒸留水に溶解し、0.
2M酢酸アンモニウム溶液緩衝液(pH6.0) に対して透析し
て沈殿中の硫安を除去した。この透析内液画分を４℃で
保存した。
【００１４】アニオン交換クロマトグラフィー で得た画分2.2lにあらかじめ、0.2M酢酸アンモニウム
緩衝液(pH6.0) で平衡化した500ml のアニオン交換樹脂
QAE−トヨパール(Toyopearl)650M(東ソー製)を加え、
４℃で１夜穏やかに攪拌した。その後、アニオン交換樹
脂を沈降させ、上清をデカンテーションにより除去し
た。ついでアニオン交換樹脂を直径50mmのカラムに移
し、樹脂量の2 倍程度の0.2M酢酸アンモニウム緩衝液(p
H6.0) を通液して樹脂を安定化させた後、0.4M酢酸アン
モニウム緩衝液(pH6.0) を通液して、さらに洗浄した。
目的物を溶出させるために1.0M酢酸アンモニウム緩衝液
(pH6.0) を通液し、溶出液を回収した。この操作を3 回
行い、2.2lの画分全て処理した。回収した画分を４℃で
保存した。
緩衝液(pH6.0) で平衡化した500ml のアニオン交換樹脂
QAE−トヨパール(Toyopearl)650M(東ソー製)を加え、
４℃で１夜穏やかに攪拌した。その後、アニオン交換樹
脂を沈降させ、上清をデカンテーションにより除去し
た。ついでアニオン交換樹脂を直径50mmのカラムに移
し、樹脂量の2 倍程度の0.2M酢酸アンモニウム緩衝液(p
H6.0) を通液して樹脂を安定化させた後、0.4M酢酸アン
モニウム緩衝液(pH6.0) を通液して、さらに洗浄した。
目的物を溶出させるために1.0M酢酸アンモニウム緩衝液
(pH6.0) を通液し、溶出液を回収した。この操作を3 回
行い、2.2lの画分全て処理した。回収した画分を４℃で
保存した。
【００１５】Con A アフィニティークロマトグラフィ
ー コンカナバリンA (Con A) 固定化セファロース (Sephar
ose)(Pharmacia製) を50φ×50mmのカラムに充填し、各
1mM の塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガ
ンを含む1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) で平衡化
した。またアニオン交換クロマトグラフィーで得た、ビ
トロネクチンを含む画分に塩化カルシウム、塩化マグネ
シウム、塩化マンガンを最終濃度として1mM となるよう
に添加し、Con A-セファロース (Con A-Sepharose)カラ
ムに通液し、ビトロネクチンを吸着させた。上記の平衡
化緩衝液を通液し、十分洗浄した後、0.5M−α−メチル
マンノピラノシド (α-methylmannopyranoside) を含む
1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) を通液し、目的物
質を溶出させた。溶出画分を0.15M 食塩を含む10mMリン
酸緩衝液(pH7.5) に対し透析した後、４℃で保存した。
ー コンカナバリンA (Con A) 固定化セファロース (Sephar
ose)(Pharmacia製) を50φ×50mmのカラムに充填し、各
1mM の塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガ
ンを含む1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) で平衡化
した。またアニオン交換クロマトグラフィーで得た、ビ
トロネクチンを含む画分に塩化カルシウム、塩化マグネ
シウム、塩化マンガンを最終濃度として1mM となるよう
に添加し、Con A-セファロース (Con A-Sepharose)カラ
ムに通液し、ビトロネクチンを吸着させた。上記の平衡
化緩衝液を通液し、十分洗浄した後、0.5M−α−メチル
マンノピラノシド (α-methylmannopyranoside) を含む
1.0M酢酸アンモニウム緩衝液(pH6.0) を通液し、目的物
質を溶出させた。溶出画分を0.15M 食塩を含む10mMリン
酸緩衝液(pH7.5) に対し透析した後、４℃で保存した。
【００１６】ヘパリンアフィニティークロマトグラフ
ィー で得た溶液を分画分子量13KDa のUF膜を用いて液量を
1/8 になるまで濃縮した。ついで最終濃度が8Mになるよ
うに尿素を添加し、室温で2 〜4 時間放置した。ヘパリ
ン固定化トヨパール (Toyopearl)650M（東ソー製) を10
φ×40mmのカラムに充填し、8Mの尿素および0.15M 食塩
を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.5) で平衡化した。次い
で、先に調整した試料をカラムに通液しビトロネクチン
を吸着させた。カラムを8Mの尿素および0.15M 食塩を含
む10mMリン酸緩衝液(pH7.5) で十分洗浄した後、この緩
衝液に10mMの2-メルカプトエタノールを添加した緩衝液
を通液し、ビトロネクチン以外の吸着物質を洗浄、溶出
させた。その後0.5M食塩を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.
5) で目的物を溶出させた。溶出画分をセファデックス
(Sephadex)G-25(Pharmacia 製) を充填し、0.1M炭酸水
素アンモニウムで平衡化したカラム(1.6φ×200mm)に通
液し、脱塩を行った。通過液を凍結乾燥し、ビトロネク
チン1.5mg を得た。
ィー で得た溶液を分画分子量13KDa のUF膜を用いて液量を
1/8 になるまで濃縮した。ついで最終濃度が8Mになるよ
うに尿素を添加し、室温で2 〜4 時間放置した。ヘパリ
ン固定化トヨパール (Toyopearl)650M（東ソー製) を10
φ×40mmのカラムに充填し、8Mの尿素および0.15M 食塩
を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.5) で平衡化した。次い
で、先に調整した試料をカラムに通液しビトロネクチン
を吸着させた。カラムを8Mの尿素および0.15M 食塩を含
む10mMリン酸緩衝液(pH7.5) で十分洗浄した後、この緩
衝液に10mMの2-メルカプトエタノールを添加した緩衝液
を通液し、ビトロネクチン以外の吸着物質を洗浄、溶出
させた。その後0.5M食塩を含む10mMリン酸緩衝液(pH7.
5) で目的物を溶出させた。溶出画分をセファデックス
(Sephadex)G-25(Pharmacia 製) を充填し、0.1M炭酸水
素アンモニウムで平衡化したカラム(1.6φ×200mm)に通
液し、脱塩を行った。通過液を凍結乾燥し、ビトロネク
チン1.5mg を得た。
【００１７】表１に各精製工程による精製度を示した。
【表１】
【００１８】
【実施例２】乳由来ビトロネクチンの特性 細胞伸展活性 実施例1 で得たビトロネクチンと市販の血清ビトロネク
チンとの細胞伸展活性測定を行った。ビトロネクチンを
20μg/mlを原液として、２10希釈までの２段階希釈系列
でダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で希釈し、各50
μl をマイクロプレートに分注し、４℃で１夜静置し、
ビトロネクチンをプレートに吸着させた。次に、増殖期
のBHK21 細胞を１×105/mlに懸濁させた細胞浮遊液を調
製し、これをダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で洗
浄した上記のプレートに50μl ずつ分注し、37℃で３時
間インキュベートした。インキュベート終了後、上清を
除き、ダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で洗浄し、
顕微鏡下で各ウエルを観察した。一定数の接着細胞数の
内、伸展した細胞数の比を次の式1 によって求めた。
チンとの細胞伸展活性測定を行った。ビトロネクチンを
20μg/mlを原液として、２10希釈までの２段階希釈系列
でダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で希釈し、各50
μl をマイクロプレートに分注し、４℃で１夜静置し、
ビトロネクチンをプレートに吸着させた。次に、増殖期
のBHK21 細胞を１×105/mlに懸濁させた細胞浮遊液を調
製し、これをダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で洗
浄した上記のプレートに50μl ずつ分注し、37℃で３時
間インキュベートした。インキュベート終了後、上清を
除き、ダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液で洗浄し、
顕微鏡下で各ウエルを観察した。一定数の接着細胞数の
内、伸展した細胞数の比を次の式1 によって求めた。
【００１９】
【式１】 細胞伸展活性％＝（伸展細胞数／接着細胞数) ×100 各濃度あたりの伸展活性を図1 に示した。乳由来のビト
ロネクチンは血清由来のビトロネクチンとほぼ同等かそ
れ以上の活性を示した。
ロネクチンは血清由来のビトロネクチンとほぼ同等かそ
れ以上の活性を示した。
【００２０】 N末端アミノ酸配列 実施例１で得たビトロネクチンのN 末端アミノ酸配列と
血清由来ビトロネクチンのN 末端アミノ酸配列を分析し
た。精製した初乳ビトロネクチン及び血清ビトロネクチ
ンのそれぞれ約0.5nmol を、6Mグアニジン塩酸塩を含む
1Mトリス塩酸緩衝液に溶解し、トリ- n-ブチルフォスフ
ィンと4 ─ビニルピリジンを添加してS-ピリジルエチル
化した。過剰の試薬と塩を逆相カラムを用いたHPLCによ
り除去した後、N 末端アミノ酸配列分析に供した。分析
には、気相シーケンサー(Applied Biosystems sequence
r Model 477Aおよび120A) を使用した。本発明で得られ
たビトロネクチンのN 末端から８番目までのアミノ酸配
列を決定した。この配列は、Asp Gln Glu Ser Cys Lys
Gly Arg(配列表、配列番号１参照) であった。また血清
由来のビトロネクチンのN 末端から10番目までの配列を
決定した。この配列は、Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly
Arg Cys Thr(配列表、配列番号２参照) であった。乳由
来のビトロネクチンと、血清由来のビトロネクチンのN
末端アミノ酸配列は一致した。
血清由来ビトロネクチンのN 末端アミノ酸配列を分析し
た。精製した初乳ビトロネクチン及び血清ビトロネクチ
ンのそれぞれ約0.5nmol を、6Mグアニジン塩酸塩を含む
1Mトリス塩酸緩衝液に溶解し、トリ- n-ブチルフォスフ
ィンと4 ─ビニルピリジンを添加してS-ピリジルエチル
化した。過剰の試薬と塩を逆相カラムを用いたHPLCによ
り除去した後、N 末端アミノ酸配列分析に供した。分析
には、気相シーケンサー(Applied Biosystems sequence
r Model 477Aおよび120A) を使用した。本発明で得られ
たビトロネクチンのN 末端から８番目までのアミノ酸配
列を決定した。この配列は、Asp Gln Glu Ser Cys Lys
Gly Arg(配列表、配列番号１参照) であった。また血清
由来のビトロネクチンのN 末端から10番目までの配列を
決定した。この配列は、Asp Gln Glu Ser Cys Lys Gly
Arg Cys Thr(配列表、配列番号２参照) であった。乳由
来のビトロネクチンと、血清由来のビトロネクチンのN
末端アミノ酸配列は一致した。
【００２１】SDS 電気泳動 SDS ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った。
本発明方法によるビトロネクチンは、約65KDの分子量の
単一バンドを示し、特開昭64-63600号公報に報告されて
いる77KDのバンドは痕跡程度しか認められなかった。本
発明方法により純粋なビトロネクチンを回収できること
が確認された。
本発明方法によるビトロネクチンは、約65KDの分子量の
単一バンドを示し、特開昭64-63600号公報に報告されて
いる77KDのバンドは痕跡程度しか認められなかった。本
発明方法により純粋なビトロネクチンを回収できること
が確認された。
【００２２】
【発明の効果】本発明の実施により、乳由来のビトロネ
クチンを得ることが可能となる。本発明で得られるビト
ロネクチンは高純度であり、血清由来のビトロネクチン
とほぼ同等かそれ以上の活性を有しており、点眼薬その
他の医薬品、細胞培養用培地、生化学試薬などに使用で
きる。また、乳を原料とするので、血液を原料とする際
に生じる、ウイルス感染などの危険もなく、安全かつ大
量に製造できる。
クチンを得ることが可能となる。本発明で得られるビト
ロネクチンは高純度であり、血清由来のビトロネクチン
とほぼ同等かそれ以上の活性を有しており、点眼薬その
他の医薬品、細胞培養用培地、生化学試薬などに使用で
きる。また、乳を原料とするので、血液を原料とする際
に生じる、ウイルス感染などの危険もなく、安全かつ大
量に製造できる。
【００２３】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:8 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド
【００２４】配列番号:2 配列の長さ:10 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: ペプチド
【図１】 ビトロネクチンの細胞伸展活性を測定した結
果を示す。
果を示す。
＋：初乳ビトロネクチン □：血清ビトロネクチン
【図２】 乳由来ビトロネクチンのSDS 電気泳動パター
ンを示す。
ンを示す。
Claims (3)
- 【請求項１】 ビトロネクチンを含有する乳を、アニオ
ン交換体、レクチン固定化担体及びグリコサミノグリカ
ン固定化担体に順次、接触吸着させ、溶出を行い、乳中
に存在するビトロネクチンを回収することを特徴とする
ビトロネクチンの製造方法。 - 【請求項２】 ビトロネクチンを含有する乳が、分娩後
５日以内の初乳であることを特徴とする請求項1 記載の
方法。 - 【請求項３】 固定化担体のレクチンとしてコンカナバ
リンを、またグリコサミノグリカンとしてヘパリンを使
用することを特徴とする請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4078261A JPH05239091A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | ビトロネクチンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4078261A JPH05239091A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | ビトロネクチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05239091A true JPH05239091A (ja) | 1993-09-17 |
Family
ID=13657046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4078261A Pending JPH05239091A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | ビトロネクチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05239091A (ja) |
-
1992
- 1992-02-28 JP JP4078261A patent/JPH05239091A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5516675A (en) | Separation of lactoperoxidase, secretory component and lactoferrin from milk or whey with a cation exchange resin | |
| JP4476362B2 (ja) | 生物学的に活性なペプチドのミルクからの精製 | |
| JP5704918B2 (ja) | 第ｖｉｉｉ因子およびフォンビルブラント因子の精製方法 | |
| EP0348508B1 (en) | Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound | |
| US4629567A (en) | Alpha-1-antiprotease purification | |
| JPH10506924A (ja) | 動物性タンパク質を含まないエリトロポイエチンの製造のための方法 | |
| JPH0443638B2 (ja) | ||
| US6194208B1 (en) | Modified milk growth factor | |
| HUE027724T2 (hu) | Eljárás G-CSF tisztítására | |
| JPS59137417A (ja) | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 | |
| EP0519726A2 (en) | A process for large-scale production of antimicrobial peptide in high purity | |
| US5097019A (en) | Pharmaceutical containing tissue protein pp4, a process for the preparation of pp4 and for the pasteurization thereof, and the use of pp4 | |
| CA1267615A (en) | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms | |
| JPH0386900A (ja) | 新規なトロンビン結合性物質及びその製法 | |
| CA2252986A1 (en) | Process for preparing functional recombinant tissue factor | |
| JP2568151B2 (ja) | アンジオジェニンの単離方法 | |
| JPH05239091A (ja) | ビトロネクチンの製造方法 | |
| EP1114060A1 (en) | Process for producing peptides from biological fluids and peptides obtainable by said process | |
| US4526782A (en) | Process for recovering interferon | |
| US6231862B1 (en) | Purified new epididymal forward motility protein and a process for the isolation of the said epididymal forward motility protein useful as a fertility prometer/blocker | |
| US6306823B1 (en) | Purified new epididymal forward motility protein and a process for isolation of the said epididymal forward motility protein useful as a fertility promoter/blocker | |
| WO1992014832A1 (en) | Processes for purifying human bcdf | |
| JPS61227795A (ja) | α‐インターフエロンの単離および精製法 | |
| JPH09286797A (ja) | ヘパリンコファクターｉｉ及びその精製方法 | |
| JP2963081B2 (ja) | 乳およびその副生物からラクトフェリンを分離、 精製する方法 |