JPH0386900A

JPH0386900A - 新規なトロンビン結合性物質及びその製法

Info

Publication number: JPH0386900A
Application number: JP1202027A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Aoki; 青木　延雄; Shigeru Kimura; 茂木村; Shozo Shirato; 正三白土
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1988-08-29
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1991-04-11
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: KR900003207A; DE68915226D1; KR940027658A; JPH0720997B2; ES2056164T3; EP0356836A3; DE68915226T2; EP0356836A2; ATE105480T1; US5043425A; EP0356836B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なトロンビン結合性物質、更に詳細には、
血液の凝固に対する抗凝固系並びに線溶系に関与する医
薬品、特に血栓症等の治療剤として有用なトロンビン結
合性物質、及びその製法に関する。

〔従来の技術およびその課題〕

血液凝固系の中で、蛋白分解酵素としてのトロンビンの
果す役割については種々の研究が行われ、凝固系のメカ
ニズムに関してはほぼ解明されている。

近年、生体内において、線溶系及び抗凝固系に作用する
と言われているプロティンＣをトロンビンが活性化する
こと及びその機構に捕酢素的に働く因子がウサギ肺組織
抽出物に存在していることが報告されており、このもの
はトロンボモジュリンと命名されている（　Ｎ、Ｌ、　
Ｂｓｍｏｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

［：ｈｅｍ、、　２５７．（２）、　８５９〜８６４　
（１９Ｂ２）］。

また、本発明者の１人である青米らはヒト胎盤より分離
した同様の性質を有する分子量約７１．０００（非還元
状態）のヒト・トロンボモジュリンを報告した［Ｔｈｒ
ｏｍｂｏ、Ｒｅｓ、３７．３５３〜３６４　（１９８５
））。

更に、　１．Ｍａｒｕｙａｍａらはヒト胎盤より分離し
た分子量約７５．０００のヒト・トロンボモジュリンと
、上記ウサギ・トロンボモジュリンの活性を比較し、両
者の活性が等しいことを報告している［Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、７５．９８７〜９９１．　　（１９８
５）］。

更に、）１．ｌ５ｈｉｉ　らはヒト血漿中及び尿中にト
ロンボモジュリンと同じ活性を有する物質が存在するこ
と、そして血漿中の当該物質の分子量が約６３、０００
と５４．０００であることを報告している（Ｊ、Ｃｌ１
ｎ、Ｉｎｖｅｓｔｏ、　７６　、２１７８〜２１８１（
１９８５）］。

更に、本発明者らはヒト尿中に上記物質とは異なる分子
量の小さい２種のトロンビン結合性物質（非還元状態の
分子量約３９．０００及び約３１．０００）を見出し、
特許出願した（特開昭６３−１４６８９８号）。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、更にヒト・トロンボモジュリンの有利な
取得、単離、精製方法に関し、鋭意研究を行ったところ
、ヒト尿中から上記物質とは異なる２種のトロンビン結
合性物質〈八）及び（口〉を分離することに成功すると
共に、これらが新規物質であることを確認し、さらにこ
のトロンビン結合性物質の工業的に有利な分離採取方法
を提供せんと鋭意研究を行なった結果、ヒト組織由来細
胞の組織培養液中にも尿中に存在するものと同じトロン
ビン結合性物質が存在すること、そしてこの培養液中か
ら簡単な操作で目的物を分離採取できることを見出し、
本発明を完成した。

従って、本発明は新規なヒト由来のトロンビン結合性物
質（＾）及び〈Ｂ）、−並びにその製法を提供するもの
である。

本発明のトロンビン結合性物質は、トロンビンと結合し
てプロティンＣを特異的に活性化し、血液凝固時間を延
長することから、線溶促進剤、抗凝固剤等として有用で
ある。

本発明のトロンビン結合性物質は、（１）ヒト尿をカル
シウムイオンで処理したのち、トロンビン結合性物質の
カルシウムイオンによる構造変化を認識するモノクロー
ナル抗体を用いる免疫吸着カラムクロマトグラフィー、
次いで分子量分画法で分離、精製する方法、または（２
）ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養液から前記
と同様の手段で分離、精製する方法により製造される。

（１）の方法においてヒト尿としては、ヒト新鮮尿又は
濃縮尿が使用されるが、これらはイオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過法、トロンビン−担体結合物を用い
るアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組合せて
前処理を行ってもよい。

前処理のイオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ８〜１
２に調整した尿を、ＤＲＡＢ−セファデックス＾−５０
（ファルマシア社！Ｉ）　、口ＢＡＢ−）コバール６５
０Ｃ，同６５０Ｍ、同６５０Ｓ　（東洋曹達社製）、口
ＡＢ　−セファデックスＡ−５０（ファルマシア社製）
等の樹脂と接触させて目的物を吸着させ、低濃度の塩、
例えば塩化す）　ＩＪウムを含有する緩衝液で洗浄した
のち、塩濃度を上げた同様の緩衝液で溶出する方法を採
用するのが好ましい。ゲル濾過は、セファデックスＧ１
５０　（ファルマシア社製）、ウルトロゲルＡｃＡ３４
　（Ｌ　Ｋ　Ｓ社製）等の担体を用いて行うことができ
る。アフィニティーカラムクロマトグラフィーにおける
トロンビン−担体結合物としては、トロンビンを、例え
ばジイソプロピルフロロフォスフエイトで不活性化させ
、不溶性担体、例えばアガロースゲル、セファロースゲ
ル、デキストランゲル、ポリビニルゲル等に結合させた
ものを用いるのが好ましい。

カルシウムイオン処理は、免疫吸着カラムクロマトグラ
フィーを行う直前もしくは前処理の何れかの段階におい
て、カルシウム化合物、例えば塩化カルシウム、炭酸カ
ルシウム、水酸化カルシウム等を添加することによって
行われる。一般には２〜１０ｍＭ濃度になるような量を
添加すると、目的のカルシウム結合部位を有するトロン
ビン結合性物質のみが、カルシウムと結合して構造変化
をきたす。

この構造変化を特異的に認識するモノクローナル抗体は
、例えば前記のヒト胎盤より抽出した分子量的７１．０
００のトロンビン結合性物質で免疫したマウス胛臓細胞
とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ａｇ８−Ｔとを細胞融合し、
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、更にＢＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸）の存在下でトロンビン結合
性物質とは免疫反応を行わないもの、すなわちカルシウ
ムイオンによる構造変化を認識する抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを選択し、これより常法によって製造するこ
とができる（特開昭６４−４５３９８号）。免疫吸着剤
としでは、このモノクローナル抗体とデキストランゲル
、アガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体とを
結合させたモノクローナル抗体結合担体を利用するのが
好ましい。免疫吸着カラムからの溶出は、例えばＢＤＴ
Ａを含有する緩衝液で行うことができる。

分子量分画法としては、イオン交換樹脂を用いる高速液
体クロマトグラフィー、電気泳動法等が採用される。高
速液体クロマトグラフィーに用いるイオン交換樹脂とし
ては、アニオン交換樹脂が好ましく、例えばＴＳにｇｅ
ｌ　ＤＢＡＲ−５ＰＷ、同２Ｓｌｌ、同３ＳＷ（東洋曹
達社製）　、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ｆｌＲ５１５（７ｙ　ルマ
シア社製）などを例示できる。電気泳動法としては通常
の方法、例えばＳＯ３−ポリアクリルアミドゲルを用い
るＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｎａｔｕｒｅ、　２２７゜６
８０〜６８５　（１９７０）３などを採用することがで
きる。

本発明方法（２）において用いられる細胞は、ヒトに由
来する細胞であって、本発明のトロンビン結合性物質を
産生ずる能力を有するものであれば何れでもよい。この
ような細胞としては、例えばヒト胎児の腎臓、肺、小腸
、皮膚、心臓等に由来する細胞、ヒト底入の腎臓、肺、
包皮、胎盤、リンパ球等に由来する細胞が挙げられる。

細胞の組織培養は、通常の動物細胞の培養に用いられる
方法、例えばｒＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｐ、に
、にｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｍ、に、Ｐａｔｔｅｒｓ−ｏｎ
、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９７３）に記
載の方法に準じて行なうことができる。

培養液からの本発明トロンビン結合性物質の分ｍｍ製は
、前記（１）の方法を利用することができる。

一般に、動物細胞を組織培養する際に用いられる培地は
カルシウムイオンを含有しているため、産生された培養
液中のトロンビン結合性物質は構造変化をきたしている
が、カルシウムイオンを含有していない培地を使用する
ときは、免疫吸着カラムクロマトグラフィーを行なう前
にカルシウムイオン処理を行なう必要がある。この処理
はカルシウム化合物、例えば塩化カルシウム、炭酸カル
シウム、水酸化カルシウム等を添加することによって行
なわれる。一般には２〜１０ｍＭ濃度になるような量を
添加すると、目的のカルシウム結合部位を有するトロン
ビン結合性物質のみが、カルシウムと結合して構造変化
をきたす。

このようにして得られるトロンビン結合性物質（＾）及
び（Ｂ）は次の性質を有する。

（ａ）分子量（八）還元状態で９０．０００〜９２．０００非還元状
態で５５．０００〜５８．０００（Ｂ）還元状態で９８
．０００〜１０５．０００非還元状態で６０．０００〜
６５．０００測定法：　Ｌａｅａ＋ｍｌｉの方法に準じ
て１０％のアクリルアミド−０，８％ビスアクリルアミ
ドを用いるＳＯ３−ＰＡＧＢで測定した。、ｔ！！準蛋
白として、バイオラッド５ＤＳ−ＰＡＧＢスタンダード
高分子用（日本バイオラッドラボラトリ−社製）を用い
た。

（ｂ）等電点（Ａ）　ｐＨ６，０〜６．８（Ｂ）　ｐＨ５，８〜６．５測定法：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔ
ａｍ　［プレート：ＩＢＦ（３−９））を用い、等電点
電気泳動法により測定した。

（ｃ）アミノ酸組成スパックスマンらの方法〔＾ｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　
３０゜１１９０　（１９５Ｂ）］に従い、ベックマン６
３００Ｂ型子ミノ酸分析装置（ベックマン社製）を用い
てアミノ酸組成分析を行った結果を第１表に示す。

なお、比較例として下記の文献に記載のトロンビン結合
性物質につき、各文献に記載のデーターより、同じ基準
で計算したものを併記した。

１、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５９．１２２
４６　（１９８４）■１国際公開公報−０８７１０００
５０以下余白第表のち測定した。

（ｄ）糖組成糖自動分析装置を用いて糖組成分析を行った結果を第２
表に示す。

６）蛋白量はＵＶ法で測定した。

？）２ＭＩＪフルオロ酢酸中酢酸中上００時間分解後に
測定した。

８）４Ｍ塩酸中、１００℃で４時間分解後に測定した。

９）０．ＩＮ硫酸中、８０℃で１時間分解後に、チオバ
ルビッール酸法で測定した。

（ｅ）親和性トロンビンに対し強い親和性を有する。

ジイソプロピルフォスフォロートロンビン−アガロース
［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２４５．３０５９〜
３０６５（１９７０）参照〕を用いるクロマト処理で本
物質（Ａ）及び（Ｂ）は何れも１００％吸着した。

（ｆ）活性 ■トロンビンと結合してプロティンＣを活性化する。

測定法：ヒト胎盤由来トロンボモジュリンまたは本物質
の０．０２Ｍ）リス−塩酸−０，１５Ｍ塩化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，５、以下ＴＢＳと称する）溶液（５ｎ
ｇ／ｍ１）　　１０　ｔｉβ、ヒトプロティンＣのＴＢ
Ｓ溶液（１μＭ）３０μｌ並びに１％牛血清アルブミン
及び５ｍＭ塩化カルシウムを含有するＴＢＳ　１０μｌ
を混合し、ヒトトロンビンのＴＢＳ溶液（５１／ｍｊり
５０μｆを加えて３７℃で３０分間反応させた。反応液
にヒ）ＡＴＩＩＩのＴＢＳ溶液（５０、ｕｇｌｏｌ）１
００　ｐ　１を加え、３７℃で１０分間反応させた。更
にこの反応液にＢｏｃ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−＾ｒ
ｇ−ＭＣＭ基質のＴＢＳ溶液（２００μＭ）２００μｌ
を加えて３７℃で１０分間反応させた。反応液に２０％
酢酸６００μｌを加えて反応を停止させ、生じたＡＭＣ
の濃度を、蛍光光度計を用いて励起波長３８０　ｎｍ、
発光波長４６０　ｎｍで測定した。この結果を第３表に
示す。

以下余白第３表 ■血液の凝固時間を延長する。

測定法：ウシトロンビン（持田魁薬製〉の１０ｍＭ塩化
カルシウム含有ＴＢＳ溶液（０，，０５Ｕ／ｍｆ）２０
０μｌに被験物質のＴＢＳ溶液（１０μｇ／ｍＡ）　　
１０μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた後、ヒト
血漿２００μｌを加え、直ちにフィブロメーターを用い
て凝固時間を測定した。

この結果を第４表に示す。

以下余白第４表（ｇ１安定性変性剤（ドデシル硫酸す）　ＩＪウム、尿素）に対して
安定。

測定法：本物質（八）又は　（Ｂ）　（４５μｇ）を第
５表に示す条件下、３７℃、６０分処理した。処理後、
ＴＢＳで１００倍に希釈し、活性を測定した。結果を第
５表に示す。

〔発明の効果〕

本発明のトロンビン結合性物質（Ａ）及び（Ｂ）はカル
シウム結合部位が欠損していない高分子量のものである
ので、従来の尿由来の低分子量のトロンビン結合性物質
とは異って、ネイティブに近い薬理効果が期待できる。

更に、本発明によれば、斯かるトロンビン結合性物質を
大量に入手可能なヒト尿又は組織由来細胞を原料とし、
工業的に製造することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１新鮮床６００１を６Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用い
てｐ）１９．０に調整し、４℃で一夜放置した。

生じた沈澱を除去したのち、予めｐＨを９．０に調整し
たＱＡＢ−セファデックスＡ−５０を８１加え、４℃で
２時間攪拌した。ガラスフィルターを用いて樹脂を濾過
し、０．０５　Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２Ｍ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　１０１で洗浄したのち、
２Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２　Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６）　２０　Ｉｔで溶出した。

溶出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加
えて４℃で一夜放置した。生じた沈澱を遠心分離法で採
取し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２Ｍ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　１０　Ｉｔに溶解して、
同緩衝液１００１で３回透析した。透析液に塩化カルシ
ウムを５ｍＭになるように加え、ジイソプロピルフォス
フォロートロンビン−アガロースのカラムに付した。０
．０５　Ｍ塩化ナトリウム及び５＋ｎＭ塩化カルシウム
を含有する０、　０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，６）　２０１で洗浄したのち、０．０５Ｍ塩化ナト
リウム及び５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸有する上
記緩衝液５１と１Ｍ塩化ナトリウム及び５ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸を含有する上記緩衝液５１の間で濃度
勾配法によって溶出し、１００ｍｊ２ずつ分取した。活
性部分を集め、０．０５Ｍ塩化ナトリウム含有上記緩衝
液１００１に対して３回透析した。透析液をモノクロー
ナル抗体（ＴＭ−Ａ９１）とアガロースよりなる免疫吸
着剤（特開昭６４−４５３９８号）５００ｍｌのカラム
に付し、１Ｍ塩化カルシウム含有上記緩衝液３００１で
洗浄したのち、３Ｍチオシアン酸ナトリウム及び５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸酢酸有する上記緩衝液５１で溶
出した。溶出液を０．０５　Ｍ塩化ナトリウム含有上記
緩衝液５０１で３回、次いで脱イオン水１００１で透析
したのち凍結乾燥して１０ｍｇの粉末を得た。

この粉末１０ｍｇを１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．
５％グリセロール及び０．０１％ブロムフェノールブル
ーを含有する０、　０２　Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩衝液
８０ｍ１に溶解し、１００℃で５分間加熱した。

加熱後１０％アクリルアミド−０，８％ビスアクリルア
ミドを用い、Ｌａｍｍ１ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ＋　２
２７゜６８０〜６８５　（１９７０））に準じてＳＯ３
−ＰＡＧＢを行い、活性区分を切り出した。得られた２
つの活性区分を各々水洗後、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム含有０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、５）に
浸し、４℃で一夜静置して目的物を溶出した。溶出液を
濃縮後凍結乾燥すると、（Ａ）が６ｍｇ、（ｂ）が２　
ｍｇ得られた。

実施例２新鮮床１１を０．０５　Ｍ塩化ナトリウム含有０．０２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　５１に対して３
回透析したのち、塩化カルシウムを５ｍＭになるように
加えて、実施例１と同様の免疫吸着剤１ｍｊ！のカラム
に付した。０．０５　Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カ
ルシウム及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有上記緩衝
液１００ｍｌ、次いで１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ
塩化カルシウム含有上記緩衝液１００ｍ　ｌで洗浄した
のち、３Ｍチオシアン酸ナトリウム及び５ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸酢酸含有上記緩衝液１０ｍｌで溶出した
。溶出液を０．０５　Ｍ塩化ナトリウム含有上記緩衝液
５００ｍｊ！に対して４℃で３回透析したのち、凍結乾
燥して５μｇの粉末を得た。

以下実施例１の後半と同様にＳＯ３−ＰＡＧＢを行い、
（Ａ）３μｇ、（Ｂ）１μｇを得た。

実施例３ヒト新鮮床１トンをモノクローナル抗体（Ｔ　Ｍ　−＾
７３）とＱＡＢ−セファデックス八−５０よりなる免疫
吸着力ラム及びジイソプロピルフォスフォロートロビン
−アガロースカラムで順次精製したのち、ミリボアイマ
ーシブルＣＸ−１０で５ｍＡに濃縮した。

濃縮液をウルトロゲルＡｃへ３４のカラム（２，７ｘ　
９０ｃｍ）に付し、トリス−塩酸緩衝液で溶出した。

２、４　ｍ　ｌずつ分画し、第９０〜９７両分より本物
質（Ｂ）５■、次いで第１２７〜１４５両分より本物質
（Ａ）３■が得られた。

実施例４ヒト成人腎細胞２Ｘ１０’個を７５ｃ＋ｆの平底容器に
接種し、５６℃で３０分間加熱処理したウシ胎児血清を
１０％含有するＭＢＭ２５ｍｊ！を分注した。炭酸ガス
培養装置を用い、３７℃、炭酸ガス５％の条件下で細胞
が単層に増殖するまで培養した。増殖をｒ１１認した後
、培養液を除去し、細胞の表面をリン酸緩衝液で充分に
洗浄して、２０■／ｍｌｌのプロテオースペブトンを含
有するＭＵＭ培地で更に７日間培養した。

培養上清液に含まれるトロンビン結合性物質をモノクロ
ーナル抗体＾−５９及びＡ−７３を用いるＢＬＩＳＡ法
によって測定した結果は、１０　ｎｇ／ｍｊ！であった
。

ヒト成人包皮細胞を用いて上記と同様に培養した培養上
清中のトロンビン結合性物質の含量は、４０　ｎｇ／ｍ
ｌであった。

実施例５実施例４と同様にして培養したヒト成人腎細胞の培養液
ＩＩｌをモノクローナル抗体＾−７３を結合したセファ
ロース（２ｍｇ　ＩｇＧ／ｍ　ｊ！樹脂）１ｍｊ！のカ
ラムに通した。ＩＭ塩化ナトトリム加０．０２Ｍ）リス
ー塩酸緩衡液（ｐ）１７．４）　２０ｍｊ！でカラムを
洗浄した後、２Ｍチオシアン酸ナトリウム及び５−のＢ
ＵＴ＾を含む前記緩衝液５ｍｌで溶出し、溶出液を０．
１　Ｍ塩化ナトリウム加０．０２Ｍ）！Ｊスス−酸緩衝
液に対して透析した。

透析液をウルトロゲル＾ｃＡ３４のカラム　（１，７Ｘ
９０ｃ＋ｍ）に通し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム加０．
０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で０．１　ｍ
　ｌ　／分の流速で溶出し、２．４ｍｉずつ分取した。

フラクションＮ１９０〜９５を合しくフラクション■〉
、実施例４と同様のＢＬＩＳＡ法により測定してトロン
ビン結合性物質４μｇの存在を確認した。また、フラク
ションＮ１１１２５〜１３５　（フラクション■）にト
ロンビン結合性物質３μｇがａｍされた。

実施例６実施例５で得られたフラクション■及び■並びに実施例
１〜３の尿中トロンビン結合性物質（Ａ）及び（Ｂ）を
Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８
０〜６８５）に従い、５Ｏ３−ＰＡＧＢを行なった。

ゲルをＭａｔｓｕｄａｉｒａの方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　、　２６２（２１）、　１００３５〜１００
３８］　ニ従い、ＰＶＤＦ膜１．：転写シタ。

次いでＰＶＤＦ膜を０．１％牛血清アルブミンを含有す
るＴＢＳ溶液中で室温にて２時間反応させた。溶液を捨
て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−　ＴＢＳで充分洗浄し
た後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したモノクロ
ーナル抗体Ａ−７３を含有する０、０５％Ｔｗｅｅｎ２
０−ＴＢＳ中、室温で１時間反応させた。溶液を捨て、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで充分洗浄した後、
３−アミノ−９−エチルカルバゾール５　ｍｇ及び３０
％過酸化水素水２５μｌを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５，０）　５０ｍｌに入れて発色させた。フラク
ション■は尿中トロンビン結合性物質（Ｂ）と同じ位置
に発色し、フラクション■は尿中トロンビン結合性物質
（Ａ）と同じ位置に発色した。

以　　上

Claims

【特許請求の範囲】１、次の性質、（ａ）分子量；還元状態で９０，０００〜９２，０００
、非還元状態で５５，０００〜５８，０００（ｂ）等電点；ｐＨ６．０〜６．８（ｃ）親和性；トロンビンに対し強い親和性を有する。（ｄ）活性；（１）トロンビンと結合してプロテインＣ
を活性化する。（２）血液の凝固時間を延長する。（ｅ）安定性；変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素
）に対して安定。を有するヒト尿由来のトロンビン結合性物質。２、次の性質、（ａ）分子量；還元状態で９８，０００〜１０５，００
０、非還元状態で６０，０００〜６５，０００（ｂ）等電点；ｐＨ５．８〜６．５（ｃ）親和性；トロンビンに対し強い親和性を有する。（ｄ）活性；（１）トロンビンと結合してプロテインＣ
を活性化する。（２）血液の凝固時間を延長する。（ｅ）安定性；変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素
）に対して安定。を有するヒト尿由来のトロンビン結合性物質。３、ヒト尿をカルシウムイオンで処理したのち、トロン
ビン結合性物質のカルシウムイオンによる構造変化を認
識するモノクローナル抗体を用いる免疫吸着カラムクロ
マトグラフィー、次いで分子量分画法で分離、精製する
ことを特徴とする請求項１記載のトロンビン結合性物質
の製法。４、ヒト尿をカルシウムイオンで処理したのち、トロン
ビン結合性物質のカルシウムイオンによる構造変化を認
識するモノクローナル抗体を用いる免疫吸着カラムクロ
マトグラフィー、次いで分子量分画法で分離、精製する
ことを特徴とする請求項２記載のトロンビン結合性物質
の製法。５、ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養液から分
離採取することを特徴とする請求項１記載のトロンビン
結合性物質の製法。６、ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養液から分
離採取することを特徴とする請求項２記載のトロンビン
結合性物質の製法。７、分離採取が、カルシウムイオンによるトロンビン結
合性物質の構造変化を認識するモノクローナル抗体を用
いる免疫吸着カラムクロマトグラフィー、次いで分子量
分画法で、培養液を分離、精製することによるものであ
る請求項５または６記載の製法。